CytoCount Codenr. S 2366 Uitgave

Transcriptie

1 CytoCount Codenr. S 2366 Uitgave Beoogd gebruik Inleiding Principe van de test Geleverd reagens Waardetoekenning Bewaring Voorzorgsmaatregelen Voor diagnostisch gebruik in vitro. CytoCount is bestemd voor gebruik bij flowcytometrie. CytoCount is een suspensie van fluorescerende microsferen die gebruikt kan worden als referentiepopulatie voor de telling van de desbetreffende leukocytenpopulatie. CytoCount kan worden toegepast op perifere bloedmonsters, leukofereseproducten, bloedproducten met minder leukocyten en monsters van navelstrengbloed. De telling van absolute niveaus van celsubsets in klinische monsters is van primair belang, bijvoorbeeld bij de controle van de immuunstatus van personen met een verminderde weerstand (CD4+ T-lymfocytentelling), bij de timing van leukoferese bij patiënten die kandidaat zijn voor autotransplantatie (CD34+ hematopoëtische progenitorceltelling) en bij het beoordelen van bloedproducten met minder leukocyten (telling van resterende witte bloedcellen) (1). De telling van cellen kan verricht worden met gebruikmaking van single- of dual-platform teltechnologieën met gebruikmaking van cytometrische methoden. Bij de single-platform techniek worden absolute celtellingen van de desbetreffende geïdentificeerde cellen uitgevoerd in een precies gedefinieerde hoeveelheid monster. De toevoeging van fluorescerende referentieparels van een bekende concentratie, zoals CytoCount, kan gebruikt worden voor het definiëren van de hoeveelheid geanalyseerd monster. De singleplatform techniek heeft minder bronnen van variabiliteit vergeleken met de eerder algemeen gebruikte dualplatform techniek en in multicenter onderzoek is aangetoond dat deze techniek een betere variatiecoëfficiënt (CV) biedt en dat de risico s op afwijkende resultaten lager zijn (1). Een nauwkeurig gemeten hoeveelheid van het desbetreffende monster wordt gekleurd met de relevante fluorochroom-geconjugeerde antilichamen. Voor CD4-telling kunnen antilichamen tegen CD45, CD4, CD8 en CD3 worden gekozen. Voor CD34-telling wordt meestal een combinatie van anti-cd45/fitc en anti-cd34/rpe gebruikt. Na incubatie met geconjugeerd antilichaam worden de rode bloedcellen gelyseerd. Daarna wordt een precies gemeten aantal CytoCount parels aan het monster toegevoegd met gebruikmaking van een reverse pipetteertechniek (zie hiervoor onder Algemene procedure). Het aantal parels is gelijk aan de hoeveelheid monster. Het monster wordt geanalyseerd in een flowcytometer en de desbetreffende cellen worden geteld met behulp van een aanbevolen gating-strategie (2, 3). Het aantal CytoCount parels wordt verkregen door een gebied rond de parels in te stellen in een dot plot waarbij de parels duidelijk gescheiden worden van de gekleurde cellen. De gated parel events worden weergegeven in een tijd versus FSC histogram en er wordt een gebied getekend rond de mono-dispersed events. Het absolute aantal te onderzoeken cellen (cellen/µl) wordt berekend op basis van de volgende vergelijking: Aantal getelde cellen (bijv. CD4+ of CD34+) x CytoCount concentratie x verdunningsfactor Aantal getelde CytoCount parels Definities: aantal getelde cellen: bijv. aantal CD4+ of CD34+ verkregen door gebruikmaking van een aanbevolen gating-strategie (2, 3). Aantal getelde CytoCount parels: aantal parel events uit hetzelfde monster als de desbetreffende cellen. CytoCount concentratie: aantal parels/µl zoals aangegeven op de flacon. Verdunningsfactor: de factor waarmee het oorspronkelijke monster is verdund (het protocol is geoptimaliseerd voor het analyseren van 10 6 leukocyten en het oorspronkelijke monster moet daarom vaak verdund worden voordat de analyse wordt uitgevoerd). Aanbevolen wordt gebruik te maken van een techniek waarbij het monster niet gespoeld wordt, omdat de eerste relatie tussen het aantal bloedcellen en het bloedvolume verloren kan gaan en dan kunnen absolute celaantallen niet precies berekend worden (1). Aggregatie van parels ter