Voor- en nadelen van natuurlijke en recombinant allergenen

Transcriptie

1 Voor- en nadelen van natuurlijke en recombinant allergenen Trefwoorden - type-1-allergie - graspollen - huisstofmijt - allergeenstandaardisatie - recombinantallergenen Samenvatting Op 19 september 2003 promoveerde Erica van Oort op het proefschrift getiteld: Pros and Cons of Natural and Recombinant Allergens bij prof. dr. R.C. Aalberse en co-promotor dr. R. van Ree verbonden aan de Universiteit van Amsterdam. Het onderzoek vond plaats binnen Sanquin op de afdeling immunopathologie te Amsterdam. Hieronder volgt een korte beschrijving van haar onderzoek. (Ned Tijdschr Allergie 2004;4: ) Auteur E. van Oort Inleiding Sinds het begin van de vorige eeuw worden allergeenextracten gebruikt voor de diagnose en behandeling van type-1-allergieën. Een nadeel verbonden aan het gebruik van extracten is dat er geen specifieke immuuntherapie mogelijk is, omdat er meerdere allergenen in het extract zitten. Dit heeft mogelijk tot gevolg dat patiënten gesensibiliseerd raken voor deze allergenen. Daarnaast kan de concentratie en samenstelling van de extracten wisselen, wat ook gevolgen heeft voor de immuuntherapie en allergiediagnostiek. Door de ontwikkelingen in de biotechnologie zijn er perspectieven voor vernieuwing van deze producten ontstaan. Zo heeft de introductie van monoklonale antistoffen de karakterisatie en standaardisatie van allergeenextracten verbeterd en zijn efficiëntere zuiveringsmethoden ontwikkeld. Recombinanttechnieken maken het mogelijk om allergenen op grotere schaal en op meer reproduceerbare wijze na te maken, in zowel prokaryoteals eukaryote-expressiesystemen. Inmiddels is het ook mogelijk geworden om met behulp van moleculaire technieken mutaties in recombinanteiwitten aan te brengen, waardoor de allergeniciteit van het eiwit beïnvloed kan worden. Hiermee zouden hypoallergenen kunnen worden gecreëerd waardoor het mogelijk wordt op gecontroleerde wijze desensibilisatie toe te passen bij patiënten met type-1-allergieën. Deze proefschriftbespreking behandelt de toepassing van de verschillende recombinanttechnieken bij het onderzoek naar allergenen. Tevens worden verschillende voor- en nadelen van de productie van recombinant graspollen- en huisstofmijtallergenen in gist en tabaksplanten besproken. 1 Deze recombinantallergenen kunnen worden gebruikt om de allergiediagnostiek te verbeteren en om specifieke immuuntherapie mogelijk te maken. Verder worden de op monoklonale-en/of polyklonale antistoffen gebaseerde assays zoals ELISA en RIA, op toepasbaarheid voor standaardisatie van deze allergenen getest. Daarnaast worden zuiveringsmethoden voor recombinant en/of natuurlijke major allergenen beschreven. 2 Een aantal voor type-1-allergieën relevante allergenen zullen in dit kader achtereenvolgens worden besproken. Graspollengroep-1-allergenen De graspollengroep-1-allergenen zijn homologe glycoproteïnen die verantwoordelijk zijn voor 95% van de IgE-reactiviteit binnen de groep van graspollen gesensibiliseerde patiënten. Verschillende methodes voor de zuivering en meting van graspollengroep-1-allergenen van Dactylis glomerata (Dac g 1) of Kropaar werden onderzocht. Het blijkt dat afhankelijk van het soort extract en de zuiveringsmethode varianten van Dac g 1-allergenen gemist kunnen worden. Zo kunnen bijvoorbeeld bij het extraheren van allergenen uit pollen alleen al door het al dan niet toevoegen van zout, variaties ontstaan in het voorkomen van Dac g 1-varianten. In 158 AUGUSTUS-SEPTEMBER NR.4

