Apoptose: to kill or not to kill.

Transcriptie

1 Academiejaar Apoptose: to kill or not to kill. Mattias HOFMANS Promotor: Prof. Dr. Karen Geboes Co-promotor: Dr. Sc. Nancy Van Damme Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUNDE

2

3 Academiejaar Apoptose: to kill or not to kill. Mattias HOFMANS Promotor: Prof. Dr. Karen Geboes Co-promotor: Dr. Sc. Nancy Van Damme Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUNDE

4 De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk. Datum Mattias Hofmans Prof. Dr. Karen Geboes

5 Inhoudstafel 1. Abstract Inleiding Celdood Mechanismen van apoptose Caspase Bcl Intrinsieke pathway Extrinsieke pathway Apoptose en Kanker Colorectaal carcinoom Materialen en methoden Resultaten TRAIL en TRAIL receptor TRAIL TRAIL receptor Functie van TRAIL Relatie met kanker Resistentiemechanismen en strategieën om ze te vermijden Resistentie Resensitisatie TRAIL receptor agonisten Recombinant humaan TRAIL Agonischtische monoclonale antilichamen Discussie... 46

6 Lijst met afkortingen AE Adverse events Apaf-1 Apoptotic protease activating factor-1 ASCO American Society of Clinical Oncology ATP Adenosine-5'-triphosphate Bak Bcl-2 homologe antagonist/killer Bax Bcl-2 associated X protein Bcl-2 B-cell Lymphoma-2 Bid BH3 interacting domain death agonist BIR domeinen Baculoviraal IAP repeat domeinen Bok Bcl-2-related ovarian killer protein Caspase cysteine aspartaat-specifieke protease Ced-3 Cell death protein 3 c-flip cellular FLICE inhibitory protein CRC Colorectaal carcinoom DcR1 Decoy receptor 1 DcR2 Decoy receptor 2 DD Death domain DED Death effector domain DISC Death-inducing signalling complex DLT dose limiting toxicity DR4 Death receptor 4 DR5 Death receptor 5 FADD Fass associated death domain protein FAP Familiaal adenomateuze polypose GALNT14 UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 14 HDAC inhibitoren Histone deacetylase inhibitoren HNPCC hereditary non-polyposis colorectal cancer IAP Inhibitor of apotosis FOLFIRI Combinatie van leucovorin, 5-FU en irinotecan mab Monoclonale antilichamen MAP kinase Mitogen-activated protein kinase MMR Mismatch repair MTD Maximum tolerated dose

7 NF- κ B NK-cellen NSCLC OPG PAK2 PCB PFS PUMA RANK RANKL RECIST rhtrail RIP-1 ROS Smac/DIABLO tbid TNF TRAIL Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells Natural killer cellen Niet-kleincellig longcarcinoom Osteoprotegerin P21 activated kinase paclitaxel, carboplatin en bevacizumab Progressie vrije overleving/ Progression free survival p53 upregulated modulator of apoptosis Receptor Activator of Nuclear factor KappaB Receptor Activator of Nuclear factor KappaB Ligand Respons Evaluation Criteria in Solid Tumors Recombinant human TRAIL Receptor interacting proteïne Reactive oxygen species second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pi truncated BH3 interacting domain death agonist Tumor necrosis factor TNF-related apoptosis-inducing ligand

8 1. Abstract Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) is een eiwit dat apoptose induceert door stimulatie van de dood receptoren DR4 en DR5, gelegen op het celoppervlak. Apoptose is een vorm van geprogrammeerde celdood, die zowel kan optreden in normale cellen als in tumorcellen. Er bestaan twee belangrijk pathways om apoptose te induceren, de intrinsieke en de extrinsieke. Het is deze laatste die gestimuleerd wordt door TRAIL. Het doel van deze masterproef is het onderzoeken van de recentste inzichten in verband met TRAIL-induced apoptose bij colorectale carcinoom (CRC). CRC is één van de belangrijkste kanker gerelateerde doodsoorzaken wereldwijd. TRAIL receptoren staan sedert korte tijd in de belangstelling als mogelijk doelwit voor therapie, gezien het direct optreden van apoptose in tumorcellen en de relatief beperkte cytotoxiciteit ten opzichte van lichaamseigen cellen. In het laatste decennium werden er diverse TRAIL receptor agonisten ontwikkeld die DR4 en DR5 receptoren stimuleren. Preklinische studies hebben evenwel aangetoond dat verschillende tumoren resistent zijn tegen TRAIL-induced apoptose. Deze resistentie kan plaats vinden op verschillende niveaus van de signaalcascade. Resistentie kan het gevolg zijn van verandering in de expressie en functionaliteit van DR4, DR5 en de decoy receptoren, en van veranderingen in de expressie van pro-apoptotische en antiapoptotische proteïnen. Om deze resistentie te omzeilen werden verschillende resensitisatietechnieken ontwikkeld. Chemotherapeutica, NSAIDs, proteasoom inhibitoren, histone deacetylase (HDAC) inhibitoren en andere resensitising drugs kunnen deze resistentie overkomen door TRAIL receptor expressie te beïnvloeden en de expressie van pro- en anti-apoptotische drugs te veranderen. De TRAIL receptoragonisten kunnen opgedeeld worden in twee grote groepen. Enerzijds onderscheiden we recombinant humaan TRAIL, Apo2L/TRAIL, en anderzijds de agonistische monoclonale antilichamen, mapatumumab, lexatumumab, conatumumab (AMG-655), apomab, LBY135, Tigatuzumab, HGS-TR2J en PRO Op dit ogenblik bevinden deze agonisten zich in fase I of fase II klinische studies. De eerste resultaten tonen voor de verschillende agonisten vergelijkbare resultaten. Er worden weinig dose limiting toxicity s (DLT) vastgesteld. Dit betekent dat op basis van de eerste studies de farmaca als veilig beschouwd kunnen worden. Verder wordt een beperkte tumorrespons vastgesteld. Meestal is er hoogstens stabiele ziekte. Verder onderzoek dient te gebeuren om de tumorrespons te bestuderen, om te bepalen welke populaties het meest gebaat zijn met deze nieuwe behandelingen en om de effectiviteit van combinatietherapieën te bestuderen. 1

9 2. Inleiding Apoptose kan gedefinieerd worden als een natuurlijk celproces dat leidt tot geprogrammeerde celdood. De term apoptose is afkomstig van het Griekse woord αποπτοσις dat het vallen van de bladeren betekent (1). Apoptose werd voor het eerst beschreven in 1972 door Kerr, Wyllie en Currie (2). Zij beschreven celdood via apoptose als een basis biologisch fenomeen met belangrijke complicaties op de weefselkinetiek. Dit proces, dat gedurende de evolutie goed geconserveerd is, speelt een zeer belangrijke rol in de weefselhomeostase. Apoptose is niet enkel betrokken bij de normale turn-over van gezonde cellen, maar ook bij het opruimen van mogelijk schadelijke cellen (2;3). Hierdoor wordt op elk ogenblijk van de embryologische ontwikkeling en het leven van een organisme het aantal cellen gecontroleerd door deze op het gepaste ogenblik te verwijderen. Bij verschillende pathologische processen is apoptose betrokken, onder andere bij acute neurologische letsels, neurodegeneratieve ziekten, cardiovasculaire ziekten, AIDS en kanker. De celpopulatie wordt sterk gereguleerd met betrekking tot proliferatie, differentiatie en celdood. Een dysfunctie in een van deze processen kan aanleiding geven tot ongecontroleerde celdood of tot ongecontroleerde proliferatie van cellen met het ontstaan van kanker als gevolg. Kanker ontstaat ofwel door een toename in proliferatie of door een afname in apoptose van de gemuteerde cellen. (zie verder) Celdood Celdood kan gebeuren via verscheidene mechanismen, elk met een andere vorm. Verschillende types van celdood zijn al beschreven. Aanbevelingen van het Nomenclature Committee on Cell Death hebben geholpen bij de classificatie van celdood en van de verschillende types van morfologie (4). We onderscheiden twaalf modaliteiten, waarvan 4 typische en 8 atypische vormen. De 4 belangrijkste vormen van celdood zijn apoptose, necrose, autofagie en cornificatie (zie tabel 1). Cornificatie is een vorm van geprogrammeerde celdood die enkel plaats vindt in de buitenste laag van de epidermis. Necrose werd lange tijd aanzien als een accidenteel en ongecontroleerd proces, maar er is nu bewijs dat necrose ook gereguleerd wordt door signaaltransductie en specifieke degradatiemechanismen. Bovendien draagt het samen met apoptose bij tot de embryologische ontwikkeling en weefselhomeostase. Tumor necrosis factor (TNF), CD95, TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) en receptor interacting proteïn (RIP-1) zijn factoren die zowel apoptose als necrose kunnen uitlokken afhankelijk van hun interacties met receptoren en andere moleculen. Er bestaat een belangrijke cross-talk tussen apoptose en necrose, bv. inactiviteit van caspase (cysteine aspartaatspecifieke protease) kan een shift van apoptose naar necrose geven of naar een mengvorm van beide processen genaamd necroptosis (1). In tegenstelling tot necrose lokt apoptose geen inflammatoire reactie of een immuunreactie uit van het organisme. 2

