Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation.

Transcriptie

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Mildner, Michael Title: A human organotypic knock-down skin model to study molecules involved in epidermal keratinocyte differentiation. An alternative to knock-out animal experiments in dermatological research Issue Date:

2 NEDERLANDSE SAMENVATTING De epidermis vormt de primaire barrière die organismen beschermt tegen dehydratie, het ontstaan van schade door chemische en fysieke stress en het binnendringen van pathogenen. De ontwikkeling van een epidermale barrière is essentieel voor het leven op aarde en veranderingen in dit proces kunnen leiden tot huidziekten en zelfs de dood tot gevolgen hebben. De opheldering van de processen die tot de vorming van een epidermale barrière leiden is daarom een belangrijk onderzoeksveld. Organoide huidmodellen worden al tientallen jaren in dermatologisch onderzoek gebruikt. Deze modellen kunnen eenvoudig worden opgezet, ze zijn zeer reproduceerbaar en diverse aspecten van normale huid worden in deze modellen teruggevonden. Om deze redenen zijn deze modellen een standaard techniek in dermatologisch onderzoek geworden, met name voor onderzoek naar mechanismen en moleculen die betrokken zijn bij terminale keratinocyt differentiatie en de vorming van de barrière functie van de huid. Hoewel de organoide huidmodellen algemeen geaccepteerd zijn werden experimenten om de werking van individuele genen te bestuderen via introductie of deletie van genen vaak nog uitgevoerd in proefdieren. Echter, deze aanpak heeft diverse nadelen. Het zijn langdurige experimenten en de interpretatie van de onderzoeksgegevens, vooral in de huid, is vaak moeilijk. Indirecte effecten, onder andere door in de huid aanwezige cellen van het immuunsysteem, kunnen interfereren in de barrière functie of differentiatie van cellen. Door gebruik te maken van een humaan in vitro model zouden de effecten van gendeletie op keratinocyt differentiatie en de ontwikkeling van de epidermis direct bestudeerd kunnen worden. Door de ontwikkeling en verfijning van zowel in vitro als in vivo experimentele systemen is in de afgelopen 20 jaar fundamenteel inzicht verkregen in dit proces en dit heeft tevens geleid tot een verbeterd inzicht in de processen die leiden tot diverse huidziekten. Het werk beschreven in dit proefschrift heeft hier aan bijgedragen. Het doel van de studie was het ontwikkelen van een robuust en reproduceerbaar humaan in vitro huidmodel dat geschikt was voor het uitschakelen van de functie van individuele genen en het bepalen van de gevolgen hiervan op epidermale celdifferentiatie

3 Tevens werd hiermee beoogd een alternatief voor dierexperimenteel werk te ontwikkelen. Onze aanpak heeft tot nieuw inzicht in de rol van diverse differentiatie gerelateerde gen in de vorming van de epidermale barrière functie geleid. Er werd specifiek gekeken naar de rol van matriptase-1 (Hoofdstuk 3 and 4), DNase1L2 (Hoofdstuk 5), DNase 2 (Hoofdstuk 6), filaggrin en zijn afbraakprodukten (Hoofdstuk 7), alsmede histidase (Hoofdstuk 8) in de vorming van de epidermale barrière. Het organoide gen-deletie huidmodel als alternatief voor dierexperimenteel onderzoek Een van onze hoofddoelen was de ontwikkeling van een human gen-deletie huidmodel om zo de effecten van deze deleties in vitro te kunnen bestuderen. In hoofdstuk 3 analyseerden wij huidcultures waarin twee genen waren uitgeschakeld die eerder in zogenaamde knock-out muis modellen. Hierbij werd gekozen voor de knock-down van VEGF, die in de muismodellen geen invloed op het epidermale phenotype vertoonde; en voor knock-down van matriptase-1, dat een ernstige phenotypische verandering in het muizenmodel tot gevolg had. Bij de vergelijking tussen het in vitro organoide knock-down huidmodel met de muizenmodellen bleek dat er veel overeenkomsten waren. Zo had de remming van de VEGF expressie geen invloed op de epidermale ontwikkeling en werden defecten in keratinocyt differentiatie en de vorming van het stratum corneum gevonden na remming van de expressie van matriptase-1. Verder werd gevonden dat matriptase-1 deficiëntie leidde tot een defect in de processing van filaggrin, vergelijkbaar met de observaties in het in vivo model. Deze bevindingen suggereerden dat het in vitro organoide knock-down huidmodel een nieuw en zeer bruikbare nieuwe methode is voor de bestudering van de rol van genen en genproducten in epidermale ontwikkeling en vorming van een functionele barrière. De rol van Matriptase-1 bij de vorming van de epidermale barrière in gezonde en aangedane huid Onze studies in het oragnoide knockdown huidmodel bevestigende voor de eerste maal de rol van matriptase-1 in de vorming van het stratum corneum formation in de

