Intercellular spread of the transgene product to improve the efficiency of cancer gene therapy Beerens, Anthonius Martinus Johannus

Transcriptie

1 University of Groningen Intercellular spread of the transgene product to improve the efficiency of cancer gene therapy Beerens, Anthonius Martinus Johannus IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2006 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Beerens, A. M. J. (2006). Intercellular spread of the transgene product to improve the efficiency of cancer gene therapy s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 8 Samenvatting

3 Chapter 8 Gentherapie is een techniek waarbij erfelijk materiaal (in de vorm van DNA of RNA) in een cel wordt gebracht om een therapeutisch effect te verkrijgen. Zo is het mogelijk om nieuwe informatie toe te voegen, maar het is ook mogelijk om afwezige of beschadigde informatie te vervangen. Gentherapie is een veelzijdige techniek en kan gebruikt worden voor de behandeling van veel verschillende aandoeningen, waaronder kanker. Hierbij wordt vaak een gen (een stuk DNA dat meestal de informatie bevat voor één eiwit) in de kankercel gebracht dat codeert voor een enzym (een eiwit met een katalytische functie) dat de kankercel kan doden (suïcide gentherapie). Een probleem van deze aanpak is dat het suicide enzym, als het in gezonde cellen terecht komt, deze gezonde cellen ook zal doden. Daarnaast is een belangrijk probleem van gentherapie in het algemeen en van kanker gentherapie in het bijzonder, echter het gebrek aan efficiëntie; het blijkt onmogelijk om alle kankercellen te bereiken met het suïcide gen, door de aanwezigheid van verschillende fysiologische en immunologische barrières in het lichaam. Dit is voornamelijk een probleem voor kankertherapie, omdat voor genezing alle kankercellen bereikt en vernietigd moeten worden. Om het erfelijke materiaal in de doelcel te krijgen maakt men gebruik van een vector; een drager die het DNA of RNA in de cel kan brengen, zoals een virus of een liposoom. De effectiviteit van suïcide gentherapie kan worden verhoogd door het gebruik van efficiëntere vectoren, bijvoorbeeld door hieraan nieuwe eigenschappen toe te voegen waardoor de vector specifiek kankercellen binnendringt. Dit kan door middel van adapter moleculen, die met de ene kant binden aan de vector en met de andere kant aan de doelcel, of door direct de vector te veranderen. Door deze verbeteringen kan een behandeling met gentherapie tevens specifieker voor de doelcellen gemaakt worden, doordat de vector minder bindt aan andere cellen. Door de eerder genoemde barrières wordt echter nog steeds slechts een klein gedeelte van alle doelcellen bereikt. Een andere veelbelovende manier van verhoging van de efficiëntie is het gebruik van replicerende virussen. Deze virussen zijn op genetisch niveau zo aangepast dat ze alleen nog in staat zijn zich te repliceren in de kankercellen. Hierdoor worden alleen de doelcellen vernietigd. Doordat het virus zich repliceert ontstaat tevens een nieuwe generatie van virusdeeltjes, die op hun beurt weer kankercellen kunnen infecteren, en zo ontstaat een versterking van het effect. De grote hoeveelheid virusdeeltjes die wordt geproduceerd is tevens het nadeel van deze therapie, omdat de immuunreactie die optreedt tegen het virus de virusdeeltjes verwijdert, en een ontstekingsreactie op gang brengt, die ernstige bijeffecten kan veroorzaken. Daarnaast is het natuurlijk mogelijk dat de aanwezigheid van grote hoeveelheden virusdeeltjes zelf schadelijke bijeffecten tot gevolg heeft. Dit proefschrift beschrijft een recent ontwikkelde manier om de effectiviteit van gentherapie te verhogen. Het doel is hierbij er voor te zorgen dat ook de cellen die het gen niet ontvangen bereikt worden door de therapie. Dit kan men bereiken door de cellen die het gen wel opnemen, het daaruit geproduceerde eiwit te laten verspreiden naar de cellen die het gen niet hebben ontvangen. Voor verschillende 120

4 Nederlandse Samenvatting suïcide enzymen en toxische moleculen, die actief zijn buiten de cel, is al aangetoond dat uitscheiding een positief effect heeft op het aantal gedode cellen. Een groot aantal suïcide enzymen echter zijn alleen actief in de cel, en niet daarbuiten. Deze eiwitten zullen moeten worden aangepast zodat ze ook weer worden opgenomen in de kankercellen. Met dit onderzoek hebben we de mogelijkheden onderzocht van het modificeren van een suïcide enzym om de efficiëntie van gentherapie te verhogen door transmissie. Transmissie is de uitscheiding van het transgenproduct (het geproduceerde eiwit) door de producerende cellen, en de opname daarvan door andere doelcellen. Het concept transmissie wordt verder toegelicht in de onderstaande figuur. Om de mogelijkheden te onderzoeken hebben we thymidine kinase (TK), een veelgebruikt suïcide enzym dat ondanks vele voordelen in klinische studies niet efficient genoeg is gebleken, gebruikt als model Gene Therapy Vector Protein Transgene Schematisch overzicht van het proces van transmissie. 1. Genoverdracht door gentherapie-vector 2. Productie van het eiwit in de bereikte cellen 3. Secretie van het eiwit uit de producerende cellen 4. Internalizatie van het eiwit in andere kankercellen 5. Werking van het eiwit (dood van de cel) 121