2 OD 280 mm Elutie in ml Figuur 1. Gelfiltratie graspollengroep-1-allergenen (HMr en IMr Dac g 1). Een waterextract Dac g-h 2 O (- -) en een PBS/zoutextract Dac g-pbs (- -) zijn na zuivering over de Phenyl Sepharose kolom gescheiden op molecuulgewicht. Het resultaat is te zien in dit figuur. De scheiding resulteert in 3 of 4 eiwitpieken, afhankelijk van het soort extract. De eerste eiwitpiek met groep- 1 elueert na 280 ml en bevat Dac g-1-variant- 1 (laan 1, immunoblot). De tweede eiwitpiek met Dac g 1 elueert na 324 ml en bevat Dac g- 1-variant-2 (laan 2, immunoblot), deze piek is alleen in het PBS/zoutextract aanwezig. Dit figuur demonstreert dat afhankelijk van het soort extract varianten van het groep-1-graspollenallergeen wel of niet gezuiverd zullen worden. figuur 1 op pagina 159 is te zien dat zowel variant 1 als variant 2 in het zoutextract (PBS) terug te vinden zijn, in tegenstelling tot het waterextract waar variant 2 niet is in aan te tonen (piek afwezig). Uiteraard kunnen deze verschillen de kwantificering en daarmee de standaardisatie van major-allergenen in extracten bemoeilijken. Voor allergiediagnostiek maar ook voor specifieke immuuntherapie is een homogeen, zuiver en gestandaardiseerd preparaat onontbeerlijk, recombinantallergenen zouden daar een oplossing voor kunnen vormen. Graspollengroep-1-allergenen zijn echter moeilijk als recombinantallergeen te produceren. Om toch een homogeen preparaat te verkrijgen dat voldoet aan bovengenoemde voorwaarden, werd een zuiveringsmethode voor natuurlijk Dac g 1 opgezet. Een meer succesvolle zuiveringsmethode kon worden ontwikkeld door verschillende technieken te combineren zoals extractie in water, hydrofobe interactiechromatografie en gelfiltratie. Graspollengroep-5-allergenen In tegenstelling tot de groep-1-graspollenallergenen zijn de groep-5-allergenen niet geglycosyleerd. Groep-5-allergenen geven in 85% van de gevallen IgE-reactiviteit bij graspollengesensibiliseerde patienten. Karakterisatie door middel van gelfiltratie heeft aangetoond dat groep-5-allergeen van Dactylis glomerata graspollen (Dac g 5) voornamelijk als dimeer in een extract voorkomt. Ook bevindt zich een halfmolecuul met groep-5-reactiviteit in Dac g- extracten. Dit laatste molecuul blijkt de C-terminale helft van Dac g 5 te zijn en zich ook als dimeer te gedragen, maar een lage biologische activiteit te bezitten (geeft weinig histamine release). Sommige groep-5-specifieke immunoassays reageren beter met de dimeer van het hele molecuul, dan met de dimeer van het C-terminaalfragment. Voor standaardisatiedoeleinden kunnen deze assays de voorkeur genieten boven de assays die ook het halfmolecuul detecteren, omdat het halfmolecuul niet bijdraagt aan de biologische activiteit. Behalve de karakterisatie van natuurlijk Dac g 5 is ook de productie van recombinant Dac g 5 in de gist Pichia pastoris beschreven. In tegenstelling tot het natuurlijk allergeen blijkt het recombinanteiwit te worden geglycosyleerd, hetgeen echter niet van invloed is op de binding van groep-5-specifieke IgE-antistoffen uit patiëntenserum. Dit blijkt uit de IgE-reactiviteit van natuurlijk- versus recombinantallergeen in de RAST (zie figuur 2, op pagina 160). 3 Wellicht zou derhalve recombinant Dac g 5 gebruikt kunnen worden voor verbetering van allergiediagnostiek en de mogelijkheid tot specifieke immuuntherapie kunnen creëren. Huisstofmijtallergenen Der p 1 of groep-1-allergeen van de huisstofmijt Dermatophagoides pteronyssinus, is een glycoproteïne met protease-activiteit. 4 Ook dit allergeen is moeilijk als recombinant te produceren en is alleen in Pichia pastoris tot expressie te brengen als pro-enzym (dit is een niet-actief enzym door aanwezigheid van een signaalsequentie). Het sterk Nederlands Tijdschrift voor Allergie 159

