UvA-DARE (Digital Academic Repository) On the intracellular ph of baker s yeast Orij, P.J. Link to publication

Transcriptie

1 UvA-DARE (Digital Academic Repository) On the intracellular ph of baker s yeast Orij, P.J. Link to publication Citation for published version (APA): Orij, P. J. (2010). On the intracellular ph of baker s yeast General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( Download date: 12 Feb 2017

2 SAMENVATTING Om de biochemische processen die in alle levende cellen plaatsvinden goed te kunnen laten verlopen is het voor cellen nodig hun binnen milieu te reguleren. Dit betekent dat de cel moet kunnen reageren als dat milieu door veranderingen van buitenaf wordt verstoord. Een belangrijk onderdeel van het intracellulaire milieu is de zuurgraad of ph-waarde. De ph van zuiver water is neutraal en heeft een waarde van 7. Zure oplossingen hebben een ph-waarde lager dan 7 en basische oplossingen een ph-waarde die hoger ligt. Dit proefschrift beschrijft de mechanismen die de zuurgraad regelen in bakkersgist. Bakkersgist is een eencellige eukaryoot, wat betekent dat de cellen van dit organisme aparte compartimenten (organellen) bevatten omgeven door membranen. Bakkersgist wordt al meer dan 100 jaar bestudeerd en fungeert als een modelorganisme voor hogere eukaryoten zoals de mens. Door de organellen kan de cel biochemische processen van elkaar scheiden en zo kan elk organel zijn eigen specifieke ph-waarde hebben. Omdat de ph-waarde in cellen alle geladen moleculen in een cel kan beïnvloeden, heeft de ph-waarde een belangrijke invloed op bijna alle biochemische reacties die in een cel plaatsvinden. Vanwege deze grote impact is het belangrijk om de ph goed te kunnen reguleren. In dit proefschrift hebben we de mechanismen bestudeerd die de phwaarde in gistcellen waarnemen en reguleren en wat voor signaleringsfuncties deze regulatie heeft. Hoofdstuk 1 van dit proefschrift vat de huidige kennis over intracellulaire ph samen, toegespitst op bakkersgist. We bediscussiëren hoe intracellulaire ph wordt gedefinieerd en welke methoden er worden gebruikt om de ph in cellen te meten. De methode die wij voor alle ph metingen in dit proefschrift hebben gebruikt maakt gebruik van een ph gevoelige variant van het groen fluorescent proteïne (GFP). Dit eiwit is in 1962 ontdekt in een kwal en wordt in de moleculaire biologie veel gebruikt om andere eiwitten te markeren. Door middel van microscopie kan dan zichtbaar gemaakt worden waar dit zogenaamde fusie-eiwit zich bevindt. De methode om ph te meten met de ph gevoelige variant van dit eiwit heeft als voordelen dat het in de cel gemaakt wordt en vervolgens naar elk gewenst organel gestuurd kan worden. Een bijkomstig 159

3 voordeel van deze methode is dat er zeer snel gemeten kan worden. Hoofdstuk 1 vervolgt met een beschrijving van de effecten van intracellulaire ph op verschillende componenten in de cel gevolgd door een beschrijving van ph regulatie. Er wordt ingegaan op de primaire regulators van de zuurgraad in cellen, de zogenaamde ATPases. Dit zijn pompen die zich in de buitenmembraan of in membranen van organellen bevinden en protonen over deze membranen kunnen pompen om zo de ph-waarde in de cel te reguleren. Naast deze ATPases zijn er ook nog pompen die andere ionen over de verschillende membranen kunnen pompen die ook de zuurgraad kunnen beïnvloeden. Dit komt doordat de verhouding tussen de concentraties van alle geladen deeltjes in een cel constant gehouden wordt. Hoofdstuk 1 sluit af met een beschrijving van hoe bakkersgist omgaat met verstoringen van de intracellulaire ph door veranderingen van buitenaf. Hoofdstuk 2 beschrijft hoe we de methode met het ph gevoelige GFP hebben opgezet voor metingen in bakkersgist. Het GFP werd naar twee verschillende plekken in de cel gestuurd; het celvocht (cytosol) en de mitochondriën. Een mitochondrion is een organel dat kan functioneren als de energiecentrale van een cel. Wanneer een gistcel zijn mitochondriën gebruikt om energie te genereren worden voedingsstoffen afgebroken en gebruikt om een ph verschil op te bouwen over de binnenmembraan van de mitochondriën. Deze ph gradiënt drijft de productie van adenosinetrifosfaat (ATP), de voornaamste drager van chemische energie in de cel. Gist heeft echter de eigenschap dat het suiker ook kan vergisten, in tegenstelling tot hogere eukaryoten. Bij deze manier van verbranding wordt geen gebruik gemaakt van de mitochondriën. Het gebruik van koolstofbronnen die niet kunnen worden vergist kan de gistcellen dwingen hun mitochondriën te gebruiken. Door de GFP in deze compartimenten tot expressie te brengen konden we metingen verrichten onder verschillende condities. Er werd onder andere gekeken naar het effect van de aanwezigheid van voedsel en het toevoegen van zwakke zuren die vaak worden gebruikt als conserveringsmiddelen. Om onze methode te testen herhaalden we oude experimenten waarvan de uitkomst goed beschreven is in de literatuur. Na deze test waren we overtuigd van de werking van onze methode waarna we de eerste metingen konden verrichten. De cytosolische ph van groeiende cellen lag rond de 7,2 terwijl de mitochondriële ph iets hoger lag rond 7,5. Ook lieten 160