controle van de telling is een welbekend verschijnsel (1). CytoCount parels vertonen een zeer laag aantal veelvouden (minder dan 3%) wat de gating van de parels eenvoudiger maakt. Als een hoger aantal CytoCount veelvouden wordt waargenomen en er een probleem met het product wordt vermoed, moet u contact opnemen met onze Technical Services. CytoCount is een suspensie van 5,2 µm polystyreenfluorosferen (parels) in een waterige oplossing die surfactans bevat. CytoCount parels bevatten een mengsel van eigen kleurstoffen met een lichtemissie met breed bereik. De kleurstoffen zijn in water oplosbare fluorescerende stoffen die tijdens het productieproces uniform op de parels geladen worden. De kleurstoffen worden geëxciteerd bij 488 nm en zenden licht uit bij nm. CytoCount wordt geleverd als één flacon met 17 ml van een parelsuspensie met een concentratie van circa parels/µl. Het exacte aantal parels per µl is aangegeven op de flacon. Eén flacon is voldoende voor ten minste 150 tests (100 µl per test). De parelconcentratie (C) en bijbehorende standaarddeviatie (S) zijn aangegeven op de flacon als getal/µl. Dit getal wordt verkregen door het product te tellen op een Coulter Particle Counter Z1. De standaarddeviatie van de parelconcentratie levert een geringe bijdrage aan de gecombineerde onzekerheid van het analytische resultaat. Bewaar het product bij 2-8 C in het donker. Niet gebruiken na de op de flacon aangegeven uiterste gebruiksdatum. Als het product bewaard wordt onder andere dan de aangegeven condities, moet de gebruiker de condities controleren. Plaats de flacon niet langer dan 2 uur achter elkaar bij kamertemperatuur op een draaimenger. 1. Voor professionele gebruikers. ( ) S 2366/NL/TIA/ p. 1/5

2 Zijwaartse verstrooiing 2. Dit product bevat natriumazide (NaN 3), een chemische stof die in zuivere vorm uiterst toxisch is. In productconcentraties wordt natriumazide niet geclassificeerd als gevaarlijk, maar kan het reageren met loden en koperen leidingen, waarbij uiterst explosieve stapelingen van metaalaziden worden gevormd. Bij het afvoeren spoelen met ruime hoeveelheden water om stapeling van metaalaziden in de leidingen te voorkomen. 3. Controleer of de CytoCount flacon goed is afgesloten en rechtop staat, om lekkage te voorkomen. De CytoCount parels moeten vóór gebruik grondig worden geresuspendeerd. Te sterk mengen van de CytoCount parels op een vortexmenger kan ertoe leiden dat er luchtbellen in de vloeistof komen en dat kan de verwachte hoeveelheid gepipetteerde CytoCount parels verlagen. Voorzichtig draaien (bijv. op een draaimenger of bloedbuisjesroller) wordt aanbevolen. 4. Gezorgd moet worden dat er geen CytoCount suspensie verloren gaat vóór het resuspenderen, anders wordt de pareltelling ongeldig. 5. Het is van essentieel belang dat gebruik wordt gemaakt van dezelfde gekalibreerde pipet en de wet tip reverse pipetteertechniek voor zowel het monster als de CytoCount parels. Het is belangrijk dat het aantal CytoCount parels en de hoeveelheid monster nauwkeurig zijn. De hoeveelheden antilichaamreagentia en lyserend reagens zijn niet belangrijk in verband met de bepaling van de absolute telling omdat het gaat om de verhouding tussen de hoeveelheid monster en het aantal parels. Algemene procedure 1. Verdun het oorspronkelijke monster tot ongeveer 10 6 leukocyten per 100 µl. Noteer de precieze verdunningsfactor. In sommige gevallen is verdunning niet nodig. 2. Pipetteer 100 µl van het monster met 10 6 leukocyten in een reageerbuis. Gebruik reverse pipettering (zie onderstaande richtlijnen). 3. Kleur en lyseer het monster volgens de instructies van de fabrikant. Voor CD4+ telling adviseren wij het gebruik van Dako UtiLyse, codenr. S 3325 of S Voor CD34+ telling adviseren wij het gebruik van Dako EasyLyse, codenr. S Voor beide procedures wordt lyse no wash aanbevolen. 