FEDERALE OVERHEIDSDIENST, VOLKSGEZONDHEID, VEILIGHEID VAN DE VOEDSELKETEN EN LEEFMILIEU COMMISSIE VOOR KLINISCHE BIOLOGIE

Transcriptie

1 FEDERALE OVERHEIDSDIENST, VOLKSGEZONDHEID, VEILIGHEID VAN DE VOEDSELKETEN EN LEEFMILIEU COMMISSIE VOOR KLINISCHE BIOLOGIE DIENST VOOR LABORATORIA VAN KLINISCHE BIOLOGIE COMITE VAN DESKUNDIGEN GLOBAAL RAPPORT EXTERNE KWALITEITSEVALUATIE VOOR ANALYSEN KLINISCHE BIOLOGIE NIET-INFECTIEUZE SEROLOGIE ANA ENQUÊTE 2010/01 WIV-10/01/Niet-infectieuze serologie/13 Dienst Klinische Biologie J. Wytsmanstraat, Brussel België

2 ISSN: COMITE VAN EXPERTEN WIV (secretariaat) TEL: 02/ FAX: 02/ Coördinators: Coördinator: Dr. VAN CAMPENHOUT C. Vervanger coördinator: Dr. VAN BLERK M. TEL: 02/ TEL: 02/ Experten: Dr. BOSSUYT X. TEL: 016/ FAX: 016/ Dr. HUMBEL R. TEL: 352/ FAX: 352/ Dr. MEWIS A. TEL: 011/ FAX: 011/ Dr. SERVAIS G. TEL: 02/ FAX: 02/ Dr. TOMASI J-P. TEL: 02/ FAX: 02/ Dr. VERCAMMEN M. TEL: 02/ FAX: 02/ Alle rapporten zijn tevens te raadplegen op onze website: Institut Scientifique de Santé Publique Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid, Brussel Dit rapport mag niet gereproduceerd, gepubliceerd of verdeeld worden zonder akkoord van het WIV-ISP. Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/2011 2/15

3 I. OPSPOREN EN IDENTIFICEREN VAN ANTI-NUCLEAIRE ANTISTOFFFEN (ANA) Staalmateriaal Er werd één monster (SN/10258) rondgestuurd afkomstig van een patiënte gekend met aanwezigheid van anti-mitochondriale antistoffen. Wij danken Prof. R. Humbel (LLIP - Luxembourg) voor het bezorgen van dit monster en het verstrekken van de nodige gegevens. Deelname 130 Belgische laboratoria hebben aan deze enquête deelgenomen. Resultaten Bij deze patiënte gekend met een primaire biliaire cirrhose (PBC) en met aanwezigheid van anti-mitochondriale antistoffen, worden geen anti-kern antistoffen verwacht en dus ook geen kernfluorescentie op HEp-2(000) cellen maar eerder een cytoplasmatische fluorescentie. 1. Indirecte immunofluorescentie (IIF) op HEp-2(000) cellen Van de 130 deelnemende laboratoria hebben er 127 indirecte immunofluorescentie op HEp-2(000) cellen uitgevoerd. Aldus werden 127 resultaten bekomen voor het opsporen van ANA met behulp van IIF. KERNFLUORESCENTIE laboratoria hebben een negatieve kernfluorescentie gerapporteerd. - 2 laboratoria rapporteerden een borderline resultaat (titer 1/80) - 4 laboratoria vermeldden een positief resultaat voor de kern met volgende titers: 1/80 (=cut-off) - 1/160-1/160 - > 1/ laboratoria hebben enkel het patroon gerapporteerd. - 6 laboratoria hebben noch voor het patroon, noch voor de interpretatie +, -, +/- een resultaat gerapporteerd. Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/2011 3/15

4 CYTOPLASMATISCHE FLUORESCENTIE laboratoria hebben een positief resultaat gerapporteerd voor de cytoplasmatische fluorescentie - 1 laboratorium bekwam een borderline resultaat (titer 1/80) - 3 laboratoria rapporteerden een negatief resultaat - 17 laboratoria hebben geen interpretatie medegedeeld maar enkel het aspect van de fluorescentie vermeld. In totaal hebben 113 laboratoria een antwoord vermeld betreffende het cytoplasmatisch aspect: laboratoria hebben het cytoplasmatisch patroon beschreven - 10 laboratoria hebben geen beschrijving medegedeeld maar enkel positief geantwoord 1 laboratorium heeft op geen enkele wijze enig resultaat voor de cytoplasmatische fluorescentie gerapporteerd maar heeft enkel een gespikkelde kernfluorescentie vermeld. Onderstaande tabellen vermelden de gerapporteerde immunofluorescentie patronen voor kern en cytoplasma bekomen op HEp-2(000) cellen. PATROON KERN AANTAL ANTWOORDEN Positief 1 (Fijn) gespikkeld 8 Homogeen 1 Nuclear dots 1 Spikkeling in de deelcellen 1 Negatief 109 Geen resultaat vermeld 6 TOTAAL 127 Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/2011 4/15

