Methode ontwikkeling voor de gelijktijdige analyse van zure, neutrale en zwak basische pesticiden in oppervlaktewater met SAMOS-HPLC-DAD

Transcriptie

1 Rij kswaterstaat Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling/RIZA Methode ontwikkeling voor de gelijktijdige analyse van zure, neutrale en zwak basische pesticiden in oppervlaktewater met SAMOS-HPLC-DAD Onderzoek naar de toepasbaarheid van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie Werkdocument x Afstudeerverslag voor de opleiding HLO-chemisch, uitgevoerd bij het Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling/RIZA, te Lelystad, afdeling IMLO. Sanne Palstra Noordelijke Hogeschool Leeuwarden

2 Methode ontwikkeling voor de gelijktijdige analyse van zure, neutrale en zwak basische pesticiden in oppervlaktewater met SAMOS-HPLC-DAD Onderzoek naar de toepasbaarheid van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie Werkdocument x Naam Opleiding Begeleiding Sanne Palstra HLO-chemisch, Noordelijke Hogeschool Leeuwarden Dhr. J. Veerman Afstudeerbedrijf Afdeling Begeleiding Periode Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling/RIZA, te Lelystad Informatie en Meettechnologie, Laboratorium voor Organische analyse, IMLO Dhr. R.B. Geerdink februari 1998-juni 1998 N.B.: De inhoud van dit werkdocument hoeft niet noodzakelijkerwijs in overeenstemming te zijn met de visie van het Ministerie van Verkeer en Waterstaat

3 Samenvatting In dit onderzoek is onderzocht of het mogelijk is om met behulp van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie zure, neutrale en zwak basische pesticiden geiijktijdig bij neutrale phwaarde te analyseren in oppervlaktewater. Tevens is onderzocht of de invloed van matrix, in de vorm van DOC (dissolved organic carbon), op de analyses kon worden teruggebracht. De analyses zijn uitgevoerd op een on-line SPE HPLC-DAD systeem. Met soortgelijke systemen, ook wel SAMOS genoemd, wordt in de meetstations langs de Rijn en de Maas de kwaliteit van het rivierwater gecontroleerd. Er zijn in totaal 27 verschillende pesticiden, chloorfenoxycarbonzuren, dinitrofenolen, triazinen en fenylureumherbiciden, geanalyseerd in standaardoplossingen en in oppervlaktewatermonsters waaraan additie heeft plaatsgevonden. De extractie en scheiding van de pesticiden vond plaats met respectievelijk een PLRP-S prekolom en een Ci8 analytische kolom. Er is gradientelutie toegepast. De uitvoering van de eerste serie experimenten had als doel meetomstandigheden te vinden waarmee het mogelijk is om de verschillende pesticiden, verdeeld over drie standaardoplossingen, te kunnen scheiden op de analytische kolom met behulp van ionpaar chromatografie. Als ionpaar vormer is TBAHS0 4 gebruikt, dat in staat is om bij neutrale phwaarde voor retentie van gedissocieerde zure pesticiden te zorgen. De ph-waarde en de concentratie TBAHS0 4 van de waterfractie in het eluens zijn gevarieerd. Door het toepassen van ionpaar chromatografie en een eluens bestaande uit HPLC water (ph 6.4 en TBAHS mmol/l) en acetonitril, bleek het mogelijk om zowel neutraal/zwak basische fenylureumherbiciden en triazinen als zure chloorfenoxycarbonzuren, bentazon en dinitrofenolen in afzonderlijke standaardoplossingen, te scheiden op een Cl8 analytische kolom. Het doel van de tweede serie experimenten was meetomstandigheden te vinden, waarmee het mogelijk is om alle 27 pesticiden uit standaardoplossing en oppervlaktewatermonster te extraheren, te elueren, te scheiden en te detecteren. De concentratie ionpaar vormer, TBAHS0 4, in het monster en de elutietijd zijn gevarieerd. Door toepassing van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie, bij een monstersamenstelling ph 6.5 en TBAHS mmol/l, een elutietijd van 40 minuten en eluens met ph 6.4 en TBAHS mmol/l, bleek het mogelijk zowel neutrale en zwak basische als zure pesticiden te analyseren. Door het ontbreken van een goede scheiding tussen de fenylureumherbiciden en de chloorfenoxycarbonzuren, bleek het niet mogelijk om alle pesticiden betrouwbaar te identificeren en te kwantificeren, mede omdat een bruikbare spectrumbibiliotheek ontbrak. Daarnaast bleek de reproduceerbaarheid van de meetresultaten erg slecht te zijn. Het doel van de derde serie experimenten was de invloed van de matrix op de analyse te verminderen. Dit is gedaan door het varieren van de samenstelling van de wasstappen van de pre-kolom, voor en na de extractie van het monster. Met de uitgevoerde experimenten is het niet gelukt de matrix invloed te verminderen. Met name de reproduceerbaarheid bleek een probleem. Geconcludeerd kan worden dat de gelijktijdige analyse van zure, neutrale en zwak basische pesticiden in oppervlaktewater met behulp van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie niet tot een goed eindresultaat heeft geleid, door het ontbreken van betrouwbare kwantificatie en door een slechte reproduceerbaarheid van de meetresultaten.

4 Inhoudsopgave Samenvatting 1 Inleiding RIZA Algemeen Probleemstelling Doelstelling 4 2 Theorie Analysesysteem Ionpaar chromatografie 6 3 Literatuuronderzoek 10 4 Experimenteel Onderzochte verbindingen Chemicalien Oplossingen Mobiele fase Spoel- en wasvloeistoffen Standaardoplossingen en oppervlaktewatermonsters Apparatuur en hulpmiddelen Meetomstandigheden 15 5 Resultaten en discussie Optimaliseren scheidingscondities Optimaliseren de extractie en scheiding Minimaliseren van de matrix invloed Reproduceerbaarheid van de meetresultaten 26 6 Conclusies 29 7 Aanbevelingen 30 8 Literatuur Literatuurverwijzingen Geraadpleegde literatuur 32 9 Bijlagen 33

5 1 Inleiding 1.1 RIZA Het Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling/RIZA is een specialistische dienst van het Directoriaat-Generaal Rijkswaterstaat van het Ministerie van Verkeer en Waterstaat. Het is een onderzoeks- en adviesinstituut op het gebied van de Nederlandse zoete wateren en een nationaal kenniscentrum voor integraal waterbeheer. Het RIZA bestaat uit vier hoofdafdelingen: Informatie en Meettechnologie, Watersystemen, Emissies, en Inrichting en Herstel [1]. De afstudeeropdracht is uitgevoerd bij de afdeling IMLO, het Laboratorium voor Organische analyse in Lelystad, dat onder de hoofdafdeling Informatie en Meettechnologie valt. De hoofdafdeling Informatie en Meettechnologie is verantwoordelijk voor het inwinnen en opslaan van gegevens over het Nederlandse binnenwater en het verwerken van deze gegevens tot inform;.c. De laboratoria analyseren zoet water, sediment en afvalwater. Daarnaast houdt men zich ook bezig met de ontwikkeling van methoden voor de chemische, fysische en biologische analyse ervan. Het laboratorium levert tevens een bijdrage aan de nationale en internationale afstemming van analysemethoden en aan de ontwikkeling van kwaliteitsnormen. De RIZA-laboratoria hebben in 1995 een STERLAB-erkenning gekregen. In het IMLO-laboratorium worden verschillende groepen bestrijdingsmiddelen uiteenlopend van PCB's en OCB's tot PAK's, FUH's en CFCZ's in zoet water, sediment en afvalwater geanalyseerd [1]. 1.2 Algemeen In de landbouw worden veel bestrijdingsmiddelen gebruikt die, deels afgebroken, uiteindelijk in oppervlakte- en grondwater terechtkomen. Ze bedreigen hierdoor niet alleen de kwaliteit van het leefmilieu van veel organismen, maar zeker ook het drinkwater voor de mens. Vanwege de schadelijke effecten van veel pesticiden heeft de Europese Gemeenschap normen opgesteld voor de aanwezigheid ervan in water. Het maximale niveau van een afzonderlijk pesticide in water is 0.1 ug/l en de totale hoeveelheid pesticiden mag maximaal 0.5 ug/l zijn [2]. Het is dan ook nodig dat er analysemethoden bestaan, die in staat zijn deze lage concentraties betrouwbaar te kunnen meten (bepalingsgrens < 0.1 ig/l) en in staat zijn in korte tijd veel verschillende componenten te analyseren. Een taak van het RIZA is het bewaken van de wt.;erkwaliteit. Met behulp van een meetnet wordt de kwaliteit van het Rijn- en Maaswater continue en volautomatisch bewaakt. Dit gebeurt in meetstations bij Lobith en Eijsden, de punten waar het rivierwater Nederland binnenstroomt. Er worden allerlei verschillende componenten geanalyseerd met meetsystemen die zijn aangesloten op een systeem voor automatische inwinning, verwerking en presentatie van de gegevens. Dit systeem wordt AQUALARM genoemd. Wanneer meetgegevens (bijv. de piekhoogte van een bestrijdingsmiddel in een chromatogram) bepaalde waarden over- of onderschrijden, geeft dit systeem een alarm bij de waterbeheerder. Op grond van zo'n alarm kan de rivierwaterwinning voor de drinkwaterbereiding stilgelegd worden. In de laboratoria in Lelystad wordt na een alarm, het verontreinigde rivierwater geanalyseerd om te achterhalen om welke component het ging en in welke hoeveelheid deze in het rivierwater aanwezig was. l