5 Chapter 8 In Hoofdstuk 2 beschrijven we enkele proteïne transductie domeinen (PTDs), als moleculen die gentherapie mogelijk kunnen verbeteren. PTDs zijn eiwitten die zich uit zichzelf van cel naar cel verspreiden, doordat ze worden opgenomen door de cellen (stap 4 in de figuur). Door een suïcide enzym te koppelen aan een PTD ontstaat mogelijk een suïcide enzym dat zichzelf verspreid. Naast een samenvatting van wat uit de literatuur bekend is over PTDs en hun internalisatie, zetten we uiteen wat voor eisen er worden gesteld aan een molecuul dat gebruikt kan worden voor transmissie in gentherapie. Hoofdstuk 3 beschrijft hoe we een uitgescheiden vorm van TK hebben gemaakt (stap 3 in de figuur). TK wordt normaal gesproken gevonden in de celkern, en nog niet eerder heeft men geprobeerd dit eiwit uit te laten scheiden. Hoewel in onze studies efficiënte uitscheiding van het eiwit mogelijk bleek, had dit een negatief effect op de activiteit van het enzym. Uit deze resultaten kunnen we concluderen dat het mogelijk is om TK efficiënt uit te laten scheiden door de producerende cellen, en secretie niet de beperkende stap hoeft te zijn in transmissie. Er moet echter nog gewerkt worden aan behoud van de enzymactiviteit. De volgende stap in transmissie; internalisatie, wordt beschreven in de hoofdstukken 4 en 5. We hebben geprobeerd een internalizerend eiwit te construeren (stap 4 in de figuur) door het toevoegen van een internalisatie-signaal (het HIV TAT-PTD) aan het TK eiwit (Hoofdstuk 4). Hoewel het TAT-PTD eerder gebruikt is voor de internalisatie van eiwitten, werden de fusie eiwitten door andere onderzoekers geproduceerd in bacteriële systemen, en later toegevoegd aan de cellen die deze eiwitten op moesten nemen. Omdat bacteriële eiwitten op veel punten verschillen van menselijke eiwitten, hebben we onderzocht of het TAT-PTD ook geproduceerd kan worden in zoogdiercellen. In verschillende typen experimenten, waarin we gebruik maken van zowel bacteriële als zoogdiercellen om de eiwitten te produceren, hebben we aangetoond dat een fusie-eiwit van het TAT-PTD en TK niet geïnternaliseerd wordt door kankercellen. We moeten daarom concluderen dat transmissie van TK gebaseerd op het TAT-PTD niet mogelijk is. In Hoofdstuk 5 beschrijven we de resultaten met een andere PTD, namelijk HSV VP22. Deze PTD is al succesvol gebruikt om eukaryoot geproduceerde eiwitten af te leveren in verschillende cellen. Door middel van verschillende technieken hebben we de bruikbaarheid van VP22 als internalisatiesignaal bepaald. Hoewel in onze experimenten VP22 als enkel molecuul wel in staat was de cellen binnen te dringen, bleek dit voor het fusie eiwit TK-VP22 niet mogelijk. Ook wanneer cellen die deze fusie produceren werden gekweekt samen met onbehandelde cellen, doodde het TK-VP22 eiwit niet meer cellen dan het TK eiwit, waaruit we af kunnen leiden dat het eiwit zich niet verspreidde naar de onbehandelde cellen. Omdat het leek alsof van het fusie-eiwit minder werd geproduceerd dan van TK als enkel molecuul, maar er in beide gevallen toch evenveel cellen werden gedood, en omdat eerder andere onderzoekers al opperden dat VP22 wellicht de enzymatische activiteit van TK kan verhogen, hebben we de enzymatische 122