5 PATROON CYTOPLASMA AANTAL ANTWOORDEN Negatief 0 Positief 10 Geen patroon vermeld 14 Granulair 26 Gespikkeld 16 Grof gespikkeld 2 Granulair gespikkeld 5 Fijn (diffuus) korrelig 4 Mitochondriaal beeld 13 Mitochondriën 21 Mitochondriën M2 1 Verdacht mitochondriën 3 Granulaire (fijne) fluorescentie (AMA-like) 8 Grof gespikkeld filamenteus (vermoeden van anti-m2 beeld) 1 Granulair filamenteus peri-nucleair en cytoplasmatisch 1 Korrelig netwerk 2 TOTAAL 127 Voor dit monster wordt enkel een korrelige (granulaire) cytoplasmatische fluorescentie verwacht en geen kernfluorescentie. De omschrijving mitochondriën (M2) is te voorbarig; een identificatie op andere cellen of d.m.v. EIA technieken is hiervoor vereist. Een resultaat positief is onvoldoende. De terminologie gespikkeld is eerder voorbehouden voor kernfluorescentie, granulair is een meer aangepaste woordkeuze voor de beschrijving van cytoplasmatische fluorescentie. Patroonsbeschrijving 24 /127 laboratoria hebben geen patroon vermeld of enkel positief geantwoord. 22 /127 laboratoria hebben voorbarig anti-mitochondriën gerapporteerd. 81 /127 laboratoria hebben een correct antwoord geformuleerd. Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/2011 5/15

6 2. Opsporen van anti-ndna/dsdna antistoffen 74/130 laboratoria (56.9%) hebben de aanwezigheid van anti-n/dsdna antistoffen opgespoord. 4 laboratoria gebruikten hiervoor 2 technieken en 2 laboratoria 3 technieken. Aldus werden 82 resultaten bekomen voor het opsporen van anti-ndna/dsdna. 21 resultaten werden bekomen met indirecte immunofluorescentie (IIF) op Crithidia luciliae. 52 resultaten werden bekomen met een ELISA /EIA techniek. 9 laboratoria maakten gebruik van een immunodot techniek. Alle laboratoria bekwamen een negatief resultaat Gezien de klinische gegevens van deze patiënte worden er voor dit monster geen anti-ndna/dsdna antistoffen verwacht. 3. Opsporen en identificeren van ANA/anti-ENA antilichamen 101/130 laboratoria (77.7%) spoorden de aanwezigheid van ANA/anti-ENA antilichamen op met één of meerdere methoden. Voor de screeningtesten werden volgende resultaten bekomen: ENA SCREEN: 28 negatief, 8 +/- en 5 positief. ANA SCREEN: 3 negatief, 3 +/- en 5 positief. 33 laboratoria hebben de aanwezigheid van anti-ro52 antistoffen gerapporteerd, waaronder 1 laboratorium met 2 technieken. 2 laboratoria hebben eveneens anti-rnp antistoffen (zwak positief; Inova, The Binding Site) teruggevonden, waarvan 1 in aanwezigheid van anti-ro52. Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/2011 6/15

7 Volgende tabel geeft een overzicht van de gebruikte methoden waarmee anti-ro52 antistoffen werden aangetoond: Methode N Fabrikant Ro 52 N Totaal N RID (3010) 2 Immunoconcepts 0 2 Dot/Blot 61 Alphadia 1 12 (3030) Euroimmun Innogenetics 6 7 BMD 0 8 Orgentec 0 1 Immunoconcepts 0 1 TOTAAL ELISA / EIA / FEIA 26 Innogenetics 1 1 (3050) Inova/Quantalite 1 4 Phadia EliA 1 18 The Binding Site 0 1 Phadia Varelisa 0 2 TOTAAL 3 26 TOTAAL AANWEZIGHEID VAN ANTI-MITOCHONDRIALE ANTISTOFFEN 43 laboratoria, waarvan 2 met 2 technieken, hebben voor dit deel van de enquête dmv EIA eveneens de aanwezigheid van anti-mitochondriale antistoffen aangetoond. Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/2011 7/15