6 In 1993 is AQUALARM uitgebreid met een systeem waarmee zeer polaire pesticiden in rivierwater kunnen worden gemeten. Deze pesticiden zijn over het algemeen in lage concentraties aanwezig en zijn, vanwege de goede oplosbaarheid in water, met de bestaande meetsystemen moeilijk te meten. Het RIZA heeft in samenwerking met de Vrije Universiteit Amsterdam SAMOS ontwikkeld. Met dit systeem is het mogelijk polaire pesticiden te analyseren. SAMOS staat voor 'System for the Automated Monitoring of Organic pollutants in Surfacewater' en is ontwikkeld voor het snel, selectief en met hoge gevoeligheid kunnen analyseren van pesticiden en hun afbraakproducten in oppervlakte- en drinkwater in het lage- en sub-ug/l niveau (sporenanalyse). Het is een volledig on-line systeem waarin de monstervoorbewerking (preconcentratie, clean-up) en de scheiding en detectie van de te bepalen componenten in een analyse-opstelling plaatsvindt [3]. Met het SAMOS-LC meetsysteem worden polaire pesticiden met on-line Solid-Phase Extractie (SPE) uit het water geextraheerd. Na elutie, worden de componenten gescheiden op een reversed phase analytische kolom en vervolgens gedetecteerd met een DAD UV detector [3]. Het RIZA heeft twee SAMOS meetsystemen; in Eijsden langs de Maas en in Lobith langs de Rijn. De meetsystemen blijken vooral geschikt te zijn voor de analyse van neutrale en zwak basische pesticiden. 1.3 Probleemstelling Bij de huidige SAMOS meetsystemen wordt het oppervlaktewater bij neutrale ph-waarde geextraheerd. Bij deze ph-waarde zijn de zure pesticiden (bijv. de chloorfenoxycarbonzuren en dinitrofenolen ) door hun lage pka-waarde grotendeels gedissocieerd. De componenten voelen zich in deze ionogene toestand meer aangetrokken tot de polaire waterfase, dan tot het apolaire adsorbensmateriaal van de extractiekolom. Hierdoor zijn ze, in tegenstelling tot de nauwelijks geioniseerde zwak basische componenten, moeilijk te extraheren. Het probleem is, dat bij welke ph-waarde men ook werkt er altijd geioniseerde en dus lastig te extraheren pesticiden zullen zijn. Bij zure ph zijn er geprotoneerde basische stoffen en bij neutrale ph gedissocieerde zure stoffen. Het Laboratorium voor Organische Analyse in Lelystad analyseert oppervlakte- en afvalwatermonsters op de aanwezigheid van zowel de zure chloorfenoxycarbonzuren en bentazon als de neutraal, zwak basische fenylureumherbiciden en triazinen m.b.v. reversed phase SPE en HPLC. De zure pesticiden worden echter, o.a. door de uiteenlopende pka-waarden, met een andere analysemethode geanalyseerd dan de neutrale en zwak basische pesticiden. Dat zure, neutrale en zwak basische pesticiden nog niet geiijktijdig geanalyseerd worden, komt niet alleen door de uiteenlopende pka-waarden van de pesticiden. De aanwezigheid van DOC (Dissolved Organic Carbon), met name de polaire humus- en fulvinezuren, heeft een grote invloed op de analyse van zeer polaire pesticiden. In het algemeen komt DOC in oppervlaktewater voor op het mg/l niveau terwijl pesticiden op het ng-ug/l niveau voorkomen. Bij analyse van een monster m.b.v. SPE-HPLC-DAD zorgt de polaire matrix, o.a. afhankelijk van de ph-waarde, voor een grote bult in het begin of het midden van het chromatogram [2,4, 5, 6, 7]. De zeer polaire pesticiden die ook in het begin van het chromatogram elueren, vallen deels weg in deze achtergrond, wat betrouwbare identificatie en kwantificatie onmogelijk maakt.

7 Nu is het zo, dat wanneer monsters bij neutrale ph-waarde worden geextraheerd, zoals bij de SAMOS meetsystemen en de huidige fenylureumherbiciden bepaling in het RIZA laboratorium gebeurt, humus- en fulvinezuren minder goed worden geextraheerd dan bij zure ph. Dit komt enerzijds doordat deze matrix, door de lage pka-waarde, gedissocieerd is. Anderzijds vertonen lange humuszuurmolekulen afhankelijk van de ph-waarde een andere configuratie, wat er voor zorgt dat de zure groepen van deze matrix-molekulen, gemakkelijker bij zure en minder makkelijk bij neutrale ph-waarde een interactie met het adsorbensmateriaal van de extractiekolom aan kunnen gaan [8]. Helaas worden de zure pesticiden, zoals reeds beschreven, bij neutrale ph-waarde ook slecht geextraheerd. Bij lage ph-waarde zijn de zure pesticiden nauwelijks tot niet gedissocieerd en zijn ze evenals de neutrale pesticiden goed te extraheren. De zwak basische pesticiden zijn deels geprotoneerd en zullen hierdoor minder makkelijk geextraheerd kunnen worden. Het probleem bij het werken bij lage ph-waarde, is dat matrix ook wordt geextraheerd en vervolgens moeilijk van de te bepalen componenten te scheiden is, doordat de humus- en fulvinezuren grote overeenkomsten, o.a. in de lage pka-waarde en de molekuulstruktuur, met de zure pesticiden vertonen. Bij de huidige bepaling van de chloorfenoxycarbonzuren werkt men bij lage ph-waarde, maar heeft men een zogenaamde 'clean-up' stap ingevoerd, waarmee de zure matrix na de extractie, door het toevoegen van sterk loog deels van de SPE-cartridge worden gewassen [4]. Onbekend is welke invloed deze wasstap op de, bij deze ph-waarde toch al moeilijk te extraheren, zwak basische componenten heeft. Samenvattend kan worden gesteld, dat het met het huidige SAMOS-systeem in de meetstations niet mogelijk is om zure polaire pesticiden te meten. Ook in het laboratorium in Lelystad is er nog geen analysemethode waarmee zowel neutrale, zwak basische als zure polaire pesticiden in een bepaling, d.w.z. geiijktijdig, en m.b.v. HPLC-DAD geanalyseerd kunnen worden. Wat betreft de screening van polaire pesticiden in rivierwater is het, met het oog op de giftigheid van bepaalde componenten, zeer wenselijk dat naast neutrale en zwak basische ook zure componenten geanalyseerd kunnen worden. Wat betreft de laboratoriumsituatie, zou het efficienter (en waarschijnlijk ook economischer) zijn, wanneer de verschillende componenten met een methode geanalyseerd zouden kunnen worden. Het ontwikkelen van zo'n methode vereist dat er aandacht wordt geschonken aan twee belangrijke factoren: de ph-waarde van monster en eluens, en de matrix.

8 1.4 Doelstelling De afstudeeropdracht is gericht op de gelijktijdige analyse van zure, neutrale en zwak basische pesticiden in oppervlaktewater met SAMOS-HPLC-DAD. Er wordt onderzocht of het mogelijk is om bij neutrale ph-waarde zowel zure als neutrale en zwak basische pesticiden te analyseren. Het werken bij neutrale ph-waarde heeft als voordeel dat de neutrale pesticiden niet en de zwak basische pesticiden nauwelijks gei'oniseerd zijn en dat er veel minder matrixproblemen te verwachten zijn dan bij lage ph-waarde. Er wordt geprobeerd de zure pesticiden, die bij neutrale ph-waarde gedissocieerd, te extraheren en te scheiden door gebruik te maken van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie. Door het varieren van de samenstelling van wasstappen, wordt getracht de matrixinvloed (verder) te verminderen. De doelstelling van het onderzoek is: Het ontwikkelen van een methode waarmee chloorfenoxycarbonzuren, bentazon, dinitrofenolen, fenylureumherbiciden en triazinen geiijktijdig kunnen worden geanalyseerd in oppervlaktewatermonsters. Getracht wordt dit te bereiken door: Verrichten van literatuuronderzoek. Optimaliseren van de scheidingscondities van standaardoplossingen door het toepassen van ionpaar chromatografie en variatie van de ph-waarde van het eluens. De standaardoplossingen worden hierbij met behulp van een loop-injectie op de analytische kolom gebracht. Optimaliseren van de extractie van de verschillende pesticiden uit zowel (meng)standaardoplossingen als oppervlakterwatermonsters, door het toepassen van ionpaar extractie. Minimaliseren van de matrix invloed door het varieren van de samenstelling van de wasstappen zowel voor als na de extractie. Het aantal te optimaliseren parameters beperkt te houden en voor iedere parameter circa twee meetcondities te onderzoeken 1. ' Dit is gedaan vanwege de geringe tijd die er voor het uitvoeren van het onderzoek was. Optimaliseren is dan ook een groot woord, voor de weinige experimenten die er worden gedaan.

9 2 Theorie 2.1 Analysesy steem De analysemethode wordt ontwikkeld op een on-line SPE-HPLC-DAD meetsysteem. Ditzelfde systeem wordt op dit moment in het RIZA laboratorium gebruikt voor de analyse van de fenylureumherbiciden en triazinen. controller y-rzr-...-!... a*. pomp a pompt j! a i Lfijj prospekt II ; 4 SDU A DAD» workstation Fig 1. On-line SPE HPLC DAD systeem 1. pre-kolom 2. schakelkranen 3.'guard' kolom 4. analytische kolom in kolom-thermostaat 5. monsteraanvoerslang a. afvalvat De analyse kan worden onderverdeeld in drie onderdelen: extractie, elutie en scheiding, en detectie. Extractie De extractie is bedoeld als concentreringsstap van de pesticiden in het te analyseren monster. De componenten worden met behulp van Solid Phase Extractie (SPE) op een PLRP-S prekolom geconcentreerd. Er wordt reversed phase extractie toegepast: de componenten adsorberen vanuit het polaire water, aan het vrij apolaire adsorbensmateriaal polystyreen divinylbenzeen co-polymeer. De verwisselbare pre-kolom bevindt zich in een houder in de PROSPEKT (PROgrammable on-line Solid-Phase E(K)xtraction Techniques) en is bij de extractie met capillairen en via schakelkranen verbonden met de 'Solvent Delivery Unit' (SDU) en het afvalvat. Met de SDU worden spoelvloeistoffen en monsters door de pre-kolom gepompt. Elutie en scheiding Na extractie van een monster, eventueel nog gevolgd door een wasstap, worden de geextraheerde componenten met behulp van gradientelutie van de pre-kolom geelueerd. De pre-kolom is hierbij via de schakelkraan verbonden met de HPLC-pomp en de analytische kolom. Omdat het eluens vanuit de HPLC pomp via de pre-kolom naar de analytische kolom gaat, kunnen de elutie en scheiding van de componenten met behulp van hetzelfde eluens plaatsvinden. Bij de scheiding m.b.v. de analytische kolom, wordt reversed phase chromatografie toegepast: de componenten worden van elkaar gescheiden door gebruik te maken van een polaire mobiele en een apolaire stationaire fase.

10 Bij gradientelutie wordt de samenstelling van het eluens gedurende de elutie veranderd. In het onderzoek dat is uitgevoerd, is de fractie organisch oplosmiddel in het eluens lineair verhoogd van 10 naar 90 % t.o.v. van de waterige fase. De aan de pre-kolom geadsorbeerde componenten elueren wanneer zij een grotere affiniteit voor het eluens voelen dan voor het adsorbensmateriaal van de pre-kolom. Dit is per pesticide verschillend, waardoor het ene pesticide al bij een eluenssamenstelling met 10 % organisch oplosmiddel van de pre-kolom elueert en een ander pesticide pas wanneer het eluens voor 90 % uit organisch oplosmiddel bestaat. Wanneer een component van de pre-kolom is geelueerd komt het op de analytische kolom. Hier ondervindt het, afhankelijk van de samenstelling van het eluens, retentie door een interaktie aan te gaan met het apolaire adsorbensmateriaal van de analytische kolom. De kolompakking van de analytische kolom bestaat uit octadecyl gemodificeerde silicagel. De meest polaire pesticiden ondervinden weinig retentie op de analytische kolom, zij voelen meer affiniteit voor het polaire eluens. Minder polaire pesticiden ondervinden meer retentie. Ze gaan makkelijker een interaktie aan met het apolaire adsorbensmateriaal en voelen pas meer affiniteit voor het eluens, wanneer daarin de fractie organisch oplosmiddel ('modifier') is toegenomen. Door het verschil in affiniteit die de verschillende pesticiden voor het eluens en het adsorbensmateriaal voelen, kan men de pesticiden van elkaar scheiden. Detectie De componenten worden gedetecteerd met een photodiode array detector (DAD). Hiermee wordt gedurende bijvoorbeeld 50 minuten, iedere 10 milliseconden een spectrum opgenomen van de vloeistof (het eluens met monstercomponenten) die vanuit de analytische kolom door de DAD gaat. Het spectrum geeft per golflengte de mate van absorptie door de vloeistof (-componenten) weer. Op deze wijze kan er een spectrale bibliotheek worden samengesteld van stoffen waartegen toekomstige analyses worden vergeleken. Nadat alle spectra zijn opgenomen kan voor iedere golflengte een chromatogram worden weergegeven. Hierin is de intensiteit, de mate waarin de betreffende golflengte is geabsorbeerd door de vloeistof, weergegeven tegen de tijd dat de spectra zijn opgenomen (50 min.). Ieder pesticide heeft een specifieke retentietijd en een specifiek spectrum. Hiermee is het pesticide in het chromatogram bij de golflengte waarbij het de grootste intensiteit vertoont te identificeren en te kwantificeren. De intensiteit van de piek is een maat voor de concentratie van dat pesticide in het monster. De dataverwerking vindt plaats met behulp van een speciaal computerprogramma dat ook wordt gebruikt om de DAD in te stellen en aan te sturen. 2.2 Ionpaar chromatografie Wanneer men bij neutrale ph- waarde een monster gaat extraheren of elueren, zoals in dit onderzoek wordt gedaan, dan zullen de gedissocieerde zure componenten nauwelijks tot geen retentie ondervinden op de apolaire pre-kolom of analytische kolom. Om er voor te zorgen dat deze componenten wel uit het watermonster geextraheerd kunnen worden en vervolgens gescheiden op de analytische kolom, kan men een ionpaar vormer aan het monster (voor ionpaar extractie) en aan het eluens (voor ionpaar chromatografie) toevoegen.

