Dried matrix spot in TDM en Toxicologie : nieuwe ontwikkelingen

Transcriptie

1 Dried matrix spot in TDM en Toxicologie : nieuwe ontwikkelingen Dr L Stolk, ziekenhuisapotheker/klinisch farmacoloog/toxicoloog Klinische Farmacie en Toxicologie, Maastricht Universitair Medisch Centrum. lml.stolk@mumc.nl KKGTDAG2013 1

2 Academisch Ziekenhuis Maastricht az M NVZA KKGTDAG

3 Inhoud Korte inleiding bloed spot methode in TDM Nieuwe ontwikkelingen: Nieuwe bepalingen TDM en Toxicologie Stabiliteit en Flash Heating DBS en de farmaceutische industrie Bloedmonsters ipv plasmamonsters Het hematocriet probleem Alternatieven voor hematocriet gevoelige methoden KKGTDAG2013 3

4 Historie Dried Blood spot 1961: Dr Robert Guthrie ontwikkelde een screening test voor phenylketonuria (PKU) bij neonaten: een bepaling voor fenylalanine in bloed gedroogd op filtreer papier. Vanaf dat moment is bloed spot methode gebruikelijk geworden voor screening van metabole ziekten bij neonaten. Vooral kwalitatieve analyse 09/06/2015 researchtoxicologyum 4

5 Bloed spot methode in TDM Het gebruik van de bloed spot methode in TDM is later ontwikkeld na de neonatale methode. Sinds de tachtiger jaren, maar vooral de laatste 10 jaar zijn veel TDM bepalingen gebaseerd op de bloed spot gepubliceerd. 09/06/2015 researchtoxicologyum 5

6 Andere toepassingen van de bloed spot methode in de literatuur: Genotyperen Wijnen P, Op den Buijsch R, Cheung S, van der Heijden J, Hoogtanders K, Stolk L, van Dieijen-Visser M, Neef C, Drent M, Bekers O. Genotyping with a dried blood spot method: A useful technique for application in pharmacogenetics. Epub 10 oct Clin Chim Acta 2008;388: Identificatie of virussen: eg HIV Klinisch chemische bepalingen Toxicologie: drugs of abuse 09/06/2015 researchtoxicologyum 6

7 09/06/2015 researchtoxicologyum 7

8 Techniek Hoe werkt de dried blood spot methode? KKGTDAG2013 8

9 Bloed spot methode (A) Patient prikt zijn vinger met een automatisch lancet. De patient vult een voorgedrukte cirkel (8 mm ø) op monster papier volledig met één bloeddruppel. De bloed spot moet tenminste 3 uur drogen aan de lucht. Het monster wordt per post verzonden naar het laboratorium KKGTDAG2013 9

10 Bloed spot methode (A) In het laboratorium: -Controle van het monster. - Een ponsje (7.5 mm ø) wordt uitgeponst. -Extractie van het ponsje vindt plaats. -Het extract wordt geanalyseerd KKGTDAG

11 Bloed spot alternatieve methode (B) Een vinger prik vindt plaats Patient of trained technician brengt nauwkeurig een bepaald volume bloed op het monster papier met een pipet. In het laboratorium wordt de totale spot in zijn geheel geextraheerd KKGTDAG

12 Bloed spot methoden De eerste methode is eenvoudiger, omdat er niet wordt gepipetteerd. Echter op correcte manier bloed bemonsteren en uitponsen van de spot zijn van kritisch belang om het juiste monstervolume te verkrijgen. Met de tweede methode is dit minder kritisch. KKGTDAG

13 Bloed spot in beeld KKGTDAG

14 Voordelen bloed spot methode -De patient is kan thuis bemonsteren (na geschikte training) -(Verkorte ) AUC gemakkelijker: meerdere monsters gedurende de tijd. -Verzenden per post is mogelijk (biohazard risk verwaarloosbaar) -In droge vorm zijn de meeste geneesmiddelen zeer stabiel. -Klein monster volume: + 30 μl per spot. 09/06/2015 researchtoxicologyum 14

15 Nadelen bloed spot methode Bemonsteren is niet onder controle (A) Ondanks training blijkt de kwaliteit van de monsters soms toch onvoldoende te zijn. Patienten zijn soms bang voor vingerprik Klein monstervolume betekent dat gevoelige en dus dure analytische technieken nodig zijn. Meestal zijn de methoden beperkt tot één geneesmiddel. Na analyse is er meestal geen monster over. 09/06/2015 researchtoxicologyum 15

16 Dried blood spot Wat is er nieuw? KKGTDAG

17 Alle TDM bepalingen Bijna alle bepalingen die routinematig in TDM worden gedaan met veneus bloed, zijn nu ook beschikbaar als dried blood spot methode. KKGTDAG

18 Bloed spot TDM bepalingen Antipsychotics Antiepileptics Antimalarials Antibiotics Antifungals Tuberculostatics Antiretrovirals Immunosuppressives Tyrosinekinase-inhibitors 09/06/2015 researchtoxicologyum 18