8 II. OPSPOREN EN TITREREN VAN ANTI-WEEFSEL ANTILICHAMEN Staalmateriaal Er werd één monster (SN/10258) rondgestuurd afkomstig van een patiënte gekend met aanwezigheid van anti-mitochondriale antistoffen. Er werd aan de laboratoria gevraagd ANA op te sporen, te titreren en te identificeren (deel I) alsook, indien relevant, anti weefsel-antistoffen op te zoeken en te identificeren (deel II). Volgende weefselantistoffen werden ter evaluatie voorgesteld: Anti-mitochondriale antistoffen Anti-gladde spier antistoffen Anti-pariëtaalcel antistoffen Wij danken Prof. R. Humbel (LLIP - Luxembourg) voor het bezorgen van dit monster en het verstrekken van de nodige gegevens. Deelname 130 Belgische laboratoria hebben aan de gehele enquête deelgenomen en 89 laboratoria hebben anti-weefsel antistoffen opgespoord. Resultaten ANTI-MITOCHONDRIALE ANTISTOFFEN (AMA) d.m.v. IIF 79 deelnemers hebben anti-mitochondriale antistoffen (AMA) d.m.v. IIF opgespoord en bekwamen allen een positief resultaat 50 laboratoria hebben eveneens een EIA uitgevoerd; er werden 47 positieve resultaten bekomen, 2 negatieve (ELISA BioRad en Kallestad Micro plate EIA) en 1 twijfelachtig (Alphadia Liver Dot maar positief voor Alphadia Cytodot) resultaat. Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/2011 8/15

9 ANTI-GLADDE SPIER ANTISTOFFEN (ASMA) d.m.v. IIF 79 laboratoria hebben anti-gladde spier antistoffen opgespoord en een interpreteerbaar resultaat gerapporteerd. 78 laboratoria hebben het resultaat als negatief geïnterpreteerd. 1 laboratorium antwoordde positief t.g.v. interferentie door anti-mitochondriale antistoffen. 6 deelnemers hebben eveneens bijkomend een EIA uitgevoerd en hebben allen een negatief resultaat bekomen. ANTI-PARIETAALCEL ANTISTOFFEN (APCA) d.m.v. IIF 77 laboratoria hebben de aanwezigheid van anti-pariëtaalcel antistoffen opgespoord. 66 laboratoria hebben het resultaat als negatief geïnterpreteerd, 6 laboratoria als niet interpreteerbaar wegens de aanwezigheid van anti-mitochondriale antistoffen. Deze laboratoria hebben geen tweede techniek toegepast. 4 laboratoria rapporteerden het resultaat als positief zonder bijkomend commentaar. 1 laboratorium bekwam een borderline resultaat. 7 deelnemers, die een negatief resultaat hebben bekomen met IIF, hebben eveneens een EIA uitgevoerd en hebben allen ook voor deze techniek een negatief resultaat bekomen. Onderstaande tabel geeft een overzicht van de bekomen resultaten per weefsel: WEEFSEL MITOCHONDRIEN GLADDE SPIER PARIETAALCEL IIF EIA IIF EIA IIF EIA POSITIEF NEGATIEF TWIJFELACHTIG NIET INTERPRET TOTAAL Anti-mitochondriale antistoffen werden door 60.8% van de laboratoria opgespoord d.m.v. IIF en 63.3% van deze laboratoria hebben bijkomend een EIA test uitgevoerd. Anti-gladde spier antistoffen werden door 60.8% van de laboratoria opgespoord maar slechts 7.6% van deze laboratoria heeft bijkomend een EIA test uitgevoerd. Anti-pariëtaalcel antistoffen werden door 59.2% van de laboratoria opgespoord en slechts 9.1% van deze laboratoria heeft bijkomend een EIA test uitgevoerd. Grafische voorstelling van de resultaten per weefsel en techniek Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/2011 9/15

10 N POS NEG NI BORDER TOTAL 10 0 AMA IIF AMA EIA ASMA IIF ASMA EIA APCA IIF APCA EIA POS: positief resultaat NEG: negatief resultaat NI : resultaat niet interpreteerbaar BORDER: borderline resultaat TOTAL: totaal van laboratoria die de analyse hebben uitgevoerd. Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/ /15

