Chapter 8. Nederlandse Samenvatting. voor niet-biologen

Transcriptie

1 Chapter 8 Nederlandse Samenvatting voor niet-biologen

2 108 Chapter 8 Inleiding 1.1 Fundamentele vragen in de biologie. De vragen die we proberen te beantwoorden in de biologie, de wetenschap van de levende natuur, gaan over zaken waar velen zich van tijd tot tijd ook over zullen verwonderen. Zoals, een wondje dat mooi heelt, een geur die plotseling een lang vergeten herinnering terugbrengt, of een knorrende maag die feilloos aangeeft dat het 12 uur is en tijd voor de lunch. Om over het ontstaan van nieuw leven maar te zwijgen. De laatste tientallen jaren zijn grote ontwikkelingen doorgemaakt in de biologie en vele nieuwe mogelijkheden ontstaan op de gebieden van onder andere de geneeskunde en de biotechnologie. In dit bredere perspectief is het voor vele niet-wetenschappers soms moeilijk voor te stellen dat deze ontwikkelingen veelal mogelijk werden door met geduld en toewijding te werken aan het beantwoorden van kleine deelvragen. Het verkrijgen van fundamentele kennis is ook het doel van het onderzoek dat beschreven is in dit proefschrift waarin de vorm en het functioneren van een eiwit dat transport uitvoert het onderwerp is. 1.2 Transport is van levensbelang. Alle levende organismen zijn opgebouwd uit een of meerdere cellen, die elk omgeven zijn door een nagenoeg ondoorlaatbare vetlaag, de membraan, die de celbinnenzijde afschermt van haar omgeving. Bacteriën bestaan, op een enkele uitzondering na, uit een enkele cel, terwijl een mens bijvoorbeeld uit zeer vele bestaat. De uitwisseling van signalen en van voeding- en afvalstoffen is essentieel voor het voortbestaan van een eencellige, maar is zeker ook essentieel om een goed functionerend meercellig organisme te vormen. Gespecialiseerde eiwitten 3, welke gelokaliseerd zijn in de membraan, zijn verantwoordelijk voor transport en signalering van binnen naar buiten de cel, en andersom (Figuur 1). De transporteiwitten zorgen voor gecontroleerde opname en excretie van stoffen over de membraan, en wel zo dat er geen lek ontstaat in de membraan. Voor het verzorgen van het transport is energie nodig. De transporteiwitten die onderwerp zijn in dit proefschrift zijn de zogenaamde 'secundaire' transporters, en zij hebben gemeen de wijze waarop energie wordt verkregen om transport uit te voeren. Het soort energie dat zij gebruiken wordt verderop in dit hoofdstuk uitgelegd. Secundaire transporters komen veel voor in alle levende organismen en zij transporteren een grote verscheidenheid aan stoffen. Enkele voorbeelden van transport in de mens en uitgevoerd door transporters uit deze klasse zijn het transport van CO 2 uit rode bloedlichaampjes naar de longen, de re-absorptie van suiker in de nieren of het transport van neurotransmitters bij zenuwimpuls-overdracht. 3 De meeste eiwitten kan men zich voorstellen als zeer kleine machines. Elke cel bevat vele soorten eiwitten die elk een functie vervullen. Sommige eiwitten zijn niet als machines, ze doen niets, en zijn slechts bouwstoffen.

