Physiology and biochemistry of primary alcohol oxidation in the gram-positive bacteria "amycolatopsis methanolica" and "bacillus methanolicus"

Transcriptie

1 Physiology and biochemistry of primary alcohol oxidation in the gram-positive bacteria "amycolatopsis methanolica" and "bacillus methanolicus" Hektor, Harm Jan IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 1997 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Hektor, H. J. (1997). Physiology and biochemistry of primary alcohol oxidation in the gram-positive bacteria "amycolatopsis methanolica" and "bacillus methanolicus" s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 121

3 Dit onderzoek beschrijft de karakterisering van nieuwe enzym-systemen voor de oxidatie van primaire alcoholen in Gram-positieve bacteriën. Deze studie heeft zich geconcentreerd op twee methanol-gebruikende bodembacteriën: de nocardia-achtige actinomyceet Amycolatopsis methanolica en de thermotolerante bacterie Bacillus methanolicus. Methanol is overvloedig aanwezig in de natuur en wordt door vele micro-organismen gebruikt als koolstof- en energiebron. Deze organismen worden methylotrofen genoemd en ze beschikken over speciale fysiologische aanpassingen om energie en koolstof-koolstof bindingen te kunnen maken uit methanol. Beide bestudeerde bacteriën gebruiken de ribulose monofosfaat (RuMP) route voor formaldehyde fixatie om te groeien op C 1 - verbindingen. Vergeleken met andere routes voor groei op deze substraten levert de RuMP route de hoogste groeiopbrengst. Het meeste onderzoek aan methanol metabolisme is tot dusver verricht aan Gram-negatieve bacteriën. Gram-positieve methylotrofen zijn relatief recent geïsoleerd. In Gram-negatieve bacteriën zijn de enzymen die verantwoordelijk zijn voor methanol oxidatie gelokaliseerd in het periplasma en veelal PQQafhankelijk. In Gram-positieve bacteriën is geen duidelijke periplasmatische ruimte aanwezig. Dit roept de vraag op of de fysiologie en biochemie van methanol oxidatie in Gram-positieve methylotrofen verschilt van de bekende situatie in Gram-negatieve bacteriën (Hoofdstuk 1). Dit proefschrift handelt over de eerste stap in de methanol oxidatie, de omzetting van methanol naar formaldehyde, in Gram-positieve bacteriën. Karakterisering van de verantwoordelijke enzymen en enzym-systemen heeft duidelijk gemaakt dat het cytoplasmatische eiwitten betreft, die niet alleen een sleutelrol vervullen in de oxidatie van methanol, maar ook in de oxidatie van andere primaire alcoholen. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat B. methanolicus een NADafhankelijke methanol dehydrogenase (MDH) bezit. Een dergelijke NADafhankelijke alcohol dehydrogenase (ADH) activiteit is niet gevonden in extracten van A. methanolica. Kunstmatige elektronen-acceptoren zijn hier nodig om in vitro alcoholen te kunnen oxideren. Drie verschillende, geschikte elektronen-acceptoren zijn tot nu toe geïdentificeerd, resulterend in drie verschillende activiteiten: met DCPIP (n-mdh), MTT (MTT-ADH) en NDMA (MNO; Hoofdstuk 2). n-mdh activiteit is toegewezen aan een instabiel enzymcomplex, actief met methanol en formaldehyde en niet met andere alcoholen; de activiteit wordt gestimuleerd door NAD. De instabiliteit van het complex heeft een gedetailleerde verdere karakterisering in de weg gestaan. MTT-ADH activiteit is ook het gevolg van een eiwitcomplex, maar is actief met meerdere primaire alcoholen en is veel stabieler dan n-mdh. 122

