Inleiding Biotechnologie 1

Transcriptie

1 Ineiding Biotechnoogie 1 MODULE European Initiative for Biotechnoogy Education Aan de modue hebben bijgedragen: Eckhard R. Lucius (Coördinator) Catherine Adey, Jan Frings, Ceciy Leonard, Dean Madden, Marcus Müer, Uta Neen, Patricia Nevers, John Schoar, Mareen van Strydonck, Pau Wymer.

2 Het Europees Initiatief voor Biotechnoogische Educatie (EIBE) stet zich tot doe vakkennis te verspreiden, inzicht en begrip te vergroten en het maatschappeijk debat te bevorderen door midde van verbeterd biotechnoogisch onderwijs in schoen in de Europese Unie (EU). EIBE Contactpersonen BELGIË/BELGIQUE Prof. Dr. Vic DAMEN/ Mareen van STRYDONCK, Universitaire Insteing Antwerpen (U.I.A.), Department Didactiek en Kritiek, Universitätspein 1, 2610 Antwerpen, emai Dr. Maurice LEX, EC, GD XII E-1, SDME 9/38, Rue de a Loi 200, 1049 Bruxees, Fax 0032/2/ BULGARIA Prof. Raytcho DIMKOV, University of Sofia St. Kiment Ohridski, Facuty of Bioogy, Dr. Tzankov bvd. No. 8, 1421 Sofia, emai ray@biofac.uni-sofia.bg CZECHÁ REPUBLIKA Dr. Hana NOVÀKOVÀ, Pedagprogram co-op Pedagogiká Fakuta UK, Konevova 241, Praha 3. Fax +420/2/ DANMARK Dr. Dorte HAMMELEV, Association of Danish Bioogists, Sønderjyands Ae 2, 2000 Frederiksberg, emai dorte@centrum.dk Mrs Lisbet MARCUSSEN, Association of Danish Bioogists, Skoebakken 13, 5800 Nyborg, emai isbetma@post2.tee.dk DEUTSCHLAND Prof. Dr. Horst BAYRHUBER/ Dr. Jens FRIEDRICH/ Dr. Eckhard R. LUCIUS/ Mrs Renate GLAWE, Institut für die Pädagogik der Naturwissenschaften (IPN) an der Universität Kie, Oshausenstr. 62, Kie, emai csec@ipn.uni-kie.de, friedrich@ipn.uni-kie.de, ucius@ipn.uni-kie.de; gawe@ipn.uni-kie.de Dr. Ognian SERAFIMOV, INCS-Centre of UNESCO, c/o Jörg-Zürn- Gewerbeschue, Rauensteinstr. 17, Überingen, emai joergzuern.os@t-onine.de, ognian.serafimov@t-onine.de Prof. Dr. Eberhardt TODT, Universität Giessen, FB Psychoogie, Otto- Behage Str. 10, Giessen, emai Eberhard.Todt@psycho.uni-giessen.de Prof. Dr. Michae SCHALLIES, Pädagogische Hochschue, Heideberg, FB Chemie, Im Neuenheimer Fed 561, Heideberg, emai schaie@ph-heideberg.de EESTI Prof. Dr. Tago SARAPUU, Science Didactics, Dept., University of Tartu, Vanemuise , Tartu 51014, emai tago@ut.ee. EIRE Dr. Catherine ADLEY, University of Limerick, Biotechnoogy Awareness Centre, Dept. of Chemica and Environmenta Sciences, Limerick, emai Catherine.Adey@u.ie Mrs. Ceciy LEONARD, University of Limerick, Dept. of Life Sciences, Limerick, emai ceciy.eonard@u.ie ELLADA Prof. Vasiis KOULAIDIS/Ass. Prof. Vasiiki ZOGZA- DIMITRIADI, University of Patras, Dept. of Education, Rion, Patras, emai zogza@upatras.gr, Kouaidi@upatras.gr ESPAÑA Dr. María J. SÁEZ, Dr. Angea GÓMEZ-NIÑO/ Rosa VILLAMANAN, Universidad de Vaadoid, Dept. de Bioogia Ceuar y Farmacoogia, Geoogo Hermandez Pacheco 1, Vaadoid 47014, emai mariaj@redestb.es, Angea@bioce.uva.es, rviama@dce.uva.es FRANCE Prof. Gérard COUTOULY, LEGPT Jean Rostand, 18, Bouevard de a Victoire, Strasbourg Cedex, emai coutouy@cybercabe.tm.fr Prof. Laurence SIMONNEAUX, ENFA, Tououse, Boîte Postae 87, Castanet-Toosan Cedex, emai aurence.simonneaux@educagri.fr ITALIA Prof. A. BARGELLESI-SEVERI/Dr. Stefania UCCELLI/Dr. ssa. A. CORDA-MANNINO, Centro di Biotecnoogie Avanzate, Largo Rosanna Benzi 10, Genova., emai dcs@ist.unige.it LUXEMBOURG Mr. John WATSON/Mr. Laurent KIEFFER, European Schoo, 23 BLVD Konrad Adenauer, 1115 Luxembourg, emai aurent.kieffer@euroschoo.u, john.watson@ci.educ.u NEDERLAND Dr. David J. BENNETT, European Federation of Biotechnoogy Working Party on Education, Cambridge Biomedica Consutants, Oude Deft 60, NL-2611 CD Defte, emai efb.cbc@stm.tudeft.n Dr. Fred BRINKMAN, Hogeschoo Hoand, Communication Project, P.O. Box 261, 1110 AG Diemen, emai f.brinkman@hshoand.n Drs. Liesbeth van de GRINT, Hogeschoo van Utrecht, Coordinatiecentrum van het Landeijk Network voor Educatiecentra voor Biotechnoogie, Postbus 14007, 3508 SB Utrecht, emai Liesbeth.vd.Grint@feo.hvu.n Dr. Jan F.J. FRINGS, Pr. Marijkeaan 10, 7204 AA Zutphen, emai j.frings@hccnet.n Dr. Ana-Maria BRAVO-ANGEL, Secretariat of the Task Group on Pubic Perceptions of Biotechnoogy, Oude Deft 60, NL-2611 CD Defte, emai efb.cbc@stm.tudeft.n RZECZPOSPOLITA POLSKA Dr. Anna STERNICKA, University of Gdansk, Dept.of Bioogy, AL. Legionow 9, Gdansk, Fax +48/58/ SCHWEIZ Dr. Kirsten SCHLÜTER, ETH, Institut für Verhatenswissenschaften, ETH Zentrum TUR, Turnerstr. 1, 8092 Zürich, emai schueter@ifv.huwi.ethz.ch SVERIGE Mrs. Margareta JOHANSSON, Föreningen Gensyn, P.O. Box 37, Svaöv, emai margareta.johansson@gensyn.svaov.se Dr. Eisabeth STRÖMBERG, Östrabogymnasiet, Kämpegatan 36, Uddevaa, emai es@ostrabo.uddevaa.se THE UNITED KINGDOM Dr. John GRAINGER/ Mr. John SCHOLLAR/ Dr. Caroine SHEARER, Nationa Centre for Biotechnoogy Education, The University of Reading, Whiteknights, P.O. Box 228, Reading RG6 6AJ., emai j.m.grainger@rdg.ac.uk, j.w.schoar@rdg.ac.uk, c.shearer@rdg.ac.uk Mr. Wibert GARVIN, The Queen s University of Befast, Schoo of Education, 69 University Street, Befast BT7 1HL, emai w.garvin@qub.ac.uk Dr. Ji TURNER, The Queen s University of Bedfast, Schoo of Nursing and Midwifery, 1-3 Coege Park East, Befast BT7 1LQ, emai Ji.Turner@Queens-Befast.ac.uk Dr. Pau WYMER, 6 Park Way, Whetstone London N20 0XP, emai pau.wymer@virgin.net Dr. Jenny LEWIS, University of Leeds, Centre for Studies in Science and Mathematics Education, Leeds LS2 9JT, emai j.m.ewis@education.eeds.ac.uk Mr. Adam HEDGECOE, University Coege London, Dept. of Science and Technoogy Studies, Gower Street, London WC1E 6BT, emai a.hedgecoe@uc.ac.uk. E.I.B.E. co-ordinator Prof. Dr. Horst BAYRHUBER, Institut für die Pädagogik der Naturwissenschaften (IPN) an der Universität Kie, Oshausenstr. 62, Kie, Deutschand. Te.: , Fax: emai: csec@ipn.uni-kie.de. E.I.B.E. secretariat Dr. Jens FRIEDRICH/Renate GLAWE, Institut für die Pädagogik der Naturwissenschaften (IPN) an der Universität Kie, Oshausenstr. 62, Kie, Deutschand. Te.: and , Fax , emai: friedrich@ipn.uni-kie.de, gawe@ipn.uni-kie.de. 2 EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 2000

