Overzicht van eiwit transportsystemen in Gram-negatieve bacteriën

Transcriptie

1 Overzicht van eiwit transportsystemen in Gram-negatieve bacteriën Caput structuurbiologie Bernike Kalverda, studentnummer

2 Inhoud Inleiding Transport over cytoplasmatisch membraan - Sec systeem - SRP - Tat systeem - Type I - Type II - Type III - Type IV - Autotransporters Discussie Referenties Bladzijde Inhoud

3 Inleiding Gram-negatieve bacteriën bestaan vanuit de binnenkant gezien uit het cytosol, waarin zich onder andere de celkern en ribosomen bevinden, het cytoplasmatisch membraan, het periplasma met daarin een peptidoglycaanlaag en het buitenmembraan 6 (figuur 1). Eiwitten worden in de bacteriële cellen gesynthetiseerd door ribosomen, die zich los in het cytosol bevinden. Deze geproduceerde eiwitten functioneren in het cytosol, in de celkern, in een van de membranen, in het periplasma of buiten de cel. Het transport van de eiwitten naar de juiste locatie wordt mogelijk gemaakt door diverse eiwit transportsystemen. Dit review behandelt de transportsystemen over het cytoplasmatisch membraan en het buitenmembraan. Aan de orde komen de componenten waaruit deze systemen bestaan, de substraten, de mechanismen en andere specifieke kenmerken van de systemen. Er zal ook gekeken worden naar de verschillen en overeenkomsten tussen deze transportsystemen en de relatie tussen de systemen onderling. a b Figuur 1 Schematische voorstelling van de membraanstructuren in Gram-negatieve bacteriële cellen. a) Membranen in Escherichia coli. Het aangegeven kader is vergroot weergegeven in figuur 1b. b) Dwarsdoorsnede van de membraanstructuren in een Gram-negatieve cel. Inleiding

4 Transport over cytoplasmatisch membraan Het langst en meest bekende transportsysteem van eiwitten over het cytoplasmatisch membraan is het Sec transportsysteem. Ook het eiwit SRP is in staat eiwitten te transporteren. Dit systeem is echter een onderdeel van het transport via de Sec route. Een aantal jaren geleden is er naast het Sec systeem een tweede systeem ontdekt, namelijk het twin-arginine transport (Tat). Oorspronkelijk vond men het Tat systeem in eukaryoten, waar het eiwitten transporteert over de thylakoïd membraan van chloroplasten 6, 14, 17. Deze route is DpH afhankelijk 2, 6, 14. Sinds enkele jaren is bekend dat ook in Gram-negatieve bacteriën, zoals Escherichia coli, de Tat route parallel aan de Sec route werkt in transport van eiwitten over het cytoplasmatisch membraan Transport over cytoplasmatisch membraan

5 Sec systeem Het Sec systeem bestaat uit een aantal verschillende componenten. In het cytoplasmatisch membraan bevindt zich een translocase: een integraal membraan eiwitcomplex, dat bestaat uit de drie componenten Sec Y, Sec E en Sec G 12. Aan dit complex kan aan de binnenkant van het cytoplasmatisch membraan een ATP-ase, genaamd SecA, binden 6, 12. Wanneer SecA niet betrokken is bij het translocatieproces komt het los voor in het cytoplasma 12. Twee andere membraaneiwitten, SecD en SecF, zijn niet essentieel voor eiwittranslocatie, maar stabiliseren SecA in diens actieve conformatie 6. Het Sec systeem transporteert alleen ongevouwen eiwitten 6, 17. SecB is een eiwit dat in het cytosol hecht aan de precursorproteïnes, voorkomt dat deze vouwen en ze naar de translocase brengt 6. SecB wordt veelal de chaperone van het Sec systeem genoemd 6, 12, maar is dit juist niet, omdat het als functie heeft vouwing te voorkomen in plaats van erbij te helpen zoals bij chaperones het geval is. Transport via SecB is niet de enige manier om bij het Sec translocase te belanden. Er zijn ook preproteïnes die via SRP (zie blz. 6) of zonder hulp van andere eiwitten het translocase bereiken 6 (figuur 2). Figuur 2 6 Het Sec systeem met de verschillende routes van het ribosoom naar het Sec translocase, welke bestaat uit de integrale membraaneiwitten SecY, SecE en SecG, met daaraan het perifeer gebonden SecA. a) Wanneer het signaal sequentie domein van het preproteïne zeer hydrofoob is, kan het hechten aan SRP (signal recognition particle), waardoor het bij het membraangebonden FtsY terechtkomt. Hier laat SRP los en wordt het preproteïne overgegeven aan het Sec translocase. SRP kan ook integrale membraaneiwitten van het ribosoom naar hun locatie in het membraan brengen. b) Wanneer de signaalsequentie niet gebonden wordt door SRP en het mature domein de juiste kenmerken heeft, bindt SecB aan het mature domein. Bij het membraan geeft SecB het preproteïne over aan SecA, waarna translocatie kan optreden. c) Wanneer het preproteïne niet herkend wordt door SecB, zou de signaal sequentie direct kunnen hechten aan SecA. Transport over cytoplasmatisch membraan 5