10 Tabel 1: Verschillende mechanismen van celdood (4). Types celdood morfologische veranderingen Definitie Apoptose Rond worden van de cel Geïntroduceerd door Kerr, Wyllie en Currie Reductie van cellulair en nucleair volume (pyknose) in Volgens Pinkhof betekent apoptose: het Chromatine condensatie fysiologisch uiteenvallen van cellen en Nucleaire fragmentatie opruimen van de fragmenten die door Beperkte wijziging van fagocyten worden opgenomen en daarin cytoplasmatische organellen door lyse of lysosomale enzymwerking Plasma membraan blebbing met worden afgebroken. vorming apoptotische lichamen Apoptose is geen synoniem van Opname door residuele fagocyten geprogrammeerde celdood of van caspase activatie Autofagie o Geen chromatine condensatie Volgens Pinkhof geneeskundig o Massieve vacuolisatie van het cytoplasma woordenboek: Autofagie is een proces waarbij o Vacuoles hebben een dubbel membraan en bevatten degeneratieve organellen of lichaamseigen materiaal verteerd wordt, in het bijzonder cel eigen delen/organellen door lysosomen. cytoplasma Necrose Zwelling van het cytoplasma (oncosis) Necrose kan negatief gedefinieerd worden als celdood zonder de kenmerken van Plasma membraan ruptuur apoptose en van autofagie. Zwelling van cytoplasmatische organellen Volgens Pinkhof: Necrose is de dood van weefsels of cellen mogelijk als gevolg van Chromatine condensatie allerlei factoren. Cornificatie o Eliminatie van cytoplasmatische organellen Cornificatie of keratinisatie is specifiek voor de huid om een barrière te vormen. o Modificatie plasmamembraan Het vindt plaats in de stratum granulare en o Accumulatie van lipiden in L en F granules stratum corneum van de epidermis. Volgens Pinkhof betekent het: omzetting o Extrusie van lipiden in de extracellulaire ruimte in hoorn substantie, verhoorning. o Desquamatie door protease activiteit met verhoorning 2.2. Mechanismen van apoptose Caspase De morfologische veranderingen bij apoptose zijn het gevolg van de activatie van een proteolytisch systeem bestaande uit een familie van proteasen. Deze cysteine aspartaat-specifieke proteasen (caspasen) zijn intracellulaire proteïnen die betrokken zijn bij de initiatie en executie van apoptose. Men onderscheidt de initiator en de effector caspasen. Initiator caspasen zijn in staat om effector caspasen te activeren. Deze effector caspasen op hun beurt klieven intracellulaire substraten, leidend tot celdood. Effector caspasen knippen target proteïnen op specifieke plaatsen in hun sequenties 3

11 (steeds na een aspartaat residu). Dit resulteert meestal in een inactiviteit van dit substraat, zoals klieving van cytoskeletale proteïnen welke verlies van celvorm geven. Caspasen zijn ook in staat om een substraat te activeren. Caspase zorgt voor activatie van PAK2, een lid van de p21 kinase familie, door verwijderen van de negatieve subunit. PAK2 medieert de blebbing van de cel bij apoptose met vorming van apoptotische lichaampjes. Gedurende apoptose zijn verschillende belangrijke proteïnen, zoals B-cel lymphoma 2 (Bcl-2), cytochroom c en apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1) betrokken bij de activatie van caspasen (5). De humane caspase gen familie bestaat uit 11 enzymen onderverdeeld in 2 subfamilies. De inflammatoire groep gerelateerd aan caspase-1 en de apoptotische groep gerelateerd aan cell death proteïn 3 (ced-3). Al deze enzymen vertonen gelijkenissen in aminozuur sequentie, structuur en substraat specificiteit. Ze worden vrijgesteld als zymogenen (pro-enzymen) bestaande uit drie domeinen: een N-terminaal prodomein, een grote subunit die de actieve site cysteine bevat en een C- terminaal domein. Caspasen bevatten een aspartaat klievingsite tussen het prodomein en de grote subunit en één of twee aspartaat klievingsites tussen de grote en kleine subunit. De aanwezigheid van deze klievingsite maakt auto-activatie en activatie door andere caspase enzymen mogelijk (6). Zymogenen worden geactiveerd door twee klievingen. De eerste verdeelt de enzymen in een grote en kleine subunit en de tweede klieving verwijdert het N-terminaal prodomein. Caspasen worden geactiveerd op drie manieren: ofwel door een ander stroomopwaartse caspase, ofwel door associatie met een regulatoire subunit, of door interacties met membraan gebonden signaalcomplexen. Een actief caspase enzym is een tetrameer bestaande uit twee grote en twee kleine subunits. Individuele caspasen vertonen twee grote verschillen, zijnde enerzijds een verschil in lengte en sequentie van het prodomein en anderzijds in substraat specificiteit. Het meest frequente caspase enzym in de cel is caspase 3, deze effector caspase is verantwoordelijk voor het grootste deel van de apoptotische effecten. Caspase 3 wordt in zijn activiteit gesteund door caspase 6 en 7. Ook nog andere caspase moleculen komen voor, zowel initiator als effector moleculen. Daarnaast bevat de cel ook natuurlijke inhibitoren van caspasen (IAP), deze inhiberen de werking en de effecten van de caspasen (5-7). Twee verschillende, maar toch met elkaar interagerende signaal pathways reguleren apoptose en de activatie van de caspase moleculen. We onderscheiden de intrinsieke en de extrinsieke pathway (zie figuur 1) Bcl-2 Een tweede belangrijke groep moleculen welke het mechanisme van apoptose reguleren, is de Bcl-2 familie. Moleculen uit deze familie zijn gelokaliseerd in de buitenste mitochondriale membraan en verhinderen of stimuleren apoptose door regulatie van de loslating van cytochroom c in de intrinsieke of mitochondriale pathway. Deze familie van proteïnen wordt verder onderverdeeld in drie grote 4

12 groepen. We onderscheiden een anti-apoptotische groep met o.a. Bcl-2 en Bcl-x. Leden van deze groep worden gekenmerkt door 4 Bcl-2 homologie domeinen (BH1 tot BH4) en een C-terminale hydrofobe staart. Deze proteïnen gaan apoptose tegen door inhibitie van de loslating van cytochroom c. Daarnaast hebben we ook een pro-apoptotische groep die uit twee subgroepen bestaat, zijnde de Bax subfamilie en de BH3-only proteïnen. De Bax-subfamilie, welke Bax, Bak en Bok bevat, heeft een structuur die vergelijkbaar is met die van de eerste groep, maar bevat geen BH4 domeinen. En de laatste groep bevat enkel een BH3 domein, PUMA en NOXA (7-9). Moleculen van de Bcl-2 familie kunnen homo- en heterodimeren vormen. Via de vorming van heterodimeren tussen proteïnen uit de pro- en anti-apoptotische groep kunnen ze elkaars functie blokkeren. De heterodimerisatie kan beschouwd worden als een neutralisatiereactie. Eenvoudig gesteld kan men zeggen dat de verhouding tussen beide groepen de respons van de cel bepaalt. Als er meer anti-apoptotische Bcl-2 leden zijn, dan zal de cel overleven en in het andere geval zal de cel apoptose ondergaan Intrinsieke pathway De intrinsieke pathway van apoptose, ook wel de mitochondriale pathway genoemd, vindt plaats in de mitochondriën. Deze celorganellen spelen dus niet enkel een rol in de vorming van Adenosine-5'- triphosphate (ATP), maar ook bij apoptose. De intrinsieke pathway wordt geïnduceerd door verschillende doodsignalen waaronder het verlies van groeifactoren, cellulaire stress en DNA schade door cytotoxische chemotherapeutica, hypoxie, reperfusie stoornissen en straling. Al deze factoren veroorzaken activatie van het p53, dat de transcriptie van BH3-only proteïnen induceert. Proteïnen uit de pro-apoptotische groep (Bax, Bak en Bok) die in normale omstandigheden heterodimeren vormen met proteïnen uit de anti-apoptotische groep (Bcl-2, Bcl-XL) worden door deze BH3-only proteïnen losgeknipt en geactiveerd. Deze conformationele wijziging leidt tot translocatie van Bax/Bak naar de mitochondriën, waar ze loslating van verschillende proteïnen, ondermeer cytochroom c, mediëren. In normale omstandigheden bevindt cytochroom c zich in de intermembranaire ruimte, los verbonden met de binnenste mitochondriale membraan en speelt het een belangrijke rol in de synthese van ATP. Het truncated BH3 interacting domain death agonist (TBid), dat geactiveerd wordt door caspase 8 in de extrinsieke pathway door klieving van het BH3 interacting domain death agonist (Bid), kan via Bax/Bak ook de loslating van cytochroom c veroorzaken. Proteïnen uit de anti-apoptotische Bcl-2 familie proberen deze vrijstelling te voorkomen en celoverleving te bevorderen. In het cytoplasma vormt cytochroom c samen met Apaf- 1 en met procaspase 9 het apoptosoom, ook wel het wiel des doods genoemd. In dit apoptosoom wordt caspase 9 geactiveerd. Caspase 9 klieft daarna het effector caspase 3, 6 en 7. Deze caspasen zijn verantwoordelijk voor het grootste deel van de biochemische veranderingen welke we kunnen observeren in apoptotische cellen (6;8-10). 5