3 Ineiding Biotechnoogie MODULE 1 European Initiative for Biotechnoogy Education Inhoudsopgave H H H H H H H H H H H H H H H Word Wide Web H H H H H H H H H H H H H H H INHOUD Vei eiigheid, igheid, copyright en verantwoording 4 Over Modue 1 Ineiding 5 Er zijn maar weinig gebieden die zich zo sne ontwikkeen as de biotechnoogie. De EIBE Modues worden eektronisch gepubiceerd om ze te kunnen actuaiseren en ze dan zo goedkoop mogeijk te verspreiden. Modeen DNA bouwpaat 6 Bacteriofaag bouwpaat 8 DNA isoatie DNA isoatie uit bacteriën 10 DNA isoatie uit uien 12 Productie Amyase productie 14 Ceuase productie 16 Antibioticum productie 18 Micro-organismen in actie Brooddeeg 20 Geïmmobiiseerde gistceen 22 Brandstofce 25 Genoverdracht Bacteriëe conjugatie 27 Genoverdracht door Agrobacterium tumefaciens 31 Appendix 1 Microbioogische media 34 Appendix 2 Microbioogische technieken 35 Appendix 3 Het openen van een ampu 40 Deze pagina s (en de andere EIBE Modues) zijn overa ter wered beschikbaar via het Word Wide Web. Ze zijn te vinden onder: Ae EIBE Modues op het Word Wide Web zijn Portabe Document Format (PDF) Fies. Dit betekent dat de kwaiteit van de iustraties, keuren, ettertypen en ay-out van deze documenten gehandhaafd bijft, ongeacht weke computer wordt gebruikt (Macintosh -incusief Power PC, Windows, DOS of Unix patforms). Bovendien zijn PDF-fies keiner dan de oorspronkeijke fies, zodat het minder tijd kost om de documenten te downoaden. Om deze EIBE Modues te kunnen bekijken, is we een programma van Adobe Acrobat (Reader) nodig. Het Reader programma van Adobe Acrobat is gratis verkrijgbaar in diverse taen (Nederands, Enges, Frans, Duits en Itaiaans). Het kan worden gedownoad van de EIBE of Adobe WWW site: Met behup van deze software kunnen de EIBE Modues bekeken en uitgeprint worden. Verder is het mogeijk om rond te neuzen en rustig de documenten te doorzoeken.n.b.: Adobe en Acrobat zijn handesmerken van Adobe Systems Incorporated die in bepaade rechtsgebieden kunnen zijn gedeponeerd. Macintosh is een handesmerk van Appe Computer Incorporated. EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998 MODULE N 1: INLEIDING BIOTECHNOLOGIE 3

4 Veiigheid We hebben geprobeerd ae EIBE Modues op ae mogeijke gevaren te controeren en van passende veiigheidsvoorschriften te voorzien. De wet - die in de EG gedt in de vorm van EG-richtijnen - beperkt geen experimenten waarbij natuurijk voorkomende parasexuee processen, zoas conjugatie, transductie of fagenkruising, in het aboratorium toegepast worden, op voorwaarde dat de gebruikte organismen geen gentechnoogisch veranderd DNA bevatten. De voorgestede procedures zijn, indien mogeijk, in overeenstemming met de agemeen gedende risicobeoordeingsanayses. As er sprake is van een verhoogd risico is dit aangegeven. Voor het werken met micro-organismen geden kort onderstaande veiigheidsmaatregeen. Deze staan bekend as VMT, Veiige Microbioogische Techniek. Appendix 2 in deze Modue geeft nog eens uitgebreid veiigheidsvoorschriften op microbioogisch gebied. De tien geboden van VMT: Werk vogens de reges, speciaa as u denkt dat er geen risico is. Houd de deur dicht. Houd uw jas dicht en binnen de practicumruimte. Begin met schone handen en nages, zonder ringen of armbanden. (Vui vermindert de weerstand van de huid en verbruikt desinfectans. De huid onder ringen en banden kan niet worden gewassen of ontsmet.) Verzame aes wat nodig is en ste dat ordeijk op voor u begint. Vermijd hand-mond contact: niet roken, niet eten, niet drinken. Vermijd aërosovorming. Aërosovorming kan optreden door: 2 gieten van voeistof, 2 vaende druppes, 2 uitbazen van pipetten, 2 openen van vochtige stoppen, 2 centrifugeren van open buizen, 2 te warme entogen. Gebruik mechanische hupmiddeen voor pipetteren. Deponeer gebruikte pipetten in een desinfecterende voeistof. Besteed voe aandacht aan opruimen, desinfectie, afvoer van besmet materiaa en handen wassen. Copyright Deze EIBE Modue vat onder het copyright. De medewerkers van deze Modue benadrukken hun recht om erkend te worden as copyright houders as omschreven onder sectie 77 van de Designs, Patents and Copyright Act, UK (1988). Voor onderwijskundige doeeinden Eektronische of schrifteijke kopieën van deze EIBE Modue of pagina s mogen worden gemaakt voor kassikaa gebruik, onder voorwaarde dat de kopieën zonder kosten, of tegen reproductiekosten worden uitgedeed, en dat de medewerkers van de Modue worden erkend en genoemd as copyright houders. Gebruik door derden voor andere doeeinden Deze Modue mag worden doorgegeven aan individuen voor niet-commerciëe doeeinden, maar niet met behup van eektronische distributieijsten, maiing ists (istserv), nieuwsgroepen, buetin boards of ongeautoriseerde Word Wide Web paatsingen. Het is evenmin toegestaan om met andere bukdistributie, toegangs- of reproductiemechanismen die een abonnement, of geautoriseerde individuee toegang vervangen, te gebruiken, of deze beperkingen anderszins te omzeien. Commerciee gebruik Het gebruik van materiaa van deze Modue voor commerciëe doeeinden, zonder vooraf verkregen toestemming van de copyright houders, is strikt verboden. Indien u dit materiaa voor commerciëe doeeinden wenst te gebruiken, in zijn gehee of een dee ervan, of indien u het in de een of andere vorm wenst te pubiceren, dan dient u contact op te nemen met: EIBE secretariaat (Ute Harms) p/a Institut für die Pädagogik der Naturwissenschaften Universität Kie Oshausenstraße 62 D KIEL 1 Duitsand teefoonnummer: +49 (0) faxnummer: +49 (0) Emai adres:harms@ipn.uni-kie.de Ontwikkeingsteam Catherine Adey, Universiteit van Limerick, Ierand Jan Frings, Educatiecentrum voor Biotechnoogie, Hogeschoo van Utrecht, Nederand Ceciy Leonard, Universiteit van Limerick, Ierand Eckhard R. Lucius (coördinator), IPN, Kie, Duitsand Mareen van Strydonck, Universiteit van Antwerpen, Begië Pau E.O. Wymer, Society for Genera Microbioogy, Groot-Brittannië. Ontwerp, iustraties, vormgeving, additionee teksten en editing: Dean Madden, NCBE, The University of Reading, The United Kingdom. Iustrations and typography Dean Madden, Verantwoording en dank De EIBE wi in het bijzonder de vogende personen bedanken voor hun hup bij de productie van deze Modue. Liesbeth van de Grint (Hogeschoo van Utrecht, EcB). en John Schoar (NCBE, Reading, Engeand) hebben een mutinationae workshop opgezet en begeeid, waarbij de materiaen van deze Modue zijn getest. De vogende docenten hebben deegenomen en vee waardevoe commentaren geeverd op de concept versie: E. Vergauts, L. Danies, L. Nees (Begië), Dorte Hammeev (Denemarken), Lucienne Diemer, Gérard Coutouy (Frankrijk),Thomas Jeb, Dr. U. Schnack; Dr. E. Lipkow (Duitsand),A. de Graaf, Guus Smid, J. Gradener (Nederand),Rebecca Weston, Jane Gent, Derek Mackie, Sarah Whitethread, Maggie Parson (Groot-Brittannië). 4 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998