6 SecB bindt aan het mature gedeelte van het preproteïne 6. Gesuggereerd wordt dat de interactie tussen SecB en het precursorproteïne plaats vindt tussen een aantal basische residuen van het preproteïne en de hydrofobe kant van een b-structuur van SecB 6. SecB bindt vervolgens met de andere, negatief geladen zijde van deze b-structuur aan SecA 6 (figuur 3). In de aanwezigheid van het signaal peptide van het preproteïne bindt SecB met hogere affiniteit aan SecA 6. Dit signaal peptide bestaat uit drie delen, een positief geladen amino-terminale (n-) regio, een centrale hydrofobe (h-) regio en een carboxyl-terminale (c-) regio (figuur 4). De c- regio is de klievingsplaats voor een signaal peptidase 6. Dit enzym bevindt zich in het periplasma en katalyseert het van het preproteïne afhalen van de amino-terminale signaal peptide 14. Figuur 3 6 SecA en het preproteïne binden elk aan een kant van een b-structuur van SecB. Figuur 4 Sec specifieke signaal peptide, bestaande uit een positief geladen amino-terminale n-regio, hydrofobe h-regio en een carboxy-terminale c-regio. De signaal peptide zorgt voor hogere affiniteit bij de binding van het SecBpreproteïne complex aan SecA. De signaal peptide wordt na aankomst van het preproteïne in het periplasma bij de c-regio van het preproteïne afgeknipt door een peptidase. 6 Transport over cytoplasmatisch membraan

7 Na binding van SecB aan SecA laat SecB los van het precursorproteïne, die daarbij overgedragen wordt op SecA. SecB verlaat de membraan weer om een nieuw preproteïne te binden in het cytosol. Herhaalde cycli van SecA preproteïne associatie, ATP binding en hydrolyse en SecA preproteïne dissociatie leiden tot stapsgewijze translocatie van het gehele preproteïne door de membraan 6 (figuur 5). Hierbij zorgt elke ATP voor de energie voor de insertie van een gedeelte van SecA en een stukje van het preproteïne door de porie van de translocase, zodat uiteindelijk het gehele preproteïne door het cytoplasmatisch membraan getransporteerd is 6. Figuur 5 12 Model voor de stapsgewijze translocatie van een preproteïne door het Sec translocase door middel van de SecA reactie cyclus. 1) In de eerste stap is SecA ADP gebonden. 2) ADP wordt vervangen door ATP, wat leidt tot de membraan insertie van SecA en een preproteïne translocatie van ongeveer 2,5 kda. 3) Hierna wordt ATP gehydrolyseerd en laat SecA het preproteïne en de membraan los. Het kan nu uitwisselen met cytosolisch SecA. 1a) Als SecA opnieuw bindt, resulteert dit in de translocatie van opnieuw ongeveer 2,5 kda. De cyclus gaat door tot het gehele preproteïne door de membraan is. Transport over cytoplasmatisch membraan 7

8 SRP route De SRP route is een belangrijke route bij het transport van eiwitten over het membraan van het Endoplasmatisch Reticulum 6. Daarnaast speelt het ook een rol bij de targeting van preproteïnes naar het Sec translocase complex in het cytoplasmatisch membraan. SRP (Signal Recognition Particle) is een eiwitcomplex dat concurreert met SecB in het transporteren van preproteïnes vanuit het cytosol naar het Sec translocase in het cytoplasmatisch membraan 6. SRP hecht aan de hydrofobe signaalsequentie van preproteïnes, waarna via het membraaneiwit FtsY het preproteïne in contact kan komen met de Sec translocase (figuur 2). Op dit punt vindt dus convergentie plaats van de SecB- en SRP-gemedieerde transport route. Een overeenkomst tussen SecB en SRP is dat beide chaperones hun substraat loslaten na interactie met een membraangebonden receptor 6. Een verschil is dat SRP met name integrale membraan proteïnes transporteert, die een sterk hydrofobe signaalsequentie hebben, en SecB alleen secretie-eiwitten, die meer hydrofiel van aard zijn 6. 8 Transport over cytoplasmatisch membraan

9 Tat systeem Het Tat systeem onderscheidt zich van het Sec systeem doordat het in staat is om compleet gevouwen eiwitten te transporteren 2, 6, 17 (figuur 6). De meeste van de bekende Tatafhankelijke eiwitten bevatten redox cofactoren en zijn componenten van verschillende ademhalingsketens die de anaërobe groei van bacteriën ondersteunen. Andere Tat substraten zijn betrokken bij de aanpassing van bacteriën aan een specifieke omgeving met hoge osmolariteit 17. Figuur 6 14 Eiwitsecretie via de Sec- en Tat route. a) De Tat (twin-arginine translocatie) route. De meeste (maar niet alle) substraten van deze route binden redox cofactoren en functioneren in het periplasma. Na de synthese in het cytoplasma neemt men aan dat de substraten vouwen en dan de cofactor (gerepresenteerd door een wit rechthoekje) binden, waarna het preproteïne getransporteerd wordt door het Tat systeem. b) De Sec route. Snel na het vrijkomen van de ribosoom wordt het preproteïne gewoonlijk gebonden door het SecB eiwit, welke het vouwen van het mature domein voorkomt. Het substraat wordt dan getransporteerd naar SecA, de drijvende kracht achter het ATP-afhankelijk transport door het SecYEG complex. In het periplasma wordt het precursoreiwit verwerkt en kan het vouwen. Transport over cytoplasmatisch membraan 9