4 mens (Chapter 3). Vergelijkbaar met de observaties in het muizenmodel leidde matriptase-1 knock-down in het in vitro model tot hyperkeratosis, dat ook gezien wordt in sommige vormen van ichthyosis. In tegenstelling tot de observaties in het muizenmodel vonden wij ook een uitgesproken parakeratosis, met de daarbij behorende typische retentie van celkernen in het stratum corneum. Aangezien parakeratosis bij uitstek gezien wordt bij psoriasis onderzochten wij de expressie van matriptase-1 in huidlaesies van patiënten met psoriasis en vonden dat de expressie en activiteit hiervan in deze laesies bijna volledig ontbrak (Chapter 4). In contrast met autosomale recessive Ichthyosis met hypotrychosis, waar een mutatie in het gen dat codeert voor matriptase-1 is verantwoordelijk voor de aandoening, wordt bij psoriasis gedacht dat ontregeling van de expressie van pro-inflammatoire cytokinen, in het bijzonder de verhoogde productie van TNF het ziekteproces aanstuurt. In oveereenstemming hiermee vonden wij dat incubatie van keratinocyten met TNF leidde tot een sterke reductie van de expressie van matriptase-1, en we konden aantonen dat de intracelllaire IKK2/NF B signall transductie route hierin een cruciale rol speelt. Daarnaast vonden wij dat het toevoegen van TNF aan organoide huidcultures hyper- and parakeratosis tot gevolg had an dat dit gepaard ging met het verlies van de expressie van matriptase-1. Al met al toonden deze studies aan dat matriptase-1 een belangrijke rol speelt bij keratinocyt differentiatie en de vorming van een functionele epidermale barrière in de mens. Het laat ook zien dat deze serine protease kan bijdragen aan de pathogenese van inflammatoire huidziekten zoals psoriasis aangezien pro-inflammatoire cytokines de expressie van matriptase-1 beïnvloeden. De functie van DNases bij de vorming van de huid barriere Een essentiële stap in de vorming van de huid barrière is de afbraak van celkernen en het DNA daarin. Het is echter weinig bekend over het mechanisme en de enzymen die hierbij betrokken zijn. Om dit te bestuderen hebben wij gebruik gemaakt van twee in vitro modellen - keratinocyt monolayers en het organoide huid model - en muizen modellen. Hierbij werd vooral gekeken naar de rol van DNases bij keratinocyt differentiatie (Chapters 5 and 6). Uit analyse van de expressie niveaus van DNases

5 bleek dat alleen de expressie van DNase1L2 sterk verhoogd was in de laatste fase van keratinocyt differentiatie terwijl in stratum corneum samples hoofdzakelijk DNase 2 achtige activiteit werd gevonden. Daarom werden in vervolgexperimenten deze twee DNases en hun rol bij de vorming van het stratum corneum in detail geanalyseerd. De knock-down van DNase 2 in het organoide huidmodel leidde niet tot veranderingen in epidermale ontwikkeling maar wel tot een sterke vermindering van DNase activiteit in het stratum corneum. Knock-down van DNase1L2, echter, resulteerde in het achterblijven van de celkernen in het stratum corneum, een indicatie van DNase1L2 een cruciale rol speelt in de afbraak van kern DNA gedurende keratinocyt differentiatie. Ook werd gevonden dat DNase1L2 expression sterk verminderd was in huidziekten die gekenmerkt zijn door parakeratosis, zoals psoriasis en Bowen s disease. In tegenstelling tot deze observaties in het humand organoide kweek systeem, vonden wij dat muizen waarin de expressie van DNase1L2 was uitgeschakeld, geen afwijkend stratum corneum hadden en eveneens vonden wij geen parakeratosis in de interfolliculaire epidermis. Deze resultaten laten zien dat er belangrijke verschillen zijn tussen de huid van mensen en muizen en ook in basale processen die ten grondslag liggen aan keratinocyt differentiatie. Dit onderstreept het belang van de ontwikkeling van kwalitatief hoogwaardige humane huidmodel systemen als een aanvulling op diermodellen. Nieuwe inzichten in de functie van filaggrin Een groot aantal studies waarin de rol van filaggrin in de barriere functie van de huid is onderzocht hebben gebruik gemaakt van de zogenaamde flaky tail muis. Deze muis is heeft een recessieve genetische afwijking in filaggrin en is in 1958 op natuurlijke wijze ontstaan uit een muizenstam met een recessief haar fenotype gekarakteriseerd door een droge en schilferige huid in combinatie met neonatale afwijkingen aan de staart en de poten. Het is echter onduidelijk hoe de resultaten in dit muizenmodel representatief zijn voor de situatie in de mens. Bovendien leidt de schade aan de huid barrière tot ontsteking dat keretinocyt differentiatie kan beïnvloeden. Diot maakt het extra moeilijk om in dit in vivo model de cel autonome effecten veroorzaakt door de filaggrin mutatie te onderscheiden van effecten die het