4 experimenten zien dat de intracellulaire ph van groeiende cellen bestand is tegen grote veranderingen in de buiten ph. Door de cellen te laten groeien op verschillende soorten koolstofbronnen konden we aantonen dat de intracellulaire ph op een andere manier wordt gereguleerd onder deze verschillende condities. De belangrijkste observatie uit hoofdstuk 2 was een opmerkelijke correlatie tussen de groeiremming na toevoeging van zwakke zuren aan het medium en de verlaging van de intracellulaire ph als gevolg daarvan. Wanneer de cellen hun ph weer op pijl hadden begonnen ze ook weer te groeien. Dit werd ook waargenomen bij cellen die uitgehongerd werden en waar vervolgens weer suiker aan werd toegevoegd. Deze observatie gaf een eerste aanwijzing dat er een relatie zou kunnen bestaan tussen intracellulaire ph en de groeisnelheid van gistcellen. In hoofdstuk 3 wordt de relatie intracellulaire ph en de groeisnelheid verder onderzocht. Om genen te identificeren die betrokken zijn bij ph regulatie werd de GFP tot expressie gebracht in het cytosol van de complete mutantencollectie. Deze collectie bevat giststammen waarbij in elke stam één van de genen uit het gistgenoom is verwijderd met uitzondering van de genen die leiden tot een niet levensvatbare stam. Een afwijkende intracellulaire ph in een mutant in vergelijking met de controle zou een goede aanwijzing zijn dat het gen iets te maken zou hebben met intracellulaire ph regulatie. Uit onze analyse kon worden geconcludeerd dat de intracellulaire ph genetisch gezien een erg sterk gereguleerde parameter is omdat maar weinig mutanten een afwijking lieten zien en deze afwijking bovendien nooit groter was dan 0,3 ph eenheden. Verder onthulde onze analyse een zeer sterke correlatie tussen de intracellulaire ph en de groeisnelheid van de stammen. Om de causaliteit in deze correlatie te ontrafelen stelden we de ph in de cel waarbij we gebruik maakten van een mutant met een verlaagde tolerantie voor verzuring van buiten de cel. Op deze manier konden we de intracellulaire ph stapsgewijs verlagen en vervolgens de groeisnelheid onder deze condities bepalen. Uit deze experimenten bleek dat de verlaging van de intracellulaire ph precies de remming van de groeisnelheid teweeg bracht die hoorde bij de gestelde ph. Hieruit konden we concluderen dat de intracellulaire ph de groeisnelheid van gistcellen bepaalt en niet andersom. Het mechanisme waarmee de intracellulaire ph de groeisnelheid controleert is nog onbekend, maar onze 161

5 experimenten suggereren dat de ph een signaleringsfunctie zou kunnen hebben. Een kleine groep mutanten was ontkoppeld van de gevonden relatie tussen intracellulaire ph en groeisnelheid: ze groeiden te snel voor de gemeten ph in die stammen. Deze groep was verrijkt met genen die belangrijk zijn voor de synthese van pyrofosfaten, wat suggereert dat deze metabolieten een rol zouden kunnen spelen bij de overdracht van een signaal van intracellulaire ph naar de mechanismen die de groeisnelheid regelen. Hoofdstuk 4 beschrijft de experimenten die zijn gedaan om de mechanismen die de mitochondriële ph en de ph gradiënt over de mitochondriële binnenmembraan reguleren te ontrafelen. Hiertoe werd wederom de mutantencollectie gebruikt, maar nu werd mitochondriële ph gemeten in alle stammen. Een van de conclusies die uit deze experimenten kon worden getrokken was dat de ph van organellen niet los van elkaar wordt gereguleerd maar allen door centrale mechanismen op het niveau van de hele cel. De meest verrassende observatie uit de experimenten uit hoofdstuk 4 was het feit dat de ph gradiënt over de mitochondriële binnenmembraan hetzelfde was onder condities waarin de cellen de aanwezige voedingstoffen vergisten, waar de cellen hun mitochondriën niet gebruiken voor energievoorziening, als condities waarin de mitochodriën wel noodzakelijk zijn. Dit suggereert dat de grootte van de ph gradiënt door de cellen niet wordt gereguleerd om de capaciteit om energie te genereren te kunnen variëren. In hoofdstuk 5 wordt beschreven hoe de intracellulaire ph de synthese van celmembranen reguleert. In gist wordt celmembraansynthese gereguleerd door het eiwit Opi1. Dit eiwit remt de aanmaak van nieuw membraanmateriaal wanneer het zich in de kern bevindt. In groeiende cellen is Opi1 gebonden aan fosfatidylzuur, een component van membranen, zodat het niet de kern in kan om de membraansynthese te remmen. De experimenten in hoofdstuk 5 tonen aan dat de interactie tussen Opi1 en fosfatidylzuur ph gevoelig is. Een kleine verlaging in de zuurgraad in de cel zorgt ervoor dat het eiwit loslaat van de membraan. Die verlaging van de ph houdt verband met de aanwezige voedingsstoffen. Het opraken van voedingstoffen zorgt ervoor dat de ph in de cel daalt, Opi1 naar de kern verplaatst en de aanmaak van nieuw 162

6 membraanmateriaal wordt geremd. Op deze manier zijn de beschikbaarheid van voedsel en celgroei aan elkaar gekoppeld via de intracellulaire ph. Dit proefschrift beschrijft nieuw ontdekte functies van de intracellulaire ph in bakkersgist. De mechanismen die worden beschreven zijn zo basaal dat wij het zeer waarschijnlijk achten dat deze ook gelden voor hogere organismen. De gevonden signaleringsfuncties van de intracellulaire ph geven een nieuwe visie op het functioneren van cellulaire systemen. Wij veronderstellen dat deze bevindingen een nieuwe wending aan het onderzoeksveld geven in de manier waarop men tegen celsignalering aankijkt en hoe toekomstige experimenten worden opgezet. 163