13 Recent werd een nieuw proteïne, het Smac/DIABLO, ontdekt. Dit staat voor second mitochondriaderived activator of caspase (Smac) en direct IAP-binding protein with low pi (DIABLO). Het Smac/DIABLO wordt samen met cytochroom c uit het mitochondrium vrijgesteld tijdens apoptose. Het promoot caspase activatie door associatie met het apoptosoom en door inhibitie van IAPs. Het Smac/DIABLO wordt synchroon met het cytochroom c vrijgesteld. Wanneer het cytochroom c apaf-1 activeert, heft het Smac/DIABLO de inhibitie van caspase door IAP op (6) Extrinsieke pathway De extrinsieke pathway van apoptose verloopt onafhankelijk van p53 en wordt geactiveerd door binding van een pro-apoptotische ligand aan een gespecialiseerde receptor op het oppervlak van de cel. Deze liganden worden vrijgesteld door gespecialiseerde immuuncellen zoals cytotoxische T- lymfocyten, of natural killer cellen (NK-cellen) en behoren tot de TNF cytokine superfamilie (11). We onderscheiden Fas/Apo1/CD95 ligand die bindt aan de Fas/Apo1/CD95 receptor, TRAIL/Apo2L aan twee gerelateerde receptoren DR4 (TRAIL-R1) en DR5 (TRAIL-R2) en FasL aan Fas receptor. Vereenvoudigd kunnen we stellen dat binding van een pro-apoptotisch ligand aan zijn receptor zorgt voor de rekrutering van een Fass associated death domain protein (FADD) aan het intracellulair death domain (DD) van de receptor. FADD is werkzaam als een adaptor proteïne doordat het zowel een DD als een Death effector domain (DED) heeft. Via zijn DED bindt FADD met procaspasen 8 en 10 en c- flip, met formatie van een death-inducing signalling complex (DISC). DISC is een multiproteïne complex dat de conversie van procaspasen naar actieve caspasen stimuleert (10-13). Niet alle proteïnen die deel uitmaken van DISC zijn pro-apoptotisch. Cellular FLICE inhibitory protein (c-flip), dat een grote structurele homologie vertoont met caspase 8 en 10, inhibeert caspase activatie door ter hoogte van het DISC in competitie te gaan voor binding met DED van FADD. We onderscheiden twee verschillende varianten van het c-flip, namelijk het c-flip L en het c-flip S. Beide moleculen bevatten twee DED domeinen die structureel verwant zijn met het N-terminaal gedeelte van pro-caspase 8. Ze worden beiden gerecruteerd op DISC via homotypische DED domein interacties. c-flip S blokkeert daar processie en activatie van pro-caspase 8. De rol van het c-flip L daarentegen is minder duidelijk en meer controversieel. Sommige studies karakteriseren c-flip L als een anti-apoptotisch proteïne vergelijkbaar met c-flip S, terwijl andere studies aan c-flip L eerder proapoptotische functies toe bedelen (12). Na activatie in het DISC worden caspase 8 en 10 gekliefd in een autokatalytisch proces met vorming van grote en kleine subunits. Deze subunits vormen vervolgens hetero-tetrameren welke op hun beurt de effector caspase 3, 6 en 7 activeren. Cellen worden onderverdeeld in twee groepen naargelang mitochondriën nodig zijn om deze effector caspasen te activeren. In type 1 cellen is de aanwezigheid van actief caspase 8, dat als initiator caspase vrijgesteld wordt uit DISC, voldoende om de effector caspasen te activeren. Type 1 cellen zijn dus in staat om apoptose te ondergaan onafhankelijk van de 6

14 activiteit van het apoptosoom en de loslating van het Smac/DIABLO. Dit is waarschijnlijk het gevolg van lage concentraties van XIAP. In type 2 cellen daarentegen worden de effector caspasen niet rechtstreeks geactiveerd door caspase 8 (te lage concentratie van caspase 8 in combinatie met te hoge concentratie van XIAP), maar door een mitochondrium afhankelijke apoptotische amplificatie lus. Deze lus start met activatie van Bid. Dit BH3-only proteïne is cruciaal aangezien het de apoptotische signaalcascade van de extrinsieke pathway koppelt aan de intrinsieke pathway. Caspase 8 klieft Bid met vorming van de korte vorm tbid. tbid bindt vervolgens aan de mitochondriën en activeert Bak en Bax met een destabilisatie van de buitenste mitochondriale membraan tot gevolg en de loslating van cytochroom c en andere pro-apoptotische proteïnen zoals Smac/DIABLO, dat de natuurlijke antagonist van XIAP is. Daarop volgend zien we vorming van het apoptosoom en neutralisatie van XIAP (13;14). Figuur 1: Intrinsieke en extrinsieke pathway voor apoptose (11) Apoptose en Kanker We hebben reeds vastgesteld dat apoptose een zeer belangrijke rol heeft in de homeostase van normale weefsels. Daarnaast is apoptose ook betrokken in het opruimen van maligne cellen. Het is dus niet verwonderlijk dat er een sterk verband bestaat tussen het ontstaan van kanker en dysfunctie van apoptose. Celpopulaties worden strikt gereguleerd door de snelheid waarmee ze prolifereren, differentiëren en sterven. Een dysfunctie in een van deze processen kan resulteren in ongecontroleerde 7

15 celdood of in ongecontroleerde proliferatie van cellen met het ontstaan van maligniteiten tot gevolg (15). In welke mate dysfuncties in celproliferatie of sterfte moeten optreden om tumorformatie te induceren blijft evenwel nog steeds twijfelachtig. Volgens Hanahan en Weinberg (1) zijn er zes essentiele alteraties in celfysiologie nodig om maligne groei te geven. Dit staat bekend als de multiple hit theorie. Deze veranderingen worden bekomen gedurende tumorontwikkeling: Zelf-voorziening in groeisignalen Ongevoeligheid voor groei inhiberende signalen Celdood (apoptose) vermijden Ongelimiteerd replicatievermogen Angiogenese Weefselinvasie en metastasering Elk van deze veranderingen in de fysiologie van de cel betekent een doorbraak doorheen een antitumoraal defensiemechanisme in de cel. Figuur 2: verworven vermogens van kanker (1). Hier bespreken we specifiek de rol van apoptose. Het vermijden van celdood is een van de zes alteraties die plaats vinden bij de ontwikkeling van tumoren. Resistentie tegen apoptose is een kenmerk van de meeste (zo niet alle) tumoren. Vroegtijdig bewijs van het verband tussen kanker en apoptose, was het feit dat Bcl-2 dat voor het eerst gevonden en beschreven is in folliculaire B-cel lymfomen, dienst doet als anti-apoptotische proteïne. In folliculaire B-cel lymfomen vindt men een translocatie van het Bcl-2 gen t(14;18) met coexpressie van myc oncogen. Het Bcl-2 is in staat om in deze context lymfoomvorming te promoten en de sensitiviteit van deze tumoren voor behandeling te beïnvloeden (1). Bcl-2 stimuleert dus de vorming van de folliculaire B-cel lymfomen niet door proliferatie, maar door toename van de overleving van de cellen. Hieruit volgt dat inhibitie van apoptose tot kanker kan leiden. Er moet wel op gewezen worden dat Bcl-2 slechts een beperkte tumorigene capaciteit heeft (15). Dit en andere voorbeelden heeft tot de veronderstelling geleid dat genen die celdood stimuleren mogelijks dienst doen als tumorsupressor genen en omgekeerd dat anti-apoptotische genen dienst doen als oncogenen (1). Zo is er groeiend bewijs dat andere leden van de Bcl-2 anti-apoptotische familie ook werken als oncogenen en dat leden van de pro-apoptotische Bcl-2 groepen een tumorsuppressie effect hebben (14). 8

16 Mutaties in genen betrokken bij apoptose kunnen leiden tot het ontstaan van kanker. Daarnaast zien we dat tumoren zonder een oorspronkelijke mutatie in deze genen ook resistentie tegen apoptose ontwikkelen. Deze resistentie kan op verschillende wijzen verkregen worden. Aangezien we net aangetoond hebben dat er een verband bestaat tussen apoptose en kanker, moet het mogelijk zijn om specifiek in kankercellen apoptose te induceren. Verder in deze masterproef bespreken we verschillende nieuwe geneesmiddelen welke tot doel hebben om kankercellen tot apoptose te dwingen zonder dat deze geneesmiddelen toxisch zijn voor de eigen weefsels. Deze geneesmiddelen zijn gericht tegen TRAIL receptoren en zijn in staat om kankercellen tot apoptose te brengen. We richten ons op de behandeling van colorectale carcinomen Colorectaal carcinoom Colorectaal carcinoom (CRC) is de derde meest voorkomende maligniteit in de wereld met een geschatte incidentie van 1 miljoen nieuwe gevallen per jaar. Hiervan sterven naar schatting mensen. Dit maakt van CRC de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker gerelateerde mortaliteit in de wereld (16;17). Volgens Pinkhof (het Nederlandse geneeskundig woordenboek) is CRC kwaadaardige woekeringen uitgaande van het darmepitheel gewoonlijk door degeneratie van een vooraf bestaande adenomateuze of villeuze poliep. In 99 percent betreft het een adenocarcinoom dat voortgekomen is uit een adenomateuze poliep. Dergelijke CRC komen vooral voor bij mensen boven jaar, bij mannen en vrouwen gelijk. CRC ontstaat meestal in het slijmvlies van een darmpoliep in het onderste deel van het colon. Het wordt veroorzaakt door accumulatie van epigenetische alteraties. Hierdoor verandert normaal intestinaal epitheel in een adenoom en later in een carcinoom. Tot de grootste risicopatiënten voor colorectaal carcinoom behoren patiënten met inflammatoire darmaandoeningen zoals colitis ulcerosa of de ziekte van Crohn. In de meerderheid van de gevallen treedt CRC sporadisch op. Slechts in ongeveer 10 percent van de gevallen van CRC speelt erfelijkheid een rol. Er zijn verscheidene erfelijke vormen, waarvan de twee belangrijkste het hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) en het familiaal adenomateuze polypose (FAP). Darmpoliepen geven vaak geen klachten en worden dan ook dikwijls per toeval ontdekt. De meest voorkomende klachten zijn: veranderingen in het ontlastingspatroon, verstoppingen, diarree of een wisselend stoelgangspatroon en bloed of slijm bij de ontlasting. CRC zijn eveneens vaak asymptomatisch, hoewel ze soms obstructie kunnen veroorzaken. CRC kan lymfogeen en hematogeen metastaseren. De lymfedrainage gebeurt naar lymfeklieren die langs takken van de A. mesenterica liggen, naar klieren in het mesenterium of retroperitoneaal. Hematogeen metastaseren CRC vooral naar de lever via de venae portae en naar de long via de vena cava inferior. 9

