Melk en Melkproducten

Transcriptie

1 Melk en Melkproducten Pathogene E. coli, een voedselpathogeen in opmars. Shiga toxine producerende E. coli (STEC) zijn voedselpathogenen die ernstige ziekte kunnen veroorzaken bij de mens. Ze vormen binnen de voedselgerelateerde zoönosen de vierde meest voorkomende groep in België, maar wat betreft de humane symptomen zijn ze één van de meest gevreesde. Runderen vormen als asymptomatische drager het belangrijkste reservoir. Besmetting naar de mens gebeurt veelal door de inname van besmette voedselproducten afgeleid van runderen, waaronder melk en melkproducten. Een brede waaier aan serogroepen is in staat om deze humane infecties te verwekken, maar de voornaamste zijn O26, O103, O111, O145 en O157. De STEC bacterie dankt zijn ziekteverwekkende vermogen aan een combinatie van virulentie-eigenschappen. De voornaamste zijn: de productie van shiga toxines type I en II, die verantwoordelijk zijn voor het aantasten van de nieren, de eiwitten gecodeerd op de LEE locus, verantwoordelijk voor de modificatie en intieme hechting aan de darmwandcellen, en het enterohemolysine, dat een rol speelt in de bloedafbraak. De combinatie van deze manifestaties heeft een complex ziektebeeld tot gevolg, het hemolytisch uremisch syndroom (HUS). In België worden jaarlijks gemiddeld 50 humane STEC infecties gerapporteerd, waarvan 50% veroorzaakt wordt door de serogroep O157 en een 20-tal patiënten HUS ontwikkelt (EFSA, 2009). Voedingsproducten afgeleid van runderen liggen doorgaans aan de basis van humane infecties, alsook rauwe groenten en drinkwater. Door faecale contaminatie van karkassen, irrigatie water of tijdens het melken, kan de STEC bacterie binnentreden in de voedselketen. In het kader van het monitoring programma voor voedingsmiddelen op de Belgische markt in 2009, werd geen E. coli O157 aangetroffen in kaas, boter en room stalen, behalve voor rauwmelkse geitenkaas werd één staal positief bevonden (Anonymus, 2010). In een studie van De Reu et al. (2004) en niet gepubliceerde resultaten van De Reu et al. (2009) werden anderzijds in respectievelijk 0.7 % en 0.8 % van de Belgische rauwe hoevemelk monsters E. coli O157 aangetroffen. Voor voedingsmiddelen liggen de prevalenties typisch tussen 0-2%, zoals blijkt uit rapporteringen van de Europese Unie van (EFSA, 2009). Doch, afhankelijk van de toegepaste methode kunnen resultaten sterk variëren. Indien men moleculaire detectie methoden toepast, gebaseerd op het detecteren van genetisch materiaal van de pathogeen, bekomt men zeer hoge prevalenties tussen 5 30% voor rauwe melk en kaas (Jordan et al., 2010; Fach et al., 2001; Pradel et al., 2000; Vernozy et al., 2005). Maar, het detecteren van STEC DNA in een staal, wijst niet automatisch op de aanwezigheid van een levend, virulent organisme. Evenmin werd aangetoond dat de gedetecteerde virulentie genen zich binnen één organisme bevinden. Dit geldt ook voor de isolaten, die vaak geen combinatie van de stx en LEE genen bevatten en in dat geval als relatief weinig virulent worden beoordeeld. Mogelijks biedt dit een verklaring voor het minder voorkomen van humane STEC infecties. Dat voorzichtigheid bij (rauwmelkse) zuivelproducten aangewezen is, blijkt duidelijk uit een voorval in oktober 2007 waarbij vijf kinderen ernstige nierschade opliepen na het eten van hoeve-ijs dat besmet was met STEC. Niet de serogroep O157, maar serogroepen O26 en O145 werden geïsoleerd. De niet-sorbitol-fermenterende (NSF) O157 stammen zijn het meeste bestudeerd. Voor deze groep is namelijk een internationaal gestandaardiseerde isolatiemethode voor levensmiddelen en diervoeders (ISO 16654) beschikbaar, die fungeert als gouden standaard. De methode is gebaseerd op fenotypische kenmerken van het organisme, zoals verhoogde resistenties en enzymatische eigenschappen. Via een klassieke cultivering wordt de NSF O157 stam geïsoleerd in ca. 4 dagen. In eerste instantie wordt het staal selectief aangerijkt met toevoeging van antibiotica 23