11 Ionpaar chromatografie (ionpaar extractie hier ook bij gerekend) berust op het feit dat een toegevoegde verbinding, de ionpaarvormer, zowel affiniteit heeft voor het apolaire adsorbensmateriaal van de kolom, als voor een gei'oniseerd deeltje en hierdoor voor retentie van dit deeltje kan zorgen. In het geval van de zure, bij neutrale ph gedissocieerde, pesticiden zijn tetraalkylammoniumzouten, bijv. tetrabutylammoniumwaterstofsulfaat (TBAHS0 4 ), geschikte ionpaar vormers. Het tetrabutylammoniumion, (CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 ) 4 N*, heeft enerzijds een sterke positieve lading waarmee het een interaktie met de negatief geladen pesticiden kan aangaan en anderzijds hydrofobe, apolaire, koolstofketens waamee een interaktie met de stationaire fase kan worden aangegaan [9]. Er zijn diverse theoretische modellen, zoals het 'ionpaar model' en het 'dynamic exchange model', ontwikkeld waarmee wordt geprobeerd de retentie van componenten bij ionpaar chromatografie (ionpaar extractie hier ook bij gerekend) te beschrijven. Het 'electrostatic model' is het meest veelzijdige model dat de voorkeur geniet boven de andere twee modellen. Hoewel er voor het electrostatische model goede experimentele ondersteuning van de theorie is, is het model wiskundig gezien complex en is het erg abstract [9]. Bij het electrostatische model wordt uitgegaan van de vorming van een oppervlaktepotentiaal tussen de mobiele fase en de stationaire fase, doordat (in het geval van TBAHS0 4 ) TBA" geadsorbeerd wordt door de stationaire fase en HS0 4 ' niet. Om electrische neutraliteit te behouden vormt zich een electrische dubbellaag ('electrical double layer') en een verschil in electrische potentiaal tussen de mobiele fase en de oppervlakte van de stationaire fase. mobiele fase HS0 4 -: -> grensvlak met electrische dubbellaag tussen mobiele fase en stationaire fase, Fig. 2: Interactie anion uit mobiele fase met geadsorbeerd kation (ionpaarvormer), vorming electrische dubbellaag en oppervlaktepotentiaal tussen mobiele en stationaire fase.

12 Er vindt een uitwisseling plaats van de negatief geladen componenten uit het eluens met de HS0 4 " ionen, waardoor eerstgenoemden een interaktie met de TBA + aan kunnen gaan en hierdoor retentie op de kolom ondervinden. mobiele fase OOCCH 2 -a(c 6 H 3 CH 3 Cl) HS0 4 - : A C18H37 Fig. 3: Uitwisseling negatief geladen pesticide (MCPA) met HS0 4 ' ion. Wanneer de concentratie ionpaar vormer wordt gevarieerd, treedt er o.i.v. verandering in de oppervlaktepotentiaal, een verandering op in de retentie die de ionogene componenten ondervinden. Dit komt doordat de mate waarin de component een interactie met de geadsorbeerde ionpaar vormer kan aangaan veranderd bij verandering van de oppervlaktepotentiaal. De retentiefactor k', van een ionogene component met lading z, kan volgens het electrostatische model worden beschreven met de volgende formule: k' = k'o exp(-z F u/o / R T) Hierbij is u/o het verschil in electrostatische potentiaal tussen de oppervlakte van de stationaire fase en de mobiele fase, k'o de retentiefactor van de component bij mobiele fase zonder ionpaar vormer, waarvoor de oppervlaktepotentiaal gelijk is gesteld aan nul en F is de Faraday constante. De waarde van u/o hangt hoofdzakelijk af van de concentratie ionpaar vormer op de oppervlakte van de stationaire fase en van de ion-sterkte en dielectrische constante van de mobiele fase. Het is een wiskundig gezien lastig te benaderen begrip. Retentie en selectiviteit worden bij reversed phase ionpaar chromatografie, bei'nvloed door een groot aantal experimented variabelen, waaronder de lading en hydrofobiciteit van het tegenion (dat voor retentie van componenten moet zorgen) concentratie ionpaar vormer in de mobiele fase soort en concentratie buffer ph-waarde ion-sterkte concentratie organische 'modifier' temperatuur adsorptie eigenschappen van de stationaire fase

13 Bij het toepassen van ionpaar chromatografie in de praktijk, is de juiste keuze van de ionpaar vormer een eerste vereiste. De ionpaar vormer zal een tegengestelde lading moeten dragen t.o.v. de ionen waarmee het een interaktie aan moet gaan. Daarnaast speelt bij de keuze ook de oplosbaarheid van de ionpaar vormer en eventuele bufferzouten, in het bij gradientelutie van samenstelling veranderende eluens, mee. Verder is het belangrijk dat de ionpaar vormer een minimale absorptie vertoont bij de golflengtes waarbij de te bepalen componenten worden gemeten met de DAD. Wanneer een geschikte ionpaar vormer is gekozen zijn de belangrijkste experimentele variabelen de concentratie ionpaar vormer, de concentratie organische modifier en de phwaarde van de mobiele fase. N.B.: Bovenstaande theorie is (soms letterlijk vertaald), overgenomen uit literatuurbron 9.

14 3 Literatuuronderzoek Het verrichten van literatuuronderzoek had als doel inzicht te krijgen op de bepaling van zure, neutrale en zwak basische pesticiden met behulp van SPE-HPLC-DAD en de problemen die zich daarbij voordoen. Er zijn publicaties, werkdocumenten en theorieboeken bestudeerd waarin onderwerpen als (ionpaar) chromatografie, de analyse van zure, neutrale en zwak basische pesticiden in water, HPLC-DAD, SAMOS, SPE, en/of humuszuren worden behandeld. Onderzocht is of er analysemethoden beschreven zijn, waarmee het mogelijk is geiijktijdig zure, neutrale en zwak basische pesticiden in oppervlaktewater te analyseren m.b.v. SPE- HPLC-DAD. In enkele publicaties [6, 8, 10 t/m 13] worden experimenten beschreven, waarin zowel zure als neutrale en zwak basische pesticiden zijn geanalyseerd. Alleen in publicatie 6 is on-line SPE toegepast. In publicatie 10 is voor de detectie een 'particle beam interface'gekoppeld aan een quadrupole massaspectrometer gebruikt i.p.v. een UV/DAD. In de experimenten die in publicatie 12 staan beschreven, zijn de zure, neutrale en zwak basische pesticiden geiijktijdig geanalyseerd, maar is er niet geexperimenteerd met oppervlaktewater. Hierdoor is niet bekend hoe groot de invloed van DOC uit oppervlaktewater op de analyseresultaten is. In publicatie 8 zijn zowel zure, als neutrale en zwak basische pesticiden geanalyseerd bij neutrale ph-waarde van het monster. De recovery van zure, bij neutrale ph gedissocieerde, pesticiden in drinkwater, is na extractie met behulp van een SDB-1 extractiekolom erg goed (> 78%) in vergelijking met een C18-kolom. De resultaten tonen aan dat door het gebruik van geschikt adsorbensmateriaal het mogelijk is om naast de neutrale en zwak basische pesticiden ook de zure pesticiden bij neutrale ph-waarde te extraheren. Ook bij oppervlaktewatermonster was het mogelijk om, ondanks de aanwezigheid van veel interferenties, bij extractie van 500 ml monster met neutrale ph-waarde, nog zure pesticiden te analyseren. In andere publicaties [6, 10, 11, 13] zijn de zure componenten apart van de neutrale en zwak basische componenten geextraheerd en gescheiden, dan wel op een SPE-kolom geextraheerd en vervolgens apart geelueerd en gescheiden. In verschillende publicaties wordt geschreven over de invloed van matrix op de analyseresultaten [2,4 t/m 8]. Experimenten waarbij de ph-waarde van het monster is gevarieerd [2, 7, 8], tonen aan dat verhoging van de ph-waarde leidt tot een verlaging van de matrixintensiteit in de chromatogrammen, terwijl er bij de te bepalen neutrale en basische pesticiden nauwelijks verschil in intensiteit waarneembaar is. Dat de ph-waarde van het eluens ook effect heeft op de wijze waarop de matrix wordt gechromatografeerd, wordt in publicatie 2 aangetoond. De matrix verschuift, bij hogere ph, naar voren in het chromatogram, gedraagt zich meer polair, en is in hoeveelheid afgenomen. Hierdoor interfereert de matrix minder met de te bepalen componenten dan bij lage phwaarde het geval was. Hoewel er is gepubliceerd over de mogelijkheden die er zijn om gedissocieerde of geprotoneerde pesticiden te extraheren en te elueren, zal men er rekening mee moeten houden dat deze componenten vanwege hun sterk polaire struktuur snel doorbreken. Geioniseerde pesticiden ondervinden minder retentie op de extractie- en scheidingskolom [14] dan ongeladen componenten. 10

15 Door het toepassen van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie [5, 9, 14] kan men er voor zorgen dat geioniseerde pesticiden kunnen worden geextraheerd en geelueerd. In publicatie 5 zijn zure pesticiden bij neutrale ph-waarde geextraheerd en geelueerd. De resultaten tonen echter wel aan dat ook matrix wordt geanalyseerd, wat de bepaling van enkele componenten verstoord. Uit de verschillende publicaties werd duidelijk, dat de ontwikkeling van een methode voor de gelijktijdige analyse van zure, neutrale en zwak basische pesticiden in oppervlaktewater niet eenvoudig is. Dit is niet eens zo zeer meer te wijten aan de aanwezigheid van geioniseerde pesticiden (omdat er adsorbensmaterialen zijn waarmee ook ionogene componenten geextraheerd kunnen worden), als wel aan de grote hoeveelheid matrix die moeilijk te scheiden is van de te bepalen componenten. ll