10 De signaalpeptides van de substraten voor de Tat route lijken sterk op Sec signaal peptides (figuur 7). Zo bestaan Tat signaal peptides ook uit een n-regio, een h-regio en een c-regio. In de n-regio bevindt zich het twin-arginine motief, dat essentieel is voor effecieve Tat translocatie 6, 11, 14, 16. In dit motief zijn de twee arginine residuen het belangrijkst. Over de residuen die daarnaast nog van belang zijn in dit domein verschillen de meningen. Voorgesteld worden de sequenties RRXFXK 6 en SRRXFLK 16. Ondanks de overeenkomsten tussen de Sec en Tat signaal peptides verschillen deze peptides toch zodanig dat ze in staat zijn om de precursorproteïnen zodanig te sorteren dat bepaalde preproteïnen de Tat route nemen en andere de Sec route 14, 16. Er wordt beweerd dat de Tat afhankelijke signaal peptides binding aan onderdelen van de Sec route voorkomen doordat de h-regio van het peptide een lage hydrofobiciteit heeft en de c-regio een Sec-ontwijkings motief van basische/positief geladen residuen bevat 16, 17. De meeste preproteïnes volgen een van de beide routes, maar waarschijnlijk zijn er ook uitzonderingen die over beide routes getransporteerd kunnen worden 14. De belangrijkste componenten van het Tat systeem zijn de membraaneiwitten TatB en TatC (figuur 8b). Deze vormen een functionele en structurele eenheid 2, 14. In Bacillus subtilis zijn twee verschillende TatC eiwitten aangetoond, met elk een eigen specificiteit 11. Hieruit is afgeleid dat TatC een bepalende factor is in de substraatspecificiteit van het Tat complex. Figuur 7 Sec- en Tat specifieke signaal peptides. Voor de bepaling welke route een eiwit neemt in de translocatie over het cytoplasmatisch membraan zijn deze peptides erg belangrijk. Beide signaal peptides hebben dezelfde opbouw in een n-regio, h-regio en c-regio. In de n-regio van het Tat peptide bevindt zich het twin-arginine motief, met daarin twee essentiële arginine residuen. Er wordt beweerd dat de Tat afhankelijke signaal peptides binding aan onderdelen van de Sec route voorkomen doordat de h-regio van het peptide een lage hydrofobiciteit heeft en de c-regio een Sec-ontwijkings motief van basische/positief geladen residuen bevat 16, Transport over cytoplasmatisch membraan

11 Voor translocatie is naast TatB en TatC ook TatA of TatE nodig. TatA is hiervan het meest voorkomend 2. Er is gesuggereerd dat TatA in relatie tot TatB en TatC een lossere associatie heeft of een aparte functie 2. Hoewel er verder geen andere subunits zijn gevonden, kan het bestaan van zulke subunits niet worden uitgesloten 2. De tat genen zijn georganiseerd in een tatabcd operon en een apart monocistronisch tate gen 14 (figuur 8a). Dit gen is homoloog aan het tata gen, maar heeft een veel lagere expressie 14. Het tatd gen codeert voor een cytoplasmatisch eiwit waarvan de activiteit niet van belang is voor Tat-afhankelijke export 14. Voor zover bekend gebruikt het Tat systeem in tegenstelling tot de Sec route geen NTP hydrolyse bij het translocatie proces 14. Verdere structurele analyse van het Tat complex zal leiden tot een meer gedetailleerd begrip van de organisatie en werking van dit translocatie systeem. Figuur 8 14 Genen en eiwitten die betrokken zijn bij de Tat route in Escherichia coli. a) Organisatie van de bekende tat genen. TatA, B, C en D zijn georganiseerd in het tatabcd operon. De tatabc genen coderen voor belangrijke (TatA) of essentiële (TatB en TatC) membraan-gebonden componenten, terwijl het tatd gen codeert voor een cytoplasmatisch eiwit waarvan de activiteit niet belangrijk is voor Tat-afhankelijk transport. Het monocistronische tate gen codeert voor een TatA homoloog, maar komt op een laag niveau tot expressie. b) Voorspelde eiwit structuur en organisatie van de E. coli Tat eiwitten (TatA, TatB en TatC) en hun vermeende homologen in het planten thylakoïd membraan (Tha4, Hcf106 en TatC). Van TatA en TatB is voorspeld dat ze een zeer kort periplasmatisch amino-terminaal domein bezitten, één membraan overspannende regio, gevolgd door een korte amphipatische regio. TatA (en diens homoloog, TatE, die niet is afgebeeld) bevat een klein cytoplasmatisch domein. TatB heeft een groter cytoplasmatisch domein. Van TatC heeft men voorspeld dat het zes transmembraan helices bevat, met korte regio s ertussen en amino- en carboxyleindes gelocaliseerd in het cytoplasma. Transport over cytoplasmatisch membraan 11

12 Eiwitten kunnen langs veel verschillende routes met bijbehorende eiwitcomplexen door het buitenmembraan van de Gram-negatieve bacterie gebracht worden. Deze routes kunnen geklassificeerd worden in vier verschillende families: type I, II, III en IV 7, 10 (figuur 9). Van deze families zorgen type I en III voor het transport over zowel het cytoplasmatisch membraan als over het buitenmembraan 7, 10. Er wordt geen gebruik gemaakt van andere transport routes, zoals de Sec- Tat- of SRP routes. Omdat het Sec-systeem lange tijd de enige bekende transportroute over het cytoplasmatisch membraan was, zijn het type I en III transport vaak aangeduid met Sec-onafhankelijk transport. Het is echter Sec-, Tat- en SRPonafhankelijk transport. Transport via type II is wel afhankelijk van andere routes. Na transport door Sec of Tat door het cytoplasmatisch membraan zorgt deze route ervoor dat de eiwitten door de buitenmembraan gesecreteerd worden. Er vindt aminoterminale processing van de te secreteren eiwitten plaats in het periplasma 10, waarbij de signaalsequentie die door Sec of Tat wordt herkend van het eiwit wordt afgeknipt. Type IV transport is grotendeels onafhankelijk van andere transportroutes, maar zou gedeeltelijk afhankelijk kunnen zijn van de Sec- en Tat route 3. autotransporters buitenmembraan I IV III? II Tat Sec binnenmembraan Figuur 9 Overzicht van de transportsystemen over het cytoplasmatisch- en buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën. Het Sec- en Tat systeem transporteren preproteïnes over het cytoplasmatisch membraan. In de Sec route kan SRP een rol vervullen in het transport van het preproteïne naar het membraan. Type I en III verzorgen het transport over zowel het cytoplasmatisch membraan als over het buitenmembraan 7, 10 en maken daarbij geen gebruik van andere transport routes. Transport via type II is wel afhankelijk van transport over het cytoplasmatisch membraan door het Sec- of Tat systeem. Het type IV systeem transporteert over het algemeen zelfstandig over beide membranen, maar zou gedeeltelijk afhankelijk kunnen zijn van de Sec- en Tat route 3. Sommige eiwitten zijn autotransporters, zij hebben geen transportsysteem nodig om door het buitenmembraan heen te komen.

