Citation for published version (APA): Geel, T. M. (2010). Pompe disease: towards gene correction using targeted nucleases Groningen: s.n.

Transcriptie

1 University of Groningen Pompe disease Geel, Tessa Marieke IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2010 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Geel, T. M. (2010). Pompe disease: towards gene correction using targeted nucleases Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Chapter 10 Nederlandse samenvatting 133

3 Chapter 10 De ziekte van Pompe is een erfelijke stofwisselingsziekte die wordt gekenmerkt door stapeling van glycogeen in de lysosomen. Lysosomen zijn kleine organellen in een cel die met behulp van eiwitten (enzymen) verantwoordelijk zijn voor de afbraak en hergebruik van verschillende stoffen in de cel. Als één van die enzymen ontbreekt of niet goed functioneert dan vindt er stapeling plaats van (afval) stoffen. In geval van de ziekte van Pompe functioneert het enzym zure α-glucosidase slecht of helemaal niet. Het enzym zure α-glucosidase is normaal gesproken verantwoordelijk voor de afbraak van glycogeen, een vorm waarin suikers worden opgeslagen in de spieren en lever. Echter, door een tekort aan het zure α-glucosidase kan glycogeen niet worden afgebroken en vormt zich een ophoping van glycogeen in de lysosomen (zie Figuur 1). Deze stapeling vindt met name plaats in de spiercellen waardoor spierzwakte ontstaat. Het tekort aan zure α-glucosidase wordt veroorzaakt door een mutatie in het gen dat codeert voor het zure α-glucosidase. De positie van de mutatie bepaalt hoeveel enzymactiviteit er over is (ook wel restactiviteit genoemd) en bepaalt in grote lijnen de klinische presentatie. De patiënten kunnen dan ook onderling grote verschillen vertonen. De eerste symptomen kunnen al direct na de geboorte tot uiting komen, terwijl er ook patiënten zijn die op latere leeftijd ( >60 jaar) klachten krijgen. Uiteindelijk resulteert deze ziekte in de voortijdige dood van de patiënt. De ziekte van Pompe komt naar schatting 1 keer per geboorten voor en wordt gezien als een zeldzame ziekte. A B C Enzymvervangings therapie Lysosoom X Kern Normale situa e X Kern Lysosoom Ziekte van Pompe onbehandeld Geen GAA produc e X Kern Lysosoom Ziekte van Pompe behandeld Geen GAA produc e ER Golgi M6P receptor Glycogeen Glucose Zure -glucosidase Recombinant zure -glucosidase X Muta e in het gen coderend voor zure -glucosidase Figure 1. A. In a normale situatie wordt het zure α-glucosidase geproduceerd en getransporteerd naar de lysosomen in de cel. In de lysosoom is het zure α-glucosidase verantwoordelijk voor de afbraak van glycogeen tot glucose. Een portie van het zure α-glucosidase wordt uitgescheiden en kan weer opgenomen worden door een andere cel met behulp van een mannose-6-fosfaat receptor. B. In een patiënt met de ziekte van Pompe is er een tekort aan het zure α-glucosidase door een mutatie in het gen dat codeert voor het zure α-glucosidase. Door dit tekort aan het enzym ontstaat er een opeenhoping van glycogeen in de lysosomen. C. Enzymvervangingstherapie is op dit moment de enige therapie die beschikbaar is voor patiënten met de ziekte van Pompe. Via injecties wordt het recombinant zure α-glucosidase in het bloed gebracht. (zie voor kleuren figuur blz. 159) 134