3 Samenvatting 109 Figuur 1: Transport en signaaloverdracht over de membraan rondom cellen. Het transport van o.a. voeding- en afvalstoffen en de overdracht van signalen over de membraan welke cellen omgeeft worden verzorgd door membraaneiwitten en zijn essentieel voor het voortbestaan van een cel. 1.3 Vraagstelling in dit proefschrift. Dit proefschrift beschrijft proeven die tot doel hebben gehad inzicht te verkrijgen in de vorm en het functioneren van een secundair transporteiwit. Het werken met membraaneiwitten is technisch lastiger dan met wateroplosbare eiwitten. Onze kennis over membraaneiwitten in hun algemeenheid is beperkter dan die over een veelheid aan wateroplosbare eiwitten en staat niet in verhouding tot het belang van deze klasse van eiwitten voor het bestaan van leven. Desondanks is het onderzoek aan secundaire transporteiwitten aangeland op een punt waar we kunnen beginnen een aantal belangrijke vragen omtrent de vorm en het werkingsmechanisme te beantwoorden. Zoals: Hoe ontstaat selectiviteit voor een bepaalde stof (substraat)? Wat voor vormveranderingen vinden plaats in het eiwit zodat een substraat aan één zijde van de membraan gebonden en aan de andere zijde losgelaten wordt? Is de functionele eenheid voor transport een enkele eiwit (monomeer) of zijn hierbij meerdere eiwitten betrokken (multimeer)? Hoeveel suiker-bindingsplaatsen zijn er? Hoe wordt de energie voor transport geleverd? Hoe wordt de transportactiviteit gereguleerd? Deze vragen komen aan bod met betrekking tot het eiwit dat centraal staat in dit proefschrift, het suiker transporteiwit van de melkzuurbacterie Streptococcus thermophilus met de naam LacS (Lac van lactose en S van Streptococcus). Het gebruik van bacteriën voor onderzoek heeft als voordeel dat snel grote hoeveelheden gekweekt kunnen worden en dat kleine veranderingen in het eiwit gemakkelijk geïntroduceerd kunnen worden door genetische manipulatie. De verwachting is dat de principes over de vorm en het werkingsmechanisme opgedaan voor dit specifieke eiwit meer algemeen geldend kunnen zijn voor de gehele klasse van secundaire transporteiwitten, ongeacht uit welk organisme.

4 110 Chapter 8 2 Vorm en functie van een suiker transporteiwit. 2.1 Specificiteit van LacS. De melkzuurbacterie Streptococcus thermophilus wordt veel gebruikt voor de bereiding van kaas en yoghurt. De bacterie groeit dan in melk, een omgeving die rijk is aan melksuiker, ofwel lactose. Het LacS eiwit is gelokaliseerd in de membraan van de melkzuurbacterie en is verantwoordelijk voor de opname van de lactose. Binnenin de melkzuurbacterie wordt de lactose gesplitst in zijn twee deeleenheden, glucose en galactose. Het glucose-deel wordt door de bacterie verbrand, maar het galactose-deel wordt weer naar buiten getransporteerd. Er wordt dus netto één glucose-deel opgenomen als voedingsstof. Wij stellen ons voor dat transporteiwitten als LacS kunnen wisselen tussen op zijn minst twee verschillende gedaanten of conformaties. In de ene conformatie kan een suiker gebonden worden aan het eiwit vanaf de buitenzijde van de cel, terwijl in de andere conformatie suikers vanaf de binnenzijde gebonden kunnen worden (zie Figuur 2, plaatje 1 en 3). Om ongecontroleerde lekkage over de membraan te voorkomen mag het eiwit geen open verbinding maken tussen beide zijden van de membraan en kan het eiwit niet tegelijk van de binnen- en van de buitenzijde openstaan. Transport vindt plaats door achtereenvolgens suiker te binden aan LacS aan de éne kant, LacS te veranderen van conformatie, en suiker los te laten aan de andere kant van de membraan. Waneer we gebruik maken van een kunstmatig systeem waarbij gezuiverd LacS eiwit in de membraan van kunstmatig gevormde membraan blaasjes zit kunnen we transport van verschillende soorten suikers in beide richtingen bekijken. Gebruik makend van dit systeem is in kaart gebracht welke suikers precies getransporteerd kunnen worden, en hoe goed verschillende suikers kunnen binden aan de bindingsplaats aan de binnenzijde en buitenzijde van de cel (hoofdstuk 2). De resultaten geven aan dat beide bindingsplaatsen zeer specifiek zijn voor galactose. Echter, ook veel andere suikers, waaronder lactose, worden getransporteerd mits ze een galactose-deel hebben. Suikers bleken sterker te binden in de bindingsplaats aan de binnenzijde van de cel dan aan de bindingsplaats aan de buitenzijde. Wanneer men ervan uitgaat dat LacS bedoeld is om suiker naar binnen te transporteren om als voedingsstof gebruikt te worden, is het niet logisch dat ze juist aan de celbinnenzijde sterk gebonden worden. Ze moeten hier immers losgelaten worden. Echter, als je bedenkt dat de LacS transporter er niet alleen voor zorgt dat lactose binnen komt maar er ook voor zorgt dat galactose naar buiten gaat, zijn deze bevindingen wel logisch. De sterke binding van galactose aan de binnenzijde van de cel wordt gebruikt om galactose naar buiten te brengen, terwijl de specificiteit van de bindingsplaats aan de buitenzijde voor galactose dient om het glucose-deel van de lactose naar binnen te halen. Het eiwit is kennelijk geëvolueerd om een efficiëntie substraat (lactose)/ afvalproduct (galactose) uitwisseling mogelijk te maken en niet alleen om een efficiënte suiker opname te bewerkstelligen.