2 (novobiocine), gedurende 6 u bij een relatief hoge temperatuur (41,5 C). Vervolgens wordt immunomagnetische scheiding (IMS) toegepast op het aangerijkte staal. Hierbij worden E. coli cellen met serogroep O157 aan magnetische parels gehecht m. b. v. antilichamen (zie figuur 1). Vervolgens worden de parels op twee selectieve agar media gebracht, waaronder CT-SMAC, dat selectieve (galzouten, kristal violet, cefixime en telluriet) en electieve (sorbitol en BCI-glucuronide) componenten bevat om E. coli O157 te isoleren en te herkennen. Bevestiging van verdachte kolonies wordt verkregen met de indol- en agglutinatie-test. Indien geen E. coli O157 isolaat verkregen wordt, dient de isolatie procedure herhaald te worden voor het 24u-aangerijkte staal. Als alternatief voor deze arbeidsintensieve methode erkent het FAVV het gebruik van een reeks alternatieve methoden, met name Rapid E. coli O157:H7, VIDAS ECO, VIDAS UP E. coli O157 including H7, IQ-Check E. coli O157:H7, GeneDisc E. coli O157:H7, HQS E. coli O157:H7, BAX E. coli O157:H7 MP, BAX Real-Time PCR Assay E. coli O157:H7 en MICROSEQ E. coli O157:H7. Met de klassieke isolatie methode Rapid E. coli O157:H7 wordt sneller een resultaat verkregen en zijn minder agar media vereist. De VIDAS systemen steunen op een immunologische detectie van de pathogeen, de IQ Check, GeneDisc, HQS, MICROSEQ en BAX systemen op een DNA-detectie van de pathogeen m. b. v. PCR, en enkel bij positieve resultaten dient een isolatie procedure uitgevoerd te worden. Kortom, de klassieke ISO cultuur methode is omslachtig en gevalideerde alternatieven zijn beschikbaar. Maar, specifieke voor- en nadelen zijn verbonden aan elke methode. Figuur 1: Dynal staal mixer voor het bevorderen van de binding van STEC bacteriën uit het aangerijkte voedingsstaal aan immunomagnetische parels die gecoat zijn met specifieke antilichamen. 24

3 Momenteel is er geen internationale standaard methode voorhanden voor de detectie en isolatie van STEC stammen die niet tot de serogroep O157 behoren. Dit, vanwege het gebrek aan uniforme fenotypische eigenschappen. Onderzoekers hanteren verschillende aanrijkingsmedia met toevoeging van selectieve componenten alsook IMS voor de voornaamste serogroepen (O26, O103, O111 en O145). PCR-gebaseerde methoden werden beschreven voor de detectie van de voornaamste virulentie genen of serogroepen in stalen. Verschillende agar media werden beschreven, waaronder ramnose-macconkey Agar, enterohaemolysin agar of de bodem ontwikkeld door het ILVO (Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek) en de Universiteit Gent en beschreven door Possé et al (2008) voor STEC O26, O103, O111 en O145 (zie figuur 2). Verder worden nog een hele reeks alternatieve methoden gehanteerd, zoals de kolonie-hybridisatie of serologische isolatie technieken. Opnieuw kunnen we stellen dat aan elke methode voor- en nadelen gekoppeld zijn, maar in tegenstelling tot E. coli O157, werd voor de andere STEC serogroepen nog geen gestandaardiseerde methode ontwikkeld. Figuur 2: Isolatie medium voor STEC O26, O103, O111, O145 en SF O157, zoals beschreven door Possé et al. (2008). 25

4 Referenties: The EFSA Journal , Anonymus, Trends and Sources; Report on zoonotic agents in Belgium, De Reu, K., Grijspeerdt, K., Herman, L A Belgian survey of hygiene indicator bacteria and pathogenic bacteria in raw milk and direct marketing of raw milk farm products. Journal of food safety. 24, Fach, P., Perelle S., Dilasser, F., Grout, J Comparison between a PCR-ELISA and the vero cell assay for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli in dairy products and characterization of virulence traits of the isolated strains. Journal of Applied Microbiology. 90, Jordan, K., Murphy, M., Lynch, M. J Verocytotoxigenic Escherichia coli O157, O111, O26, O103, O145 in Irish dairy cattle and raw milk: prevalence and epidemiology of emergent stains. Submitted to World Dairy Summit Auckland, Pradel, N., Livrelli, V., De Champs, C., Palcoux, J. B., Reynaud, A., Scheutz, F., Sirot, J., Joly, B. Forestier, C Prevalence and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from cattle, food, and children during a one-year prospective study in France. Journal of Clinical Microbiology. 38, Vernozy-Rozand, C., Montet, M. P., Berardin, M., Bavai, C., Beutin, L Isolation and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from raw milk cheeses in France. Letters in Applied Microbiology. 41, Karen Verstraete en Koen De Reu (ILVO T&V, Melle) Karen.Verstraete@ilvo.vlaanderen.be en Koen.Dereu@ilvo.vlaanderen.be Normatieve en wettelijke ontwikkelingen Nieuwe IDF- FIL (International Dairy Federation Fédération International de Laiterie) normen in (verschenen tussen 9 oktober 2010 en 14 maart 2011) (Last update website 26th October 2010) Normen: Nieuwe: ISO IDF 214: Milk - Determination of lactose content Enzymatic method using difference in ph ISO IDF 220: Milk products - Enumeration of presumptive bifidobacteria - Colony count technique at 37 degrees C ISO 2962 IDF 033: Cheese and processed cheese products -Determination of total phosphorus content - Molecular absorption spectrometric method Vervallen in 2010: IDF 027: Determination of the ash content of processed cheese products. IDF 098A: Milk - Determination of protein content Amido Black dye-binding method (routine method) IDF 102A: Dried milk - Guideline for the detection of neutralizers. IDF 112A: Butter - Determination of water dispersion value IDF 114: Dried milk - Assessment of heat class - Heat-number reference method 26

5 Andere nuttige IDF publicaties: Bulletin of the IDF No. 447/ New Applications of Mid Infra-Red Spectrometry for the Analysis of Milk and Milk Products Bulletin of the IDF No. 446/ The World Dairy Situation 2010 Bulletin of the IDF No. 445/ A common carbon footprint approach for dairy - The IDF guide to standard lifecycle assessment methodology for the dairy sector Koen De Reu (ILVO-T&V) Jessy Claeys (ILVO-T&V) Koen.Dereu@ilvo.vlaanderen.be Jessy.Claeys@ilvo.vlaanderen.be 27