4 Nederlandse samenvatting Onderzoek heeft er toe geleidt dat er een biotechnologische variant van het menselijk zure α-glucosidase (recombinant GAA) geproduceerd kan worden. Bij toediening zorgt deze variant voor de afbraak van glycogeen. Deze therapie, ook wel enzymvervangingstherapie genoemd, wordt sinds 2006 toegepast in de kliniek en zorgt er niet alleen voor dat de spierfuncties verbeteren in de loop van de tijd, ook de overlevingstijd van de patiënten neemt toe. Hoewel deze therapie de enige optie is voor de tot dusverre ongeneeslijke ziekte, zijn er een aantal nadelen die het succes ernstig belemmeren zoals hoge productie kosten, inefficiënte opname van het enzym en de noodzaak van levenslange behandeling. Hoofdstuk 2 geeft een gedetailleerd overzicht van de ziekte van Pompe, de behandelmethode als ook de mogelijke toekomstige behandelmethodes. Om de nadelige effecten van de enzymvervangingstherapie te omzeilen, worden verschillende nieuwe behandelmethodes onderzocht. In dit proefschrift worden twee mogelijke strategieën voor de behandeling van de ziekte van Pompe beschreven: 1. Verbetering van de huidige enzymvervangingstherapie 2. Correctie van de mutatie in het gen dat codeert voor het zure α-glucosidase. Het is algemeen bekend dat de opname van recombinant GAA in het menselijk lichaam zeer inefficiënt is omdat een groot gedeelte van het enzym wordt uitgescheiden in de urine. Dit noodzaakt de arts om de patiënten een hoge dosering toe te dienen om het gewenste effect te bereiken. Echter, zulke hoge doseringen kunnen leiden tot inductie van het afweerrespons in het lichaam. Bij patiënten, die helemaal geen zure α glucosidase aanmaken, kan het lichaam zelfs zeer heftig reageren op de toediening van recombinant GAA: Het lichaam ziet het recombinante GAA als lichaamsvreemd en zal daardoor antilichamen produceren om het recombinante GAA op te ruimen. Het is daarom van groot belang om 1) minder recombinant GAA en 2) verpakt/afgeschermd toe te kunnen dienen en toch het gewenste effect in de cel te bewerkstelligen. In het eerste gedeelte van dit proefschrift vroegen wij ons af of aflevering van recombinant GAA met behulp van positief geladen vetachtige moleculen, genaamd SAINT, kan leiden tot een verbeterde opname van recombinant GAA. Onze groep heeft eerder al beschreven dat moleculen zoals SAINT spontaan een interactie kunnen aangaan met DNA en RNA maar ook met eiwitten. SAINT kan hierdoor de aflevering van eiwitten, DNA of RNA in de cel bespoedigen. In de hoofdstukken 3 5 is deze strategie, eiwit aflevering in de cel met behulp van SAINT, verder onderzocht voor GAA en restrictie enzymen. In hoofdstuk 3 beschrijven we de opname van lysosomale enzymen met behulp van SAINT in huidcellen van patiënten met een lysosomale stapelingsziekte. Deze huidcellen worden doorgaans afgenomen bij de patiënt om de ziekte van Pompe of een andere lysosomale stapelingsziekte vast te stellen. Voor deze studie werden drie verschillende lysosomale enzymen gebruikt (betrokken bij drie verschillende lysosomale stapelingsziekten) om zo de mogelijke toepassing van SAINT voor deze aandoeningen te onderzoeken. Een belangrijke bevinding was dat alle enzymen functioneel afgeleverd konden worden in de huidcellen: In de loop van de tijd werd een verhoogde enzymactiviteit waargenomen, met name bij aflevering van recombinant GAA. In hoofdstuk 4 beschrijven we de aflevering van eiwitten, antilichamen en restrictie enzymen