5 Samenvatting 111 Er zijn goede indicaties dat het eiwit dat de splitsing van lactose in glucose en galactose bewerkstelligt, het β-galactosidase, bindt aan het lactosetransporteiwit, zodat de lactose na het transport naar de cel-binnenzijde direct gesplitst kan worden en de galactose terug naar buiten gebracht kan worden. In Figuur 2 is suikertransport weergegeven zoals dit plaatsvindt in de melkzuurbacterie wanneer deze in melk groeit. Figuur 2: Lactose/galactose uitwisseling door LacS. Transport van suikers door LacS vindt plaats doordat het eiwit afwisselend bestaat in een vorm waarin suikers vanaf de buitenzijde van de cel aan LacS gebonden of losgelaten kunnen worden (1 en 4, handen aan cel buitenzijde), en een vorm waarbij suikers aan de binnenzijde van de cel gebonden of losgelaten kunnen worden (2 en 3, handen aan cel binnenzijde). De plaatjes 1-4 geven een complete transportcyclus weer. Lactose (de lolly) wordt aan de cel-buitenzijde gebonden aan LacS (jongen met pet) (1). Door een vormverandering (armbeweging) in het eiwit kan lactose naar de cel-binnenzijde gaan en laat daar los (2). Het β-galactosidase eiwit (jongen in wit shirt), welke aan LacS gebonden is, knipt (schaar) snel de lactose in zijn twee deeleenheden, galactose (stokje van de lolly) en glucose (het eetbare deel van de lolly) (2). Galactose wordt aan de cel-binnenzijde gebonden (3) en door een tweede vormverandering wordt galactose weer naar buiten getransporteerd (4). De cyclus is rond, en een nieuwe lactose kan worden gebonden aan de cel-buitenzijde. Alleen galactose, of het galactose-deel van lactose kunnen gebonden worden (het stokje), en netto blijft slechts het glucose-deel van de lactose (het eetbare deel van de lolly) binnen. Om het plaatje overzichtelijk te houden is slechts één LacS eiwit getekend, maar zoals verderop is beschreven komt LacS altijd in paren voor. Illustratie door Theo van Dijken.