16 4 Experimenteel 4.1 Onderzochte verbindingen De struktuurformules zijn weergegeven in bijlage 1 Zuur Chloorfenoxycarbonzuren (CFCZ) MCPA MCPP (mecoprop) 2,4-D 2,4-DP (dichlorprop) 2,4-DB 2,4,5-T 2,4,5-TP (fenoprop) MCPB Bentazon Dinitrofenolen (DNF) 2,4-dinitrofenol dinoseb dinoterb DNOC dinocap dinobuton Neutraal Fenylureumherbiciden (FUH) metoxuron metabenzthiazuron chloortoluron isoproturon diuron monolinuron metobromuron chlooroxuron linuron chloorbromuron Zwak basisch Triazinen simazine atrazine 4.2 Chemicalien In bijlage 2 zijn de gebruikte chemicalien weergegeven met specificaties als fabrikant, CASnummer, artikelnummer en zuiverheid. 4.3 Oplossingen Mobiele fase De mobiele fase (eluens) bestond uit HPLC grade water (voortaan HPLC water genoemd) en acetonitril. Aan de waterfase is voor de menging met acetonitril een afgewogen hoeveelheid ionpaarvormer, TBAHS0 4, toegevoegd. Deze TBAHS0 4 -oplossing is (eveneens voor de menging met acetonitril) op gewenste de ph-waarde gebracht door het toevoegen van verdunde natronloog of zwavelzuur. Voor het verwijderen van zwevende deeltjes en lucht is het eluens onder vacuum gefiltreerd over een, afhankelijk van de fractie organisch oplosmiddel, FHUP- of HVLP-filter. De verhoudingen en concentraties van het eluens staan in het hoofdstuk Resultaten en Discussie,

17 4.3.2 Spoel- en wasvloeistoffen Voor het spoelen van de pre-kolom voor de extractie van het monster (conditionering), is afhankelijk van het experiment dat is uitgevoerd, een op ph gebrachte TBAHS0 4 -oplossing of HPLC water gebruikt. Bij gebruik van de TBAHS0 4 -oplossing kwam de concentratie TBAHSG, overeen met die van het monster. Als wasvloeistof na de extractie (clean-up) is, afhankelijk van het uitgevoerde experiment, een oplossing van 90% HPLC water (met TBAHS0 4 ): 10% acetonitril en 90% HPLC water (zonder TBAHS0 4 ): 10% acetonitril, of HPLC water gebruikt Standaardoplossingen en oppervlaktewatermonsters Optimaliseren scheidingscondities Standaardoplossingen 0.05 pg/ml FUH's en triazinen: 4 ml 0.25 pg/ml FUH's + triazinen mengstandaard [15] gepipeteerd in maatkolf van 20 ml en aangevuld met leidingwater tot de maatstreep (0.01% v/v acetonitril) pg/ir.l CFCZ's en bentazon: gram 20 pg/ml acetonitril (s.g.= 0.78) CFCZ's + bentazon mengstandaard [16] afgewogen, in een maatkolf van 200 ml overgebracht en aangevuld met leidingwater tot de maatstreep (0.25% v/v acetonitril) pg/ml DNF's: 5 ml 0.25 pg/ml DNF's mengstandaard gepipeteerd in maatkolf van 25 ml en aangevuld tot de maatstreep met leidingwater (0.70% v/v acetonitril). De standaardoplossingen zijn bewaard bij 4 C. Blanco leidingwater HPLC water Er is 100 pl monster geinjecteerd, dit komt bij de standaardoplossingen overeen met 5 ng voor ieder pesticide. Er is eenmaal 100 pl 0.25 pg/l DNF mengstandaard geinjecteerd, wat overeenkomt met 25 ng van ieder DNF-pesticide. Optimaliseren extractie en scheiding Voor het optimaliseren van de extractie en scheiding van zowel zure als neutrale en zwak basische pesticiden is uitgegaan van de extractie van 25 ml 1.0 pg/l monster, overeenkomend met 25 ng van ieder pesticide. Standaardoplossingen (bewaard bij 4 C) 1.0 pg/l FUH's en triazinen: 2 ml 0.25 pg/ml mengstandaard [15] FUH's + triazinen pipeteren in een maatkolf van 500 ml en tot de maatstreep aanvullen met leidingwater (% ACN «0). 1.0 pg/l CFCZ's en bentazon: 5 ml 0.05 pg/ml mengstandaard CFCZ's + bentazon pipeteren in een maatkolf van 250 ml een tot de maatstreep aanvullen met leidingwater (% ACN «0). 1.0 p/l DNF's: 2 ml 0.25 pg/l mengstandaard gepipeteerd in een maatkolf van 500 ml een tot de maatstreep aangevuld met leidingwater (% ACN «0). 1.0 pg/l mengstandaard met daarin alle componenten: 2 ml 0.25 pg/ml mengstandaard FUH's en triazinen, 2 ml 0.25 pg/ml mengstandaard DNF's en 10 ml 0.05 pg/ml mengstandaard CFCZ's en bentazon zijn gepipeteerd in een maatkolf van 500 ml en deze is aangevuld met leidingwater tot de maatstreep (% ACN «0). 13

18 Oppervlaktewatermonster Er is Rijnwater gebruikt dat bij het RIZA meetstation in Lobith was bemonsterd. Het water werd bewaard bij 4 C. 1.0 pg/l oppervlaktewatermonster met alle componenten: 4 ml 0.25 pg/ml mengstandaard FUH's en triazinen, 4 ml 0.25 pg/ml mengstandaard DNF's en 20 ml 0.05 pg/ml mengstandaard CFCZ's en bentazon zijn gepipeteerd in een maatkolf van 1 L en deze is aangevuld met oppervlaktewater tot de maatstreep. Deze oplossing werd bewaard bij 4 C. Als houdbaarheidstermijn werd 6 weken aangehouden. Blanco Leidingwater HPLC grade water Voordat een standaardoplossing, oppervlaktewatermonster of bianco werd geextraheerd, werd TBAHS0 4 toegevoegd en werd het monster op gewenste ph-waarde gebracht met behulp van verdunde natronloog en/of zwavelzuur. Bij de eerste experimenten die zijn gedaan, werd een afgewogen hoeveelheid TBAHSG, aan het monster toegevoegd. In latere experimenten is analoog aan een in een artikel [5] omschreven methode voor het toevoegen van de ionpaarvormer, gewerkt. Hierbij is eerst een 0.1 M oplossing van TBAHS0 4 gemaakt, door een hoeveelheid TBAHS0 4 af te wegen en op te lossen in leidingwater (of zoals ook een keer is gedaan: in HPLC water). Vervolgens werd met een injectiespuit een hoeveelheid 0.1 M TBAHS0 4 -oplossing aan het monster toegevoegd, waardoor de gewenste concentratie kon worden verkregen. 4.4 Apparatuur en hulpmiddelen HPLC pomp systeem 2152 HPLC controller, LKB 2150 HPLC pump, LKB 2150 HPLC pump, Pharmacia LKB monster- en wasvloeistoffen Solvent Delivery Unit (SDU), Separations aanvoerpompsysteem ontgasser wasvloeistof ontgasser eluens kranenschakelsysteem en cartridge verwisselaar pre-kolom Ontgasser, Separations ERC-3215, ERC Inc. PROSPEKT versie 4.80, Spark Holland/Separations PLRP-S (15-25pm) 10*2 mm (id), Separations, partno 'guard' kolom Applied Biosystems, RP-18, 7 pm, 15*3 mm, P/N injectiekraan Rheodyne 7010 met 100 pl loop 14

19 kolomthermostaat analytische kolom detector datastation analytische balans injectiespuit zonder punt ultrasoontriller magneetroerder volpipet ph-meter en electrode vacuumfilteropstelling Mistral, Separations Inertsil ODS-3, 5pm, 4.6*250 mm, GL Sciences Inc. (ph2-7.5) Waters 996 Photodiode Array Detector, Waters NEC Image 466es workstation Millenium 2020 softwarepakket versie 2.12 (netwerk), Waters Mettler AT200, Mettler, aflezing tot 0.1 mg nauwkeurig 250 pl, Hamilton, #1725 Bransonic 1210, Boom B.V. Meppel IKAMAG RCT motor 2,4,5, 10 en 20 ml Schott ph-meter CG 840 opzetstuk, Millipore XX en XXI opvangkolf, Millipore XF FHUP filter 0.5 pm, Millipore HVLP filter 0.45 pm, Millipore gebruikelijk laboratoriumglaswerk en benodigdheden 4.5 Meetomstandigheden Optimaliseren scheidingscondities Loopinjectie 100 pl Ionpaar chromatografie De beschrijving van de samenstelling van eluens A en eluens B wordt gegeven in het hoofdstuk Resultaten en Discussie, 5.1. gradient tijd in min %A %B flow 1.0 ml/min. temperatuur (analytische kolom) 30 C 15

20 Er is gekozen voor deze temperatuur omdat deze tussen de temperatuur van de CFCZbepaling (60 C) en de FUH-bepaling (10 C ) ligt. Detectie DAD nm De chromatogrammen werden aanvankelijk opgenomen van nm, maar dit is na een aantal experimenten bijgesteld naar nm, omdat de pesticiden boven 350 nm nauwelijks of niet meer absorberen. 223 nm, triazinen [15] 232 nm, CFCZ's en bentazon [16] 245 nm, FUH's [15] 260 nm, DNF's [17] 268 nm, metabenzthiazuron (FUH) [15] Optimaliseren extractie- en scheidingscondities Voor de extractie van de pesticiden wordt 25 ml monster door een PLRP-S pre-kolom geleid. De elutie van de pesticiden vindt plaats met het eluens dat ook wordt gebruikt voor de scheiding ervan op de analytische kolom. De samenstelling van eluens A en B is: A: 90% H 2 0 (ph 6.5) mmol/l TBAHS0 4 : 10% ACN B: 10% H 2 0 (ph 6.5) mmol/l TBAHS0 4 : 90% ACN De meetomstandigheden voor de scheiding van de pesticiden zijn identiek aan die beschreven bij 'Optimaliseren scheidingscondities'(geen loop-injectie). De monster samenstelling en de elutietijd zijn gevarieerd en worden behandeld in het hoofdstuk Resultaten en Discussie, 5.2. Voor het PROSPEKT extractie- en elutieprogramma dat gebruikt is, wordt verwezen naar bijlage 3. Daar wordt ook de samenstelling van de wasvloeistoffen van de conditionering en de clean-up beschreven. Minimaliseren matrix invloed Voor het minimaliseren van de matrix invloed is geexperimenteerd met standaardoplossing en oppervlaktewater monster waarin alle pesticiden aanwezig zijn. De meetomstandigheden, waren op de samenstelling van de conditioneringsstap en de 'clean-up' stap na, identiek aan die bij de optimalisatie van de extractie- en scheidingscondities. De monsters worden bij een ph-waarde van ongeveer 6.5 en een concentratie TBAHS mmol/l geextraheerd. De elutietijd is gevarieerd. Dit wordt evenals de samenstelling van de wasstappen behandeld in het hoofdstuk Resultaten en Discussie,