13 Type I Het type I systeem is een vrij eenvoudig systeem dat bestaat uit drie of vier 1, 7, 10 moleculen, die samen een transmembraan kanaal vormen (figuur 10). In het binnenmembraan is een transport ATPase aanwezig, ook wel ABC eiwit genoemd, wat staat voor ATP- Binding Cassette 10. Deze ATPase is substraat specifiek en levert de energie voor de eiwit secretie 10. Voor de verbinding van de membranen is er een membraanfusie-eiwit (MFP), die verankerd is in het binnenmembraan en de periplasmatische ruimte overbrugt. Daarnaast is er een eiwit in het buitenmembraan 10. De formatie van een complex van deze drie eiwitten komt pas tot stand door binding van substraat aan het ATPase, waardoor een chemische of structurele verandering van het ATPase plaatsvindt 1. De genen die coderen voor het secretie systeem zijn gewoonlijk geclusterd met het te secreteren eiwit 1, 7, 10. De eiwitten die worden getransporteerd zijn toxines, proteases en lipases 1. Een prototype eiwit dat via type I wordt gesecreteerd is de E. coli a-hemolysine 7. De eiwitten hebben geen klassieke signaal sequentie 7, maar worden door het ATPase herkend aan een C-terminaal domein van ongeveer 60 aminozuren 1, 7, 10. Dit secretie signaal lijkt specifiek te zijn voor subfamilies van het secretie systeem; dat wil zeggen dat bijvoorbeeld proteases nauwelijks worden gesecreteerd via het hemolysine systeem en omgekeerd 10. Figuur a-hemolysine secretie door E. coli is het prototype secretiesysteem van type I. Het systeem bestaat uit drie componenten, te weten TolC in het buitenmembraan, HlyD als membraanfusie-eiwit in het periplasma en the ATP-ase HlyB in het cytoplasmatisch membraan. OM = outer membrane; PP = periplasma; IM = inner membrane; CP = cytoplasma; C = carboxy terminus. 13

14 Direct naast het secretie signaal ligt een domein met een Glycine-rijke sequentie, die 4 tot 36 keer wordt herhaald. Het zou kunnen dat dit domein werkt als een interne chaperone, dat wil zeggen dat het ervoor zorgt dat het eiwit zo wordt gevouwen dat het secretie signaal juist wordt gepositioneerd 1. 14

15 Type II Het type II transport systeem is zeer complex en maakt deel uit van de Algemene Secretie Route 5, 17. Dit is een tweestaps proces, waarbij de translocatie over het buitenmembraan wordt uitgevoerd door het type II systeem 17. Het transport over het binnenmembraan wordt verzorgd door het Sec systeem (de Algemene Export Route) en in sommige gevallen ook het Tat systeem 17. Dit laatste systeem wordt in ieder geval gebruikt door twee fosfolipases in Pseudomonas aeruginosa 17. Er is hier dus sprake van een mozaïek model, waarin zowel het Sec systeem als het Tat systeem substraten doorgeeft aan het secreton van het type II systeem (figuur 11). Het type II transport systeem transporteert volledig gevouwen enzymen en toxines van het periplasma naar het extracellulaire medium 5, 15. Waarom de eiwitten gesecreteerd worden in hun volledig gevouwen vorm is onbekend, maar zou kunnen komen doordat voor succesvolle vouwing specifieke chaperones zoals disulfide isomerase nodig zijn. Ook lijkt het voordelig te zijn om eiwitten die uit meerdere subunits bestaan samen te stellen in het geconcentreerde milieu van het periplasma in plaats van de extracellulaire omgeving 15. Figuur Mozaïek model van eiwit secretie via de type II route. Exotoxine A (ETA), met een Sec-afhankleijke signaal peptide (SP), en de fosfolipases C (Plc s), met een twin-arginine (RR) signaal peptide, worden respectievelijk door de Sec- en Tat route door het binnenmembraan geëxporteerd. In het periplasma worden de exoproteïnes, nadat de signaal peptides erafgehaald zijn, herkend door het Xcp systeem, geleid naar het secretine XcpQ, en losgelaten in het externe medium. C = cytoplasma; IM = inner membrane; P = periplasma; OM = outer membrane. 15

16 Het type II secretie systeem bestaat uit 12 tot 15 verschillende componenten. In de meeste systemen worden deze aangegeven als A tot en met O en S. In Pseudomonas aeruginosa heten de componenten P tot en met Z en A 15. Hoewel het type II systeem zorgt voor transport over het buitenmembraan, zijn de meeste van deze factoren geassocieerd met het cytoplasmatisch membraan 15. Een reden hiervoor kan zijn dat het systeem energie haalt uit hydrolyse van ATP, wat alleen in het cytoplasma aanwezig is. De eiwitten in het cytoplasmatisch membraan zouden dan een functie kunnen hebben in het doorgeven van de door ATP geleverde energie naar de plaats van secretie. De locaties en interacties van de componenten van de type II secretie van pullulanase door Klebsiella oxytoca en het cholera toxine door V.cholerae staan respectievelijk aangegeven in de figuren en Figuur Het best bestudeerde voorbeeld van type II secretie is pullulanase (PulA) secretie door het Pul secreton van Klebsiella oxytoca 10. Hierbij zijn 14 secretiefactoren betrokken, waarvan zich tenminste zeven zich in het cytoplasmatisch membraan bevinden. PulS en PulD zijn buitenmembraaneiwitten en functioneren in een stabiel complex als een afsluitbaar buitenmembraan kanaal. Pul G assembleert in pili 13. Voor pullulanase secretie is naast de Pul eiwitten ook het DsbA eiwit nodig. DsbA katalyseert de vorming van intramoleculaire disulfidebruggen in het secretine gidseiwit PulS en het kleine pseudopiline PulK 13. Pul E heeft een ATP bindingsplaats en is verankerd aan de binnenkant van het cytoplasmatisch membraan 8. Ook PulL lijkt een ATP bindend eiwit te zijn. LspA is een periplasmatische peptidase, die de amino-terminale signaal sequentie van de eiwitten afknipt wanneer ze geëxporteerd zijn via de Sec Route. 16