3 Figuur 2. RAST met 42 graspollenpositieve patiënten. Vergelijking van de IgErespons (in IU/ml) tussen ndac g 5 (X-as) en rdac g 5.01 (Y-as). Figuur 3. Histamine release assay met een BSA-neoglycopeptide. Test is uitgevoerd met een serum dat zowel IgE-antistoffen tegen graspolleneiwitten als IgE-antistoffen tegen suikergroepen bevat. Het verschil in histamine release verkregen na stimulatie met een allergeen (eiwitepitoop), ndac g 5 ( ) of een stimulans met kruisreactieve suikergroepen, BSA-neoglycopeptide ( ) wordt gedemonstreerd. Minder dan 0,1 ng/ml ndac g 5 is nodig om 20% histamine release te verkrijgen in tegenstelling tot minimaal 7 ng/ml voor de suikergroepen. De negatieve controle geeft geen histamine release ( ). % vrijgave histamine rdac g 5.01 IU/ml ,1 0, Ratio: 1.02 ndac g 5 IU/ml 0,0001 0,001 0,01 0, ug/ml allergeen geglycosyleerde recombinantallergeen dat dan door de gist wordt geproduceerd, blijkt na verwijdering van de suikers deels zijn signaalsequentie te zijn kwijt geraakt. Naast verwijdering van suikers blijkt incubatie van het recombinantallergeen met enzymatisch actief natuurlijk Der p 1 ook tot partiële verwijdering van de signaalsequentie te leiden. De IgE-reactiviteit van het recombinant pro-der p 1 correleert sterk met die van het natuurlijk allergeen, hoewel de IgE-titers tegen het natuurlijk allergeen hoger zijn. 5 Recombinant pro- Der p 1 zou geschikt kunnen zijn voor specifieke immuuntherapie. Het gebruik van geglycosyleerde eiwitten in diagnostische testen De glycosylering van recombinant Dac g 5 door P. pastoris blijkt te bestaan uit meerdere korte mannose-bevattende-o-gebonden suikerketens. Deze mannose-bevattende glycanen blijken aanleiding te geven tot vals positieven in diagnostische testen bij patiënten met invasieve schimmelinfecties (ABPA). De IgE-antistoffen ontwikkeld tegen deze schimmel blijkt bij sommige patiënten kruisreactief te zijn met de gistsuikers aanwezig op recombinantallergenen. Een vergelijkbaar probleem doet zich voor bij IgG-antistoffen in sera van gezonde controledonoren. Het merendeel van deze sera bevat IgG-antistoffen die reactief zijn met de gistsuikers op het recombinantallergeen en dus niet met het natuurlijk allergeen. Bij de invoering van (geglycosyleerde) recombinantallergenen zou rekening moeten worden gehouden met dit soort kruisreacties. IgE-antistoffen met specificiteit voor suikerstructuren zijn ook beschreven voor plantaardige glycoproteïnen (CCD, Crossreactive Carbohydrate Determinants). 6 Binnen dit onderzoek is een model ontwikkeld om de aan- of afwezigheid van klinische relevantie van deze tegen plantensuikers gerichte IgE-antistoffen aan te tonen. 7 Het groep-2- allergeen van de huisstofmijt, Der p 2, is hiervoor gemuteerd waardoor op twee plaatsen suikerbindingsplaatsen werden geïntroduceerd. Expressie in tabaksplanten zorgde voor de IgE-reactieve plantensuikers (maximaal 2 bindingsplaatsen). 8 BSA (albumine) met daaraan artificieel 3 tot 4 plantensuikers gekoppeld, zorgde voor de meervoudige IgE-bindingsplaatsen. 9,10 Histamine release-experimenten uitgevoerd met gemuteerd Der p 2 en dit artificieel BSA, suggereren dat er 4 suikergroepen op een eiwit zouden moeten zitten om biologische activiteit van IgE-antistoffen tegen plantensuikers te kunnen meten. En zelfs dan is de activiteit 100- maal lager dan in geval van IgE-antistoffen tegen niet-suiker epitopen (zie figuur 3). Conclusies Pichia pastoris kan gebruikt worden om recombinantallergenen (Dac g 5 en Der p 1) te produceren voor verbetering van allergiediagnostiek en de invoering van specifieke immuuntherapie. Voor andere allergenen zoals Dac g 1, lijkt gerichte zuivering uit natuurlijke bron het beste alternatief voor het verkrijgen van specifieke preparaten voor bovengenoemde applicaties. Hoewel glycosylering soms nodig is voor de stabiliteit en correcte vouwing van een eiwit, is tevens aangetoond dat het tot een verminderde specificiteit van diagnostische testen kan leiden. Dit geldt zowel voor recombinanteiwitten verkregen uit gist als uit tabak. Wellicht zou de detectie van laagbiologisch actieve plantensuikerspecieke-igeantistoffen in allergiediagnostiek vermeden moe- 160 AUGUSTUS-SEPTEMBER NR.4