21 5 Resultaten en discussie 5.1 Optimaliseren scheidingscondities Het doel van deze optimalisatie is meetomstandigheden te vinden waarmee de verschillende pesticiden op de analytische kolom kunnen worden gescheiden m.b.v. ionpaar chromatografie. De experimenten werden uitgevoerd met 3 standaardoplossingen met daarin respectievelijk FUH's en triazinen, DNF's, en CFCZ's en bentazon en met blanco's ( 4.3.3). Door de experimenten met de standaardoplossingen uit te voeren, is het mogelijk te weten te komen of ionpaar chromatografie effectief kan worden toegepast. Er wordt duidelijk wanneer de verschillende pesticidepieken van de analytische kolom elueren en of de scheiding tussen de pieken voldoende is om de verschillende pesticiden (die bij dezelfde golflengte worden geanalyseerd) te kunnen identificeren en kwantificeren. De meetomstandigheden die uiteindelijk de meest optimale resultaten geven, kunnen vervolgens worden gebruikt voor de elutie en scheiding van de pesticiden na concentrering op de pre-koloir.. De meetomstandigheden staan, met uitzondering van de samenstelling van het eluens, beschreven in 4.5. In de beginsituatie bestond eluens A uit 90 % HPLC water (3.0 mmol/l TBAHS0 4, ph 3) en 10% acetronitril en eluens B uit 10 % HPLC water (3.0 mmol/l TBAHS0 4, ph 3) en 90 % acetronitril. Er is voor een concentratie TBAHS0 4 van 3.0 mmol/l gekozen, omdat deze ionpaar vormer concentratie, in deze orde van grootte, vaker bij ionpaar chromatografie wordt gebruikt [5, 16, 18]. Bij eluens met ph 3 is het toevoegen van ionpaar vormer eigenlijk niet nodig, er zijn immers geen gedissocieerde zure pesticiden, maar is dit wel gedaan om vergelijking met eluens met ph 6.4 mogelijk te maken. Nadat met eluens ph 3 was geexperimenteerd is de ph-waarde van het eluens verhoogd naar ph 6.4. De resultaten die zijn verkregen na het elueren van standaardoplossingen en blanco's bij ph 3 en ph 6.4 zijn erg slecht. In de chromatogrammen zijn veel stoorpieken te zien. Bij de standaardoplossingen interfereert een aantal stoorpieken met de te bepalen pesticiden, die hierdoor niet te identificeren of te kwantificeren zijn. De basislijn, die naar verwachting een toenemende intensiteit krijgt bij het toenemen van de acetonitrilfractie in het eluens, heeft in vergelijking met de pesticidepieken een hoge intensiteit en heeft met name bij ph 6.4 een grillig verloop. Dat er zelfs na injectie van HPLC water stoorpieken in het chromatogram te zien zijn, geeft aan dat het analysesysteem niet vrij van verontreinigingen was. Dit zijn waarschijnlijk verbindingen die afkomstig kunnen zijn uit het eluens (van de ionpaar vormer), de gebruikte natronloog en zwavelzuuroplossingen (voor de aanloging, aanzuring van het eluens), de guard kolom en de analytische kolom. Het is de vraag of deze matrixpieken ook te zien waren geweest wanneer de monsters waren geelueerd met eluens zonder ionpaarvormer. 17

22 Verlaging concentratie ionpaar vormer in eluens Omdat het doel was de pesticiden bij neutrale ph-waarde op de analytische kolom te scheiden en de resultaten bij ph 3 niet veelbelovend waren (bij gebruik van TBAHS0 4 in het eluens), is er verder geexperimenteerd met eluens ph 6.4. Het vermoeden bestond dat de verontreinigingen door een te hoge concentratie ionpaar vormer co-elueerden met de pesticiden uit het monster. De concentratie TBAHS0 4 in het eluens is daarom tien maal verlaagd. Met eluens ph 6.4 en TBAHS mmol/l waren er, in vergelijking met de hogere ionpaar vormer concentratie, veel minder stoorpieken aanwezig in de chromatogrammen en is de intensiteit van de stoorpieken afgenomen. De intensiteit van de basislijn nam net als de acetonitrilfractie lineair toe. Dit is niet alleen bij de blanco's maar ook bij standaardoplossingen te zien. Een voorbeeld van een chromatogram van een standaardoplossing is te zien in figuur 4. Fig. 4: Chromatogram bij 245 nm, verkregen na injectie van 50 ul 0.05 ug/ml (5 ng) FUH + triazinen standaardoplossing na een scheiding met eluens ph 6.4 en 0.3 mmol/l TBAHSO,. De pesticidepieken zijn aangeduid met een getal, de overige pieken zijn stoorpieken. De FUH + triazinen standaard bevat 12 stoffen die met de FUH-bepaling alle worden gescheiden. In het chromatogram van de FUH standaard, dat verkregen is met eluens ph 6.4 en TBAHS mmol/l, zijn bij 245 nm 10 componentpieken en een aantal stoorpieken waarneembaar. Mogelijk vallen er twee componenten geheel samen, doordat er een andere gradient en temperatuur van de analytische kolom gebruikt is. De twaalfde ontbrekende piek is van een triazine (atrazine) die bij 245 nm niet maar bij 223 nm wel in het chromatogram te zien is. De stoorpieken interfereren niet met de FUH's en triazinen. De retentietijden van de FUH's en triazinen liggen tussen de 18 en 32 minuten. In het chromatogram van de CFCZ + bentazon standaardoplossing heeft een aantal componentpieken een lage intensiteit. De intensiteit van enkele pieken is zelfs lager dan bij eluens ph 6.4 en TBAHS0 4 3 mmol/l. Hoewel het aantal stoorpieken en de intensiteit daarvan is afgenomen in vergelijking met de hogere concentratie ionpaar vormer, is het niet mogelijk om de 9 pesticiden direct in het chromatogram aan te wijzen. Er is niet duidelijk geworden of bepaalde pesticiden tegelijkertijd van de analytische kolom elueren. 18

23 De spectrumbibliotheek voor de CFCZ's en bentazon, kan niet altijd duidelijkheid geven over welke piek bij welk pesticide hoort. Dit komt onder andere doordat enkele spectra door de aanwezigheid van achtergrond iets veranderd zijn en hierdoor niet meer met het bibliotheekspectrum overeenkomen. De onduidelijkheden over de ligging van de componentpieken hadden wellicht enigszins opgelost kunnen worden, wanneer een grotere hoeveelheid CFCZ's en bentazon zou zijn geinjecteerd, bijv. 25 ng i.p.v. 5 ng. De retentietijden van de CFCZ's en bentazon liggen tussen 20 en 27 minuten. In het chromatogram verkregen na injectie van 100 pl 0.05 pg/ml DNF standaardoplossing en elutie met eluens ph 6.4 en TBAHS mmol/l hebben de dinitrofenolen eenzelfde intensiteit als enkele stoorpieken, waardoor niet met zekerheid te zeggen is welke pieken afkomstig zijn van dinitrofenolen. Na injectie van 0.25 pg/ml standaardoplossing is dit wel duidelijk, omdat de stoorpieken niet in intensiteit zijn toegenomen en de dinitrofenol pieken wel. De dinitrofenolen tonen niet alleen bij 260 nm maar ook bij 232 nm een goede intensiteit. In het chromatogram bij 232 nm zijn zelfs alle (6) dinitrofenolen te onderscheiden. Bij 260 nm zijn er 5 componentpieken te zien. Omdat bij later uitgevoerde experimenten 232 nm een minder geschikte golflengte blijkt te zijn, is er voor gekozen om de dinitrofenolen bij 260 nm te analyseren. De retentietijden van de dinitrofenolen liggen tussen de 24 en 44 minuten. 4 Van de 6 dinitrofenolen elueren pas van de analytische kolom, wanneer het eluens voor bijna 90% uit acetonitril bestaat. Waarbij drie componenten pas elueren wanneer de acetonitrilfractie in het eluens al weer aan het afnemen is. De componenten gedragen zich vrij apolair in vergelijking met de CFCZ's en de FUH's. De meetomstandigheden gaven bij gebruik van eluens ph 6.4 en 0.3 mmol/l TBAHS0 4 in vergelijking met de andere eluens samenstellingen de beste resultaten. Vanwege de beperkte tijd waarin de experimenten konden worden uitgevoerd, is er voor gekozen met deze meetomstandigheden verder te werken in plaats van ze verder te optimaliseren. Conclusie Door het toepassen van ionpaar chromatografie met behulp van eluens ph 6.4 en TBAHS mmol/l, is het mogelijk om zowel neutraal/zwak basische fenylureumherbiciden en triazinen als zure CFCZ's, bentazon en dinitrofenolen in afzonderlijke standaardoplossingen, te scheiden op de analytische kolom. 5.2 Optimaliseren extractie en scheiding Het doel van deze optimalisatie is meetomstandigheden te vinden, waarmee het mogelijk is om zowel FUH's en triazinen als ook CFCZ's, bentazon en dinitrofenolen uit standaardoplossing en oppervlaktewatermonster te extraheren, te elueren, te scheiden en te detecteren. Er is ionpaar extractie en ionpaar chromatografie toegepast. De experimenten zijn uitgevoerd met standaardoplossingen en met oppervlaktewatermonster waaraan alle te bepalen pesticiden zijn geaddeerd en met blanco's ( 4.3.3). Door de experimenten met deze oplossingen uit te voeren, is het mogelijk te weten te komen of de componenten, in aanwezigheid van veel andere (soortige) pesticiden en matrix, kunnen worden geanalyseerd. 19

24 De meetomstandigheden staan, met uitzondering van de samenstelling van het monster en van de elutietijd beschreven in 4.5 en in bijlage 3. In de beginsituatie werden monsters met TBAHS mmol/l geextraheerd. De ph-waarde van de monsters was, na aartzuring, ongeveer 6.7. De resultaten van de standaardoplossingen met daarin afzonderlijk de FUH's en triazinen, de CFCZ's en bentazon en de dinitrofenolen laten zien dat het mogelijk is om niet alleen FUH's en triazinen bij neutrale ph-waarde te extraheren en te scheiden, maar ook zure pesticiden. Wel is de scheiding tussen bepaalde componenten in vergelijking met de resultaten na loopinjectie, slechter geworden. Ook de intensiteit van met name de pesticiden die vanaf een eluensfractie van 75 % van de analytische kolom elueren, is slechter geworden. Dit kan zijn veroorzaakt door een onvolledige extractie, maar een onvolledige elutie ligt meer voor de hand. De elutietijd (d.w.z. de tijd dat eluens door de pre-kolom spoelt en de componenten kunnen desorberen) kan hierbij een belangrijke rol spelen. De elutietijd is 3 minuten; de acetonitrilfractie in het eluens is dan nog erg laag en bepaalde componenten voelen bij deze eluenssamenstelling nog een grotere affiniteit voor het adsorbensmateriaal van de pre-kolom dan voor het eluens, waardoor ze niet elueren. In vergelijking met de standaardoplossingen na loop-injectie, heeft de achtergrond een hogere intensiteit gekregen, de basislijn is hoger. Dit is ook bij de blanco's, met name de leidingwaterblanco, te zien. In de chromatogrammen is een bult te zien die wordt veroorzaakt door matrixverbindingen uit het leidingwater (waarmee ook de standaardoplossingen zijn bereid). De matrixbult co-elueert met een aantal pesticiden. Door de toevoeging van ionpaar vormer aan het monster en aan het eluens worden niet alleen de zure pesticiden, maar ook matrixverbindingen bij neutrale ph-waarde geextraheerd. In de chromatogrammen van standaardoplossing en oppervlaktewater waarin alle pesticiden aanwezig zijn, zijn de pesticidepieken nauwelijks terug te vinden. Het lijkt alsof ze, of in de achtergrond zijn weggevallen, of zoals bij het oppervlaktemonster het geval lijkt te zijn, nauwlijks tot niet zijn geextraheerd en/of geelueerd. De basislijn is hoger dan bij de standaardoplossingen met daarin de afzonderlijke pesticidegroepen en er zijn achterin het chromatogram stoorpieken te zien. Analyse van een leidingwaterblanco liet dit ook zien, wat erg vreemd is, aangezien een eerder gemeten leidingwaterblanco onder dezelfde meetomstandigheden een heel ander (en ook beter) resultaat gaf. Vermoed werd dat eluens B langzamerhand van samenstelling is veranderd. In deze oplossing, die bij de bereiding helder en doorzichtig was, was na verloop van tijd een witte waas te zien en dreven er vlokken in. Dit kan veroorzaakt zijn door slechte oplosbaarheid van de in het eluens aanwezige componenten (TBAHS0 4, zwavelzuur en natronloog of verontreinigingen), daar de fractie organisch oplosmiddel erg groot is. In nieuw (vers) bereide eluens was er geen waas te zien, maar verbeterden de resultaten ook niet. 20