4 De karakterisering van MNO, met een hoge formaldehyde dismutase activiteit (vorming van methanol en formiaat uit formaldehyde), een relatief lage methanol:ndma oxidoreductase activiteit en een NADH-afhankelijke formaldehyde dehydrogenase activiteit, staat beschreven in Hoofdstuk 2. Dit decamere enzym, met subunits van 50 kda, oxideert niet alleen methanol, maar ook een reeks van andere alcoholen. Een vergelijkbaar enzym is geïsoleerd uit Mycobacterium gastri MB19, een andere Gram-positieve methylotroof (Hoofdstuk 2). Ook Rhodococcus NI86/21, eveneens een actinomyceet, bezit MNO; in deze bacterie is MNO waarschijnlijk betrokken bij de oxidatie van aldehydes, als intermediair in de afbraak van herbiciden. Dit geeft aan dat MNO niet specifiek is voor A. methanolica, maar wijder verspreid voorkomt. Het fysiologisch belang van MNO in A. methanolica is onderzocht middels mutanten die niet meer kunnen groeien op methanol en/of ethanol (Hoofdstuk 3). Mutanten die niet meer op methanol kunnen groeien, maar nog wel op ethanol, bezitten allemaal nog MNO en MTT-ADH activiteit, maar missen HPS of HPI; respectievelijk hexulose-6-fosfaat synthase en hexulose-6-fosfaat isomerase, twee sleutelenzymen van de RuMP route. Methanol-negatieve mutanten die ook niet meer op ethanol kunnen groeien, hebben bijna altijd zowel MNO als MTT- ADH activiteit verloren. Dit heeft tot de hypothese geleid dat MNO een onderdeel is van het MTT-ADH complex; verdere ondersteuning hiervoor is verkregen in de biochemische karakterisering van de componenten van MTT- ADH. Dat onderzoek heeft de betrokkenheid van twee andere componenten aangetoond, component H en L. De grootste component, eiwit H (> 600 kda), vertoont geringe MTT-afhankelijke NADH dehydrogenase activiteit en is opgebouwd uit subunits van 70 en 45 kda. Voor het kleinere eiwit L (15 kda) is geen specifieke activiteit gevonden. Na zuivering van de drie verschillende componenten, H, L en MNO, kan MTT-ADH activiteit worden hersteld door alle drie weer samen te voegen. Waarschijnlijk oxideert MNO in vivo het alcohol en geeft de elektronen via de andere componenten, en mogelijk nog onbekende eiwitten, door aan de elektronentransportketen. Karakterisering van mutant MM49 toont het belang aan van component H voor de in vivo alcohol oxidatie. Deze mutant kan niet meer groeien op alcoholen, heeft nog wel MNO activiteit, maar mist component H en dientengevolge MTT-ADH activiteit. Isolatie en karakterisering van het MNO coderende gen (mno) uit A. methanolica heeft het mogelijk gemaakt om een mno-disruptiemutant te maken (Hoofdstuk 4). Deze mutant kan niet meer groeien op methanol, ethanol, propanol of butanol. Het terugbrengen van het wildtype mno gen herstelt dit vermogen tot groei. Hiermee is ook op genetisch niveau duidelijk bewezen dat MNO essentieel is voor groei op methanol en andere primaire alcoholen in A. 123

5 methanolica. De geïsoleerde MNO-negatieve mutanten die niet meer op ethanol kunnen groeien, bezitten allemaal nog wel ethanol:ndma oxidoreductase (ENO) activiteit. Dit impliceert dat ENO geen, en MNO wel, een sleutelrol vervult bij het groei op ethanol (Hoofdstukken 3, 4). In eerder onderzoek is reeds een gedeeltelijke aminozuursequentie verkregen voor MNO. Op basis hiervan is gesuggereerd dat MNO behoort tot Familie III van de NAD(P)-afhankelijke ADH s. Karakterisering van het mno gen bevestigt dit vermoeden. Hoewel MNO geen activiteit vertoont met NAD(P) en geen ijzer bevat, maar zink- en magnesium-ionen, behoort het dus toch tot deze familie die oorspronkelijk gedefinieerd is voor de ijzer-afhankelijke ADH s. In de afgelopen jaren is een fors aantal leden van deze familie geïdentificeerd, gebaseerd op overeenkomsten in primaire structuur. Een relatief groot aantal van deze enzymen blijkt echter geen ijzer te bevatten, maar andere metaal-ionen. In Hoofdstuk 4 wordt het resultaat van een evaluatie van databankgegevens weergegeven, resulterend in identificatie van 24 eiwitten behorend tot Familie III waarvan de sequentie volledig bepaald is. Sequentie-vergelijkingen hebben geleid tot identificatie van drie unieke, geconserveerde sequenties, welke gebruikt kunnen worden bij identificatie van andere leden van Familie III. De quaternaire structuren van vijf leden van Familie III komen duidelijk overeen: MNO van A. methanolica, MDH van B. methanolicus, MNO van Mycobacterium gastri, ADH van Desulfovibrio gigas en ADH van Desulfovibrio HDv (Hoofdstuk 4). Alle vijf deze enzymen zijn decamere eiwitten; de eerste drie eiwitten bezitten met zekerheid een sterk gebonden NAD(P)(H) als cofactor. Overeenkomstige waarnemingen zijn eerder gedaan met andere methanoloxiderende systemen. Zo bezit alcohol oxydase uit methylotrofe gisten FAD als cofactor en komt PQQ voor als cofactor in MDH van Gram-negatieve bacteriën. MDH van B. methanolicus oxideert methanol en draagt de elektronen via het gebonden NAD (cofactor) over aan vrij NAD (coënzym). Tijdens deze reactie, welke volgens het ping-pong mechanisme verloopt, vindt geen uitwisseling plaats van de twee NAD moleculen (Hoofdstuk 5). Deze relatief langzame reoxidatie van de cofactor van MDH kan worden versneld middels een B. 2+ methanolicus activator eiwit (50 kda), welke Mg - en NAD-afhankelijk is. Bij fysiologische methanol concentraties kan de enzym-katalyse op deze manier 40 maal worden versneld. De precieze werking van het activator eiwit vereist nader onderzoek. In A. methanolica is een dergelijk activator eiwit niet gevonden en ook kan MNO niet worden geactiveerd door het eiwit uit B. methanolicus. Wel blijkt MNO in vivo te zijn geassocieerd met andere eiwitten, H en L (MTT-ADH), welke betrokken kunnen zijn in de re-oxidatie van de gebonden cofactor 124