17 De primaire behandeling van CRC is excisie. Dit kan endoscopisch gebeuren bij poliepen en bij oppervlakkige T1 tumoren. Wanneer er ingroei is in de submucosa, vanaf diepe T1 tumoren, dan dient een colectomie en een lymfadenectomie te gebeuren. Als hulptherapie wordt na resectie van colontumoren met aangetaste klieren chemotherapie gebruikt. Bij rectumtumoren kan chemotherapie en radiotherapie gebruikt worden. Gemetastaseerde ziekte wordt behandeld met chemotherapie. De prognose is afhankelijk van het stadium: in stadium I en II bedraagt de vijfjaarsoverleving percent, in stadium III bedraagt dit 50 percent en in stadium IV (metastasen op afstand) bedraagt dit nog slechts 5 percent. 3. Materialen en methoden In de materialen en methoden bespreken we op welke manier we onze resultaten gevonden hebben. Er werd gebruik gemaakt van de databanken Pubmed en ISI Web of Sciences. In eerste instantie werd er gezocht naar artikels in verband met apoptose. Dit gebeurde via de MeSH (medical subject headings) term Apoptosis. Deze zoekactie werd vervolgens uitgebreid met restrict to major topic headings only. Dit leverde een totaal van artikels op. De zoekterm werd uitgebreid met molecular mechanism cell death. Er werd enkel gezocht op reviews. Deze zoekactie had 453 artikels als resultaat. Hiervan werden de recentste en meest informatieve weerhouden. Deze artikels werden gebruikt om de inleiding te schrijven. Voor het schrijven van een deel van de inleiding werd gebruik gemaakt van het Nederlandstalig geneeskundig woordenboek volgens Pinkhof. Het deel over colorectaal carcinoom is ten dele hierop gebaseerd. Voor de resultaten werd specifiek gezocht naar artikels over TRAIL-induced apoptosis. Het gebruik van de MeSH term TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand in Pubmed leverde 2910 resultaten op waarvan 298 reviews. Wanneer we de zoektocht beperkten tot major topic headings only leverde dit nog 877 artikels op. De zoekterm "TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand/agonists"[Majr] leverde slechts 5 artikels op. Het zoeken naar klinische studies gebeurde via Pubmed. Voor het opzoeken van dergelijke klinische studies werd in de databank gebruik gemaakt van limits. Dit laat toe om enkel een bepaald type wetenschappelijk artikel te zoeken. Als limit werd clinical trial aangevinkt. Vervolgens werd gezocht naar studies in verband met recombinant humaan TRAIL en monoclonale antilichamen. Wanneer geen resultaten gevonden werden voor specifieke TRAIL agonisten werd gebruik gemaakt van google scholar. Dit leverde voornamelijk informatie op aangaande lopende klinische studies. Hiervan werden meestal enkel abstracts teruggevonden. Deze abstracts vormen de basis van tabel 8. Vervolgens werden ook artikels gezocht via referentielijsten van verschenen reviews of werd via ISI web of sciences gezocht naar artikels welke een bepaald artikel citeren. Er werd afgesproken om de zoektocht af te sluiten eind december

18 4. Resultaten In de resultaten wordt gezocht naar geneesmiddelen die in staat zijn om specifiek apoptose te induceren in kankercellen. De resultaten die gevonden werden in verschillende klinische studies worden besproken. Specifiek richten we ons op de behandeling van colorectale tumoren met apoptoseinducerende liganden. Achtereenvolgens worden de TRAIL receptor, de apoptose-inducerende liganden met hun sterke en zwakke punten en toekomstperspectieven in behandeling van CRC besproken TRAIL en TRAIL receptor Het induceren van apoptose is een nieuwe invalshoek in de ontwikkeling van anti-tumorale behandelingen. Dit kan door selectief de TRAIL receptor te stimuleren in tumorcellen. De TRAIL receptor bevindt zich op het oppervlakte van cellen waar hij een belangrijke rol speelt in de extrinsieke pathway van apoptose TRAIL TRAIL werd geïdentificeerd dankzij zijn sterke homologie met CD95L en met TNF (13). TRAIL is een type twee transmembranaire proteïne dat lid is van de TNF-superfamilie (14). Het gen van deze molecule is gelegen op chromosoom 3 op positie 3q26 (18) (voor de genetische structuur zie figuur 3). Het halfleven van dit eiwit varieert tussen 3.6 minuten (muizen) en 27 minuten (chimpansees) (18). Figuur 3: (A) Het gen voor TRAIL gelegen op chromosoom 3 op positie 3q26. (B) 3D structuur van het TRAIL receptor complex gebonden met homotrimeer TRAIL (18). Zoals andere cytokines wordt het gesynthetiseerd in een pro-vorm met een signaal sequentie die verwijderd wordt in de mature proteïne. TRAIL bestaat uit vier delen, een extracellulair TNF-like domein, een extracellulaire steel, een transmembranaire helix en een klein cytoplasmatisch domein (18;19). TRAIL is het enige eiwit van de TNF superfamilie dat een cysteïne residu, Cys230, bevat. Dit 11

19 cysteïne residu laat trimerisatie toe. Aanwezigheid van een zink ion is hierbij essentieel. TRAIL komt meestal verankerd in de celmembraan voor (20), maar het kan ook onder solubele vorm door de cel gesecreteerd worden na klieving van de extracellulaire steel (18) TRAIL receptor TRAIL kan een homotrimere proteïne vormen welke kan binden met vijf verschillende receptoren. We onderscheiden twee agonistische receptoren, death receptor 4 (DR4) en death receptor 5 (DR5) en drie antagonistische receptoren decoy receptor 1 en 2 (DcR1 en DcR2) en osteoprotegerin (OPG). Binding op de death domain bevattende receptoren DR4 en DR5 induceert apoptose. Een death domain bevat 6 antiparallelle alfa helices en is een structureel geconserveerd proteïne interactie domein (20). Een death domain kan andere death domainen binden via homotypische interacties (13). Deze receptoren komen geclusterd voor op het oppervlakte van de cel. In de celmembraan bevinden zich lipid rafts. Dit zijn microdomeinen in de plasmamembraan verrijkt met cholesterol en sphingolipide. Deze zogenaamde lipid rafts spelen een belangrijke rol in dood receptor gemedieerde celdood. Het sphingomyeline dat aanwezig is in de buitenste schil van de plasmamembraan wordt door acid sphingomyelase gehydroliseerd met vrijstelling van ceramide en vorming van ceramide membraanplatformen. Op deze platformen vormen dood receptoren clusters (21). De antagonistische receptoren daarentegen bevatten geen death domain en fungeren als decoy receptoren. DcR1 en DcR2 lijken op DR4 en DR5 met een sterk homoloog extracellulair ligand binding domein, dat volledig functioneel is. DcR1 noch DcR2 heeft een functioneel intracellulair death domain zodat er geen activatie van de apoptotische signaalcascade kan optreden. DcR1 bevat een glycosylphosphatidylinositol anker in plaats van een death domain en DcR2 bevat een inactief gecomprimeerd death domain. Overexpressie van een van beide receptoren beschermt de cel tegen TRAIL-induced apoptose (22). De rol van deze decoy proteïnen in TRAIL resistentie blijft evenwel een discussie punt en wordt door verschillende auteurs in twijfel getrokken. OPG is een oplosbare proteïne en kan eveneens als decoy proteïne fungeren door sequestratie van de ligand buiten de cel (20) Functie van TRAIL Men vermoedt dat de fysiologische functie van TRAIL de controle van het immuunsysteem en meer specifiek van autoreactieve immuuncellen is. TRAIL is specifiek gericht tegen tumorontwikkeling en tegen de vorming van metastasen (13;22). De fysiologische rol van TRAIL is verre van duidelijk. De meeste normale cellen zijn resistent tegen deze ligand. Bovendien hebben recente publicaties aangetoond dat TRAIL in resistente tumorcellen overleving, proliferatie, migratie en invasie kan promoten (23;24). 12