17 De porie in het buitenmembraan wordt gevormd door eiwit D, die een grote oligomeer vormt van 12 tot 14 subunits 15. Eiwit D behoort tot een grote familie van equivalente eiwitten, genaamd secretines, die ook componenten bevat die nodig zijn voor type IV pilus biogenese, filamenteuze faag uitscheiding en type III secretie 15. Eiwit S is een klein buitenmembraan lipoproteïne, die eiwit D stabiliseert en meewerkt aan de insertie van eiwit D in het buitenmembraan 15. Niet alle soorten met een type II systeem hebben een eiwit S. Eiwit B, die een complex vormt met eiwit A, zou een andere component kunnen zijn die interacteert met eiwit D. Het zou kunnen dat het AB complex betrokken is bij de regulatie van de secretie. Ook dit AB complex is echter niet aanwezig in alle soorten type II systemen. Figuur Secretie van cholera toxine via de type II secretie route Eps in V. cholerae. De A en B subunits van het cholera toxine worden als monomerische precursors door het cytoplasmatisch membraan (CM) getransporteerd via de Sec route. De subunits vouwen en assembleren met hulp van DsbA in het AB 5 toxine complex. Het AB 5 wordt betrokken bij het type II secretie apparaat Eps door specifieke herkenning van B 5, die het secretie signaal draagt. Het complex wordt gebracht naar de secretie porie in het buitenmembraan (OM) en laat los wanneer het buiten de cel is. In dit model vormt EpsD de secretie porie. EpsE, EpsL en EpsM reguleren extracellulaire secretie door communicatie van essentiële informatie tussen het cytoplasmatisch membraan en buitenmembraan door fosforylatie of ATP hydrolyse. Eiwitten G, H, I, J en K worden bewerkt door eiwit O en vormen waarschijnlijk een pilus-achtige structuur, met eiwit G als hoofdcomponent. De pilus zou als functie kunnen hebben om het toxine uit de porie te duwen door herhaalde uitzetting (polymerisatie) en terugtrekking (depolymerisatie), zoals gerepresenteerd door de witte pijl. Hoewel niet aanwezig in V. cholerae, helpt eiwit S bij de insertie van eiwit D in het buitenmembraan. Eiwit A vormt een complex in het cytoplasmatisch membraan met eiwit B, die op zijn beurt interactie heeft met eiwit D. Eiwitten A, B, N en S worden getoond in dit model; ze zij echter niet in alle organismen met een type II route aanwezig en zijn misschien niet in elk geval nodig voor secretie. 17

18 Eiwit E bevindt zich in het cytoplasmatisch membraan en vertoont autofosforylatie activiteit die afhankelijk is van een intacte ATP bindingsplaats (Walker box) 7, 15. Het eiwit zou kunnen werken als een kinase, die het secretieproces reguleert. Een mogelijkheid is dat het de opening en sluiting van de secretieporie zou kunnen sturen via een interactie met de eiwitten L en M. Daarentegen is ook gespeculeerd dat eiwit E geen kinase is, maar een ATPase en de functie heeft om energie te leveren voor de opening van de secretieporie of de assembly van het secretie apparaat 15. Ook eiwit C heeft interactie met de eiwitten L en M en misschien met eiwit D. De eiwitten G, H, I, J en K worden bewerkt door eiwit O en vormen waarschijnlijk een pilus-achtige structuur, waarvan eiwit G de hoofdcomponent is 15. Hiernaast bevat het type II systeem ook een peptidase, die de signaal sequenties van de eiwitten afknipt wanneer deze door de Sec of Tat route naar het periplasma zijn getransporteerd 7. Type II secretie deelt veel kenmerken met het type IV pilus biogenese systeem, inclusief het vermogen om te assembleren in pilus-achtige structuren 15. Naar analogie met het type IV piliatie systeem, dat uit veel homologen van Pul secreton componenten bestaat, wordt gesteld dat PulE benodigd is voor de assembly van oppervlakte pili 8. 18

19 Type III Type III secretie is een systeem waarbij pathogenen door contact gemedieerde specifieke injectie in zowel menselijke als dierlijke als plantaardige gastheercellen gebracht worden 7, 9. Contact met de gastheercel is nodig voor volledige activatie van de secretie route 9. De in de gastheercel geïnjecteerde effector moleculen van het type III systeem lijken vaak op eukaryote factoren met signaaltransductie functies en zijn in staat om te interfereren met de signaaltransductie routes in de gastheer cel 7, 9, 10. Het type III secretie apparaat is samengesteld uit ongeveer 20 eiwitten, waarvan de meeste gelocaliseerd zijn in het cytoplasmatisch membraan 10 (figuur 14). Een van de componenten is een cytoplasmatisch, waarschijnlijk membraan-geassocieerd ATPase 7, 10. Hiervan neemt men aan dat het de energie levert voor het secretie proces 9. De meeste binnenmembraan eiwitten lijken op de componenten van het flagella biosynthese apparaat 9, 10. Een buitenmembraan eiwit van het type III systeem lijkt erg op PulD, het buitenmembraan secretine van de type II route 10, en vormt het translocatie kanaal door dit membraan. Figuur Type III systeem voor Yop secretie door Yersinia. Van de ongeveer 20 secretiefactoren bevinden zich de meeste in het cytoplasmatisch membraan. YscC vormt een kanaal door het buitenmembraan en lijkt hierin sterk op het eiwit D in het type II transport. YscN is een ATPase die de energie voor de translocatie levert. Syc is een component die het te transporteren eiwit naar het translocatie complex brengt. 19