6 Nederlandse Samenvatting activiteit van de twee eiwitten onderzocht. We hebben aangetoond dat de enzymactiviteit niet werd veranderd door de fusie met VP22. Blijkbaar heeft een iets kleinere hoeveelheid eiwit in de cellen geen effect op de dodelijkheid van de behandeling. Naast de afwezigheid van transmissie door VP22 vonden we dat een deel van de eiwitmoleculen in twee kleinere delen brak, wat het bepalen van de hoeveelheid eiwit bemoeilijkte. Andere onderzoeksgroepen vonden dit probleem ook. Andere onderzoekers vonden ook problemen met de enzymactiviteit van VP22 fusie-eiwitten. Daarom concluderen we dat VP22 nuttig kan zijn voor gentherapie, maar dat er nog teveel problemen en onduidelijkheden zijn om er van uit te kunnen gaan dat transmissie door VP22 in alle gevallen zal werken. Om de efficiëntie van gentherapie te verhogen moet men eerst een goed inzicht hebben in het verloop van de therapie in patiënten. Daarvoor heeft met een goed beeldvormend systeem nodig, wat zowel de plaats als de hoeveelheid genexpressie kan bepalen in de patiënt. Om het effect van de beeldvorming op de patiënt te minimaliseren mag het reportergen geen immuunrespons veroorzaken. Het is daarom het beste een menselijk gen te gebruiken als reporter. Ook de techniek moet zo weinig mogelijk belastend zijn voor de patiënt, wat betekent dat we een non-invasieve techniek zoeken. In deze combinatie zijn maar weinig technieken bekend. In hoofdstuk 6 beschrijven we een nieuwe techniek voor beeldvorming van gentherapie, gebaseerd op de non-invasieve techniek positronemissie tomografie (PET) en de radioactive tracer [ 11 C]mhydroxyephedrine ([ 11 C] mhed), in combinatie met het menselijke gen voor de norepinephrine transporter (hnet). Deze tracer is al lange tijd in gebruik in klinische toepassingen. In dit hoofdstuk laten we zien dat deze techniek specifiek de productie van het hnet eiwit kan aantonen, en dat de expressie van hnet rechtevenredig is met de expressie van een onafhankelijk transgen dat ook aanwezig is in de vector. Verder konden we in een diermodel van gentherapie, in 1 van de 3 gevallen de genexpressie zichtbaar maken met behulp van PET. Dat dit niet in alle gevallen mogelijk was is het gevolg van het gebruik van een PET camera voor mensen, die een te lage resolutie heeft om effectief voor ratten te worden gebruikt. Uit deze resultaten kunnen we concluderen dat hnet in combinatie met [ 11 C] mhed een specifieke en kwantificeerbare beeldvormingtechniek is voor positronemissie tomografie. Gebaseerd op de biodistributiedata van de tracer geloven we dat het gebruik van een PET camera voor dieren, die ten tijde van deze experimenten nog niet beschikbaar was, de resolutie van de PET beelden zal verbeteren en deze conclusie zal bevestigen. Blik op de toekomst In dit proefschrift hebben we onderzocht of we enkele belangrijke stappen van transmissie kunnen toepassen op een veel gebruikt suïcide gen; thymidine kinase. Het concept transmissie is echter niet gelimiteerd tot dit gen, of tot suïcide gentherapie. Het is toepasbaar op vele soorten gentherapie waar men het effect van het transgen wil uitbreiden naar meer cellen. 123

7 Chapter 8 Hoewel de transmissie van TK door PTDs waarschijnlijk niet succesvol zal zijn, blijft het concept transmissie veelbelovend. PTDs zijn waarschijnlijk zelfs geen ideale kandidaten voor transmissie van suïcide gentherapie, omdat hun internalisatie aspecifiek is. Efficiënte en aspecifieke internalisatie van eiwitten is bruikbaar voor gentherapie, maar kan ook grote problemen veroorzaken, vooral als het eiwit ook in niet zieke cellen terecht komt. Vooral voor suïcide gentherapie kan aspecifieke opname van het eiwit leiden tot ernstige bijwerkingen. Het zou praktischer zijn om te zoeken naar een specifieke manier van internalisatie. Er zijn ondertussen vele moleculen geïdentificeerd, die exclusief binden aan receptoren die specifiek zijn voor zieke cellen. Sommige van deze moleculen zijn al gebruikt om verschillende medicijnen af te leveren bij cellen. Veel hiervan zijn waarschijnlijk ook bruikbaar voor transmissie van eiwitten. Om vervolgens het eiwit in de cel te krijgen is het nodig dat het targeting molecuul bindt aan een internaliserende receptor, of dat het eiwit zijn eigen internalisatiemechanisme krijgt. Normaal gesproken worden eiwitten die worden geïnternaliseerd door middel van een receptor vervolgens afgebroken door enzymen in de lysozomen, maar meestal ontsnapt een klein gedeelte van het eiwit aan deze route. Als het enzym erg efficiënt is, zoals het geval is bij suïcide enzymen, kan deze kleine hoeveelheid al genoeg zijn om een effect te hebben. In de meeste gevallen echter, is het nodig een mechanisme in te bouwen waardoor het eiwit kan ontsnappen uit de lysozomen. Ook moleculen met een dergelijk systeem zijn al bekend, vooral toxines en virussen bevatten vaak een eiwit dat zorgt voor de ontsnapping uit het lysozoom. Als een dergelijk molecuul wordt ingebouwd in het suïcide enzym, samen met een targeting peptide, zou dat het eiwit in staat moeten stellen geïnternaliseerd te worden door de doelcel en vervolgens te ontsnappen aan de afbraakroute. Samenvattend kunnen we zeggen dat transmisse van het transgenproduct de efficiëntie van kanker-gentherapie enorm kan verhogen. Efficiënte routes voor secretie, internalisatie en ontsnapping uit het lysozoom zijn al geïdentificeerd. Deze moeten uitgebreid worden onderzocht voordat het uiteindelijke doel, het overwinnen van de huidige beperkingen van gentherapie, kan worden bereikt. 124