20 OPG speelt een rol in regulatie van de botformatie en fungeert normaal als een decoy proteïne voor Receptor Activator of Nuclear factor KappaB Ligand (RANKL). Via de Receptor Activator of Nuclear factor KappaB (RANK) activeert RANKL specifiek NF- κ B, resulterend in een osteoclast gemedieerde bot resorptie (13). Er wordt aangenomen dat TRAIL in competitie gaat met RANKL voor binding op de OPG receptor en op deze manier de binding van RANKL op RANK bevordert. Men weet niet of deze functie fysiologisch belangrijk is aangezien TRAIL knock-out muizen een normaal fenotype hebben en een normale bot densiteit ontwikkelen (13). De belangrijkste en best gekende functie van TRAIL is inductie van apoptose via de extrinsieke pathway. TRAIL vormt trimeren en deze binden aan DR4 en DR5. Deze binding leidt tot receptor homo- of heterotrimeer vorming en recrutering van FADD. FADD bindt aan de intracellulaire death domainen van DR4 en DR5 en bezit naast een DD ook een DED. Zowel caspase 8, 10 als cflip kunnen aan dit DED domein binden met vorming van een multiproteïne complex, namelijk DISC. CFLIP is een anti-apoptotische molecule welke in competitie treedt met caspase 8 en 10 voor binding op het DED van FADD. Caspase 8 en 10 worden gekliefd in een autokatalytisch proces met vorming van grote en kleine subunits. Deze subunits vormen actieve tetrameren die verder de effector caspasen 3, 6 en 7 activeren. Deze effector caspasen veroorzaken de biomedische veranderingen van apoptose (7;9;13). De TRAIL pathway is betrokken bij de regulatie van het immuunsysteem. Monocyten, gestimuleerd door lipopolysaccharide (LPS) of interferon type І of ІІ, vertonen verhoogde concentraties van TRAIL zowel in oplosbare als in membraangebonden vorm. Dit correleert met een verhoogde cytotoxiciteit ten opzichte van kankercellen. Op dezelfde wijze leiden LPS en interferon type І tot een verhoogde expressie van TRAIL op T cellen, dendritische cellen en NK-cellen en dus tot verhoogde cytotoxiciteit tegen kankercellen. Hieruit kan besloten worden dat de TRAIL receptor pathway een rol speelt zowel in het aangeboren als verworven immuunsysteem. TRAIL wordt meer en meer aanzien als een immuun surveillance mechanisme tegen tumoren. Dit werd eerst vastgesteld door Walczak en Ashkenazi (25;26). De rol van de TRAIL pathway in tumorigenesis en in immuun surveillance tegen kanker moet evenwel verder onderzocht worden. Deze rol kan afhankelijk zijn van het type, de concentratie van TRAIL en het stadium van tumor ontwikkeling (21) Relatie met kanker Ondanks significante vooruitgang in de behandeling van kanker blijft de prognose voor vele tumoren slecht. Inherente en verkregen resistentie tegen chemotherapeutica is grotendeels verantwoordelijk voor deze slechte prognose. We hebben hoger reeds gezien dat bij het ontstaan van kanker 6 alteraties plaatsvinden in de maligne cellen (1). Een van deze alteraties is het vermijden van apoptose. Inhibitie 13

21 van apoptose speelt dus een essentiële rol in het ontstaan van kanker. Hieruit volgt dat inductie van apoptose een belangrijke invalshoek vormt in de ontwikkeling van nieuwe kankertherapieën. Er is reeds veel onderzoek gedaan naar stimulatie van dood receptoren. Hieruit is gebleken dat TRAIL één van de meest veelbelovende doelwitten is mede omdat TRAIL receptor stimulatie specifiek apoptose veroorzaakt in kankercellen zonder dat dit toxisch is voor de eigen cellen. Dit zou een grote vooruitgang zijn in de behandeling van kanker. Men heeft evenwel ontdekt dat in tumoren verschillende resistentiemechanismen bestaan tegen TRAIL induced apoptose. Stimulatie van deze resistente tumorcellen kan aanleiding geven tot overleving, proliferatie, migratie en invasie (23;24). Kennis van deze resistentiemechanismen en weten hoe ze te sensitiseren is zeer belangrijk. Prognostische factoren die voorspellen of er resistentie optreedt kunnen nuttig zijn om de behandelingsstrategieën aan te passen Resistentiemechanismen en strategieën om ze te vermijden Resistentie Een belangrijk probleem dat zich stelt is resistentie tegen de Tumor necrosis factor related apoptosisinducing ligand. Tot de helft van alle tumorcellijnen is mogelijk TRAIL resistent. Resistentie tegen TRAIL varieert in primaire tumorcellen. Primair coloncarcinoom is gewoonlijk gevoelig voor TRAIL, maar primaire astrocytoma cellen en B-CLL zijn meestal resistent. In andere gevallen kan er een meer variabel resistentie patroon zijn, zoals bij het ovariumcarcinoom. Resistentie kan inherent zijn aan een bepaalde tumorcellijn, maar kan ook ontstaan in primair sensitieve tumorcellen na expositie aan dosissen die te laag zijn om apoptose te induceren. Grotendeels kunnen resistentiemechanismen ingedeeld worden in twee grote groepen (20;27). Eerst beschouwen we de resistentie die het gevolg is van defecten in de death receptor pathway, daarna bekijken we resistentie door inwerking van anti-apoptotische proteïnen Resistentie ter hoogte van TRAIL receptor DR4/DR5 ratio Oorspronkelijk werd de regulatie van TRAIL-induced apoptose toegeschreven aan het evenwicht tussen TRAIL receptoren. DR4 en DR5 zijn een noodzakelijke voorwaarde voor TRAIL induced apoptose. Naast het evenwicht tussen DR4 en DR5 en decoy proteïnen, speelt ook de ratio tussen DR4 en DR5 een essentiële rol in celsensitiviteit. In sommige cellijnen ziet men dat de ene receptor voor TRAIL efficiënter is dan de andere. Dit is afhankelijk van enerzijds de omstandigheden, het celtype en het type van TRAIL ligand. Zo zien we dat onder fysiologische omstandigheden TRAIL een hogere affiniteit heeft voor DR5. In keratinocyten, die zowel DR4 als DR5 tot expressie brengen, werkt 14

22 TRAIL voornamelijk via DR4 receptor. De TRAIL molecule kan onder twee vormen voorkomen, namelijk cross-linked (gebonden aan het celmembraan) en niet cross-linked (oplosbaar). Beide vormen kunnen hun effect uitoefenen via de DR4 receptor, maar enkel de oplosbare vorm kan binden aan DR5. De gevoeligheid van een cel voor TRAIL kan bepaald worden door DR4/DR5 ratio (28) Resistentie door verminderde expressie van dood receptoren Interactie tussen TRAIL en zijn receptoren DR4 en DR5 resulteert in transductie van apoptotische signalen via de vorming het DISC complex. Veranderingen in expressie van deze receptoren en van proteïnen die deel uit maken van het DISC complex kunnen leiden tot resistentie tegen TRAILinduced apoptose. Een gebrek aan DR4 ter hoogte van het oppervlakte van kankercellen door een epigenetische wijziging is beschreven als een mechanisme voor resistentie tegen TRAIL in ovariumcarcinoom (29). In CRC werd een deficiënt transport van DR4 naar het celmembraan beschreven als mogelijk mechanisme voor resistentie (17;30). Andere mechanismen voor verminderde expressie van DR4 en DR5 receptoren aan het oppervlakte van de cel zijn: intracellulaire retentie van receptoren (31) en receptor endocytose (21) Resistentie door decoy receptoren De rol van de decoy receptoren in TRAIL resistentie is een onderwerp van debat. Vroeger werd gepostuleerd dat expressie van DcR1 en DcR2 leidt tot TRAIL resistentie omdat zij fungeren als decoy proteïnen die in competitie gaan met DR4 en DR5 voor TRAIL binding en door de vorming van een dysfunctioneel receptorcomplex met DR4/DR5 (32;33). Verschillende recente studies spreken dit evenwel tegen (13). De rol van deze decoy receptoren in TRAIL resistentie blijft een onderwerp voor verder debat Resistentie door dysfunctionele receptor Mutaties in dood receptoren Genetische mutaties in DR4 en DR5 kunnen aanleiding geven tot een verlies van TRAIL-induced apoptose. Bij de meeste carcinomen evenwel zijn deze mutaties zeldzaam. Verlies van chromosoom 8p21-22 (locatie van TRAIL receptor genen) wordt frequent gezien in verschillende kankercellen, o.a. in CRC (28). Polymorfismen van de DR4 receptor werden beschreven in verschillende kankercellijnen. Kankercellen welke dergelijke polymorfe DR4 receptoren tot expressie brengen zijn minder effectief in apoptose en zijn meer resistent tegen TRAIL-induced apoptose (14). Twee missense nucleotide substituties in DR4 werden aangetoond in longkanker, hoofd- en halstumoren en maagadenocarcinomen. Deze veranderingen treden op in of in de nabijheid van het ligand bindend domein. Dit geeft mogelijk aanleiding tot abnormale trimerisatie of verstoorde binding van de ligand (14). 15