6 112 Chapter De vorm van een LacS eiwit in 3 dimensies. Om werkelijk te begrijpen hoe iets werkt wil je in het algemeen weten hoe het eruit ziet. Een gedetailleerd beeld over de vorm van transporteiwitten zal uiteindelijk verkregen moeten worden door deze te berekenen uit röntgenanalyse van kristallen van transporteiwitten. Totdusver is het zeer moeilijk gebleken om zulke geördende clusters (kristallen) van secundaire transporteiwitten te vormen en gedetailleerde informatie over de vorm is dus vooralsnog niet beschikbaar. Toch hebben we al een beeld over hoe LacS en andere secundaire transporteiwitten eruit zien. Op grond van vergelijkingen met enkele andere membraaneiwitten waarvan wel gedetailleerde informatie over de vorm beschikbaar is, wordt aangenomen dat ze bestaan uit een bundel van zogenaamde α-helices, cilindervormige elementen welke de membraan overspannen. De α- helices worden verbonden door meer flexibele delen. Voor LacS wordt voorspeld dat het, net als veel andere secundaire transporteiwitten, bestaat uit 12 met elkaar verbonden helix elementen. In hoofdstuk 3 hebben we gekeken hoe de 12 helices van LacS in de membraan gerangschikt zijn. Door te kijken naar het effect van kleine veranderingen in LacS, geïntroduceerd door genetische modificatie, op de transport capaciteit, kon in kaart gebracht worden welke gebieden belangrijk zijn voor het werkingsmechanisme (hoofdstuk 3). Verder hebben we gezocht naar gegevens omtrent de nabijheid van de α-helices ten opzichte van elkaar door te zoeken naar zogenaamde 'tweede-plaats suppressors'. Wanneer een eerste verandering ervoor zorgt dat de transporter het niet meer doet, terwijl een tweede verandering op een andere plaats in het eiwit in staat is deze inactivatie op te heffen, moet geconcludeerd worden dat beide gebieden elkaars functie beïnvloeden. Daarvoor moeten ze hoogstwaarschijnlijk dicht bij elkaar liggen. Op grond van deze en andere proeven postuleren we dat de helices I, II, IV, VII, X en XI dicht bij elkaar liggen en belangrijk zijn voor transport, terwijl de helices III, V, VI, VIII, IX en XII minder belangrijk zijn en meer perifeer gelokaliseerd zijn (Figuur 3). We zouden ons kunnen voorstellen dat de helices I, II, IV, VII, X en XI een kanaal omgeven welke afwisselend afgesloten wordt van beide zijden.

7 Samenvatting 113 XII I XI II X IV III IX V VIII VII VI Figuur 3: Een model voor de vorm van LacS in 3 dimensies. Het LacS eiwit wordt, net als veel andere secundaire transporteiwitten, verondersteld te bestaan uit 12 met elkaar verbonden cilindervormige α-helix elementen die elk de membraan overspannen. De membraan rondom LacS is aangegeven. 2.3 Energie. Over de celmembraan van de meeste cellen worden concentratiegradiënten van ionen, veelal protonen of natrium-ionen, in stand gehouden door de concentratie protonen of natrium ionen binnenin de cel lager te houden dan buiten. Secundaire transporteiwitten gebruiken de energie die geborgen ligt in deze gradiënten. Door de drijvende kracht van de gradiënt van protonen over de membraan te gebruiken en de protonen 'stroomafwaarts' te laten gaan naar de zijde van de membraan waar weinig protonen zijn, kan LacS lactose in de cel, 'stroomopwaarts', accumuleren. Hoe deze koppeling precies gewaarborgd wordt is nog onduidelijk, maar uit proeven beschreven in hoofdstuk 3 en eerder gepubliceerd onderzoek blijkt dat de helices II en IV en het gebied dat de helices X en XI verbindt van belang zijn. Alhoewel het eiwit redelijk robuust lijkt en het vele veranderingen kan verdragen zonder dat het de capaciteit om suikers te binden en te verplaatsen verliest, lijkt het waarborgen van de koppeling tussen het transport van suikers en protonen veel kwetsbaarder en door kleine veranderingen verstoord. In paragraaf 2.2 is beschreven dat LacS in de natuurlijke situatie, wanneer het groeit in melk, lactose/ galactose uitwisseling bewerkstelligt. De gradiënten