5 Chapter 10 met behulp van SAINT in humane niercellen en muizen huidcellen. De experimenten toonden aan dat zowel het eiwit β-galactosidase als het antilichaam IgG efficiënt afgeleverd kon worden in niercellen. We vervolgden ons onderzoek met de aflevering van restrictie enzymen in muizen huid cellen. Van restrictie enzymen is bekend dat zij een bepaalde korte sequentie kunnen herkennen in het DNA en daar een knip kunnen veroorzaken in het DNA. Er zijn meestal veel herkenningssites aanwezig in het DNA, waardoor restrictie enzymen het DNA in meerdere stukken kunnen knippen (DNA fragmentatie). In deze studie laten we zien dat aflevering van een restrictie enzym in complex met SAINT leidt tot DNA fragmentatie in muizen huid cellen. Deze studie bevestigd de brede toepasbaarheid van SAINT om eiwitten, antilichamen en restrictie enzymen af te leveren in verschillende celtypen. Om SAINT te kunnen gebruiken voor zowel verbetering van de huidige enzymvervangingstherapie als ook voor gen correctie in de ziekte van Pompe is het wenselijk om GAA producerende cellen te kunnen bereiken. In hoofdstuk 5 hebben we de aflevering en biodistributie van SAINT onderzocht in een diermodel. In dit hoofdstuk beschrijven wij de aflevering van klein interfererend RNA (sirna) in GAA-producerende cellen. In deze studie hebben wij sirnas ontwikkeld tegen het GAA gen. SiRNA bestaat uit 20 tot 25 nucleotiden lang RNA dat bindt aan het mrna. Het mrna wordt door het sirna afgebroken en zorgt er zo voor dat er geen eiwit meer wordt aangemaakt wat resulteert in verlaging van GAA activiteit in de cel. Het tekort van GAA eiwit zorgt er voor dat er in de cel minder GAA eiwit uitgescheiden wordt in het plasma. Verlaging van GAA kan vastgesteld worden op zowel enzymactiviteit niveau als ook op mrna niveau. Uit de experimenten kwam naar voren dat toediening van sirna in complex met SAINT leidt tot een verlaging van GAA activiteit in het bloed. Dit resultaat werd waargenomen 14 dagen na de eerste toediening van sirna in complex met SAINT. Om vast te kunnen stellen welke cellen verantwoordelijk waren voor de GAA verlaging werd nader onderzoek gedaan. Biodistributie studies met radioactief gelabeld SAINT toonden aan dat het grootste deel van SAINT moleculen werd opgenomen in de lever. We waren echter niet in staat om vast te stellen welke subtype cellen in de lever de GAA producerende cellen zijn. Omdat SAINT in staat was om sirna af te leveren in GAA-producerende cellen in een in vivo setting, lijkt SAINT een goede kandidaat voor verbetering van de huidige enzymvervangingstherapie voor de ziekte van Pompe. Hoewel deze strategie veelbelovend is als behandeling, tot een genezing van de ziekte van Pompe zal het niet komen. Daarom hebben we in het tweede gedeelte van dit proefschrift onderzocht of gencorrectie een mogelijk toekomstige strategie kan zijn voor de ziekte van Pompe. Gencorrectie heeft als doel het gemuteerde DNA permanent te veranderen via homologe recombinatie. Homologe recombinatie is een proces waarbij één DNA segment wordt uitgewisseld met een zeer homoloog gebied van ander DNA molecuul. Omdat normaal gesproken de frequentie van homologe recombinatie in een cel erg laag is, is het maken van een dubbelstrengs breuk in het DNA een manier om de frequentie te verhogen. Bij het ontstaan van een dubbelstrengs breuk wordt er in de cel een signaal afgegeven om de breuk snel te herstellen via homologe recombinatie om blijvende schade te voorkomen. Dubbelstrengs breuken kunnen onder andere 136