20 Voor het in de gastheer cel brengen van de gesecreteerde eiwitten zijn enkele aanvullende eiwitten nodig, die door middel van de type III route naar het bacteriële cel oppervlak zijn gebracht. Deze functioneren in het voelen van contact met de gastheer, het overbruggen van de ruimte tussen bacterie en gastheer cel en het stimuleren van translocatie over het cytoplasmatisch membraan van de gastheer 9. In Salmonella typhimurium heeft men een zogenoemd naald complex ontdekt, dat zowel het binnen- als het buitenmembraan overspant en erg lijkt op het basale lichaam van de flagella 9 (figuur 15). Het naald complex is een lange, holle structuur en is samengesteld uit twee duidelijk indentificeerbare domeinen: een naaldachtig gedeelte dat uit het oppervlak van de bacteriële cel steekt en een cylindrische basis die de structuur verankert aan het binnen- en buitenmembraan. Het complex bestaat uit ten minste drie eiwitten: InvG (een lid van de secretine familie) en twee lipoproteïnes, PrgH en PrgK. Hoewel informatie over de organisatie van type III secretie systemen bij andere bacteriën niet aanwezig is, geeft het hoge gehalte aan gelijkheid in sequenties tussen verscheidene structurele componenten aan dat waarschijnlijk al deze systemen een zodanige structuur kennen 9. De mechanismen van type III secretie zijn nog nauwelijks bekend. Het zou kunnen dat het type III secretie naald complex dient als een holle koker, waardoor de te secreteren eiwitten door de membranen van de bacteriële celenvelop kunnen oversteken 9. Figuur 15 9 Schematische weergave van het naald complex van het Salmonella typhimurium type III secretie systeem. Het naald complex is een lange, holle structuur en bestaat uit ten minste drie eiwitten: InvG (een lid van de secretine familie) en twee lipoproteïnes, PrgH en PrgK. De locatie van de verschilende componenten is hypothetisch. 20

21 Naast het naald complex vertonen sommige type III secretie systemen andere structuren van oppervlaktemoleculen, die waarschijnlijk functioneren in het overbrengen van de effector eiwitten in de gastheer cel 9. Deze structuren zijn samengesteld uit eiwitten die via het type III secretie systeem gesecreteerd zijn en assembleren op het oppervlak van de bacteriën wanneer er contact is met een gastheer cel 9. Net als in type I en type II secretie zijn de genen die betrokken zijn bij type III secretie geclusterd. Deze clusters worden, vanwege het pathogene karakter van de route, pathogeniciteits eilanden genoemd 10. De eiwitten die via type II gesecreteerd worden, bevatten geen signaal peptide. Het secretie signaal ligt in de 5 regio van het mrna dat codeert voor de te secreteren eiwitten 9, 10. De translatie van het eiwit stopt, totdat het 5 mrna bindt aan een component van het secretie apparaat. Hier treedt dus een koppeling op van translatie en secretie. Sommige type III gesecreteerde eiwitten kunnen echter posttranslationeel gesecreteerd worden door een alternatief secretie signaal 9. In dit alternatieve mechanisme zijn specifieke chaperones aanwezig, die de te secreteren eiwitten binden aan bepaalde domeinen binnen de eerste 100 aminozuren en deze naar het translocatie complex brengen 7. Regulatie van type III secretie vindt plaats op zowel transcriptie- als posttranslatie niveau 9. 21

22 Type IV Een van de meer recentelijk ontdekte families van transport systemen is de familie van type IV transporters, waarvan de meeste leden in eerste instantie DNA mobiliseren, ofwel van bacterie naar bacterie ofwel van bacterie naar eukaryote cellen 3. Het type IV systeem is sterk gerelateerd aan andere bacteriële conjugatie systemen 3. In de laatste jaren zijn er andere leden van deze groep ontdekt die andere functies hebben, zoals het transport van multi-subunit eiwitten over het bacteriële membraan 3. Het prototype lid van de type IV transport familie is het VirB systeem van Agrobacterium tumefaciens 3 (figuur 16). Deze exporteert een groot enkelstrengs stuk DNA, bekend als T- DNA, over de bacteriële membranen en in plantencellen, waar het T-DNA integreert in het planten genoom 3. Diverse macromoleculen kunnen worden getransporteerd via het VirB systeem, waaronder T- DNA, VirE2, een eiwit dat het T-DNA beschermt, en VirD2, een eiwit dat covalent bindt aan het 5 einde van het T-DNA. Ook VirF, een essentieel eiwit voor de infectie van bepaalde plantensoorten, wordt getransporteerd door dit complex 3. Het transportsysteem herkent waarschijnlijk de eiwit substraten, waarmee het DNA passief wordt geëxporteerd vanwege het feit dat het gebonden is aan een actief getransporteerd eiwit 3. Figuur 16 4 Locaties van de VirB componenten van het T-DNA transport systeem. De VirB en VirD4 eiwitten zijn gegroepeerd naar aanleiding van waarschijnlijke functies: eiwitten aan de buitenkant van het buitenmembraan, die aanhechting mediëren (VirB1*, VirB2 pili en VirB5), kanaaleiwitten (VirB3, VirB6, VirB7, VirB8, VirB9 en VirB10) en ATP-ases (VirB4, VirB11 en VirD4). 22