8 114 Chapter 8 van stoffen die gebruikt worden bij deze uitwisseling zijn die van de lactose en de galactose zelf, en niet die van de protonen. Het is niet duidelijk of LacS protonengradiënt-gedreven opname überhaupt uitvoert in de natuur. We onderzochten dit transport type wel omdat veel andere secundaire transporteiwitten alleen protonengradiënt-gedreven opname kunnen bewerkstelligen. 2.4 LacS eiwitten functioneren in paren. Lang is verondersteld dat een enkel LacS eiwit, een monomeer, verantwoordelijk is voor transport, dat wil zeggen dat een monomeer een complete transporteenheid vormt. Voor LacS werd echter aangetoond dat het in eenheden van twee eiwitten (een dimeer) in de membraan zit, en de vraag was wat hiervan de functie is. In hoofdstuk 4 staat beschreven hoe we gekeken hebben of paren bestaande uit een actief en een inactief eiwit (zogenaamde heterodimeren) nog transport kunnen bewerkstelligen. We verwachten dat wanneer één enkel LacS eiwit genoeg is om transport uit te voeren het actieve LacS eiwit kan transporteren terwijl zijn inactieve buurman niets doet. Maar, als de twee LacS eiwitten samen moeten werken verwachten we dat het actieve LacS eiwit zonder hulp van zijn buurman ook geen transport kan uitvoeren. Het was een verrassing dat we beide antwoorden vonden. Voor het uitvoeren van uitwisseling, zoals die voorkomt als de bacterie groeit in melk (lactose/ galactose uitwisseling), is een enkel LacS eiwit voldoende, terwijl voor protonengradiënt-gedreven suikeropname twee LacS eiwitten nauw moeten samenwerken. Wat is nu het verschil tussen beide transport-typen? In beide wordt een suiker aan de buitenzijde gebonden, en vindt er een vormverandering plaats zodat de suiker aan de binnenzijde losgelaten kan worden. Echter, om weer terug te komen in de oorspronkelijke vorm waarin de bindingsplaats open staat naar de buitenzijde, is in het geval van uitwisseling een suiker gebonden die van binnen naar buiten verplaatst wordt, terwijl in het geval van opname de vormverandering plaats moet vinden terwijl het eiwit geen suiker gebonden heeft. We postuleren daarom dat twee LacS eiwitten voor 'opname' samen moeten werken om de vormverandering waarbij geen suiker gebonden is te bewerkstelligen (figuur 4).

9 Samenvatting 115 Figuur 4: Protonengradiënt-gedreven suikertransport door een LacS dimeer. Twee LacS eiwitten werken samen wanneer er suikeropname plaatsvindt. De vormverandering in het LacS eiwit dat een suiker gebonden heeft, wordt gekoppeld aan de meer ongunstige vormverandering in het eiwit zonder suiker. Een dimeer van LacS is weergeven als twee jongens, lactose als een lolly, en de koppeling tussen de bewegingen in de beide LacS eiwitten in de dimeer is weergegeven door de verbinding van beide handen via een katrol. Voor een complete transportcyclus herhalen zich de gebeurtenissen weergegeven in 1 en 2 maar nu zijn de rollen omgedraaid (de rechter jongen zal nu een lolly pakken van buiten, en terwijl het de vormverandering ondergaat om de lolly naar binnen te brengen, maakt de linker jongen de vormverandering door zodat hij in de nieuwe cyclus weer een nieuwe lolly kan pakken). Illustratie door Theo van Dijken.