25 Verlagen concentratie ionpaar vormer in het monster Het verlagen van de concentratie ionpaar vormer in het monster van 0.3 mmol/l naar 0.1 mmol/l geeft een verbetering in de resultaten te zien. In de standaardoplossing met daarin alle componenten zijn de FUH's en triazinen bij 245 nm goed te onderscheiden van het achtergrondsignaal. Ze lijken, op enkele wat later eluerende pesticiden na (de elutietijd is nog steeds 3 minuten), goed geextraheerd en geelueerd te zijn. Of de recovery acceptabel is, is niet onderzocht. De CFCZ's en bentazon zijn bij 232 nm moeilijk te identificeren. Dit komt doordat ze vrijwel tegelijkertijd met FUH's die bij deze golflengte ook nog een goede intensiteit vertonen, van de analytische kolom elueren. Daarnaast kan er geen betrouwbare identificatie plaatsvinden, omdat de spectrumbibliotheek niet bruikbaar is (zie ook 5.1). Van de dinitrofenolen is geen spectrumbibliotheek aanwezig, wat identificatie bemoeilijkt. Een aantal dinitrofenolen elueert bij een acetonitrilfractie van 90 % van de analytische kolom. De intensiteit van de pieken is evengroot als die van co-eluerende stoorpieken, waardoor ze moeilijk hiervan te onderscheiden zijn. Net als bij enkele FUH's kan een langere elutietijd waarschijnliik voor een betere elutie en daardoor hogere intensiteit van de pieken zorgen. Verhogen elutietijd Er is onderzocht of het verhogen van de elutietijd van 3 naar 40 minuten, de intensiteit van de pesticidepieken kan doen verhogen, ofwel de recovery van de pesticiden kan verbeteren. De concentratie ionpaar vormer in het monster was 0.1 mmol/l en de ph-waarde ongeveer 6.5. In figuur 5 is een chromatogram weergegeven dat verkregen is onder deze meetomstandigheden. Het verhogen van de elutietijd heeft inderdaad tot gevolg dat de intensiteit van met name de pieken die vanaf een acetonitrilfractie van 75 % van de analytische kolom elueren, toeneemt. Hoewel dit niet alleen gebeurt bij pesticidepieken maar ook bij stoorpieken, zijn bijvoorbeeld de dinitrofenolen nu veel beter te onderscheiden van de stoorpieken. Door de langere elutietijd zijn de CFCZ pieken beter te onderscheiden van de FUH pieken, maar is de intensiteit ervan in vergelijking met FUH en triazine pieken erg laag. Kwantificatie is niet uitgevoerd, omdat de identificatie voor een groot aantal pesticiden niet betrouwbaar kan plaatsvinden. De achtergrond, inclusief de matrixbult, is bij een langere elutietijd niet toegenomen. Hieruit kan worden geconcludeerd dat een belangrijk deel van de matrix bij een polaire gradient samenstelling (90% water en 10% acetonitril) in drie minuten van de pre-kolom elueert. Het zou kunnen zijn dat de intensiteit van de dinitrofenolpieken die pas van de analytische kolom elueren wanneer de acetonitrilfractie weer aan het afnemen is, hoger zou zijn geweest wanneer er nog langer dan 40 minuten was geelueerd en de samenstelling van het eluens langer op 100 % acetonitril zou zijn gebleven (anoere gradient-instelling). Dit is niet meer onderzocht. 21

26 e.tm Fig. 5: Chromatogram bij 245 nm, van 25 ml 1.0 ug/l (25 ng) standaardoplossing (ph 6.5, 0.1 mmol/l TBAHSO.) met alle pesticiden. Elutie van 40 minuten, eluens ph 6.4 en 0.3 mmol/l TBAHS0 4. De analyse van een oppervlaktewatermonster met alle pesticiden, ph 6.5 en 0.1 mmol/l TBAHSO,, bij een elutietijd van 40 minuten, levert chromatogrammen op waarin een grote matrixbult is te zien (zie Fig. 6). De intensiteit van deze bult is minstens drie maal groter als bij de standaardoplossingen. De matrix co-elueert nu met bijna alle pesticiden. Dit maakt, zoals ook in de probleemstelling omschreven, betrouwbare identificatie en kwantificatie onmogelijk. Vooral de pesticiden die bij de standaardoplossingen al geen grote intensiteit vertonen, enkele dinitrofenolen en CFCZ's, vallen nu helemaal weg in de achtergrond. Wat opvalt aan de chromatogrammen van het oppervlaktewatermonster is dat aan het eind van het chromato-gram, vanaf een acetonitrilfractie van ongeveer 75 %, de intensiteit van de achtergrond lager is dan bij de standaardoplossing. De retentietijden van de pesticiden zijn niet veranderd door de grotere hoeveelheid matrix die wordt geextraheerd en geelueerd. Conclusie Door het toepassen van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie, bij een monstersamenstelling ph 6.5 en TBAHS mmol/l, een elutietijd van 40 minuten en eluens met ph 6.4 en TBAHS mmol/l, kunnen zowel neutrale en zwak basische als zure pesticiden geanalyseerd worden. Door het ontbreken van een goede scheiding tussen de FUH's en de CFCZ's, een bruikbare spectrumbibliouheek en specifieke golflengtes, was het niet mogelijk om bepaalde pesticiden betrouwbaar te identificeren en te kwantificeren. De matrix wordt ook bij neutrale ph-waarde geextraheerd en geelueerd en zorgt ervoor dat de pesticiden, met name bij oppervlaktewatermonsters, niet betrouwbaar gei'dentificeerd en gekwantificeerd kunnen worden. 22

27 * IS IS IS «S.DO Fig. 6: Chromatogram bij 245 nm van 25 ml 1.0 ug/l (25 ng) oppervlaktewatermonster (ph 6.5,0.1 mmol/l TBAHSO,) waaraan alle pesticiden zijn geaddeerd. Elutie van 40 minuten, eluens ph 6.4 en 0.3 mmol/l TBAHSO,. 5.3 Minimaliseren van de matrix invloed Het doel van het verminderen van de matrix invloed is er voor te zorgen dat de verschillende pesticiden betrouwbaarder geanalyseerd kunnen worden. Geprobeerd is om door het veranderen van wasstappen zowel voor als ook na de extractie de hoeveelheid matrix die geextraheerd en/of geelueerd wordt te verminderen. Conditionering pre-kolom De conditionering van de pre-kolom vindt plaats voor de extractie van het monster. Normaal gesproken wordt er gespoeld met een vloeistof die eenzelfde samenstelling heeft als het te extraheren monster. Dat wil zeggen, eenzelfde ph-waarde als het monster en met dezelfde toevoegingen die ook aan het monster zijn gedaan. Zo wordt met HPLC water (0.1 mmol/l TBAHS0 4 + ph 6.5) gespoeld, wanneer een monster met 0.1 mmol/l TBAHS0 4 + ph 6.5 zal worden geextraheerd. Door het voorspoelen, kan het adsorbensmateriaal wennen (conditioneren) aan de omstandigheid van het monster en is het beter in staat de componenten uit het monster aan zich te binden. Door het spoelen van de pre-kolom met puur HPLC water, i.p.v. met op ph 6.5 gebracht HPLC water met 0.1 mmol/l TBAHS0 4, is onderzocht wat voor effect dit met name op de extractie van de matrix zou hebben. Het idee is dat, nadat er is gespoeld met puur HPLC water, er bij het begin van de extractie nog geen ionpaarvormer op de pre-kolom zit. Dit zou er voor kunnen zorgen dat de matrix die in het monster nog geen interaktie met de TBA* is aangegaan, niet genoeg tijd krijgt om een interaktie aan te gaan met de ionpaarvormer en met het adsorbensmateriaal, en hierdoor minder of niet kan worden geextraheerd. Er is 25 ml monster (voor de samenstelling zie 4.5) geanalyseerd. De elutietijd was 3 minuten 2. 2 Dit experiment is nog v66r de experimenten gedaan waarbij de elutietijd op 40 minuten was ingesteld. 23

28 De resultaten van het veranderen van de conditionering van de pre-kolom, laten zien dat de matrixbult zowel bij de standaardoplossing als bij het oppervlaktewatermonster sterk verkleind is. De intensiteit is flink afgenomen, waardoor de componentpieken die eerst op de bult 'zaten' in een standaardoplossing betrouwbaarder geanalyseerd kunnen worden. Bij oppervlaktewater is de matrixbult in intensiteit afgenomen, maar is de intensiteit nog wel zodanig groot dat pieken deels in de bult wegvallen (zie Fig. 7). Fig. 7: Chromatogram bij 245 nm van 25 ml 1.0 ug/l (25 ng) oppervlaktewatermonster (ph 6.5, 0.1 mmol/l TBAHSO,) waaraan alle pesticiden zijn geaddeerd. Elutie van 40 minuten, eluens ph 6.4 en 0.3 mmol/l TBAHSO,. Conditionering pre-kolom met HPLC water. Met name bij de zure pesticiden is het de vraag of de extractie wel volledig heeft kunnen verlopen. Deze pesticiden gedragen zich deels hetzelfde als de nu kwijtgeraakte matrix. Over de terugvinding van de pesticiden kan geen betrouwbare uitspraak worden gedaan. Zoals al eerder vermeld, was het moeilijk tot onmogelijk de pesticiden te identificeren, vanwege de slechte scheiding en het ontbreken van een bruikbare spectrumbibliotheek. Voorzover identificatie en kwantificatie al wel mogelijk zijn, kan er eigenlijk geen uitspraak over de terugvinding worden gedaan, omdat de elutietijd 3 minuten was. Zoals in 5.2 is beschreven, heeft de elutietijd invloed op hoeveelheid pesticide die wordt geelueerd. Een slechte recovery hoeft bij dit experiment dan ook niet veroorzaakt te zijn door de veranderde conditioneringsstap, als wel door het verschil in elutietijd. Het experiment is herhaald, waarbij de elutietijd is ingesteld op 40 minuten. De resultaten zijn erg verrassend. De chromatogrammen tonen twee matrixbulten. Een op de plaats waar, zonder verandering van de conditioneringstap, al een matrixbult te zkp was en een matrixbult iets later in het chromatogram. De eerste matrixbult is in vergelijking met eerdere metingen even hoog (de intensiteit is even hoog) maar de breedte van de bult is kleiner geworden. Hierdoor elueren een aantal componenten niet meer tegelijkertijd met de grote hoeveelheid matrix en zijn de pieken ervan beter van de achtergrond te onderscheiden. Door de aanwezigheid van een tweede matrixbult vallen er nu andere componentpieken weg in de hoge matrixachtergrond. Het lijkt alsof een deel van de matrix in het chromatogram naar achteren is verschoven, waardoor er een tweede matrixbult (met een kleinere intensiteit als de eerste bult) zichtbaar is geworden. De retentietijden van de pesticiden zijn niet veranderd. 24