6 gevolg zijn van de ontsteking. Om deze redenen hebben wij een filaggrin deficiënt humaan in vitro organoid huid model ontwikkeld zodat specifiek het effect hiervan op epidermale ontwikkeling en barrière functie kon worden bepaald (Chapter 8). Morphologisch wordt dit filaggrin knock-down model gekarakteriseerd door een afname van de grootte en aantallen van keratohyalin granules, die dienen als een opslagplaats voor filaggrin. Terwijl het stratum corneum normaal leek, bleek de vorming en uitscheiding van lamellar bodies verstoord wat duidt op een defect in de aanmaak van de lamellar lipide bilayer. Daarnaast werd gevonden dat in de afwezigheid van filaggrin keratinocyt aggregatie op normale wijze verloopt. Bij de studie van de barrière functie van de huid in patiënten met atopic dermatitis en in de flaky tail muizen is het moeilijk om secundaire effecten veroorzaakt door ontsteking of ontregelde barrière functie uit te sluiten. Onze bevinding dat in het filaggrin deficiente organoiode huidmodel de hydrofiele kleurstof Lucifer yellow in staat was tot in het stratum corneum te penetreren suggereert dat de filaggrin deficientie op zich voldoende is om de epidermale barriere functie aan te tasten. Het is bekend dat in het stratum corneum filaggrin wordt afgebroken tot aminozuren en andere componenten van de natuurlijke hydraterende factoren en zo een rol speelt bij het vasthouden van water in corneocytes. Een belangrijke afbraakcomponent van filaggrin is UCA. UCA wordt gevormd uit het aminozuur histidine door de werking van het enzym histidase (Chapter 7). Uit ons werk bleek dat histidase sterk tot expressie kwam in de granulaire laag van de huid en dat de expressie van histidase in keratinocyt kweken sterk wordt verhoogd door cel differentiatie. In het filaggrin knockdown huidmodel vonden wij een sterke reductie van de productie van UCA terwijl de expressie van histidase niet was veranderd, een aanwijzing dat de afname van histidine het directe gevolg was van de afwezigheid van filaggrin. In overeenstemming hiermee vonden wij een verhoogde gevoeligheid voor UV-straling in het filaggrin knock down organoide huidmodel, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van de afwezigheid van UCA. Gebruikmakend van het filaggrin knock-down organoide huidmodel hebben wij nieuwe functies van filaggrin in epidermale barrière vorming ontdekt. Wij vonden dat i) filaggrin niet betrokken is bij de aggregatie van keratine, ii) verlaagde filaggrin expression de vorming en secretie van lamellar bodies verandert, iii) filaggrin knock

7 down een sterk verlaagde aanwezigheid van UCA tot gevolg heeft gepaard aan een verhoogde photosensitiviteit in huid samples en iv) het ontbreken van filaggrin voldoende is om de epidermale barrière functie te verstoren. Het gebruik van alternatieve modellen voor de studie van epitheliale mechanismen Hoewel het organoide huidmodel nog steeds het meest gebruikte epitheliale systeem is, zijn zulke epitheliale in vitro modellen zijn ook voor diverse organen beschreven waaronder de long, het oog en de vagina en onderzoek in deze disciplines wordt steeds meer met zulke modellen uitgevoerd. Hierdoor wordt het mogelijk om signalerings routes en moleculaire mechanismen te identificeren die deze modellen gemeen hebben. In hoofdstuk 9 werd de productie en werking van het antimicrobiële peptide psoriasin (S100A7) in een vaginaal epitheliaal model onderzocht. Psoriasin speelt een belangrijke rol bij de bescherming tegen E.coli in de huid. Met behulp van dit model konden wij voor het eerst aantonen dat psoriasin de meest dominante anti- E-coli factor in vaginale secretie is. Zulke modellen lijken daarom geschikt voor studies naar epitheliale processen en homeostase in het genitale systeem. De ontwikkeling van een in vitro knock-down vaginaal epitheliaal model is daarom een van onze hoofddoelen in vervolgstudies. CONCLUSIES De vorming van de epidermale barrière is een complex proces en vereist een sterke regulatie van de expressie van structurele eiwitten, enzymen and cytokinen en het aanzetten van diverse signaleringsroutes afhankelijk van de differentiatie stadium van de betrokken keratinocyten. Veranderingen is de vorming van de huidbarriere kunnen het gevolg van huidaandoeningen zijn maar kunnen ook de onderliggende oorzaak van huidziekten zijn. Organoide huidmodellen hebbe substantieel bijgedragen aan het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het epidermale differentiatie proces. In dit proefschrift hebben wij een humaan organoide huidmodel gebruikt waar in individuele gene uitgeschakeld

8 kunnen worden zodat de rol van de desbetreffende genproducten in epidermale keratinocyt differentiatie in vitro bepaald kan worden. Dit heeft tot nieuwe inzichten in de processen die ten grondsalg liggen aan de vorming van de barrière in menselijke huid. Dit huidmodel is uitgegroeid tot een standaard methode, met name voor onderzoek naar epidermale differentiatie en barrière vorming. Dit model draagt er tevens toe bij dat minder proefdier onderzoek noodzakelijk is voor dermatologisch onderzoek

9