23 Het toxine transport systeem van Bordetella pertussis is een type IV systeem dat alleen eiwitten transporteert en wordt ook het Ptl systeem genoemd. Ook in andere pathogene bacteriën, zoals Heliobacter pylori en Legionella pneumophilia zijn type IV homologen ontdekt 3. Hoewel het is aangetoond dat dit systeem plasmied DNA kan transporteren van de ene bacteriële cel naar de andere, blijft het de vraag of de hoofdfunctie van dit systeem is om DNA of effector eiwitten te transporteren 3. Het lijkt onwaarschijnlijk dat het DNA het effector molecuul representeert in dit systeem. De mogelijkheid bestaat dat het systeem zich ontwikkeld heeft uit conjugale DNA transfer systemen en deze DNA transfer systemen heeft behouden, maar toch in eerste instantie functioneert om eiwitten te transporteren die de endocytische route van de eukaryote cel kan beïnvloeden 3. Het virb locus bestaat uit 11 genen 3. De VirB eiwitten bevinden zich in zowel het binnen- als het buitenmembraan en vormen een transport complex dat beide membranen overspant 3. Bepaalde componenten van het VirB systeem vomen pili. Een bewerkte vorm van VirB2 schijnt de hoofdcomponent te zijn van deze structuur 3. Er zijn indicaties dat gerelateerde transport systemen een zelfde compositie hebben als de VirB transporter 3. Over het algemeen bevatten type IV transporters twee eiwitten met nucleotide bindingsmotieven die potentiële kandidaten zijn voor de motor achter het transport proces 3. Dit zijn VirB4 en VirB11 in het VirB systeem en PtlC en PtlH in het Ptl systeem. Ook zouden deze eiwitten ertoe kunnen dienen om de opening van een kanaal via kinase activiteit door te geven, of om te werken als moleculaire chaperonnes in de assembly van de transporter of tijdens het transport proces zelf 3. Het is nog onbekend of het transport gebeurt via een eenstaps proces (door beide membranen tegelijk) of via een tweestaps proces (door het binnen- en buitenmembraan apart). Waarschijnlijk verschillen de verschillende leden van de type IV familie hierin 3. Er is gesteld dat het VirB systeem (en waarschijnlijk ook andere conjugale DNA transfer systemen) een eenstaps proces gebruiken, waarbij eiwitten en het geassocieerd DNA beide membranen tegelijk oversteken, waarschijnlijk door een kanaal gevormd door VirB eiwitten 3. In het Plt systeem wordt daarentegen het pertussis toxine waarschijnlijk gesecreteerd via een tweestaps proces. De te transporteren eiwitten hebben een eigen signaal sequentie, wat de suggestie wekt dat ze via een Sec-achtig systeem het cytoplasmatisch membraan passeren 3. 23

24 Autotransporters Autotransporters zijn eiwitten die hun eigen transport uit bacteriën regelen 7. De informatie die benodigd is voor transport over het buitenmembraan ligt geheel in het gesecreteerde eiwit 10. De groep autotransporters omvat onder andere gonococcal IgA protease en andere proteases, de vacuolating cytotoxine van Heliobacter pylori, een familie van buitenmembraan eiwiten in B. pertussis en de gesecreteerde eiwitten SepA en EspC van respectievelijk S. flexneri en EPEC 7, 10. Net als in het type II systeem worden de eiwitten door een ander systeem over het cytoplasmatisch membraan geëxporteerd, waarna de amino-terminale signaalpeptide van het eiwit wordt afgehaald 10. De autotransporters vormen waarschijnlijk een porie in het buitenmembraan, waardoor ze passeren 7, 10. Autoproteolytische klieving zorgt voor het loslaten van de eiwitten in het medium 7, 10. De groep van autotransporters wordt door sommigen het type IV secretie systeem genoemd 7,10. Hueck geeft aan de hier bij type IV genoemde translocatie mechanismen te scharen onder een type V secretie route

25 Discussie Voor het transport over het binnen- en buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën zijn diverse routes bekend. De meest voorkomende route is de Sec route door het binnenmembraan en de type II route door het buitenmembraan. Andere systemen zijn het Tat systeem (binnenmembraan), type I en type III (beide membranen), type IV (beide membranen of alleen buitenmembraan) en autotransport (buitenmembraan). Er zijn een aantal overeenkomsten in de organisatie en structuur van een aantal van deze sytemen (figuur 17). Waarschijnlijk hebben alle systemen, behalve autotransporters, aan de binnenzijde van het cytoplasmatisch membraan een ATP-bindend eiwit, dat de energie die voor het transport benodigd is kan leveren. Dit kan verklaren waarom systemen die (mede) over het buitenmembraan transporteren meer componenten hebben en complexer in elkaar zitten dan systemen die enkel over het binnenmembraan transporteren. Deze componenten dienen waarschijnlijk om de energie vanuit de binnenkant van het cytoplasmatisch membraan naar het buitenmembraan te transporteren. De vraag blijft wel waarom type I heel eenvoudig en type III zo complex kan zijn, terwijl beide sytemen over zowel binnen- als buitenmembraan transporteren. Figuur Overzicht van de transportsystemen van type I, II en III en het Sec systeem. Te zien is alle systemen gebruik maken van een ATP-bindend eiwit aan de binnenkant van het cytoplasmatisch membraan. Type I is veel eenvoudiger dan type II en III systemen. Er is een grote overeenkomst in structuur van de porievormende eiwitten van type II en III. Discussie