4 A ANWIJZINGEN VOOR DE PRAKTIJK 1. De extractiebuffer maar ook de zuiveringsmethode bepaalt hoeveel en welke varianten er van een major -allergeen uiteindelijk in een extract zitten. Dit kan per commercieel product dus erg verschillen. 2. Voor verbetering van allergiediagnostiek en het mogelijk maken van specifieke immuuntherapie wordt er onderzoek gedaan naar de standaardisatiemogelijkheden van extracten en het produceren van recombinantallergenen die standaardisatie verder kunnen vergemakkelijken. 3. De laagbiologische activiteit van IgE-antistoffen tegen plantensuikers lijkt te verklaren waarom veel patiënten met deze antistoffen geen overgevoeligheidsreacties tegen voedselallergenen (of te wel, de suikers op eiwitten in plantaardig voedsel) vertonen. Bij gebrek aan klinische relevantie zou de meting van deze IgE-antistoffen in allergiediagnostiek misschien moeten worden vermeden. ten worden. Uit het hier beschreven onderzoek is gebleken dat pas bij 4 suikergroepen er enige biologische activiteit van deze anti-ccd-antistoffen te meten is. Er zijn niet veel eiwitten die zoveel suikergroepen bevatten, hetgeen de afwezigheid van overgevoeligheid bij de meeste patiënten met anti-ccd-antistoffen zou kunnen verklaren. De resultaten in dit proefschrift illustreren dat elk allergeen een eigen benadering vereist, wil het uiteindelijk bruikbaar zijn voor allergiediagnostiek en/of immuuntherapie. Referenties 1. Aalberse RC, Koshte V, Clemens JG. Immunoglobulin E antibodies that crossreact with vegetable foods, pollen, and Hymenoptera venom. J Allergy Clin Immunol 1981;68: Van Ree R, van Leeuwen WA, Aalberse RC. How far can we simplify in vitro diagnostics for grass pollen allergy?: A study with 17 whole pollen extracts and purified natural and recombinant major allergens. J Allergy Clin Immunol 1998;102: Van Oort E, de Heer PG, Lerouge P, Faye L, Aalberse RC, van Ree R. Immunochemical characterization of two Pichia pastoris-derived recombinant group 5 Dactylis glomerata isoallergens. Int Arch Allergy Immunol 2001;126: Chapman MD and Platts-Mills TA. Purification and characterization of the major allergen from Dermatophagoides pteronyssinus-antigen P1. J Immunol 1980;125: Van Oort E, de Heer PG, van Leeuwen WA, Derksen NI, Muller M, Huveneers S et al. Maturation of Pichia pastorisderived recombinant pro-der p 1 induced by deglycosylation and by the natural cysteine protease Der p 1 from house dust mite. Eur J Biochem 2002;269: Van Ree R, Cabanes-Macheteau M, Akkerdaas J, Milazzo JP, Loutelier-Bourhis C, Rayon C, et al. Beta(1,2)-xylose and alpha(1,3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. J Biol Chem 2000;275: Mari A, Lacovacci P, Afferni C, Barletta B, Tinghino R, Di Felice G, et al. Specific IgE to cross-reactive carbohydrate determinants strongly affect the in vitro diagnosis of allergic diseases. J Allergy Clin Immunol 1999;103: Faye L, Gomord V, Fitchette-Laine AC, Chrispeels MJ. Affinity purification of antibodies specific for Asn-linked glycans containing alpha 1-->3 fucose or beta 1-->2 xylose. Anal Biochem 1993;209: Fotisch K, Altmann F, Haustein D, Vieths S. Involvement of carbohydrate epitopes in the IgE response of celery-allergic patients. Int Arch Allergy Immunol 1999;120: Batanero E, Crespo JF, Monsalve RI, Martin-Esteban M, Villalba M, Rodriguez R. IgE-binding and histamine-release capabilities of the main carbohydrate component isolated from the major allergen of olive tree pollen, Ole e 1. J Allergy Clin Immunol 1999;103: Correspondentieadres auteur: Mw. dr. ing. E. van Oort, postdoc Universitair Medisch Centrum Utrecht Divisie Biomedische Genetica Afdeling Complexe Genetica Universiteitsweg 100 Huispostnummer Stratenum CG Utrecht Tel: Fax: e.oort@med.uu.nl Dit onderzoek is gesponsord door Stallergènes S. A., Altadis, ANVAR en CNRS. Nederlands Tijdschrift voor Allergie 161

5 162 AUGUSTUS-SEPTEMBER NR.4

6