4. Haal CytoCount parels uit de opslag bij 2-8 C. Controleer of de dop goed vastzit om vloeistoflekkage te voorkomen en meng goed om te zorgen dat de parels volledig geresuspendeerd worden. Vermijd in deze fase mechanisch mengen, bijv. met een vortexmenger, vanwege het mogelijk ontstaan van luchtbellen die het daadwerkelijke aantal gepipetteerde parels zouden kunnen verminderen. Aanbevolen wordt om de parels gedurende 5-60 minuten op een draaimenger te plaatsen om te zorgen dat de parels in suspensie blijven tot ze gebruikt worden. 5. Laat de parels vóór gebruik op kamertemperatuur komen. 6. Voeg 100 µl CytoCount toe aan het gekleurde en gelyseerde monster. Het pipetteren van zowel het monster als de CytoCount parels moet gedaan worden met dezelfde gekalibreerde pipet en met gebruikmaking van een wet tip reverse pipetteertechniek (1) (zie onderstaande richtlijnen). 7. Meng de parels en het monster voorzichtig met gebruikmaking van een vortexmenger gedurende 3 seconden om er zeker van te zijn dat de CytoCount parels gelijkmatig in het monster verdeeld worden. 8. Het monster moet worden verkregen binnen 4 uur na de toevoeging van de CytoCount parels om de precieze concentratie van de parels in het monster te verzekeren. Zie ook de productbijsluiters voor het desbetreffende antilichaam en lyseerreagentia voor de maximale incubatietijd. 9. Verkrijg een minimum van CytoCount parels en minimaal 100 te onderzoeken cellen (1). 10. Het is niet aan te raden om gebruik te maken van voorwaartse verstrooiing (FSC) als drempelparameter voor gegevensverzameling omdat dit sommige CytoCount parels kan elimineren als gevolg van hun kleine afmeting van 5,2 µm. Aanbevolen wordt gebruik te maken van het kanaal gebruikt voor FITC (meestal FL1 genoemd) als drempelparameter. Een alternatieve methode is het instellen van de FSCdrempelwaarde op nul en verkrijging via een not gate geplaatst in de linkerbenedenhoek van een FSC vs. zijwaartse verstrooiing (SSC) dot plot (R8 in afbeelding 1). Dat voorkomt het meeste vuil zonder uitsluiting van de CytoCount parels (4). Voorwaartse verstrooiing Afbeelding 1. Voorwaartse verstrooiing vs. zijwaartse verstrooiing waarbij een normaal bloedmonster wordt getoond. De drempel is ingesteld op de FSC-parameter. Om te zorgen dat de CytoCount parels niet uitgesloten ( ) S 2366/NL/TIA/ p. 2/5

3 worden, wordt de FSC-drempel op nul ingesteld. Om vuil te voorkomen, wordt een not gate (R8) ingesteld in de linkerbenedenhoek. 11. Vergeet niet de tijdparameter te bewaren tijdens de verkrijging. 12. De flow rate moet stabiel zijn voordat de verkrijging gestart wordt. Richtlijn wet tip reverse pipetteerstechniek Dezelfde pipet moet worden gebruikt om het monster en de parels te doseren. Gebruik voor elk reagens een propere pipet. Gebruik van dezelfde techniek om zowel het monster als de parels te doseren, garandeert consistentere resultaten. Monster: 1. Druk de zuiger in tot de tweede stop, plaats de tip in de vloeistof en aspireer het monster. Druk dan de zuiger in tot de eerste stop en doseer het monster. De pipettip moet nu de overtollige vloeistof bevatten. 2. Herhaal deze stap minimaal twee maal terwijl u de pipettip in het monster houdt. 3. De pipettip is nu gereed voor gebruik. Druk de zuiger in tot de tweede stop en plaats de tip in de vloeistof en aspireer het monster. Verwijder de pipettip voorzichtig uit het monster en veeg de pipettip voorzichtig af met een doekje om overtollige vloeistof af te vegen. Zorg dat u de opening van de tip niet aanraakt en onbedoeld monster verwijdert uit de pipettip. 4. Probeer de pipet zo verticaal mogelijk te houden. Controleer op de aanwezigheid van luchtbellen in de tip. Als er luchtbellen aanwezig zijn, moet u de vloeistof terug laten lopen in het monster en de monsternameprocedure herhalen. 5. Doseer het monster tot de eerste zuigerstop; resterende vloeistof moet dan te zien zijn in de pipettip nadat de vloeistof gedoseerd is. Raak de wanden van de reageerbuis niet aan terwijl u de tip verwijdert. Parels: 6. Bereid de pipet zoals beschreven voor het monster (stap 1-3). 