6 Nederlandse samenvatting gemaakt worden door restrictie enzymen die een korte sequentie herkennen in het DNA. Omdat zulke herkenningssites veelvuldig voorkomen in het genoom, kunnen restrictie enzymen meerdere dubbelstrengs breuken veroorzaken in het DNA wat kan leiden tot geprogrammeerde celdood als de breuken niet meer op de juiste wijze kunnen worden hersteld. In hoofdstuk 6 beschrijven we de aflevering van verschillende restrictie enzymen met SAINT in ovarium kankercellen en bestuderen we de geprogrammeerde celdood van deze cellen. De experimenten toonden aan dat drie verschillende typen restrictie enzymen in staat zijn om meerdere breuken te veroorzaken in het DNA. Één restrictie enzym had echter de grootste potentie om geprogrammeerde celdood te veroorzaken in twee verschillende ovarium kankercel lijnen. De resultaten beschreven in hoofdstuk 6 laten zien dat efficiënte en functionele aflevering van restrictie enzymen in de kern van levende cellen met behulp van SAINT mogelijk is. Verder geeft deze studie aan dat SAINT een goede kandidaat kan zijn om als toekomstige therapie te dienen voor het elimineren van kanker cellen. Het is daarbij van belang om alleen de kankercellen te bereiken en niet de gezonde cellen. Dit kan door SAINT specifieke eiwitten te laten herkennen op de doelcellen. Onze onderzoeksgroep heeft aangetoond dat EpCAM, een eiwit dat verhoogd op het celoppervlak van verschillende typen kankercellen voorkomt, een goede target kan zijn. Koppeling van een antilichaam gericht tegen EpCAM aan SAINT kan er dus voor zorgen dat de restrictie enzymen alleen in kankercellen worden afgeleverd. Voor gen correctie is het niet zozeer van belang om cel specifiek te zijn maar het is juist van belang om gen specifiek te zijn. Om de specificiteit van restrictie enzymen te verhogen voor gencorrectie is het noodzakelijk om de enzymen bijvoorbeeld te koppelen aan een DNA bindend domein dat aan slechts één positie in het DNA kan binden. Een voorbeeld van een DNA bindend domein is een Triple Helix vormende Oligonucleotide (TFO) of een Zinkvinger Proteïne (ZFP). Deze TFO of ZFP kan een specifiek stuk DNA herkennen en op die plaats het restrictie enzym een DNA dubbelstrengs breuk laten maken. Middels deze zogenaamde targeted nucleasen kan een mutatie in het gen coderend voor het zure α-glucosidase vervangen worden door een correct stuk DNA via homologe recombinatie (zie Figuur 2). In dit proefschrift, hebben we ons geconcentreerd op het gebruik van een TFO als DNA bindend domein en hebben we onderzocht of TFO-nucleasen in staat zijn om homologe recombinatie te bewerkstelligen. In hoofdstuk 7 hebben we TFO s ontwikkeld voor zowel de humane als ook de muizen zure α-glucosidase, het gen dat gemuteerd is in de ziekte van Pompe. Vervolgens zijn de TFO s gekoppeld aan camptothecin, een compound die DNA schade veroorzaakt, of aan het restrictie enzym MunI. Deze werden vervolgens geanalyseerd voor hun binding aan het DNA, voor het aanbrengen van DNA schade en voor het bewerkstelligen van homologe recombinatie. Omdat bekend is dat in de kern van een cel het DNA in een zeer compacte structuur is gevouwen, is het lastig voor een TFO om te binden aan het DNA. In deze studie hebben we in eerste instantie ervoor gekozen om het homologe recombinatie proces te onderzoeken in een model systeem waarbij

7 Chapter 10 Restrictie enzym TFO -3 Zinc Finger Restrictie enzym + Correcte DNA sequence Homologe recombina e Gecorrigeerd gen Figuur 2. Gencorrectie strategie voor de ziekte van Pompe. Het gebruik van een TFO of Zincvinger gefuseerd aan een restrictie enzym zorgt ervoor dat het restrictie enzym alleen bij de mutatie een specifieke dubbelstrengs breuk aanbrengt. De dubbelstrengs breuk wordt hersteld door middel van het proces homologe recombinatie wanneer er een correct stuk DNA wordt aangeboden. Aangepast van A. Pingoud en G. Silva, Nature Biotechnology (zie voor kleuren figuur blz. 159) plasmiden worden gebruikt. De experimenten laten zien dat de ontwikkelde humane TFO s kunnen binden aan hun specifieke DNA sequentie en na aflevering in de cel met behulp van SAINT kunnen de TFO-fusies schade aanbrengen in het DNA. Verder is er een aanwijzing de TFO-fusies in staat zijn om homologe recombinatie te bewerkstelligen op plasmide niveau. Deze resultaten geven de potentie weer van targeted nucleasen en hun mogelijkheid om gen correctie toe te passen voor de ziekte van Pompe. Het onderzoek beschreven in hoofdstuk 7 opent nieuwe deuren voor de toekomst van de ziekte van Pompe. CONCLUSIE Voor de ziekte van Pompe is het van groot belang dat er nieuwe behandelmethodes ontwikkeld worden. De huidige enzymvervangingstherapie geeft weliswaar een verbeterd leven van de patiënt, de behandeling per patiënt wordt echter overschaduwd door de hoge kosten en doordat er te weinig rhgaa op de markt is. Daarnaast leidt het niet tot een echte genezing van de ziekte. 138

8 Nederlandse samenvatting De resultaten beschreven in dit proefschrift laten zien dat er nieuwe behandelmethodes mogelijk zijn voor de ziekte van Pompe. Enerzijds is verbetering van de huidige therapie middels SAINT een goed alternatief, anderzijds kan gen correctie met behulp van targeted nucleasen een nieuwe strategie zijn om de ziekte daadwerkelijk te genezen. Het is noodzakelijk om de twee strategieën verder te ontwikkelen en toekomstig onderzoek moet uitwijzen of de strategieën toepasbaar zijn in een klinische setting

9 140