11 VERDELING VAN SUBTRATEN GEBRUIKT DOOR DE LABORATORIA 30 USED TISSUES FOR AMA 25 Frequency SUBSTRATE CODE SUBSTRATE CODE SUBSTRATE 1 Mouse kidney 7 Rat stomach-kidney-liver 2 Rat kidney 8 Rat stomach-kidney-hep2 3 Mouse stomach-kidney 9 Rat kidney-liver 4 Mouse stomach-kidney-liver 10 Rat stomach-kidney-liver-hep2 5 Mouse kidney-liver 11 Hep 20 liver 6 Rat kidney-stomach 12 Rat kidney monkey liver-hep2 Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/ /15

12 HETEROGENITEIT VAN ANTI-MITOCHONDRIALE ANTISTOFFEN René-Louis HUMBEL - LLIP (2007) Anti-mitochondriale antistoffen (AMA) zijn de serologische merkers van primaire biliaire cirrhose (PBC). De antigene determinanten bevinden zich op het dehydrogenase multienzyme complex van de α-ketozuren, dat is terug te vinden op de binnenste membraan van de mitochondriën. De drie enzyme systemen, die deel uitmaken van dit complex, zijn het pyruvaat dehydrogenase (PDH of PDC pyruvaat dehydrogenase complex), het dehydrogenase van de vertakte α-ketozuren (BCOADC branched chain oxoacid dehydrogenase complex) en het dehydrogenase van α-ketoglutaarzuur (OGDC, oxo-glutarate dehydrogenase complex). Elk van deze complexen bestaat uit een multimeer van 3 typen niet-covalent gebonden eenheden: E1 een decarboxylase, E2 een dihydrolipoamide acetyltransferase en E3 een lipoamide dehydrogenase. E2 is de centrale oligomere kern van dit complex waaraan E1 en E3 gebonden zijn. E2 is een multifunctioneel eiwit met meerdere onafhankelijke domeinen waarvan één of twee lipoyl domeinen, die zich bevinden aan het N-terminale uiteinde. Deze lipoyl domeinen zorgen voor de binding van liponzuur aan een lysine residu. Het zijn ook deze lipoyl domeinen, die herkend worden door de anti-mitochondriale antistoffen. E2 is specifiek voor elk van de drie dehydrogenases van de α-ketozuren: voor PDC is dit een acetyltransferase, voor BCOADC een acyltransferase en voor OGDC een succinyltransferase. Het PDC bevat 60 E2 kopieën, de twee andere dehydrogenases tellen slechts 24 kopieën. Tussen de 3 E2 eiwitten bestaat een homologie in de sequentie, maar toch bevat elk eiwit nog een eigen sequentie waartegen anti-mitochondriale antistoffen kunnen gericht zijn. De epitopen, die door de AMA worden herkend, bevinden zich in de binnenste en in mindere mate in de buitenste lipoyl domeinen. Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/ /15

13 De E2 subeenheden van de drie dehydrogenases konden in hun totaliteit worden gekloneerd en de overeenkomstige eiwitten kunnen worden aangewend voor het identificeren van AMA. CO PYRUVAAT DEHYDROGENASE Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/ /15

14 Recentelijk werd een nieuw immunodot systeem van de firma DTEK geëvalueerd dat gebruik maakt van deze drie eiwitten voor het opsporen van AMA. Hiervoor werden 133 sera getest, afkomstig van patiënten met gekende PBC en met positiviteit voor AMA zoals aangetoond door immunofluorescentie. Volgende resultaten werden bekomen: Tabel 1 : Resultaten voor AMA in 133 sera van patiënten met gekende PBC. De reagentia, die meestal tot voor kort in routine werden aangewend, gebruikten als antigeen enkel het PDC, wat het groot aantal fout negatieve resultaten kan verklaren. Door gebruik te maken van deze nieuwe combinatie van eiwitten is het mogelijk ook AMA aan te tonen, die niet reageren met het PDC. Om het geheel aan AMA te kunnen detecteren is het dus onontbeerlijk om te kunnen beschikken over deze drie eiwitten. Het immunodot systeem van DTEK (cytodot of liverdot) maakt in zijn nieuwe versie gebruik van een mengsel van deze drie eiwitten. Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/ /15

15 Voorbeeld van een immunodot die de heterogeniteit van AMA aantoont. Een andere mogelijkheid voor het aantonen van AMA is door middel van een ELISA, die gebruik maakt van een hybride molecule bekomen van cdna fragmenten, die coderen voor de lipoyl domeinen van de E2 subeenheden van het PDC, het BCOADC en het OGDC (kits gecommercialiseerd door de firma s MBL (Japan) en Inova (USA)). Niet-infectieuze serologie, globaal rapport 2010/01. Printdatum: 01/02/ /15