7. Plaats voor het doseren van de pareloplossing de pipettip op de wand van de buis bij de bovenkant van het monster; de buis iets schuin houden en de pipet zal helpen bij deze stap. Doseer tot de eerste zuigerstop; resterende vloeistof moet in de pipettip te zien zijn nadat de vloeistof gedoseerd is. 8. Plaats voor verdere pipettering van de parels de tip in de CytoCount flacon en aspireer meer parelsuspensie zonder dosering van de overgebleven vloeistof die na de eerste pipettering in de tip is achtergebleven. 9. Als de tip het monster niet heeft geraakt, moet de resterende vloeistof in de tip worden gedoseerd in de CytoCount flacon. Als u ervoor kiest de resterende vloeistof weg te werpen, is er geen reagens meer voor 150 monsters. CD34- en CD4-telling Procedure voor CD34+ stamceltelling of CD4+ T-lymfocytentelling met gebruikmaking van CytoCount Het monster moet gekleurd worden met fluorochroom-geconjugeerde antilichamen en de rode bloedcellen gelyseerd; zie stap 3 in de Algemene procedure. Wij adviseren het gebruik van de ISHAGE gating-strategie voor de identificatie van CD34+ stamcellen (1, 2) en een CD45/SSC gating-strategie voor de telling van CD4+ cellen (3). CytoCount is geoptimaliseerd voor gebruik met een 100 µl monster dat maximaal 10 6 leukocyten bevat. Bepaling van de CytoCount events: 1. Maak een dot plot van het fluorescentiekanaal dat gebruikt wordt voor R-phycoerythrin (meestal FL2 genoemd) vs. SSC; de CytoCount parels zijn zichtbaar in het bovenste kwadrant van de plot. 2. Teken een gebied rond de CytoCount parelpopulatie en zorg daarbij dat dat gebied off scale is op de SSC-as zodat alle CytoCount parels (R6 in plot 2A) gevangen kunnen worden. Gezorgd moet worden dat er geen non-cytocount parel events in het gebied komen. N.B.: de dot plot-combinatie door gebruik van het R-phycoerythrin-kanaal vs. SSC kan niet gebruikt worden als CD45 gelabeld is met R-phycoerythrin omdat de parels dan overlappen met de gekleurde neutrofielen. In dit geval moet het FITC- of RPE-Cy5 kanaal gebruikt worden voor de bepaling van het aantal parels. 3. Maak een dot plot van de tijd vs. FSC (plot 2B) en gate dit dot plot op regio 6 in plot 2A. 4. Teken een tweede gebied (R7 in plot 2B), rond de mono-dispersed CytoCount parelpopulatie en voorkom events lager of hoger in de FSC vergeleken met de hoofdpopulatie. 5. Maak een logische gate-combinatie van R6 en R7 (G7) om de CytoCount parelpopulatie nauwkeuriger te bepalen (G7 = R6 en R7). ( ) S 2366/NL/TIA/ p. 3/5

4 Zijwaartse verstrooiing Voorwaartse verstrooiing Graf 2A Graf 2B R7 Tijd (512,00 s) Afbeelding 2. Plot 2A: CD34/RPE vs. zijwaartse verstrooiing toont een perifeer bloedmonster van een groeifactor-gestimuleerde patiënt. Er is een gebied getekend rond de parelpopulatie (R6). Om alle CytoCount parels te kunnen omvatten, moet het gebied R6 de bovenrand van de zijwaartse verstrooiing bereiken of off scale worden geplaatst. Plot 2B: tijd vs. voorwaartse verstrooiing R6 events. Om het aantal CytoCount parels te bepalen, wordt een gebied getekend rond de mono-dispersed parels in plot 2B (R7). Dit aantal wordt gebruikt als het getelde aantal CytoCount parels bij de berekening van het absolute aantal van de desbetreffende lymfocytenpopulatie. Tijd als kwaliteitscontrole Probleemoplossing Het gebruik van tijd als interne kwaliteitscontrole voor single-platform bepalingen Recente onderzoeken hebben aangetoond dat het aantal parels verkregen in een vaste tijdsperiode opmerkelijk constant is voor de meeste flowcytometers. De gebruiker kan dus voor elke nieuwe partij parels een gemiddelde pareltelling afleiden ± 2 SD bereik. Een monster met een pareltelling buiten dit bereik wijst op een potentiële pipetteerfout en het monster moet opnieuw worden gekleurd (5). Absolute celtelling hoger dan voorzien Een absolute celtelling die hoger is dan voorzien kan het correcte resultaat zijn voor het monster. Dit kan echter ook te wijten zijn aan een foutieve toename van het aantal getelde cel events. Dit kan veroorzaakt worden door een pipetteerprobleem, bijvoorbeeld omdat