26 Een overeenkomst in structuur tussen type II en type III is het eiwit dat de porie vormt door het buitenmembraan, dat in beide systemen een oligomeer van 12 tot 14 subunits. Een andere overeenkomst is dat in sommige van de type II en III systemen zich een langwerpige structuur bevindt, die door het buitenmembraan kan steken. In type II systemen wordt dit een pilus genoemd, in type III systemen een naald-complex. Het is niet duidelijk of deze structuren precies dezelfde functie hebben, omdat vooral over het naaldcomplex weinig bekend is. Het Sec systeem en het type III systeem lijken op elkaar in het brengen van het te secreteren eiwit naar de membraan, waar in beide systemen een speciaal eiwit voor is. De organisatie van type IV systemen is nog dermate onbekend dat er moeilijke een vergelijking te maken is met andere systemen. De meeste door bacteriën gesecreteerde eiwitten zijn toxines (tabel 1). Over het algemeen zijn de secretieroutes dus bedoeld om de gastheercel aan te vallen en/of de eigen cel te verdedigen. Tat substraten hebben een andere functie. Het zijn of redox cofactoren, bestemd als componenten van ademhalingsketens, of het zijn eiwitten die gesecreteerd worden wanneer de bacteriën zich aan moeten passen aan een omgeving met hoge osmolariteit. Verder worden ook eiwitten die werkzaam zijn in het periplasma en membraaneiwitten getransporteerd door verschillende secretieroutes. Type IV transporteert naast eiwitten ook DNA. Van alle systemen transporteren is alleen van het Tat systeem en type II systeem bekend dat zij de eiwitten in hun volledig gevouwen vorm door de membranen transporteren. Tabel 1. Substraten van de verschillende transportroutes. Transportroute SRP Sec Tat Type I Type II Type III Type IV Autotransporters Substraat Membraaneiwitten? Diverse eiwitten Gevouwen (redox)eiwitten Toxines, proteases, lipases Gevouwen enzymen en toxines Pathogene eiwitten T-DNA, toxines O.a. proteases 26 Discussie

27 Bepaalde domeinen in de te secreteren eiwitten zijn bepalend voor welke route zal worden genomen. De locatie van deze domeinen verschilt per systeem. In de SRP- en Tat route is het signaal peptide van belang bij het nemen van deze routes. Voor de Sec route zijn juist domeinen in het mature domein essentieel bij het kiezen voor deze route, pas in een later stadium in de route heeft de signaalpeptide een functie. De verschillen in de domeinen en signaalpeptides liggen in het karakter ervan, zoals hydrofobiciteit, lading, etc., en in de specifieke sequentie, bijvoorbeeld het twin-arginine motief van het Tat systeem (tabel 2). De type I-IV transport systemen maken allemaal geen gebruik van signaal peptides. Type I heeft wel een C-terminaal domein dat zorgt voor herkenning van de eiwitten door het systeem. Type III substraten worden herkend aan het 5 mrna gedurende de translatie. Van type II is enkel bekend dat de substraten gevouwen moeten zijn voor ze getransporteerd worden en van type IV is niets bekend over substraatherkenning. Over de mechanismen van de in dit review besproken systemen is nog nauwelijks informatie. Alleen over de werking van het Sec systeem is veel bekend. Voor de komende jaren ligt er dus een uitdaging in het bepalen van de functies van de verschillende componenten van de overige systemen, de onderlinge interacties van deze componenten, de herkenning van de substraten en de mechanismen waardoor de substraten uiteindelijk door de membranen worden getransporteerd. Tabel 2. 6 Karakter van signaal sequentie en mature domein voor verschillende transportroutes. Transportroute Signaal sequentie Mature domein SRP Hydrofobisch Membraaneiwitten? SecB Willekeurig SecB-bindend domein Tat RRXFXK motief Gevouwen (redox)eiwitten Discussie 27

28 Referenties 1. Binet, R., Létoffé, S., Ghigo, J.M., Delepelaire, P., Wandersman, C Protein secretion by Gram-negative bacterial ABC exporters a review. Gene. 192: Bolhuis, A., Mathers, J.E., Thomas, J.D., Barrett, C.M.L., Robinson, C TatB and TatC form a functional and structural unit of the twin-arginine translocase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 276: Burns, D.L Biochemistry of type IV secretion. Curr. Opin. Microbiol. 2: Christie, P.J., Vogel, J.P Bacterial type IV secretion: conjugation systems adapted to deliver effector molecules to host cells. Trends Microbiol. 8: Cornelis, G.R., Van Gijsegem, F Assembly and function of type III secretory systems. Ann. Rev. Microbiol. 54: Fekkes, P., Driessen, A.J.M Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane. Mircrobiol. Mol. Biol. Rev. 63: Finlay, B.B., Falkow, S Common themes in microbial pathogenicity revisited. Mircrobiol. Mol. Biol. Rev. 61: Francetic, O., Belin, D., Badaut, C., Pugsley, A.P Expression of the endogenous type II secretion pathway in Escherichia coli leads to chitinase secretion. EMBO J. 19: Galán, J.E., Collmer, A Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284: Hueck, C.J Type III protein secretion systems in bacterial pahtogens of animals and plants. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: Jongbloed, J.D.H., Martin, U., Antelmann, H., Hecker, M., Tjalsma, H., Venema, G., Bron, S., van Dijl, J.M., Müller, J TatC is a specificity determinant for protein secretion via the twin-arginine translocation pathway. J. Biol. Chem. 275: Manting, E.H., Driessen, A.J.M Escherichia coli translocase: the unraveling of a molecular machine. Mol. Microbiol. 37: Pugsley, A.P., Bayan, N., Sauvonnet, N Disulfide bond formation in secreton component PulK provides explanation for the role of DsbA in pullulanase secretion. J. Bacteriol. 183: Robinson, C., Bolhuis, A Protein targeting by the twin-arginine translocation pathway. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2: Referenties

29 15. Sandkwist, M Biology of type II secretion. Mol. Microbiol. 40: Stanley, N.R., Palmer, T., Berks, B.C The twin arginine consensus motif of Tat signal peptides is involved in Sec-independent protein targeting in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 275: Voulhoux, R., Ball, G., Ize, B., Vasil, M.L., Lazdunski, A., Wu, L.F., Filloux, A Involvement of the twin-arginine translocation system in protein secretion via the type II pathway. EMBO J. 20: Referenties 29