5 INLEIDING Over deze Modue H H H H H H H H H H H H H H H Deze Modue bestaat uit een verzameing van opdrachten die ontworpen zijn om, onafhankeijk van ekaar of in een serie, in het esprogramma te worden gebruikt. Ze zijn ontworpen door eraren en onderwijskundigen uit diverse Europese anden, bijeen gebracht met ondersteuning en aanmoediging door DGXII van de Europese Commissie, onder auspiciën van EIBE, het Europees Initiatief voor Biotechnoogie Educatie. A onderdeen zijn uitvoerig getest tijdens praktijk-workshops, waaraan eraren uit diverse deen van Europa hebben meegewerkt. De onderdeen van deze Modue bestaan uit: 1. Goedkope modeen van DNA moecuen en diverse micro-organismen. Deze zijn bedoed om de beangrijkste kenmerken van deze systemen te demonstreren en de eeringen de mogeijkheid te bieden om de reatieve afmetingen van microorganismen te bestuderen. 2. Eenvoudige, veiige en goedkope DNA isoeermethoden die de eeringen in aanraking brengen met de hierbij gebruikeijke basistechnieken en ze de mogeijkheid geven om het genetisch materiaa te bekijken. 3. Een reeks experimenten die benadrukt: a) de aanwezigheid van micro-organismen in de omgeving en de seectie van bruikbare stammen en b) een aanta producten die microorganismen kunnen aanmaken (enzymen en antibiotica). Twee experimenten zijn kwaitatief van opzet; een derde evert een kwantitatieve enzymproductie anayse op. 4. Divers onderzoek naar de effecten van microbiëe groei, gerangschikt van een eenvoudige proefje met brooddeeg, via fermentatie tot het direct meten van de metaboische activiteit van gist. In ek van deze onderzoeken is er ruime mogeijkheid voor verdere uitbreiding. Om de eeringen te stimueren, zijn proeven vanuit theoretische principes, maar met een biotechnoogische toepassing uitgezocht. 5. Twee experimenten die de methoden van genoverdracht in de natuur demonstreren. Deze zijn bedoed as een praktische introductie tot de principes van genetische modificatie. De auteurs hebben geprobeerd een combinatie aan te bieden van zowe eenvoudige as meer geavanceerde experimenten, in de hoop dat eke bioogieeraar iets van zijn of haar gading kan vinden. De gebruikte materiaen zijn verkrijgbaar bij de gebruikeijke firma s. Bacteriën, gisten en schimmes zijn in Nederand te koop bij het Centraa Bureau voor Schimmecutures (C.B.S.) te Baarn, te (035) , E-mai: info@cbs.knaw.n. Twee appendices geven de achtergrondinformatie over het gebruik van microbioogische technieken in het schooaboratorium. Aan- of opmerkingen op dit materiaa zijn zeer wekom, voora van eraren, voor wie deze Modue in eerste instantie is ontwikked. Vragen en opmerkingen over deze Modue kunt u sturen naar: Eckhard R. Lucius Institut für die Pädagogik der Naturwissenschaften Universität Kie Oshausenstraße 62 D KIEL 1 Duitsand teefoonnummer: +49 (0) faxnummer: +49 (0) E-mai adres:ucius@ipn.uni-kie.de of (voor Nederand) naar: Liesbeth van de Grint Educatiecentrum voor Biotechnoogie, FEO Hogeschoo van Utrecht, Postbus SB Utrecht Teefoon (030) E-mai: Liesbeth.vd.Grint@feo.hvu.n dan we (voor Begië) naar: Prof. Dr. Vic Damen / Mareen Van Strydonck Universiteit Antwerpen - Dept. DIKR Universiteitspein 1, 2610 Wirijk. Teefoon: 03 / Fax: 03 / E-mai: vdamen@uia.ua.ac.be mvstryd@uia.ua.ac.be EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE 5

6 Modeen DNA bouwpaat H H H H H H H H H H H H H H H Doe Inzicht krijgen in de beangrijkste eigenschappen van de structuur van DNA. Benodigde tijd Het maken van dit mode kost ongeveer een haf uur. Het eventuee inkeuren vergt wat meer tijd. Benodigdheden per eering of groepje eeringen Scharen Papierijm, ijmstick, pakband of een keine nietmachine. N.B. Dubbezijdig pakband is ook geschikt, hoewe dat vaak na een poosje weer os aat. Stuk touw (om het mode aan op te hangen as het kaar is) Opmerking: Het mode wordt steviger as twee suiker-fosfaat strengen ruggeings op ekaar geijmd worden. Werkwijze 1. Knip de beide suiker-fosfaat strengen A en B uit. 2. Knip de baseparen uit. 3. Vouw de uiteinden van de baseparen zoas staat aangegeven op de pagina hiernaast. 4. Lijm het ene omgevouwen stuk van ek basepaar aan een nummer op streng A. De vogorde doet er niet toe. Weke kant van het basepaar ook niet. 5. Lijm het andere stuk van ek basepaar aan het corresponderende nummer op streng B. Dus wat aan nummer 1 op A was geijmd, komt met de andere kant aan nummer 1 op B. 6. Hang het abe met DNA MODEL met een stuk touw aan het mode. Herkomst Dit mode is een aanpassing van een mode dat is ontwikked door de CSIRO in Austraië voor hun Doube Heix Science Cub. De EIBE dankt de CSIRO voor het oorspronkeijke idee en voor hun toestemming dit mode te mogen gebruiken. N 1 N 2 N 3 T C A G T C A G PHE PHE LEU LEU LEU LEU LEU LEU ILE ILE ILE MET SER SER SER SER PRO PRO PRO PRO THR THR THR THR TYR TYR STOP STOP HIS HIS GLN GLN ASN ASN LYS LYS VAL VAL ALA ALA ASP ASP VAL ALA GLU VAL ALA GLU CYS CYS STOP TRP ARG ARG ARG ARG SER SER ARG ARG GLY GLY GLY GLY T C A G T C A G T C A G T C A G De genetische code Eke opeenvoging van drie basen op de dubbee spiraa van het DNA codeert voor een van de twintig aminozuren. Deze worden -in het midden van de tabe- aangeduid met een drieettercode. nuceotide A C C A T C G G T A G C base G T fosfaat suiker De structuur van DNA Twee strengen van suiker- en fosfaatmoecuen vormen het geraamte van het DNA. Daartussen zitten vier basen: thymine (T), cytosine (C), adenine (A) en guanine (G), twee aan twee verbonden door waterstofbruggen. 6 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998