23 In een andere studie werden verschillende single nucleotide substituties ontdekt in het death domain van de DR4 receptor. Dit resulteert in een toegenomen resistentie tegen TRAILinduced apoptose. Vergelijkbare mutaties kunnen ook aangetoond worden in de DR5 receptor. Inactiviteit van DR5 genen door deze mutaties speelt slechts een kleine rol in TRAIL resistentie in colorectale carcinomen (28) Post translationele modificatie van dood receptoren Post translationele modificatie van de dood receptoren speelt mogelijk ook een rol in TRAIL resistentie. DR4 en DR5 worden na translatie geglycoliseerd door peptydil O-glycosyltransferase GALNT14. GALNT14 staat voor UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N- acetylgalactosaminyltransferase (34). O-glycosylatie van TRAIL receptoren promoot ligandgestimuleerde clustering van de receptoren. Dit leidt tot een meer efficiënte recrutering en activatie van caspase-8. Verlies van dit enzym correleert met een verminderde sensitiviteit voor TRAIL. Overexpressie van GALNT14 verhoogt de gevoeligheid voor TRAIL. MRNA expressie van het peptydil O-glycosyltransferase GALNT14 correleert met TRAIL sensitiviteit in bepaalde kankercellen, zoals in kleincellig longcarcinoom, melanomen en pancreascarcinoom (20;21;34;35). Peptydil O-glycosyltransferase GALNT14 expressie in kankercellen wordt aanzien als een betere predictor van TRAIL gevoeligheid dan andere regulatoren van deze pathway, zoals c-flip, XIAP en Bcl-2. Screening voor GALNT14 wordt voorgesteld om patiënten te selecteren die een hogere kans hebben om gevoelig te zijn voor TRAIL (20) Resistentie door anti-apoptotische proteïnen In tumorcellen kan resistentie het gevolg zijn van anti-apoptotische mechanismen zoals een verminderde expressie van caspase-enzymen of een verhoogde expressie van IAP moleculen. Recent werden c-flips en Bcl-2 proteïnen geïdentificeerd als zijnde moleculen met een belangrijke rol in TRAIL resistentie (20). De vorming van het DISC is een vroeg moleculair event in de signaalcascade van TRAIL induced apoptose. Veel van bovenstaande moleculen spelen een essentiële rol in de formatie van het DISC en dysfunctie in 1 van deze factoren leidt tot TRAIL resistentie (14). Zoals hoger vermeld bestaat de Bcl-2 familie zowel uit anti-apoptotische als uit pro-apoptotische eiwitten (3). De ratio tussen de anti en pro-apoptotische leden van de Bcl-2 familie bepaalt in belangrijke mate het succes van dood signaal propagatie (21). Bcl-X L is een anti-apoptotische molecule en expressie van exogeen Bcl-X L kan resistentie veroorzaken in oorspronkelijk sensitieve tumorcellijnen. Hiermee corresponderend is gevonden dat ook afwezigheid van een pro-apoptotische Bcl-2 proteïne kan bijdragen tot TRAIL resistentie (27). Bax en Bak zijn twee pro-apoptotische proteïnen uit de Bcl-2 familie. Inactiverende mutaties van genen coderend voor Bax en Bak kunnen 16

24 kankercellen resistent maken voor TRAIL. Het belang van Bak en Bax in TRAIL-induced apoptose is afhankelijk van het celtype (14). Downregulatie van de initiatorcaspasen 8 en 10 resulteert in resistentie tegen apoptotische signalen. Caspase 8 is een sleutelmolecule bij verschillende vormen van apoptose, onder andere TRAILinduced apoptose. Versnelde degradatie en verlies van caspase-8 expressie door epigenetische silencing kan leiden tot TRAIL resistentie. Caspase-8 deficiënte tumorcellen zijn volledig resistent voor TRAIL. De specifieke inhibitor voor caspase 8 (Z-IETD-FMK) kan TRAIL-induced apoptose inhiberen in TRAIL sensitieve cellen (14;36;37). Deletie van chromosoom 2q33, waar het gen coderend voor caspase 8 en 10 gelegen is, kan voor verschillende tumoren aangetoond worden (38-40). c-flip speelt een rol in de extrinsieke pathway en is structureel verwant aan caspase 8 en 10. Zoals reeds hoger besproken bestaan er twee varianten van c-flip, namelijk c-flip L en c-flip S. Vroeger werd gedacht dat c-flip zowel pro als anti-apoptotische effecten heeft. De pro-apoptotische effecten evenwel worden enkel waargenomen in transiënte systemen, waar een excessieve expressie resulteert in niet-specifieke celdood (14). In stabiele systemen daarentegen wordt enkel een anti-apoptotische werking waargenomen. Veranderingen in de c-flip/ caspase 8 ratio correleren met TRAIL resistentie in verschillende tumoren. Zo heeft een toename van c-flip concentraties een inhibitorisch effect op de activatie van initiator caspase-8 ter hoogte van het DISC complex (17;41;42). De rol van FADD in TRAIL-induced apoptose is controversieel. Sommige studies tonen aan dat TRAIL-induced apoptose afhankelijk is van FADD, terwijl andere studies het tegenovergestelde aantonen (14;43;44). IAPs zijn inhibitoren van caspasen. Ze worden gekenmerkt door één tot drie Baculoviraal IAP repeat domeinen (BIR domeinen). De IAP familie bestaat uit verschillende leden, o.a. XIAP en survivin. Meerdere studies tonen aan dat in verschillende tumortypes de IAPs opgereguleerd worden. Verhoogde expressie van XIAP en survivin verhindert de activatie en activiteit van de caspasen 3, 7 en 9 (45). Dit resistentiemechanisme wordt gezien in CRC tumorcellijnen. Inhibitie of down-regulatie van IAP herstelt de sensitiviteit van cellen ten opzichte van TRAIL-induced apoptose (21). Een mutatie in de promotor regio van survivin kan aangetoond worden in verscheidene kankercellen. Deze mutaties leiden tot overexpressie van survivin en is aanwezig in 64 percent van de onderzochte CRC tumorcellijnen. De vijfjaarsoverleving in survivin positieve tumoren is lager dan in survivin negatieve tumoren (17;22). Het is zeer waarschijnlijk dat hoge concentratie van survivin bijdragen aan TRAIL resistentie, maar dit moet nog verder onderzocht worden. NF-κB is een transcriptie factor die een rol speelt in immuun regulatie, inflammatoire respons, cel groei en apoptose. Deze factor bestaat uit 5 subunits, welke homo- en heterodimeren vormen. NF-κB 17

25 controleert transcriptie via binding aan promotor regio van doelgenen. Het effect ervan op TRAILinduced apoptose is controversieel. Sommige studies tonen aan dat NF-κB bijdraagt aan resistentie tegen TRAIL-induced apoptose door opregulatie van anti-apoptotische proteïnen zoals XIAP, cflip, Bcl-2 en DcR1 (32;46;47). Andere studies daarentegen tonen net het tegenovergestelde namelijk dat NF-κB apoptose induceert door opregulatie van pro-apoptotische proteïnen (14). Deze discrepantie kan gerelateerd zijn aan de verschillende subunits van NF-κB. Over de rol van het mitogen-activated protein (MAP) kinase met betrekking tot TRAIL induced apoptose bestaat er nog steeds controverse (48;49) Tweevoudig resistentie tegen TRAIL-induced apoptose Recente studies hebben de ontwikkeling van tweevoudige resistentiemechanismen tegen TRAILinduced apoptose aangetoond. Op basis van één paar isogenetische coloncarcinoom cellen, waarvan de ene TRAIL sensitief en de andere metastatisch en resistent was, werd aangetoond dat resistentie op twee niveaus plaatsvindt. Het eerste niveau omvat resistentie ter hoogte van de mitochondria door het verminderen van permeabiliteit van de buitenste membraam. Het tweede niveau omvat resistentie door verhoogde expressie van XIAP. Belangrijk bij deze metastatische cellen is dat ze geresensitiseerd kunnen worden door knock-down van XIAP gen (50). 18

26 Tabel 2: Overzicht van de verschillende resistentiemechanismen (21). Niveau resistentie in de cel Resistentie ter hoogte van Receptor complex Eiwitten Resistentiemechanismen referenties DR4 en DR5 Verminderde concentratie celreceptoren voor signaal transductie door (29-31;51) Downregulatie van receptor proteïne concentratie door silencing van receptor gen Deficiënt transport van receptor naar celoppervlakte Intracellulaire retentie van receptoren Receptor endocytose Dysfunctionele receptor door Mutaties in het receptor gen Post-translationele modificaties (35;52-54) Resistentie ter hoogte van DISC complex Resistentie ter hoogte van de Mitochondria Resistentie ter hoogte van andere signaal pathways DcR1 en DcR2 (decoy Resistentie door (32;33) receptoren) Competitie met DR4 en DR5 voor TRAIL Vorming dysfunctionele receptor met DR4/5 c-flip Toename van c-flip concentratie inhibeert activatie van initiator caspase-8 (29;41;55) Initiator Caspase-8 Verminderde concentraties van caspase-8 door (40;56;57) Epigenetische silencing Versnelde degradatie Anti-apoptotische Bcl- Stijging van deze proteinen blokkeren vrijstelling pro-apoptotische factoren uit (42;58;59) 2 de mitochondria Pro-apoptotische Bcl-2 Deficiëntie van Bax blokkeert vrijstelling pro-apoptotische factoren uit de (60) mitochondria SMAC/DIABLO Deficiënte vrijstelling uit mitochondria: verlies inhibitie IAP (45) IAP Toename XIAP/ survivin inhibeert activiteit van caspase 3/7/9 (45) NF-κB Trail resistentie door opregulatie van anti-apoptotische proteinen o.a. XIAP,c- (32) FLIP, Bcl-2, DcR1 MAPK Controverse met betrekking tot de rol van MAPK in TRAIL-induced apoptose (49) PI3K-PKB/Akt Anti-apoptotische signaal pathway (42) 19