19 Review artikelen - Li W, Tse FL. Dried blood spot sampling in combination with LC-MS/MS for quantitative analysis of small molecules. Biomed Chromatogr. 2010;24(1): Peter M. Edelbroek, Jacques van der Heijden, and Leo M. L. Stolk. Dried Blood Spot Methods in Therapeutic Drug Monitoring: Methods, Assays, and Pitfalls. Ther Drug Monit Volume 2009;31(3): review of 30 papers about TDM based on DBS 09/06/2015 researchtoxicologyum 19

20 Updates In 2010 and 2012 zijn updates van ons review article: 40 nieuwe artikelen gepubliceerd op de IATDMCT website: scientific committees: new sampling strategies committee 09/06/2015 researchtoxicologyum 20

21 Toxicologie Also on IATDMCT website Review of assays of toxicological assays based on DBS. 30 references Dried blood spots in toxicology: from the cradle to the grave? Critical Reviews in Toxicology, 2012; 42(3): Christophe P. Stove, Ann-Sofie M.E. Ingels, Pieter M.M. De Kesel, and Willy E. Lambert KKGTDAG

22 Toxicologische bepalingen Drugs of abuse (XTC, cocaine, opiates, cotinine, fentanyl, tramadol, zolpidem, ethylgucuronide etc) Environmental contaminants (pesticides, polychlorinated biphenyls, cholinesterase inhibitors etc) Biotoxins ( Brevetoxins = giftige algen, ciguatoxin etc) Trace elements (As, Hg, Pb, Tl etc) KKGTDAG

23 Pharmaceutische industrie en DBS Voor registratie nieuwe geneesmiddelen is onderzoek met dieren verplicht DBS kan veel geld besparen : -Kleine hoeveelheid monster (bijv voor maken conc tijd curve is maar één dier nodig.) -DBS monsters zijn stabiel (geen dure koeling tijdens transport nodig). KKGTDAG

24 Daarom had de farmaceutische behoefte aan ontwikkeling van nieuwe technieken om veel monsters te kunnen afhandelen in korte tijd: Dus automatisering KKGTDAG

25 KKGTDAG

26 a system for the automated extraction of DBS cards that can be coupled directly to LC-MS systems: Fully automated handling of up to 500 DBS cards.optical DBS card positioning and identification including barcode reading module (OCR) Wash station eliminates carryover.internal standard (IS) application module.easy Integration LC- MS systems KKGTDAG

27 Technieken voor directe analyse zijn ontwikkeld Directe Elutie Directe Desorptie KKGTDAG

28 KKGTDAG

29 Desorption electrospray ionisation DESI is een combinatie van Electrospray and Desorption Ionisation. Ionisatie vindt plaats met een electrisch geladen mist een paar mm bij het monster oppervlakte te brengen en daartussen een spanningsverschil aan te brengen. KKGTDAG

30 DESI KKGTDAG

31 Stabiliteit en flash heating monsters Gewoonlijk zijn DBS monsters stabiel in droge vorm. Echter vlak na bemonstering, wanneer het monster nog nat is, kan (enzymatische) afbraak plaatsvinden. KKGTDAG

32 KKGTDAG

33 Hitte stabilisatie Een nieuwe techniek : Kort verhiten op hoge temperatuur: 30 sec 95 ºC. Bij enkele model geneesmiddelen is stabiliteit van deze methode onderzocht. Oseltamivir, cefotaxime and ribavirin konden met succes worden gestabiliseerd. Arthemeter en Dihydroartemisin waren instabiel zelfs bij kort verhitten bij 60 ºC.

34 Oseltamivir verhit bij 95 C gedurende 30 sec

35 Bloed of plasma? KKGTDAG

36 Dried blood spot monsters zijn in essentie volbloed monsters. Klassieke TDM wordt over het algemeen in plasma of serum gedaan. Referentie waarden worden altijd aangegeven als concentraties in plasma of serum

37 De niet eiwit gebonden fractie van geneesmiddelen in plasma is de werkzame fractie. Deze is over het algemeen lastig te bepalen. Daarom wordt meestal alleen de totale concentratie in plasma bepaald.

38 De fundamentele vraag is: Is de totale geneesmiddelconcentratie in DBS ( = volbloed), een geschikte vervanger voor de totale concentratie en de vrije ongebonden concentratie in plasma? Rowland M et al.use of dried blood spots in drug development:pharmacokinetic considerations. Bioanalysis 2010;2:1791-6

39

40 -Eiwitbinding Parameters -Binding aan bloedcellen -Hematocriet = Verhouding volume rode bloedcellen/totaal volume van het bloed. (gemiddeld 0,45)

41 KKGTDAG

42 Conclusies Rowland et al Voor geneesmiddelen die weinig variabiliteit vertonen in eiwitbinding en in affiniteit voor de bloedcellen zijn er geen problemen voor gebruik van DBS (volboed) als alternatief voor plasma.