7 Streng A Streng B Baseparen European Initiative for Biotechnoogy Education MODEL van DNA cytosine guanine (P) fosfaat (S) suiker thymine adenine EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE 7

8 Modeen Bacteriofaag bouwpaat H H H H H H H H H H H H H H H Leeringen vinden het noga eens moeiijk zich een beed te vormen van de orde van grootte van micro-organismen. Daarbij komt ook nog dat het moeiijk is een driedimensionaa beed te krijgen op grond van een tweedimensionaa microscopisch beed. Het maken van modeen kan eeringen hepen hier in inzicht te krijgen; bovendien bevordert dit het zicht op de reatieve afmetingen van microorganismen. Deze activiteit za meer resutaat boeken as de eeringen de mogeijkheid krijgen om hun eigen modeen te ontwikkeen, dan wanneer ze een bepaad pan moeten vogen. Deze taak za dan ook beter thuis kunnen worden uitgevoerd, waar een grotere verscheidenheid aan materiaa za zijn, en vermoedeijk ook meer tijd. Opmerking: Voor de bekagenswaardigen die menen dat het bouwen van modeen beneden hun waardigheid is, kan het nuttig zijn te wijzen op de ange, eerbiedwaardige geschiedenis van het modeen maken in de moecuaire bioogie. Hoewe ook opgemerkt kan worden dat vandaag de dag mechanische modeen merendees zijn vervangen door computermodeen Doe Tonen van de meest essentiëe onderdeen van de structuur van de ambdabacteriofaag en van een aanta bacteriën. Inzicht verschaffen in de reatieve afmetingen van virussen en bacteriën. Benodigde tijd Het maken van het mode van de bacteriofaag kost ongeveer 30 minuten. Eventuee inkeuren kost wat extra tijd. Het maken van bacterie-modeen kunnen we een uur of meer kosten, afhankeijk van de aandacht die er aan besteed wordt. Opmerking: Dit is een geschikte huiswerkopdracht. Benodigdheden per eering of groepje eeringen Boeken met afbeedingen van virussen en bacteriën Materiaa wat nuttig kan zijn bij het maken van modeen, zoas karton, gebruikt verpakkingsmateriaa, pingpong baen, touw, enz. Scharen Lijm, pakband of (keine) nietmachine. Vitstiften in diverse keuren. Aanwijzingen voor de eeringen Virus, Bacteriofaag Knip het mode uit; knip en vouw dat tot een mode van de ambda bacteriofaag. Bacteriën Gebruik het beschikbare materiaa om modeen te maken van verschiende bacteriën (coc en staaf). Bij ek mode: 1. Ga na weke de beangrijke onderdeen zijn en waar ze zich in de ce bevinden, zoas cemembranen en erfeijk materiaa. 2. Ste vast hoe groot het organisme is dat je mode voorstet. 3. Ga na op wat voor eenvoudige manier je de reatieve grootte van dit mode aan een jongere eering zou uiteggen, bijvoorbeed: as echte bacteriën zo groot waren, dan zou jij zo groot as een huis zijn. Uitbreiding Leeringen zouden modeen kunnen maken van panten- en/of dier-ceen. Deze kunnen dan gebruik maken om verschien tussen prokaryoten en eukaryoten duideijk te maken en om de endosymbiose theorie duideijk te maken (met uiteg van de veronderstede evoutionaire oorsprong van de eukaryoten). Extra informatie Het maken van modeen is (o.a.) beschreven in: Nicho, L. & Nicho, D. (1987), Modeing the eukaryotic chromosome: a stepped approach. Journa of Bioogica Education 21 (2) MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998

9 EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE 9 Kop waarin DNA Staart Bouwpaat voor de kop van de bacteriofaag λ Fotokopieer dit op karton of op een sheet voor de overhead projector. Knip uit angs de buitenkant. Vouw angs de ijnen. Pak dan de buitenste fappen vast met een goede, snedrogende (papier)ijm. De DNAstreng kan worden voorgested door een dikke draad. Gebruik een imonaderietje voor de staart (het buigbare uitgetrokken stuk maakt het mode hee reaistisch).

10 DNA isoatie DNA isoatie uit bacteriën H H H H H H H H H H H H H H H In dit voorschrift wordt ysozym (een enzym) gebruikt om bacteriecewanden af te breken en een huishoudafwasmidde om de membranen kapot te maken en zo de kernzuren (RNA en DNA) vrij te maken. Doe DNA (en RNA) isoeren uit de bacterie Escherichia coi K-12 Voorbereiding Tenminste 4 dagen tevoren moeten bacteriecutures (op nutrient broth, ook we bekend as Nährbouion of voedingsbouion dan we basismedium, zie appendix 1) worden ingezet. (Aeen vogroeide cutures everen behoorijke hoeveeheden DNA op.) Minstens een etmaa tevoren ethano in een vriesvak zetten. Benodigde tijd Het uitvoeren van deze activiteit kost ongeveer 50 minuten, inbegrepen een haf uur waarin de bacteriën worden geïncubeerd met het enzym. Benodigdheden Per eering of groepje eeringen Vogroeide cutuur Escherichia coi K-12 (zie Voorbereiding hier boven) Lysozym poeder- een spatepuntje is genoeg 6 m ijskoude ethano (mag gedenatureerde zijn) 0,5 m huishoudafwasmidde (de simpeste is de beste) Entoog 3 m gedistieerd water 2 reageerbuizen Pipetje om water en ysozym mengse te pipetteren Waterbad 60 C Incubator (broedstoof of waterbad) 37 C Werkwijze 1 Start een Escherichia coi K-12 cutuur, tenminste 4 dagen voor u de DNA wit isoeren. 2 Voeg een kein beetje ysozym toe aan 5 m bacterie suspensie en meng goed. 3 Incubeer dit mengse 30 minuten bij 37 C. 4 Voeg 0,5 m afwasmidde toe aan de bacteriesuspensie 5 Incubeer dit mengse 2 minuten bij 60 C in een beker water. 6 Laat dit mengse enkee minuten in koud water afkoeen. 7 Giet angzaam en voorzichtig een aag ijskoude ethano op het oppervak van het mengse. 8 DNA en RNA saan neer op de grens van beide agen en trekken in de bovenste (ethano)aag. Het is er dan uit te haen met behup van een draaiende roerstaaf. Op grond van het uiterijk staat het resutaat bekend as snotje. Uitbreiding Keur het DNA met bijvoorbeed acetoorceïne of methyeenbauw. Veiigheid Bij het omgaan met de bacteriecutures moeten de gebruikeijke microbioogische veiigheidsprocedures worden gevogd. Wees ook voorzichtig bij gebruik van heet water (stap 5). Herkomst Dit voorschrift is gebaseerd op een procedure die is ontwikked door Herte et a. en Süßmuth et. a. (1987) die DNA uit Bacius subtiis isoeerden. Dank is ook verschudigd aan Prof. Joseph Lengeer (Osnabrück) voor zijn suggestie om huishoudafwasmidde te gebruiken. chromosoom ribosomen, waar de eiwitsynthese paats vindt cewand pasmiden, keine DNAringen cytopasm cemembraan 10 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998