27 Resensitisatie Zoals hierboven besproken bestaan er verschillende manieren waardoor tumorcellen resistent kunnen worden tegen TRAIL induced apoptose. We onderscheiden inherente en verworven resistentie, die kan variëren van beperkte tot uitgesproken resistentie. Begrip van deze mechanismen heeft geleid tot nieuwe therapeutische strategieën, o.a. om cellen te resensitiseren. In dit kader is het belangrijk om onderscheid te maken tussen synergie en sensitisatie. We spreken van synergie tussen twee farmaca indien beide farmaca een effect hebben wanneer ze individueel worden gebruikt, maar het gecombineerde effect van beide farmaca groter is dan de som van de individuele effecten. Synergie tussen TRAIL en een ander product treedt op wanneer de drug een verhoogde expressie van TRAIL receptoren veroorzaakt. Sensitisatie betekent dat een product alleen geen effect heeft, maar het actief wordt in combinatie met een ander product. Klinisch onderzoek heeft aangetoond dat in verschillende TRAIL-resistente tumorcellen monotherapie met slechts 1 farmaca, TRAIL of slechts één sensitiserende drug, minimale effecten heeft op celoverleving. Wanneer deze producten in combinatie evenwel gebruikt worden hebben ze een synergistisch effect (61). Een grote verscheidenheid aan farmaca kunnen TRAIL resistente tumoren sensitiseren. We onderscheiden modulatie door chemotherapeutica en cytokines (DNA damaging agents), modulatie door NSAID s, modulatie door plantaardige producten en modulatie door proteasoom inhibitoren (28). In sommige gevallen is het mogelijk om tumorcellen te sensitiseren door TRAIL-receptor targeted drugs op verschillende manieren te gebruiken zonder andere drugs te associëren (20). Het mechanisme waarop modulatie door chemotherapeutica plaatsvindt, is complex. TRAIL stimuleert de extrinsieke pathway onafhankelijk van p53 met directe activatie van de caspase cascade. Zo ontstaat apoptose onafhankelijk van een mitochondriaal blok van de intrinsieke pathway door Bcl-2. Chemotherapeutica en straling daarentegen induceren celdood via p53, zijnde de intrinsieke pathway. Het synergistische effect tussen TRAIL en chemotherapeutica berust niet enkel op activatie van beide pathways maar ook op veranderingen in de transcriptie van proteïnen betrokken bij TRAIL-receptor signalling (13). Kennis van de resistentiemechanismen tegen TRAIL-induced apoptose is zeer belangrijk. Afhankelijk van deze mechanismen zullen bepaalde resensitisatiemechanismen effect hebben of niet. Zo zal een resensitising drug die werkt via toename van DR4 of DR5 receptoren geen effect hebben wanneer het resistentiemechanisme bestaat uit een mutatie van deze receptoren. Integendeel, gebruik van deze drugs zal een stimulerend effect hebben op tumorgroei door toename van dominant negatieve effect van de mutante receptor. Wanneer de resistentie veroorzaakt wordt door verminderde expressie van deze receptoren, zullen deze resensitising drugs wel effect hebben (zie tabel 3 en 4). 20

28 Tabel 3: Effect van resistentie mechanisme op gevoeligheid voor verschillende therapeutische agentia. Naar Thorburn et al (20). Resistentie mechanisme Verwachte respons op APO2L/TRAIL Verwachte respons op Lexatumumab (anti-dr5) DR5 mutatie Geen apoptose Geen apoptose Apoptose Verwachte respons op Mapatumumab (anti-dr4) Caspase-8 inhibitie Geen apoptose Geen apoptose Geen apoptose Toename XIAP Geen apoptose Geen apoptose Geen apoptose Toename Decoyreceptor 2 Geen apoptose Apoptose Apoptose Tabel 4: Effect van resistentie mechanisme op behandeling met TRAIL in combinatie met een ander agens. Naar Thorburn et al (20). Resistentie mechanisme Effect op TRAIL sensitiviteit DNA beschadigende agentia die DR5 expressie verhogen Downregulatie van FLIP en ciap2 veroorzaakt door sorafenib DR5 mutatie Toegenomen resistentie Geen verschil Caspase-8 inhibitie Geen verschil Geen verschil Toename XIAP Toegenomen sensitiviteit Toegenomen sensitiviteit Toename Decoyreceptor 2 Toegenomen sensitiviteit geen verschil Verder bespreken we de moleculaire mechanismen van deze resensitisatie. Resensitising drugs kunnen hun effect uitoefenen via verschillende pathways (zie tabel 5 en figuur 4) Modulatie van de extrinsieke pathway Opregulatie van oppervlakte doodreceptoren (DR) Sommige resensitising drugs zijn in staat om TRAIL receptor negatieve cellen te sensitiseren door inductie van de receptoren DR4 en DR5 op het celoppervlakte. Opregulatie van DR4 en DR5 is mogelijk door diverse farmaca (zie tabel 5). Verschillende mechanismen zijn hierbij beschreven, afhankelijk van het type geneesmiddel en tumor (21). Frequent oefenen deze farmaca hun effect uit via toename van de transcriptie. De stijging in mrna concentraties van DR4 en DR5 wordt toegeschreven aan verschillende transcriptiefactoren zoals p53, NF-kB (21). Coloncarcinomen met mismatch repair (MMR) deficiëntie ontwijken TRAIL-induced apoptose door mutationele inactiviteit van Bax. Chemotherapie met irinotecan kan TRAIL sensitiviteit herstellen door p53-onafhankelijke opregulatie van DR5 (62). Leblanc et al toonden in een andere studie aan dat Bax negatieve MMR deficiënte coloncarcinomen terug sensitief voor TRAIL kunnen worden door therapie met ectoposide of camptothecin. Beide farmaca verhogen DR5 expressie aan het oppervlakte van de cel. Dit faciliteert activatie van DISC complex (63). Prebehandeling met LY (een derivaat van quercetin, een flavonide) resulteert in MAP kinase afhankelijke opregulatie van DR4 en DR5 ter hoogte van het celoppervlak. Een hogere 21

29 concentratie van DR4 en DR5 moleculen, die binden met TRAIL ligand, resulteert in een stijging van caspase-8 activatie en dus in een stijging van apoptose via de extrinsieke pathway. Dit is aangetoond in SHEP-1 neuroblastoma cellen (64). Histone deacetylase inhibitoren (HDAC inhibitoren) zoals trichostatin A sensitiseren een verscheidenheid aan tumoren door toename van de promotor activiteit, stijging van mrna concentraties en verhoogde expressie van DR5 aan het oppervlak (65). HDAC inhibitoren verhogen de expressie van pro-apoptotische moleculen, o.a. caspase-8, Bax en Bak. Daarnaast veroorzaken ze downregulatie van anti-apoptotische moleculen, o.a. cflip, Bcl-2, XIAP, survivin (13). Andere farmaca oefenen hun effect uit via reactive oxygen species (ROS) gemedieerde selectieve opregulatie van DR5. Prebehandeling met anti-oxidantia en overexpressie van catalase verhinderen de stijging van DR4 en DR5 concentraties. Hoewel de farmaca die ROS produceren de concentratie van anti-apoptotische Bcl-2 proteïnen niet doen dalen, is de opregulatie van DR5 door deze farmaca wel voldoende om het anti-apoptotisch effect van Bcl-2 en Bcl-X tegen te gaan (66;67). Veel farmaca die de gevoeligheid van cellen voor TRAIL moduleren, zijn efficiënte producenten van ROS, voornamelijk van waterstofperoxide. Dit steunt de hypothese dat ROS geproduceerd door deze farmaca een essentiële signaal molecule is die een belangrijke rol speelt in TRAIL sensitisatie (64). Proteasomen zijn belangrijk voor de regulatie van vele cellulaire processen zoals de celcyclus, celgroei en apoptose. Ze zorgen voor degradatie of stabilisatie van intracellulaire proteïnen. In tumoren zijn deze cellulaire processen verstoord (28). Het gebruik van protasoom inhibitoren die de activiteit van proteasomen blokkeren is een veelbelovende aanpak voor de behandeling van kanker. Proteasoom inhibitoren zoals bortezomib worden reeds gebruikt in de behandeling van multiple myeloom. Proteasoom inhibitoren werken door inductie en stimulatie van TRAIL-induced apoptose in diverse tumoren waaronder CRC (28). Opregulatie van de DR5 receptor door bortezomib betreft een stabilisatie van DR5 mrna met een toename van receptor halfleven. Andere auteurs schrijven sensitisatie door bortezomib toe aan een afname van caspase-8 degradatie (21) Oligomerisatie van DRs Zoals hoger besproken bevinden zich in de plasmamembraan van de cel zogenoemde lipid rafts. Op deze platformen vormen dood receptoren clusters (21). Het mechanisme van receptor clustering wordt niet enkel vastgesteld bij TRAIL receptoren, maar ook bij andere receptoren o.a. B-cel receptor, plateled-derived growth factor receptor en leden van de TNF receptor familie. Deze clustering resulteert in een hoge densiteit van receptoren, een versterkte transactivatie van signaal moleculen geassocieerd aan deze receptoren en lokaal toegenomen assemblage van signaal elementen van geactiveerde receptoren. Dit leidt tot een verbeterde transductie van extracellulaire signalen naar de cel. Er wordt gepostuleerd dat deze aggregatie van dood receptoren op de plasmamembraan de sensitiviteit 22