10 116 Chapter Complexvorming bij andere transporters. Uit voorgaande proeven zou men kunnen concluderen dat het een te simpele voorstelling zou zijn te denken dat in de membraan rondom cellen de verschillende transporteiwitten onafhankelijk van elkaar, en onafhankelijk van de eiwitten in de cel zouden opereren. Immers, LacS blijkt voor suikeropname afhankelijk van de vorming van een LacS dimeer, terwijl het voor suikeruitwisseling waarschijnlijk associeert met het eiwit β-galactosidase dat aan de binnenzijde van de cel zit. En inderdaad, de afgelopen jaren is voor meerdere secundaire transporteiwitten beschreven dat de vorming van complexen van meerdere eiwitten een functie heeft. Een samenvatting van deze literatuur, en de verschillende technieken die men kan gebruiken om complexvorming van membraaneiwitten te bestuderen, staat gegeven in hoofdstuk 6. Een interessante gedachte is dat de vorming van associaties tussen verschillende transporters de mogelijkheid geeft om de activiteit en wellicht ook de specificiteit van transporters te reguleren. Dit zou een van de verklaringen kunnen zijn voor de recentelijk opgemerkte discrepantie tussen het aantal menselijke genen 4 en de grote verscheidenheid aan functies die vervuld worden door eiwitten. Grondig onderzoek naar de vorming van complexen van secundaire transporteiwitten is technisch lastig en zal voor veel (niet-bacteriële) eiwitten moeilijk blijven, alleen al omdat het lastig is veel eiwit in handen te krijgen. De toepasbaarheid van een reeds bestaande gemakkelijke en snelle techniek, genaamd "Blue Native Electrophoreses" is geëvalueerd in hoofdstuk 5. We concluderen dat, mits de juiste correcties gemaakt worden, de techniek betrouwbare resultaten geeft en mogelijkheden biedt een breed scala aan transporteiwitten te onderzoeken. 2.6 Conclusies in dit proefschrift Wanneer we werkelijk willen begrijpen hoe transporteiwitten werken moeten we weten wat ze doen en hoe ze eruit zien. De proeven in dit proefschrift aan de lactose transporter LacS hebben hieraan bijgedragen. De belangrijkste bevindingen zijn als volgt. (i) We weten welke suikers getransporteerd kunnen worden en weten gedeeltelijk hoe de suikers gebonden worden in de bindingsplaatsen aan de binnen- en buitenzijde van de membraan. (ii) We hebben een beeld gekregen hoe het eiwit eruit ziet en welke delen van het eiwit belangrijk zijn voor de binding en het transport van suikers (figuur 3). (iii) We hebben gezien dat LacS niet als een geïsoleerd eiwit functioneel is in de membraan maar een complex kan vormen met het eiwit dat suikers kan splitsen (figuur 2). Wanneer opname plaatsvindt gedreven door een protonengradiënt werken twee LacS eiwitten samen. We postuleren dat terwijl het ene eiwit de suiker naar binnen neemt, er in de ander de vormverandering plaatsvindt die nodig is om een nieuw suiker aan de buitenkant te binden (figuur 4). Het zou goed kunnen zijn dat dit een 4 Een gen is het voorschrift voor hoe een bepaald eiwit eruit moet zien en gemaakt moet worden

11 Samenvatting 117 principe is dat meer algemeen geldt in secundaire transporteiwitten die protonengradiënt-gedreven opname verzorgen. 3 Een blik naar de toekomst Met het voltooien van het lezen (sequensen) van het erfelijk materiaal (genoom) van de mens en andere organismen is het belang van de klasse van transporteiwitten ten volle duidelijk geworden en is het besef gegroeid dat onze kennis omtrent het functioneren van deze eiwitten niet in verhouding staat tot het belang van de vele functies die zij vervullen. Verder onderzoek zal ongetwijfeld leiden tot het doorgronden van de oorzaak voor het bestaan van vele ziektes welke berusten op een niet goed functionerend transporteiwit en zal openingen bieden voor de ontwikkeling van behandelingsmethoden. Toepasbaarheid van kennis over transporteiwitten zou ook kunnen liggen in de biotechnologie, waarbij het van belang is te bedenken dat voor de meeste omzettingen, veelal door bacteriën, de eerste stap de passage van stoffen over de membraan is. Maar bovenal zal met het volledig ontrafelen van het werkingsmechanisme van secundaire transporteiwitten en de daarvoor benodigde vorm en vormveranderingen een belangrijke fundamentele vraag in de biologie beantwoord worden.