11 ysozym 5 m bacteriecutuur afwasmidde 1 Zet een E.coi K- 12 cutuur in in basismedium (zie appendix 1). 2 Voeg een kein beetje ysozym toe aan 5 m bacteriesuspensie en meng goed. 3 Incubeer dit mengse 30 minuten bij 37 C. 4 Voeg 0,5 m afwasmidde toe aan de bacteriesuspensie C koud water 5 Incubeer dit mengse 2 minuten bij 60 C (waterbad) in een bekergas water. 6 Laat dit mengse enkee minuten in koud water afkoeen. 7 Giet angzaam en voorzichtig een aag ijskoude ethano op het oppervak van het mengse. 7 ijskoude acoho 8 DNA + RNA 8 de kernzuren (DNA en RNA) saan neer op de grens van beide agen en trekken in de bovenste (ethano)aag. EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE 11

12 DNA isoatie Isoatie van DNA uit ui H H H H H H H H H H H H H H H Dit is een ruwe methode om DNA (en RNA) uit pantaardig weefse te isoeren. Eerst wordt het weefse mechanisch fijn gemaakt. Dan gebruiken we een huishoudafwasmidde om de membranen om de ce en de kern af te breken. Door fitratie raken we brokstukken van de ceen kwijt en het DNA en oposbare eiwitten bijven over. Die eiwitten worden dan met een enzym afgebroken en tensotte aten we het DNA neersaan in ijskoude ethano. Doe DNA isoeren uit ui-weefse. Opmerking: De kernzuren die op deze manier verkregen worden zijn niet erg zuiver. Waar het hierbij echter om gaat is de hoofdijnen te aten zien van het extraheren van DNA uit een weefse. Voorbereiding De te gebruiken ethano (mag gedenatureerde zijn) moet echt ijskoud zijn. Zet daartoe een (pastic) fes ethano tenminste 24 uur tevoren in een vriesvak. Tijdsduur Deze activiteit kost ongeveer 35 minuten incusief een incubatietijd van 15 minuten. Materiaa Per eering of groepje eeringen Keukenmachine, bender, staafmixer of sapcentrifuge Groot, scherp mes en snijpank Grote pastic trechter Thermometer Waterbad 60 C IJs, in een groot bekergas 2 bekergazen (250 m) Koffiefiter (geen aboratorium fitreerpapier) Ui, ca 100 g 10 m Wasmidde (gebruik niet de dikke, geconcentreerde) 3 g keukenzout (NaC) 100 m gedistieerd water Pipet of pastic spuit van 10 m om hoeveeheden voeistof af te meten Reageerbuis Gazen staaf 2 à 3 druppes protease (bijv. Neutrase) 6 m ijskoude (gedenatureerde) ethano. Werkwijze 1 Meng het zout met het wasmidde. Vu aan met water tot 100 m. 2 Hak de ui in keine stukjes niet keiner dan 10 mm x 10 mm. 3 Doe de stukjes ui in een beker en giet het wasmidde-zout-mengse er op. 4 Meng het gehee en zet het in een waterbad van 60 C gedurende precies 15 minuten. 5 Koe het mengse af door het bekergas gedurende 5 minuten in ijswater te zetten onder voortdurend roeren. 6 Giet het mengse in een keukenmachine en draai 5 seconden (niet anger!) op hoog toerenta. 7 Fitreer het mengse in het andere bekergas. Pas goed op dat het schuim op het oppervak het fitraat niet verontreinigt. Dit fitraat is het uienextract dat oposbare eiwitten en DNA bevat. 8 Doe 4 druppes protease bij ca 10 m uienextract in een reageerbuis. Meng goed. 9 Giet nu hee voorzichtig een aag ijskoude acoho bovenop het extract-enzymmengse door de acoho angzaam in de schuin gehouden buis te gieten. Laat dit gehee 2 à 3 minuten staan zonder aan te raken. 10 Het DNA (en ook RNA) saat neer op het grensvak. Dit is as vogt beter zichtbaar te maken: Draai zachtjes met het gasstaafje op het scheidingsvak. Probeer te voorkomen dat de agen a te zeer verstoord worden of dat het fragiee DNA breekt. Er is een wit web van sijmerig DNA te zien die met een Pasteurse pipet uit de buis kan worden gehaad. Uitbreiding Het DNA is te keuren met bijv. karmijnazijnzuur, aceto-orceïne of methyeenbauw. Uit dierijke weefses (zoas kuit van vis, ever, kafsthymus) of micro-organismen kan op een dergeijke manier DNA worden gehaad. Een vijze met stamper (met fijn zand) zijn dan geschikt as een wat eegantere methode dan de bender om het weefse open te breken; er is dan minder kans dat het DNA kapot gaat. Veiigheid Dit voorschrift evert geen bijzondere gevaarijke situaties op. We moet men natuurijk zorgvudig omgaan met het mes en de keukenmachine. Herkomst Deze methode is een bewerking van een voorschrift uit Aison Rasmussen en Robert Matheson (1990), A Sourcebook of Biotechnoogy Activities, Nationa Association of Bioogy Teachers, North Caroina Biotechnoogy Center. ISBN: Dit boek is rechtstreeks verkrijgbaar bij: NABT, Roger Bacon Drive #19, Reston, Virginia 22090, USA. 12 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998

13 Detergent KEUKEN ZOUT IJS 10 m afwasmidde 3 gr keukenzout 100 m water 1 ui (middemaat) Meng het zout met het wasmidde. Vu aan met water tot 100 m. Meng goed om het zout op te ossen. Doe de stukjes ui in een beker en giet het wasmidde-zoutmengse er op. Het afwasmidde breekt de cemembranen af; daardoor komt het DNA vrij uit de kern die in eke ce zit. Zet het bekergas 15 minuten bij 60 ºC In de warmte gaan de processen sneer en wordt het DNase afgebroken dat anders het DNA zou afbreken Koe het mengse af door het bekergas gedurende 5 minuten in ijswater te zetten onder voortdurend roeren... maar dat moet ook weer niet te ang duren, anders gaat het DNA stuk... daarom is een ijsbad nodig Koffiefiter Protease IJSKOUDE ethano Zet de machine 5 seconden aan; niet anger NU worden de uieceen opengebroken. Maar as dit te ang doorgaat, gaat ook het DNA kapot Fitreren Hiermee scheiden we het cewandmateriaa van DNA en eiwitten die in opossing zijn Doe 2-3 druppes enzym bij ca 10 m uienextract in een reageerbuis De protease (er is maar hee weinig nodig) breekt het opgeoste eiwit af Giet hee voorzichtig een geijk voume aan ijskoude ethano bovenop het uienextract De ethano * MOET ijskoud zijn; bewaar het een nacht tevoren in een vriesvak * mag gedenatureerde zijn Isoatie van DNA uit uien 9 DNA wordt zichtbaar in de (bovenstaande) ethanoaag DNA ost niet op in de koude ethano; het trekt uit de opossing naar de bovenaag DNA + RNA EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998 MODULE N 1: INLEIDING BIOTECHNOLOGIE 13