29 De meetresultaten verschillen behoorlijk met de meetresultaten die eerder bij verandering van de conditioneringstap en een elutietijd van 3 minuten zijn behaald. Het blijkt nu niet meer mogelijk te zijn de matrix niet of nauwelijks te extraheren en/of te elueren. Dit is niet te wijten aan de verandering in elutietijd, aangezien ook de meetresultaten van experimenten die in 5.2 zijn behandeld, onder dezelfde meetomstandigheden niet meer verkregen konden worden (zie Fig. 8 en vergelijk deze met Fig. 5). In de chromatogrammen zijn twee matrixbulten te zien, i.p.v. e n en ondervinden er meer componenten interferentie van de matrix. De dinitrofenolen die als laatste pesticiden elueren, hebben een erg lage intensiteit. Er is niet onderzocht of deze componenten wel geextraheerd en geelueerd zijn, vanwege ontbrekende identificatie mogelijkheden. Fig. 8 Chromatogram bij 245 nm, van 25 ml 1.0 ug/l (25 ng) standaardoplossing (ph 6.5, 0.1 mmol/l TBAHSO,) met alle pesticiden. Elutie van 40 minuten, eluens ph 6.4 en 0.3 mmol/l TBAHSO,. Clean-up pre-kolom De clean-up stap vindt plaats na de extractie van het monster over de pre-kolom en is bedoeld als wasstap voor het verwijderen van achtergebleven monstervloeistof en een deel van de geadsorbeerde matrixverbindingen. De clean-up vindt bij de FUH-bepaling plaats met een oplossing bestaande uit 90 % HPLC water en 10 % acetonitril. Bij de hiervoor beschreven experimenten, bestond de oplossing uit 90 % HPLC water (ph 6.5, 0.3 mmol/l TBAHSO,) en 10 % acetonitril. Door het weglaten van de ionpaar vormer uit de clean-up stap is onderzocht, of dit effect heeft op de hoeveelheid mat.lx die uiteindelijk van de pre-kolom geelueerd wordt. De resultaten van dit experiment waren erg slecht. Ook onder deze meetomstandigheden waren er twee matrixbulten in het chromatogram te zien. Het. veranderen van de samenstelling van de clean-up stap heeft niet het gewenste effect, er vindt geen vermindering van de hoeveelheid matrix (die geanalyseerd wordt) plaats. Experimenten waarbij zowel de conditioneringsstap als de clean-up stap wordt veranderd zorgen niet voor een verbetering van de resultaten. 25

30 Gradientverandering Het verhogen van de beginfractie acetonitril in het eluens, had als doel de componenten eerder van de pre-kolom en de analytische kolom te elueren. Door het langzamer laten oplopen van de acetonitrilfractie in het eluens naar 100 %, is onderzocht of hierdoor de matrix meer verspreid kon worden over het chromatogram. De volgende gradient is onderzocht: tijd in min. % A % B Met deze gradient kan ook onderzocht worden of het mogelijk is om de dinitrofenolen, die bij de eerder toegepaste gradient pas bij het afnemen van de acetonitrilfractie elueerden, nu tijdens het toenemen van de acetonitrilfractie in het eluens te elueren. Door de gradientverandering zijn de matrixbulten smaller geworden en is de intensiteit ervan groter geworden. Met name de tweede matrixbult interfereert met een groot aantal pesticiden. De pesticiden die vanaf een acetonitrilfractie van ongeveer 75 % elueren, hebben nu een lagere achtergrond en ondervinden nauwelijks tot geen meer interferentie van matrix. Het chromatogram is voor deze componenten verbeterd. Bij een acetonitrilfractie van ongeveer 90 % zijn geen componentpieken te zien. Er zijn bij een acetonitrilfractie van ongeveer 80 % enkele kleine pieken te zien, welke afkomstig zouden kunnen zijn van dinitrofenolen. Dit is niet nader onderzocht. Conclusie Conditionering van de pre-kolom met HPLC water, in plaats van HPLC water (ph 6.5, 0.1 mmol/l TBAHS0 4 ) zorgde aanvankelijk voor vermindering van de hoeveelheid matrix die geextraheerd en/of geelueerd wordt. Bij herhaling van het experiment had dit echter geen effect meer. Ook het veranderen van de samenstelling van de oplossing voor de clean up, of het veranderen van het gradientverloop had geen positief resultaat. 5.4 Reproduceerbaarheid van de meetresultaten De meetresultaten van verschillende experimenten die onder dezelfde meetomstandigheden zijn verkregen, vertonen grote verschillen. Terwijl in het ene experiment er een matrixbult in het chromatogram aanwezig is, zijn er bij het andere experiment twee matrixbulten in het chromatogram aanwezig. Terwijl in het ene experiment door het veranderen van de conditionering van de pre-kolom er nog nauwelijks matrix wordt geanalyseerd, vindt er bij het andere experiment geen verkleining van de hoeveelheid matrix plaats. De oorzaak van de verandering in meetresultaten is niet direct aan te wijzen. Er heeft soms enige tijd tussen de verschillende experimenten gezeten. Het is mogelijk dat veranderingen in bijvoorbeeld de omgevingstemperatuur invloed hebben gehad op de analyse. Tussen de experimenten waar 6en matrixbult was te zien in de chromatogrammen en de experimenten waarbij de intensiteit van de matrix in de chromatogrammen is toegenomen, waren een aantal factoren veranderd. Deze factoren zouden van invloed kunnen zijn geweest op extractie, elutie en scheiding van matrix. 26

31 De pompkoppen van de HPLC-pomp B (van solvent B) waren schoongemaakt, omdat de druk nogal varieerde. Vervolgens was er nog steeds een lichte variatie in de druk te zien, maar dat is waarschijnlijk te wijten geweest aan het niet aanstaan van de 'COMP'-functie op de HPLC-pomp. De analyse-opstelling is tijdelijk omgebouwd geweest, zodat de PROSPEKT, het capillair met de guard column, de kolomoven en de DAD voor de FUH-bepaling konden worden gebruikt. Hierbij is de temperatuur van de analytische kolom een dag 10 C geweest. Door het analysesysteem is een paar dagen eluens B rondgepompt (van eluensfles via analytische kolom en DAD weer naar eluensfles). Andere keren is eluens A rondgepompt. De 0.1 M TBAHS0 4 -oplossing die werd toegevoegd aan de monsters van de meetserie met twee achtergrondbulten, is gemaakt door een afgwogen hoeveelheid TBAHS0 4 op te lossen in HPLC water. Bij eerder geanalyseerde monsters was een TBAHS0 4 -oplossing van TBAHS0 4 in leidingwater gebruikt. Om te onderzoeken of de problemen werden veroorzaakt door vervuiling van het eluens, of van verbindingen die zich hebben opgehoopt op de analytische kolom, is de analytische kolom gespoeld met een mengsel van 50% acetonitril: 50% HPLC water. Vervolgens is een standaardoplossing (ph 6.5 en TBAHS mmol/l) geanalyseerd (meetomstandigheden zie 4.5). Het resultaat hiervan is dat de tweede matrixbult nog steeds aanwezig is, deze bult is wel smaller geworden en heeft een grotere intensiteit. Het schoonspoelen heeft geen (positief) resultaat opgeleverd. Een factor die een (grote) invloed heeft op de reproduceerbaarheid van meetresultaten is de ph-waarde van het monster en van het eluens. Verandering van de ph-waarde van het eluens kan er voor zorgen dat de retentietijden van bepaalde componenten veranderen [2]. Er is niet onderzocht of de ph-waarde bij de uitgevoerde experimenten gedurende de elutie constant was. De verschillende chromatogrammen die zijn verkregen, lieten zien dat de retentietijden van de pesticiden nauwelijks verschoven, terwijl dit bij de matrix wel gebeurde. Uit onderzoek dat is uitgevoerd door Papadopoulou-Mourkidou e.a. [2] naar het effect van veranderingen in de ph-waarde van de mobiele fase (eluens), kwam dit ook naar voren. In het betreffende artikel staat beschreven, dat bij veranderingen in de ph-waarde van het eluens, er alleen bij sterk zure of sterk basische componenten een verschuiving in retentietijd is te verwachten. Daarnaast heeft de ph-waarde van het eluens een zeer belangrijke invloed op de ligging van de achtergrondbult, veroorzaakt door met name humusmaterialen, in het chromatogram. Uit het onderzoek bleek dat bij ph 5.8 de matrixbult samenviel met de meest polaire te bepalen componenten. Bij ph 3 elueerde de matrix later van de analytische kolom en interfereerde hierdoor, net als bij de door mij uitgevoerde experimenten gebeurde, met veel meer te bepalen pesticiden. Mogelijk is de opsplitsing van de matrixbult in twee buiten, veroorzaakt door het afnemen van de ph-waarde gedurende de gradientelutie. Uit het feit dat het niet meer mogelijk blijkt te zijn om door het veranderen van de conditionering van de pre-kolom de matrixinvloed te verminderen, terwijl dat eerst wel het geval was, lijkt het erop dat de veranderingen in de meetresultaten (dus ook de opsplitsing van de matrixbulten) zijn veroorzaakt door fysisch/chemische veranderingen in de pre-kolom. Er was geen tijd meer, om dit verder te onderzoeken. 27

32 Conclusie De reproduceerbaarheid van de uitgevoerde experimenten is slecht. Meetresultaten konden bij herhaling van experimenten onder dezelfde meetomstandigheden niet meer verkregen worden. 28

33 6 Conclusies Door het toepassen van ionpaar chromatografie met behulp van eluens ph 6.4 en TBAHS mmol/l, is het mogelijk om zowel neutraal/zwak basische fenylureumherbiciden en triazinen als zure CFCZ's, bentazon en dinitrofenolen in afzonderlijke standaardoplossingen, te scheiden op een Cl8 analytische kolom. Gecombineerde toepassing van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie, bij een monstersamenstelling ph 6.5 en TBAHSO, 0.1 mmol/l, een elutietijd van 40 minuten en eluens met ph 6.4 en TBAHS mmol/l, maakt het mogelijk zowel neutrale en zwak basische als zure pesticiden te analyseren. Door het ontbreken van een goede scheiding tussen de FUH's en de CFCZ's, een bruikbare spectrumbibliotheek en specifieke golflengtes, bleek het niet mogelijk om alle pesticiden betrouwbaar te identificeren en te kwantificeren. De matrix ordt bij toepassing van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie ook bij neutrale ph-waarde geextraheerd en geelueerd en zorgt ervoor dat de pesticiden, met name bij oppervlaktewatermonsters, niet betrouwbaar ge'identificeerd en gekwantificeerd kunnen worden. Het is met de uitgevoerde experimenten niet (reproduceerbaar) gelukt de matrix invloed te verminderen. De reproduceerbaarheid van de uitgevoerde experimenten is slecht. Gelijke meetresultaten konden bij herhaling van experimenten onder dezelfde meetomstandigheden niet meer verkregen worden. De gelijktijdige analyse van zure, neutrale en zwak basische pesticiden in oppervlaktewater met behulp van ionpaar extractie en ionpaar chromatografie heeft niet tot een goed eindresultaat geleid, door het ontbreken van betrouwbare kwantificatie en door een slechte reproduceerbaarheid van de meetresultaten. 29