43 Het probleem van variatie van de Hematocriet KKGTDAG

44 Twee Hematocriet problemen 1) Analytisch probleem: De bias in de nauwkeurigheid van de bepaling die wordt veroorzaakt door spreiding van het op papier opgebrachte bloedmonster. 2) Fysiologisch probleem : Invloed op de Bloed plasma ratio. KKGTDAG

45 Volume wordt beinvloed door Ht Het uitgangspunt in DBS is dat bij gebruik van een standaard maat pons, alle spots hetzelfde volume opleveren. Echter wanneer het bloed zich radiaal over het papier verspreid, bepaalt de viscositeit van het bloed hoe ver het bloed zich verspreid. De viscositeit wordt bepaald door de hematocriet van het bloedmonster. KKGTDAG

46 Oplossingen voor het analytische hematocriet probleem : -In de validatiefase het effect over een range van hematocriet waarden onderzoeken. -Niet uitponsen maar de gehele bloed spot analyseren. Dit betekent wel dat bij monstername nauwkeurig met een pipet moet worden gepipetteerd. -Gebruik van Dried plasma spots KKGTDAG

47 2) Fysiologisch probleem Indien Hematocriet bekend is, kan er gecorrigeerd worden met een formule: Cb/Cp = (1-Ht) + Ht x ρ x fu KKGTDAG

48 Hoe weten we wat de hematocrit is met alleen een bloed spot? Antwoord: Voorspelling van de hematocriet van dried bloed spots door het meten van kalium in de spot met een routine clinical analyzer. Capiau S, Stove W, Lambert W, Stove C. Analytical Chemistry 2012; 85(1): KKGTDAG

49 Kalium wordt geanalyzeerd in kleine 3 mm ponsjes. Kalium concentraties zijn: Zeer hoog intracellular in rode bloedcellen 140 mmol. In plasma mmol en deze staat onder sterke fysiologische controle. Dus bij kleine verandering hematocriet: grote verandering kalium concentratie.

50

51 Alternatieven voor hematocriet gevoelig monster papier KKGTDAG

52 Cellulose vrij monster papier KKGTDAG

53 KKGTDAG

54 KKGTDAG

55 KKGTDAG

56 New Hematocrit Independent Dried Blood Spot Card John Mommers 1, Ellen Gorissen 1, Nik de Bont 2, Jun Qui 2,3, and Ynze Mengerink 1 * 1 DSM Resolve, 2 DSM Biomedical, 3 DSM Ahead, *corr adres: PO Box 18, 6160 MD Geleen, The Netherlands (ynze.mengerink@dsm.com) KKGTDAG

57

58 Alternatieve matrices KKGTDAG

59 In dit artikel wordt ipv bloed spot een plasma spot onderzocht. De plasma spot wordt verkregen na centrifugeren en opbrengen plasma. De resultaten in vergelijking met klassiek plasma zijn goed. KKGTDAG

60 Praktischer oplossing. KKGTDAG

61 Yorktest membrane filtration device Het device (ontwikkled voor bepaling homocysteine ) bestaat uit twee membranen. Het bovenste membraan is in staat om bloedcellen af te filtreren, maar het plasma door te laten tot het onderste membraan. Het bovenste membraan kan worden verwijderd, zodat het membraan met de plasma spot overblijft.

62 Dried Plasma Spot KKGTDAG

63 KKGTDAG

64 Behalve bloed meer matrices mogelijk. Plasma Urine Saliva etcetera The Dried Blood Spot lijkt te veranderen in The Dried Matrix Spot KKGTDAG

65 vragen? KKGTDAG

66

67 KKGTDAG

68 Dried plasma spots KKGTDAG

69 09/06/2015 researchtoxicologyum 69

70 DESI The electrospray mist wordt naar het oppervlakte getrokken door een spanningsverschil aan te brengen met het monster. Na ionisatie, verplaatsen de ionen zich naar de atmospheric pressure interface die verbonden is aan de massa spectrometer. KKGTDAG

71 Pharmacokinetic considerations about use of dried blood spot sampling Rowland M et al Use of dried blood spots in drug development: pharmacokinetic considerations Bioanalysis 2010;2:

72 Ratio concentratie Bloed/Plasma Ratio van de concentratie bloed/plasma van een geneesmiddel is een middel om af te leiden of plasma eiwit binding of bloed cel affiniteit een belangrijke rol speelt bij DBS.

73 Wateroplosbare geneesmiddelen Bij wateroplosbare geneesmiddelen, die zich niet verdelen in bloedcellen ligt de Ratio in de buurt van Bloed cellen gedragen zich louter als verdunningsmiddel en alleen de Hematocrit en de eiwitbinding zijn van belang. Voorbeeld: tobramycine

74 Geneesmiddelen met hoge affiniteit voor bloed cellen: R > 2 Sterke binding aan bloedcellen De Hematocriet en binding aan bloedcellen zijn dan van belang Voorbeeld tacrolimus R =10-20