14 Productie Amyase uit bodembacteriën H H H H H H H H H H H H H H H Zetmee is een poymeer, dat bestaat uit gucosemoecuen die aan ekaar gekopped zijn. Het kan een poymeer in een rechte keten zijn, bijvoorbeed amyose. Het kan ook een vertakte poymeer zijn: amyopectine. Deze poymeren kunnen worden afgebroken door extraceuaire poymerases. Die enzymen worden gemaakt door taoze organismen, waaronder bacteriën en schimmes. Vee microben zijn gescreend om na te gaan of ze geschikt zijn voor commerciëe enzymproductie. In dit onderzoek worden bacteriën uit de grond gescreend op extraceuaire amyase productie. β-amyase a-1,6 gucosidase α(1-4) binding Waar grijpen de enzymen het amyopectine aan α(1-6) binding α-amyase amyogucosidase De gucosemoecuen in amyose en amyopectine zijn aan ekaar gebonden door α(1-4) bindingen; de zijtakken in amyopectine zijn aan deze ketens gebonden door α(1-6) bindingen. De beangrijkste in de hande verkrijgbare amyases zijn: α-amyase. Dit hydroyseert α(1-4) bindingen in poymeren van gucose, maar aeen binnen ketens; dit eidt tot korte ketens (dextrinen). Op industriëe schaa wordt het gewonnen uit bacteriën(o.a. Bacius spp.) β-amyase. Dit hydroyseert α(1-4) bindingen in poymeren van gucose, zodanig dat aan het eind van een keten matose wordt afgespitst. Het kan α(1-6) bindingen niet passeren. In de industrie wordt het verkregen uit gerst en mout. amyogucosidase. Dit enzym breekt α(1-4) bindingen zodanig dat steeds gucose wordt afgespitst van de einden van ketens. Het kan α(1-6) bindingen niet passeren. Industriee wordt het verkregen uit de schimmes Aspergius spp. en Rhizopus oryzae. α(1-6) gucosidase. Dit hydroyseert α(1-6) bindingen. Het wordt industriee verkregen uit de bacteriën Bacius acidopuuyticus en Kebsiea pneumoniae. Doe In de grond voorkomende bacteriën testen op de aanwezigheid van amyase productie. Voorkennis De eeringen moeten op de hoogte zijn van eementaire microbioogische technieken, zoas sterie werken. Ook kennis van de zetmeejodium reactie wordt bekend verondersted. Voorbereiding. Grondmonsters. Per eering is 1 g grond nodig, gestoken van ca 10 cm diep. Het beste is het as de grondmonsters uchtdroog zijn. Zetmeevoedingsbodem. (Zie ook appendix 1) Ga uit van in de hande verkrijgbare Nutrient agar. Nutrient Broth (Nährbouion of voedingsbouion) kan ook, maar dan moet per iter extra 20 g agar worden toegevoegd. Vog de aanwijzingen die op de voorraadpot staan. Voeg per iter 2 g oposbare zetmee toe. Reken per eering op 20 m. In verband met het autocaveren, afkoeen, sterie in de (steriee) Petrischaen schenken en verder afkoeen, moet dit ruim voor de es gedaan worden. Een snekookpan is goed bruikbaar as autocaaf. Sterie water moet eveneens voor de es gesteriiseerd zijn. Reken per eering op 15 m. Jodiumopossing: Los 1 g jodiumkristaen en 3 g kaiumjodide op in 300 m gedistieerd water. Doe dit minstens een dag van tevoren; het opossen van de jodiumkristaen kost tijd. Steriee wattenstokjes. De pastic steetjes van de in een winke gekochte wattenstokjes smeten bij autocaveren. Sommige typen kunnen worden behanded met een antimicrobiee midde. U kunt voor deze proef uw eigen wattenstokjes maken door een pukje wattenprop de wikkeen op de punt van een cocktaiprikker. Autocaveer ze in een McCartney fesje of in osjes eromheen gewikked auminiumfoie bij 121 C gedurende 15 minuten. Tijdsduur Voorbereiding en beënten van de Petrischaen: 45 minuten. Bekijken van de resutaten na 2-3 dagen: 15 minuten. Benodigdheden Per student of groep studenten (aangenomen is dat gebruikeijk practicummateriaa beschikbaar is) 1 gram uchtdroge grond van 10 cm diep. Steriee Petrischaa waarin 15 à 20 m steriee zetmeevoedingsagar. 15 m sterie water in een McCartney fesje. Jodiumopossing. Een sterie wattenstokje. Markeerpen (om op Petrischaa te schrijven). 14 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998

15 Werkwijze 1 Doe 1 gram droge grond in 15 m sterie gedistieerd water. Schud krachtig opdat de grond goed wordt verdeed. 2 Doop het steriee wattenstokje in de zojuist gemaakte suspensie. Strijk dat vervogens over de agar in de Petrischaa. 3 Zet een teken op de Petrischaa (bijv. de initiaen) en de datum en waar het grondmonster vandaan kwam. 4 Zet de beënte paat, op z n kop, 2 à 3 dagen weg bij 30 C. 5 Giet dan voorzichtig jodiumopossing over de agar tot op het hee oppervak een aagje van ca 1 mm staat. Waar nog zetmee aanwezig is, wordt de agar bauwzwart (de jodiummoecuen kruipen in de spiraavormige ketens van de zetmeemoecuen). Er ontstaan ichtbruine gebieden (de keur van jodium) angs de randen van koonies as de bacteriën daar zetmee hebben afgebroken. Veiigheid BELANGRIJK. As het niet toegestaan is of niet wenseijk wordt geacht met onbekende organismen te werken kan een cutuur van Bacius subtiis worden gebruikt in paats van bodemorganismen. Bij de uitvoering van dit practicum en het opruimen van de paten moeten de gebruikeijke microbioogische veiigheidsvoorschriften in acht worden genomen, hoewe sterie werken niet echt nodig is tot op het moment van de beënting. Het is niet verstandig cutures te kweken vanuit de (niet bekende) organismen op deze paten. Jodium is vergiftig en moet met zorg behanded worden. Zetmee Agar Amyasevorming door bodembacteriën Droge grond. Maak een Petrischaa met steriee zetmeeagar kaar. Suspendeer 1 gram grond in 15 m sterie water Sterie water Veeg met een sterie wattenstokje grondsuspensie over de agar. Laat de paat 2 tot 3 dagen staan bij 30 C. Zet de paat op z n kop Geen zetmee op de ichte paatsen Keur de paat met jodium om te kijken waar zetmee is afgebroken. EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE 15