34 7 Aanbevelingen De dinitrofenolen elueren, onder de meetomstandigheden in dit onderzoek, traag van de PLRP-S pre-kolom en de Cl8 analytische kolom. Door het aanpassen van de gradient en de elutietijd is het wellicht mogelijk om deze componenten beter (betrouwbaarder) te analyseren. Er zou onderzocht kunnen worden of er veranderingen in de ph-waarde optreden gedurende de gradientverloop. Toevoegen van een geschikte bufferoplossing aan het eluens kunnen mogelijk ph schommelingen tijdens het gradientverloop opvangen. Onderzocht zou kunnen worden of het gebruik van TB AOH als ionpaarvormer en de extractie van het monster bij een ph waarde van ongeveer 8 a 9 betere resultaten oplevert. De aanwezigheid van OH' ionen zou er mogelijk voor kunnen zorgen dat de matrix minder goed geextraheerd kan worden. Met de in dit onderzoek gebruikte detectiemethode, DAD, konden niet alle pesticiden gei'dentificeerd worden. Dit kwam door het ontbreken van een spectrumbibliotheek van de dinitrofenolen en doordat de spectrumbibliotheken van de FUH's, triazinen en de CFCZ's en bentazon niet meer betrouwbaar te gebruiken waren. Door het veranderen van meetomstandigheden veranderden de spectra van de pesticiden, welke hierdoor niet meer met de bibliotheek overeenkwamen en daardoor niet meer te identificeren waren. Dat was soms erg lastig, omdat het daardoor niet mogelijk was te beoordelen of bijvoorbeeld alle zure pesticiden geextraheerd en geelueerd waren. Voor het aanmaken van een nieuwe spectrumbibliotlieek bij iedere verandering in de meetomstandigheid was geen tijd. Het verdient de aanbeveling om bij de ontwikkeling van een analysemethode voor de gelijktijdige analyse van zure, neutrale en zwak basische pesticiden, gebruik te maken van een detectiemethode waarbij de spectra van de pesticiden niet of nauwelijks veranderen bij verandering van de meetomstandigheden. Wellicht dat met een massaspectrometer de spectra van de componenten vrij constant blijven. Er zijn pre-kolommen die in staat zijn zonder toevoegingen van bijvoorbeeld een ionpaar vormer bij neutrale ph-waarde ionogene componenten te extraheren. Onderzocht zou kunnen worden of dergelijke kolommen [8] bruikbaar zijn voor de gelijktijdige analyse van zure, neutrale en zwak basische componenten in oppervlaktewater. 30

35 8 Literatuur 8.1 Literatuurverwijzingen 1. Inleiding over RIZA en AQUALARM informatie deels (letterlijk) afkomstig uit brochure "RIZA, deskundig in water". 2. Papadopoulou-Mourkidou, E. e.a.: Development of a semi-automated high-performance liquid chromatographic-diode array detection system for screening pesticides at trace level in aquatic systems of the Axios River basin, Journal of Chromatography A, 726 (1996) Brinkman, U. A. Th. e.a.: Trace-level detection and identification ofpolar pesticides in surface water: the SAMOS approach, Trends in analytical chemistry, 13 (1994) no Geerdink, R. B. e.a.: Determination of Phenoxy Acid Herbicides From Aqueous Samples by Improved Clean-up on Polymeric Pre-columns at HighpH, Analyst, 122 (1997) Lange, F. Th. e.a.: Automated Ion-pair Extraction and Ion-pair Chromatography - a Versatile Method in Water Analysis for the Determination of Highly Polar Micropollutants, Acta hydrochim. hydrobiol. 23 (1995) 1, Brouwer, E.: On-line trace enrichment in column liquid chromatography for the determination of organic micropollutants in surface water, Academisch proefschrift, 3.4 Simultaneous multiresidue determination of polar pesticides in water using multiprecolumn columnswitching system, biz Slobodnik, J.: Automation of hyphenated liquid and gas chromatographic systems in environmental analysis, Academisch proefschrift 2.1 en 2.2, SPE combined with LC: System for Automated Measurement of Organic micropollutants in Surface water, biz Pichon, V. e.a.: Simple removel of humic andfulvic acid interferences using polymeric sorbentsfor the simultaneous solid-phase extraction of polar acidic, neutral and basic pesticides, Journal of Chromatography A, 737 (1996) Poole, C. F. and Poole, S. K.: Chromatography today, Elsevier Science B.V., Amsterdam, third impression 1994, biz , ISBN (paperback) 10. Cappiello, A. e.a.: Determination of Acidic and Basic/Neutral Pesticides in Water with a New Microliter Flow Rate LC/MS Particle Beam Interface, Analytical Chemistry, 66 (1994) JI

36 11. Schiilein, J. e.a.: Comparison of different solid phase extraction material and techniques by application of multiresidue methods for the determination of pesticides in water by high-performance liquid chromatography (HPLC), Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 352 (1995) Balinova, A.: Solid-phase extraction followed bij high-performance liquid chromatographic analysis for monitoring herbicides in drinking water, Journal of Chromatography, 643 (1993) Corcia, A. Di, e.a.: Method Development for Monitoring Pesticides in Environmental Waters: Liquid-Solid Extraction Followed bij Liquid Chromatography, Environ. Sci. Technol. 26 (1992) Deelder, R. S.: Chromatografie, Bohn Stafleu Van Loghum, Houten/Zaventem, tweede druk 1994, Hoofdstuk 8 biz en hoofdstuk 10 biz , ISBN Nijveld, H.: Werkvoorschrift, bepaling van fenylureumherbiciden in (oppervlakte)water m.b.v. HPLC, nummer W , versie Nijveld, H.: Werkvoorschrift, bepaling van chloorfenoxycarbonzuren en bentazon m.b.v. HPLC, nummer W , versie Mud, R.: Onderzoek naar een HPLC bepalingsmethode voor herbiciden op dinitrofenol basis in (oppervlakte)water m.b.v. on-line preconcentratie en UV-detectie. Stage verslag HLO chemie, RIZA werkdocument OX, januari Fichtner, S. e.a.: Determination of aromatic sulfonates in the river Elbe by on-line ionpair extraction and ion-pair chromatography, Fresenius Journal of Analytical Chemistry 353(1995) The Agrochemicals Handbook, Second edition. The Royal Society of Chemistry, 1987, ISBN Geraadpleegde literatuur Applications of diode-array detection in HPLC, Hewlett-Packard Co., 1989, Publication Number Skoog, D. A. e.a.: Fundamentals of Analytical Chemistry, Saunders College Publishing, sixth edition 32

37 9 Bijlagen Bijlage 1 Bijlage 2 Bijlage 3 struktuurformules onderzochte verbindingen specificaties gebruikte chemicalien kranensysteem en extractie- en elutieprogramma PROSPEKT 33

38 Bijlage 1: struktuurformules onderzochte verbindingen 17,19 Chloorfenoxycarbonzuren (CFCZ) en bentazon MCPA a-/ VO-CH 2 -CO 2 H Me mecoprop ci 2,4 r 5-T C \ / Cl 0_CH 2- C0 2 H 2,4-D c ' M«fenoprop a-f Vo- CH r co? H ci '2 W Z' >*=\ I Cl (, \_0-CH C a :O 2 H dichlorprop MCPB CI-(* Mc I h O-CH-COjH Cl ( ^-0-[CH 2 ] 3 -C0 2 H Cl Mc 2,4-DB bentazone Cl-/ VO-CH^CHJ-C^-COJH C! CHMe

39 vervolg bijlage 1 Fenylureumherbiciden en triazinen metoxuron MeO ^ > - CO-NMt, *-0" HH T M C metobromuron linuron M. Cpri S^ ^N-C-NHMe methabenzthiazuron Cl-f V-NH-C N' OMc >=/ II ^M. Cf Me-/ ^-NH-C-NMe z chlorotoluron Br (f OMc V NH-C N' Y*S O "* chlorbromuron Cl isoproturon Mc 2 CH <f ^ NH-C NMc 2 diuron simazine Q~T NM*, CI monolinuron EtNH^^N.^NHCHMe, atrazine a / VNH-C-N OMe Cl chloroxuron c,-/~vo-/~* NH-C-NMe, Z II O

40 vervolg bijlage 1 Dinitrofenolen OH?,4-ninitrofenol NO; r OjN^^^-s^^CH-Et t OH dinoseb dinoterb 0,N CMt, DNOC 0 2 N^^- OH NO, dinocap OCOCH=CHMc OCOCH=CHMc 0 2 N i^chm«[ch 2 ] 5 M«0 2 N v Js v^n0 2 NO Z CHMelCH^Mi Mc I 0,N. ^s. ^CHEt dinobuton ^V^vO-C-OCHMc 2 NQ 2 O

41 Bijlage 2, specificaties (voor zover b ekend) van de gebruikte chemicalien naam CAS nummer z u i ve rh. /con centratie fabrikant artikelnr. Acetonitril analyzed HPLC solvent J.T. Baker Water analyzed HPLC reagent J.T Baker 4218 Methanol analyzed HPLC reagent J.T Baker Propanol Baker analyzed J.T. Baker 8067 TBAHSO* > 99% Fluka Zwavelzuur Natronloog MCPA % Riedel-de Haen MCPP (mecoprop) % Riedel-de Haen MCPB % Riedel-de Haen ,4-D % Riedel-de Haen ,4-DP (dichlorprop) % Riedel-de Haen ,4-DB % Riedel-de Haen ,4,5-T % Riedel-de Haen ,4.5-TP (fenoprop) % Riedel-de Haen Bentazon % Riedel-de Haen Metoxuron % Labor Dr Ehrenstorfer E Metabenzthiazuron % Labor Dr. Ehrenstorfer E Chloortoluron % Labor Dr. Ehrenstorfer E Isoproturon % Labor Dr. Ehrenstorfer E Diuron % Riedel-de Hafin Monolinuron % Labor Dr. Ehrenstorfer E Metobromuron % Labor Dr. Ehrenstorfer E Chlooroxuron % Labor Dr. Ehrenstorfer E Linuron % Riedel-de Haen Chloorbromuron 13360^*5-7 99% Labor Dr. Ehrenstorfer E Simazine postanal Riedel-de Haen Atrazine pestanal Riedel-de Haen ,4-dinitrofenol Riedel-de Haen dinoseb Riedel-de Haen dinoterb Riedel-de Hafin DNOC Riedel-de Haen dinocap Labor Dr. Ehrenstorfer E dinobuton Labor Dr. Ehrenstorfer E127900