de hoeveelheid monster groter is dan het aantal toegevoegde parels als gevolg van inadequaat afvegen van de pipettip vóór dosering van het monster of omdat verschillende pipetten gebruikt zijn voor de dosering van monster en parels. Het kan ook veroorzaakt worden door onjuiste plaatsing van de cel-gate waardoor te veel non cel events geteld worden. Een hogere celtelling dan voorzien kan ook het gevolg zijn van een daling van het aantal getelde CytoCount parels. Dat kan veroorzaakt worden door een pipetteerprobleem zoals de toevoeging van te weinig parels als gevolg van inadequate resuspensie van de parels vóór gebruik, de aanwezigheid van luchtbellen in de tip tijdens de dosering of door het gebruik van verschillende pipetten voor de dosering van monster en parels. Een daling van de CytoCount events kan ook veroorzaakt worden door het te hoog instellen van de FSC-drempel of het onjuist plaatsen van de parel-gate, wat leidt tot de uitsluiting van een aantal parels. Absolute celtelling lager dan voorzien. Een absolute celtelling die lager is dan voorzien kan het correcte resultaat zijn voor het monster. Dit kan echter ook te wijten zijn aan een foutieve daling van het aantal getelde cel events. Dit kan veroorzaakt worden door een pipetteerprobleem, bijvoorbeeld omdat de hoeveelheid monster kleiner is dan het aantal toegevoegde parels als gevolg van de aanwezigheid van luchtbellen tijdens het doseren van het monster (het is moeilijk luchtbellen te detecteren in een monster) of omdat verschillende pipetten gebruikt zijn voor de dosering van respectievelijk monster en parels. Het kan ook veroorzaakt worden door onjuiste plaatsing van de cel-gate wat leidt tot de uitsluiting van cel events of verlies van cellen als gevolg van langdurige incubatie met lyserend reagens. Een lagere telling dan voorzien kan ook het gevolg zijn van een stijging van het aantal getelde CytoCount parels. Dit kan veroorzaakt worden door een pipetteerprobleem, bijvoorbeeld de toevoeging van een groter aantal parels dan de hoeveelheid monster, inadequaat afvegen van de pipettip vóór dosering of het gebruik van verschillende pipetten voor de dosering van monster en parels. Een toename van de CytoCount events kan ook veroorzaakt worden door onjuiste plaatsing van de parel-gate waardoor te veel non parel events worden geteld. Verlies van de CytoCount suspensie vóór adequate resuspensie kan leiden tot een verhoogde parelconcentratie. Het verlies van suspensie kan veroorzaakt worden door een losse flacondop waardoor vloeistof lekt of door het morsen van de inhoud van de CytoCount flacon vóór resuspensie. Referenties 1. Brando B, Barnett D, Janossy G, Mandy F, Autran B, Rothe G, et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood (review). Cytometry 2000;42: Gratama JW, Keeney M, Sutherland DR. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. In: Robinson JP, Darzynkiewicz S, Dean PN, Dressler LG, Rabinovitch PS, Stewart CC, Tanke HJ, Wheeless LL. editors. Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons; p ( ) S 2366/NL/TIA/ p. 4/5

5 3. Schnizlein-Bick CT, Mandy FF, O Gorman MRG, Paxton H, Nicholson JKA, Hultin LE et al. Use of CD45 gating in three and four-color flow cytometric immunophenotyping: guideline from The National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry 2002;50: Brocklebank AM, Sparrow RL. Enumeration of CD34+ cells in cord blood: a variation on a single-platform flow cytometric method based on the ISHAGE gating strategy. Cytometry 2001;46: Bergeron M, Lustyik G, Phaneuf S, Ding T, Nicholson JKA, Janossy G, et al. Stability of currently used cytometers facilitates the identification of pipetting errors and their volumetric operation: time can tell all. Cytometry 2003;52B: Verklaring van de symbolen Catalogusnummer Temperatuurlimiet Houdbaar tot Medisch hulpmiddel voor in vitro diagnostiek Raadpleeg de gebruiksaanwijzing Niet aan zonlicht blootstellen (zie de paragraaf Bewaring) Lotnummer Fabrikant ( ) S 2366/NL/TIA/ p. 5/5