16 Productie Ceuase productie H H H H H H H H H H H H H H H Er is vee afva in de vorm van ceuose. As men die zou kunnen omzetten in veevoer, zou goedkoop materiaa tot een waardevo product worden. De meeste ceuase in de hande is afkomstig van de schimme Trichoderma reesei en wordt geproduceerd in fermentoren. In een Petrischaa groeit de bacterie Ceuomonas echter sneer. De productie van extraceuaire ceuase is daarin makkeijk meetbaar. Doe Een kwantitatieve meting van ceuaseproductie door Ceuomonas. Voorbereiding Ceuomonas kan worden aangehouden in basismedium (zie appendix 1). Ter voorbereiding moeten Ceuomonascutures in basismedium (bijv. in McCartneyfesjes) twee à drie dagen tevoren worden kaargemaakt. De cutures moeten worden geïncubeerd bij C. Per eering is 1 m vodoende. CMC medium bevat per 100 m: 0,5 g carboxymethyceuose (een oposbare vorm van ceuose); 0,1 g NaNO 3 ; 0,1 g K 2 HPO 4 ; 0,1 g KC; 0,05 g MgSO 4 ; 0,05 g gistextract; 0,1 g gucose; aes per 100 m water. Voeg tensotte per 100 m water 1,7 g agar toe. Per eering is ca 15 m medium nodig. Steriiseer het mengse en giet sterie 15 m in eke steriee Petrischaa. Steriiseer vodoende 1 m pipetten Zorg voor vodoende desinfectans bijv. 5% chooropossing. Tijdsduur Voorbereiding en beënten van de Petrischaen: 45 minuten. Bekijken van de resutaten na 2-3 dagen: 15 minuten. Benodigdheden Per student of groep studenten (aangenomen is dat gebruikeijk practicummateriaa eveneens beschikbaar is) Cutuur van Ceuomonas sp. (suspensie) Steriee Petrischaa, waarin 15 m CMC medium (zie Voorbereiding). Sterie water (in McCartneyfes). 2 Steriee 1 m pipetten. Afvabeker waarin een 5% chooropossing. Congorood opossing (1 mg per m water) 1M NaC opossing (5,85 g per 100 m) Ethano (om de kurkboor te steriiseren Kurkboor, diameter 5 mm Markeerpen (om op de Petrischaa te schrijven) Broedstoof, C Werkwijze 1 Doop de kurkboor in acoho. Houd de boor dan in een vam en aat de acoho verbranden. LET OP! Houd die boor horizontaa; anders gaan de vammen door de boor heen as door een schoorsteen en verbranden de handen. 2 Ti de dekse van een CMC paat iets op en maak met de boor een gat in de agar. Suit de dekse. Haa de agarprop weg, zonodig met een entnaad. 3 Herhaa deze stap, zo ontstaan twee gaten in de agar. 4 Markeer ek gat aan de onderkant van de Petrischaa. Een geschikte code kan zijn: C (Ceuomonas) en W (sterie water, de banco). 5 Pipetteer in het juiste gat 0,2 m of van de Ceuomonas suspensie of sterie water, tekens met een andere, steriee pipet. Zet de pipetten na gebruik in de afvabeker met desinfectans. 6 Zet de paten ongeveer een week bij 25 à 30 C. Na 48 uur bij 30 C maakt Ceuomonas hedere zones van zo n 16 mm doorsnee. Na de incubatie 7 Giet wat Congorood-opossing over de paat. Laat 15 minuten staan. Ontkeur dan met de zoutopossing gedurende 10 à 15 minuten. Waar de keur weer verdwenen is, is de CMC afgebroken tot b-(1-4) gucaan. Deze stof bevat zeven of minder gucose-eenheden. De diameter van de hedere zone evert een kwantitatieve maat voor de activiteit van ceuase. Uitbreiding 1 Pipetteer een grondsuspensie (eventuee voorgekweekt, bijv. in voeibare CMC) in de gaten in de paten om microbiëe fora te screenen op ceuase-activiteit. 2 Deze techniek is ook geschikt om commerciëe ceuase producten te onderzoeken. 3 Het veroop van de afbraak door ceuase is te vogen door meer paten te gebruiken. 16 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998

17 Ceuase 1. Steriiseer een kurkboor door hem met acoho te famberen. PAS OP. Acoho is brandbaar. Steriee wattenprop 2. Maak twee gaten in de agar in de paat. 3. Beënt een gat met Ceuomonas suspensie. Doe water in het andere gat. 4. Incubeer de paat 48 uur bij 30 C Pak de dekse vast. 5. Keur de paat Meet de diameter van het gebied waar de ceuose is afgebroken. Veiigheid De gebruikeijke veiigheidsprocedures moeten in acht worden genomen. EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE 17

18 Productie Antibiotica H H H H H H H H H H H H H H H Vee micro-organismen maken antibiotica. Dat zijn stoffen die het groeien van concurrerende bacteriën verhinderen of ze zefs kunnen doden. Vanaf de ontwikkeing van peniciine (gemaakt door de schimme Peniciium) in de jaren 40 zijn deze stoffen met vee succes gebruikt bij de bestrijding van met name infectieziekten. Op het ogenbik zijn de beangrijkste antibiotica afkomstig van de bacterie Streptomyces. Doe De productie van het antibioticum streptomycine door Streptomyces en het effect ervan op enkee micro-organismen aten zien. Voorkennis Herkomst en werking van antibiotica; ontstaan en verspreiding van resistentie tegen antibiotica. Voorbereiding De te gebruiken cutures van Streptomyces griseus moeten in de groeifase zijn. Daartoe moeten ze 2 à 3 dagen worden gekweekt op Petrischaen met 15 à 20 m basisagar. Hieronder: Een drie dagen oude cutuur van Streptomyces griseus (inks, verticaa). De testorganismen zijn (van boven naar beneden): Candida utiis, Micrococcus uteus, Pseudomonas fuorescens, Bacius mycoides, Escherichia coi. Tevoren moet een cutuur worden gekweekt om deze paten te beënten. Dit doet men het beste as vogt. Neem een oogje Streptomyces van een schuine buis, suspendeer dit in 1 m sterie basaa medium en pipetteer dit weer in een cutuurbuis met 5 m sterie basismedium. Laat deze cutuur gedurende 24 uur bij 30 C staan. Beënt de Petrischaen met deze Streptomyces cutuur met één enkee verticae streep, zover mogeijk naar inks; zorg dat de rechterkant sterie bijft. Incubeer de paten gedurende 3 à 4 dagen bij 30 C. Zet bovendien overnachtcutures kaar van testorganismen. (Bijvoorbeed Bacius mycoides, Candida utiis, Escherichia coi K-12, Micrococcus uteus, Pseudomonas fuorescens). Tijdsduur Kaar maken media en cutuur: 60 min. Incubatie van Streptomyces cutuur: Eerst 24 uur, daarna uur. Paten beënten: 20 min. Incubatie uur. Benodigdheden Per student of groepje studenten (aangenomen dat het gebruikeijke practicummateriaa beschikbaar is). Stoof van 30 C Entoog Steriee Petrischaa met 15 à 20 m basisagar, waarop geënt een streep Streptomyces griseus die uur is voorgekweekt. (zie Voorbereiding hierboven) Een keuze uit de vogend testorganismen op schuine buizen: - Candida utiis (gist) - Micrococcus uteus (bacterie) - Pseudomonas fuorescens (bacterie) - Bacius mycoides (bacterie) - Escherichia coi K-12 (bacterie) 18 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998

19 Werkwijze 1. Beënt eke voorgekweekte Streptomyces paat met de testorganismen as vogt: a) Maak een entoog sterie door hem uit te goeien in een brandende vam (bunsenbrander); aat hem kort afkoeen. b) Krab met deze steriee entoog wat af van een schuine buis van een testorganisme. Maak dan een horizontae streep op het open stuk van de paat (rechts van de Streptomyces). Deze streep moet haaks staan op de Streptomycesstreep en er zo dicht mogeijk bij beginnen. PAS OP! Raak de Streptomycesstreep zef NIET met het oogje. c) Maak de entoog weer sterie door hem weer uit te goeien. Herhaa a), b) en c) voor ek van de beschikbare testorganismen. 2. Zet de paten 2 dagen bij 30 C. 3. Bekijk de paten. Veiigheid Dit werk moet in een practicumokaa worden uitgevoerd. Men dient zich te houden aan de normae microbioogische veiigheidsvoorschriften bij het uitvoeren van dit practicum en bij het verwijderen van de gebruikte cutures. De hoeveeheid antibioticum die tijdens deze activiteit wordt geproduceerd evert geen gevaar op. Uiteg Streptomyces griseus produceert het antibioticum streptomycine. Dit diffundeert in het medium. Streptomycine en daarop geijkende antibiotica storen de eiwitsynthese door een binding aan te gaan met het 30S-dee van bacterie-ribosomen. Sommige micro-organismen (Bacius mycoides, Escherichia coi, Micrococcus uteus) zijn daar gevoeig voor, andere (Pseudomonas fuorescens) niet. Gisten (Candida utiis) zijn niet gevoeig voor streptomycine omdat dat eukaryoten zijn; die hebben een andere ribosoomstructuur. Antibiotica Eén enkee streep inks Raak niet aan de Streptomyces! Maak 3-4 dagen tevoren een Petrischaa met Streptomyces griseus kaar. Testorganismen op schuine buizen Maak een entoog sterie Strijk een van de testorganismen uit op de Streptomycespaat. Pak de paat dicht met pakband Merk de paat Doe dit ook met de andere testorganismen. Vergeet niet tussen twee uitstrijkjes de entoog te steriiseren. Zet de paat 2-3 dagen bij 30 C op de kop. EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE 19