6 NADPH. Het voordeel van het binden van een dergelijke cofactor en associatie met eiwitten die de cofactor weer moeten re-oxideren, is niet bekend. Het is daarentegen wel opvallend dat de ADH s van Familie I en II niet of nauwelijks actief zijn met methanol en geen cofactor bezitten, terwijl de tot dusver bekende methanol oxiderende enzymen/enzym-systemen alle een cofactor hebben. Vergelijking van de 24 Familie III ADH s heeft geresulteerd in identificatie van drie gebieden met een geconserveerde sequentie (Hoofdstuk 4). Zeer waarschijnlijk zijn deze betrokken bij de katalyse, de binding van substraat, product en/of metaal, door deze enzymen. Een van deze sequenties bevat veel histidine residuen en er zijn aanwijzingen dat deze betrokken zijn bij de binding van metalen. Een van de andere sequenties bevat veel glycine residuen; de uit de literatuur bekende NAD bindingsplaatsen in eiwitten worden gekenmerkt door de aanwezigheid van glycine residuen in een bepaalde volgorde met andere aminozuren. Dit specifieke patroon is niet aanwezig in leden van Familie III, maar wel in Families I en II. Analyse van de secondaire structuur van B. methanolicus MDH en vergelijking met bekende FAD bindingsplaatsen hebben geleid tot de hypothese dat het gebied met veel glycine residuen toch betrokken is bij de binding van NAD(H). Verschillende van de betrokken residuen in MDH van B. methanolicus zijn door middel van plaatsgerichte mutagenese veranderd. De aldus verkregen mutante eiwitten zijn vervolgens gezuiverd en gekarakteriseerd. Een tweetal mutanten blijkt volledig geïnactiveerd, een aantal is minder actief en een tweetal mutaties leidt tot enzymen met (veel) hogere activiteiten dan het originele MDH. De effecten op activiteitsniveau en de gevoeligheid voor het activator eiwit zijn vergeleken met het aanwezig danwel afwezig zijn van gebonden cofactor NAD(H). Hieruit blijkt dat bij afwezigheid van cofactor het activator eiwit geen effect meer heeft op de activiteit van het MDH. Bovendien blijkt het verlies van cofactor ook te leiden tot een verminderde affiniteit voor coënzym. Dit impliceert dat, ruimtelijk gezien, coënzym en cofactor dicht bij elkaar aan het eiwit binden. Mechanistisch gezien is dat ook logisch, omdat de elektronen van de een op de ander moeten worden overgedragen. De afwezigheid van cofactor NAD(H) leidt tot verandering in kinetiek van het MDH eiwit. Onder deze mutanten bevinden zich volledig inactieve enzymen, een enzym met slechte affiniteit voor zowel NAD als methanol en een mutant die een zeer hoge MDH activiteit te zien geeft, terwijl de omgekeerde reactie van formaldehyde reductase in dit geval onveranderd blijkt. Hoewel er nog nader onderzoek nodig is naar de interactie tussen de verschillende residuen en NAD(H), is wel duidelijk dat het glycine-rijke geconserveerde gebied betrokken is bij de cofactor binding. Aangezien dit een geconserveerd gebied is in de hele Familie III, is het interessant om te 125

7 onderzoeken of de andere leden ook een dergelijk sterk gebonden NAD(P)(H) bevatten. Het fysiologisch belang van een cofactor kan onderzocht worden in A. methanolica, waarvoor de genetische technieken voorhanden zijn, in tegenstelling tot de situatie in B. methanolicus. Zo kan een cofactor-deficiënte mutant gemaakt worden van MNO en die kan geïntroduceerd worden in de mnodisruptiemutant. Op die wijze kan de rol van de cofactor nader worden onderzocht in toekomstige experimenten. 126