30 van tumoren ten opzichte van TRAIL-induced apoptose verhoogt (21). Quercetin sensitiseert CRC tumorcellijnen voor TRAIL-induced apoptose via redistributie van dood receptoren in lipid rafts zonder effect op de expressie van de receptoren (68) Downregulatie van c-flip C-FLIP is een van de belangrijkste negatieve regulatoren van de extrinsieke pathway voor apoptose. Zoals eerder besproken heeft een toename van c-flip concentraties een inhiberend effect op de activatie van initiator caspase-8 ter hoogte van het DISC complex. Toename van de c-flip/caspase-8 ratio is een mogelijk resisentiemechanisme tegen TRAIL-induced apoptose. Downregulatie van c-flip door resensitising drugs kan het gevolg zijn van verschillende mechanismen, afhankelijk van het type farmaca. Zo zal behandeling met withaferin A een transcriptionele afname van beide isovormen van c-flip op een ROS gemediëerde, NF-kB afhankelijke manier veroorzaken (69). Quercetin daarentegen heeft geen effect op de transcriptie van c-flip. Quercetin beinvloedt de concentratie van c-flip enkel op het post-transcriptionele niveau via proteasomale degradatie (70). Sorafenib verhoogt de gevoeligheid van cellen voor TRAIL-induced apoptose door downregulatie van FLIP, Mcl-1 en IAP2 (20). Proteasoom inhibitoren kunnen ook een downregulatie van c-flip veroorzaken net als cycloheximide (71). Mogelijke downregulatie van c- FLIP expressie met antisense RNA of sirna is zeker de moeite waard om te onderzoeken. Dit geldt vooral voor tumoren waarbij overexpressie van c-flip centraal staat in TRAIL resistentie (14) Modulatie van de intrinsieke pathway Downregulatie van anti-apoptotische Bcl-2 proteïnen Zoals eerder besproken bestaat er een duidelijk verband tussen toename van anti-apoptotische Bcl-2 concentraties en TRAIL resistentie. Overexpressie van anti-apoptotisch Bcl-2 kan sensitieve cellen resistent maken. Proteasomale degradatie van pro-apoptotische leden van de Bcl-2 familie verhoogt resistentie tegen apoptose. Proteasoom inhibitoren beletten deze degradatie en stabiliseren proapoptotische Bcl-2 proteïnen zoals Bax, Bak en Bok. Bortezomib kan TRAIL resistentie zowel in Bax gevoelige als in Bax deficiënte coloncarcinomen overwinnen (28). Isoflavonoiden, Daidzein, sensitiseren glioma cellen voor TRAIL-induced apoptose via downregulatie van anti-apoptotische Bcl- 2 proteïnen. Isoflavonoiden hebben geen effect op de expressie van andere anti-apoptotische proteïnen en dood receptoren. Daarnaast bestaan er specifieke Bcl-2 inhibitoren die TRAIL-induced apoptose stimuleren (21) Downregulatie van IAP s Toename van IAP wordt vastgesteld in een variëteit van tumoren en representeert een belangrijk doelwit voor kankertherapie. Knockdown van XIAP in colon carcinoma cellen verhoogt de sensitiviteit van deze cellen voor apoptotische triggers zoals TRAIL (21). Behandeling met XIAP 23

31 inhibitoren induceert apoptose en verhindert proliferatie van tumorcellen. Smac mimetica inhiberen IAP s en beëindigen de inhibitie van caspase activiteit en kunnen op deze manier TRAIL resistentie overkomen (21) Gecombineerde modulatie van de intrinsieke en extrinsieke pathway Een studie van Lippa et al. vergeleek twee coloncarcinoom cellijnen. De eerste cellijn, Colo205 cellen genoemd, is zeer sensitief voor TRAIL-induced Apoptose. Behandeling met TRAIL resulteert in een dosisafhankelijk verlies van levensvatbaarheid van de cel en een toegenomen activiteit van caspase-3 (71). De tweede cellijn daarentegen, Colo320, is resistent voor TRAIL-induced apoptose. Het doel van deze studie was het beter begrijpen van factoren die bijdragen aan resistentie. Deze studie toonde dat resistente Colo320 cellen net als de sensitieve Colo205 cellen dood receptoren tot expressie brengen aan het oppervlakte van de cel en dat deze cellen in staat zijn tot het vormen van een functioneel DISC complex. TRAIL bindt in gelijke mate op dood receptoren van beide cellijnen. Evenwel treedt er in de Colo320 cellijn geen volledige activatie van caspase-3 op ter hoogte van het DISC complex. Onvolledige activatie van caspase-3 resulteert in het onderbreken van de apoptose pathway in Colo320 cellen. In deze studie werd aangetoond dat Bcl-2 minder tot expressie gebracht werd in Colo205 cellen dan in Colo320 cellen. Bcl-2 draagt mogelijk bij tot resistentie tegen TRAIL-induced apoptose. Er werden geen verschillen gedetecteerd in de concentraties van IAP en FLIP. Hoewel beide cellijnen een volledig DISC complex vormen na stimulatie met TRAIL, zijn de concentraties van FADD, caspase-8 en caspase-10 in de Colo320 cellijn verminderd. Dus de ratio FLIP/caspase-8 in het DISC complex is hoger in Colo320 cellen. Dit kan mogelijk de graad van caspase-8 activiteit mee beïnvloeden (71). Colo320 cellijnen kunnen gesensitiseerd worden door verschillende farmacologische agentia, voornamelijk door proteïne synthese inhibitoren (cycloheximide) en proteasoom inhibitoren (MG132). Combinatie van TRAIL en cycloheximide of MG132 verhoogt de activiteit van caspase-3 en vermindert de overleving van de cel. Deze agentia verlagen de concentraties van anti-apoptotische proteïnen die bijdragen tot resistentie. Om te bepalen welke factoren beïnvloed worden, werden sirnas tegen anti-apoptotische factoren gemaakt. Hieruit bleek dat downregulatie van FLIP en XIAP, maar niet van Bcl-2, de sensitiviteit van Colo320 voor TRAIL-induced apoptose herstelt (71). Ondanks sensitisatie met cycloheximide of MG132 bleken Colo320 cellijnen toch minder sensitief voor TRAIL- induced apoptose dan de Colo205 cellen die niet gesensitiseerd werden. Non-steroïdale anti-inflammatoire drugs (NSAID s) hebben chemopreventieve activiteit tegen colorectale carcinomen en ze kunnen apoptose induceren in tumorcellen. Sulindac (een NSAID) induceert degradatie van beta-catenin. Dit resulteert in verminderde transcriptionele activiteit van Tcf- 4, wat op zijn beurt leidt tot een daling van survivin expressie en een toename van apoptose. NSAID s 24

32 en in het bijzonder Sulindac zijn in staat om TRAIL sensitiviteit te verhogen door afname van de survivin expressie, maar ook door opregulatie van DR5 (28). Figuur 4: mechanismen van resistentie en potentieel therapeutische strategieën om deze te overkomen (22). TRAIL induceert tumor cel apoptose via binding aan de dood receptoren DR4 en DR5. Dit leidt via de intrinsieke of extrinsieke pathway tot apoptose. Activatie van DR4 en DR5 kan geblokkeerd worden door decoy receptoren. Dit kan omzeild worden door selectief DR4 en DR5 te activeren door receptor selectieve TRAIL varianten of door agonistische monoclonale antilichamen. DR4 en DR5 kunnen ook geblokkeerd worden door c-flip. Chemotherapeutica (in groen) en specifieke agentia (blauw) kunnen c-flip downreguleren en tumorcellen sensitiseren. Lager vindt men anti-apoptotische proteïnen van de Bcl-2 familie, die de transmissie van apoptotische signalen kunnen blokkeren. Small molecule Bcl- 2 inhibitoren en flavopiridols kunnen in combinatie met TRAIL gebruikt worden om dit resistentiemechanisme te overkomen. Een andere downstream inhibitor van TRAIL-induced apoptose is IAP. In sommige tumoren kan TRAIL transcriptie van NF-kB activeren. Dit reguleert de transcriptie van anti-apoptotische genen zoals c-flip, Bcl-2 en IAP. Dit kan omzeild worden door proteasoom inhibitoren. In tumorcellen die wild type p53 tot expressie brengen, kunnen DNA beschadigende agentia en radiotherapie TRAIL-induced apoptose stimuleren door opregulatie van p53 genen zoals DR4/DR5 en de BH3-only proteïnen Bax, Puma en Noxa (22). 25