20 Micro-organismen in actie Brooddeeg maken H H H H H H H H H H H H H H H Brood bakken is een van de oudste vormen van biotechnoogie. De vroegst bekende vermedingen ervan dateren uit het oude Egypte, zo n 4000 jaar voor Christus. Gewoonijk maken we brood uit een deeg dat, behave gist, tarwemee, water en zout en eventuee wat vet bevat. Dit vormt samen een netwerk waarin de gist gevangen zit. In het mee zitten amyases, die zetmee kunnen omzetten in suikers. En die suikers zijn weer voedingsmidde voor de gist. De gistceen hebben ook een stikstofbron nodig. Die komt van peptiden en aminozuren die ontstaan door gedeeteijke hydroyse van guten (meeeiwit). De stofwisseing van de gist eidt tot de ontwikkeing van acoho en koodioxide. Guten zorgt voor easticiteit en pasticiteit van het deeg. Daardoor komt het dat de koodioxide, een gas immers, gevangen bijft, grote been in het deeg maakt en zodoende zorgt dat het deeg rijst. Het za duideijk zijn dat eiwitrijk mee (het duurste mee) de meeste kans op succes geeft. De bakker gebruikt dit type mee voor krentenbrood; dit zou anders door ae andere ingrediënten secht rijzen. Doe Dit is een gobaa recept, bruikbaar om te onderzoeken wek effect diverse ingredienten hebben. Tijdsduur Uitvoering: 1 esuur, eventuee meer, afhankeijk van de gekozen uitbreidingen. Materiaa Basisrecept per portie deeg 1 g gedroogde gist 75 g (eiwitrijk) tarwemee 50 m water extra ingrediënten as ascorbinezuur, α-amyase, KBr. Keine bekergazen om deeg in te mengen Stevige spates of epes om in het deeg te roeren. 2 maatcyinders (100 m) Kok Opmerking: 75 g mee is ca. 125 m voume, 1 portie deeg is ongeveer 175 m. Werkwijze 1. Meng de gist met het water. Meng dan deze suspensie goed met het mee. 2. Ro het deeg tot een ro. Neem hiervan een stuk dat in een derde tot de heft van de maatcyinder past. Zet de ro in een van de maatcyinders. 3. Noteer de hoogte van eke ro deeg in de maatcyinders aan het begin van de proef en vervogens om de 10 minuten gedurende een esuur. Uitbreidingen 1. Hebben verschiende typen gedroogde gist invoed op de rijssneheid? 2. Hebben verschiende soorten mee effect? (boem, vokorenmee, roggemee enz. Vokorenmee is rijk aan amyase; sommige meesoorten bevatten weinig amyase maar vee guten.) 3. Wat is het effect van de broodverbeteraar ascorbinezuur (vitamine C) op de rijssneheid? (Voeg per boven aangegeven portie deeg 1 g toe.) 4. Wat is het effect van α-amyase? As er verschi is, hoe is dat te verkaren? 5. Kaiumbromide is ook een bekende broodverbeteraar. Het bevordert de vorming van sufhydry-bindingen tussen naast ekaar iggende eiwitten wat een eastischer, uchtiger deeg geeft. Maar tevee uchtigheid verzwakt het deeg weer. Wat heeft het voor effect? 20 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998

21 6. Zout beemmert de activiteit van proteases. En daarmee stoort het de structuur van guten waardoor weer het koodioxide weer moeiijker wordt vastgehouden. Zout maakt guten minder rekbaar doordat dan sterke ionbindingen ontstaan en dat eidt tot een stug deeg. Overmaat aan zout verstoort ook de groei van gistceen. Probeer vast te steen wat de optimae zoutconcentratie van het deeg is. BASISRECEPT VOOR BROODDEEG 1. Neem 1 g gedroogde gist op in 50 m water. 2. Laat de gist water opnemen; voeg dan 75 g mee toe. 3. Meng goed. 1. Doe wat deeg in een maatcyinder. 2. Noteer het voume om de 10 minuten. Vragen Gaat het uitzetten van het deeg we geijk op met de groei of de stofwisseing van de gist? Hoe is je idee hierover te testen? Weke andere omstandigheden (behave de activiteit van de gistceen) zouden invoed kunnen hebben op het voume van het deeg? gedroogde GIST EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE 21

22 Micro-organismen in actie Geïmmobiiseerde gistceen H H H H H H H H H H H H H H H De gewone bakkersgist, Saccharomyces cerevisiae, kan meksuiker (actose), niet verwerken. Het enzym β-gaactosidase breekt actose af tot gucose en gaactose. Gist die samen met dit enzym is geïmmobiiseerd kan we groeien in een medium met actose. Van de beide suikers die ontstaan door de enzymwerking wordt gucose het gemakkeijkst opgenomen. As nu de gucose is verbruikt stet de gist zijn stofwisseing bij en gaat de gaactose opnemen en vergisten. De activiteit van de gist is gemakkeijk te zien aan de hoeveeheid gas (koodioxide) die bij de stofwisseing vrij komt. Foto: Dr Duncan Casson Doe Een ineiding geven op het kwantitatief bestuderen van fermentatie. Voorbereiding Natriumaginaat is secht oposbaar in water. Om het op te ossen moet het water warm zijn en ook moet u fink roeren. Daarom moet natriumaginaat van te voren kaargemaakt worden. As u de opossing wit bewaren kan dat tot zeker een haf jaar in de koekast; anders is het verstandig de opossing te autocaveren. Beangrijk: gebruik gedistieerd of gedeïoniseerd water omdat caciumionen in kraanwater storen. Benodigdheden Per eering of groepje eeringen. 4% natriumaginaatopossing, m 1,5% caciumchorideopossing, 100 m 10 m wegwerpspuit zonder naad theezeefje 2 bekergazen van 200 m 2 erenmeyers van 250 m 2 doorboorde stoppen met gasbuis en sangetjes voor op de erenmeyers 2 grote bekers van ca 500 m 2 maatcyinders van 100 m desinfectiemidde, b.v. natriummetabisufiet of een Gistceen geïmmobiiserd in een matrix van caciumaginaat handesprodukt as Miton (natrium hypochoriet opossing, Procter & Gambe) of Stafiex choortabetten (natrium dichoorisocyanaat, Hospidex) 13% NaC opossing, ca 1. (gewoon keukenzout is geschikt) 100 m medium waarin 2 g gucose, 1 g gistextract en 1 g pepton. 100 m medium waarin 2 g actose, 1 g gistextract en 1 g pepton. 2 m β-gaactosidase. verse of gedroogde bakkersgist. Werkwijze. Maak de boetjes van geïmmobiiseerd enzym en gist as vogt: 1 Meng de gist met 25 m gedistieerd water in een kein bekergas. Dek het af en aat het 10 minuten staan. 2 Meng de natriumaginaatopossing met de β-gaactosidase in het andere keine bekergas. Roer daar 10 m van de gistsuspensie door. 3 Zuig wat van het mengse van aginaat, gist en enzym op in de spuit en voeg dit mengse druppe voor druppe toe aan de 22 MODULE N 1: INLEIDING B IOTECHNOLOGIE EIBE European Initiative for Biotechnoogy Education 1998