Bioengineering of the lantibitoic nisin to create new antimicrobial functionalities Zhou, Liang

Transcriptie

1 Bioengineering of the lantibitoic nisin to create new antimicrobial functionalities Zhou, Liang IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2016 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Zhou, L. (2016). Bioengineering of the lantibitoic nisin to create new antimicrobial functionalities [Groningen: University of Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Nederlandse samenvatting Lanthipeptiden zijn (methyl) lanthionine bevattende peptiden, die behoren tot de grote familie van ribosomaal gesynthetiseerde en post-translationeel gemodificeerde peptiden (Ripps) (Arnison et al., 2013). Lanthipeptiden die antimicrobiële actieviteit vertonen worden lantibiotica genoemd (Schnell et al., 1988). Lantibiotica ondergaan verschillende post-translationele modificaties (Willey and van der Donk, 2007; Knerr and Donk, 2012). De dehydratatie van serines / threonines en de daarop volgende (methyl) lanthionine vorming zijn de kenmerkende modificaties van lantibiotica. Lantibiotica hebben een groot potentieel om gebruikt te worden als antimicrobiële middelen. Sommige lantibiotica, bijvoorbeeld MU1140 (mutacin 1140) (Ghobrial et al., 2010), NAI-107 (microbisporicin) (Jabés et al., 2011; Lepak et al., 2015), NVB302 (Crowther et al., 2013) en duramycin (Jones and Helm, 2009; Elvas et al., 2015), zijn al in een ver stadium van pre-klinische en klinisch onderzoek en kunnen misschien binnenkort worden gebruikt als geneesmiddelen. Nisine is hét prototype lantibioticum en wordt geproduceerd door Lactococcus lactis. Nisine werkt tegen Gram-positieve bacteriën en is effectief bij nanomolaire concetraties. Na de ribosomale synthese, wordt pre-nisine eerst gemodiceerd door NisB. NisB werkt als een dimeer (Mavaro et al., 2011) waarbij elk monomeer een N-terminaal glutamylatie gebied en een C-terminale glutamaat-eliminatie gebied bevat (Ortega et al., 2015). Het N-terminale gebied bindt stevig aan de FNLDL box in het leader deel van pre-nisine en katalyseert een glutamyl-trna betrokken glutaminatie van serines en threonines in het maturerende peptidedeel. Vervolgens wordt de glutamaat verwijderd door het C-terminale domein van NisB en worden serines en threonines gedehydrateerd tot dehydroalanines (DhA) en dehydrobutyrines (Dhb) (Garg et al., 2013; Ortega et al., 2015). De gedehydrateerde residuen worden gekoppeld aan cysteïnes door een sulfhydryl toevoeging die ~ 109 ~

3 gekatalyseerd wordt door NisC en zinkionen waarbij de (methyl) lanthionine ringen worden gevormd (Kuipers et al., 1993a; Li et al., 2006). NisB en NisC modificeren afwisselend van elkaar het substraat op directionele wijze van de N- naar de C-terminus (Lubelski et al., 2009). Het gemodificeerde peptide wordt naar de buitenkant van de cel getransporteerd door NisT (Qiao and Saris, 1996), waarna de protease NisP het leader deel van de pre-nisine afsnijdt, waardoor nisine wordt geactiveerd (van der Meer et al., 1993) (Hoofdstuk 1, figuur 1). Om de structuur en interactie tussen NisB en pre-nisine verder te bestuderen tijdens nisine productie, is cryo-elektronenmicroscopie (cryo-em) gebruikt hetgeen een geschikte methode is om de structuur van eiwitten en complexen te definiëren. Het complex dat gevormd wordt door NisB en zijn substraat pre-nisine, werd vanuit L. lactis verder gezuiverd door middel van Strep-tag zuivering. Deze zuivering is verder geanalyseerd door Western blot en een thermo-fluor assay. Visualisatie van negatief gekleurde complex deeltjes wees uit dat de kwaliteit van het monster voldoende geschikt was voor cryo-em analyse. Het verzamelen van het beeldmateriaal en de daarop volgende structuur analyse zijn momenteel in volle gang (Hoofdstuk 2). Nisine werkt volgens twee inhibitiemechanismen (Breukink and de Kruijff, 2006; Lubelski et al., 2008b): Het bindt aan lipid II en veroorzaakt hierbij de formatie van poriën. Lipid II ligt in het membraan en speelt een essentiële rol bij celwandsynthese. Nisine kan de peptidoglycaanlaag passeren van Gram-positieve bacteriën. De eerste twee ringen van nisine kunnen binden aan lipid II waardoor het de celwandsynthese en de groei van bacteriën remt. Na binding wordt het C-terminale gedeelte van nisine in de lipide bilaag ingevoegd. Vervolgens wordt een nisine-lipid II complex opgebouwd (8:4) om een poriecomplex te vormen in het membraan, dat uiteindelijk resulteert in het doden van de bacterie (Hasper et al., 2004). ~ 110 ~

4 Figuur 1. De werking van nisine. Het zogenaamde scharniergebied van nisine bestaat uit drie aminozuren (NMK) en bevindt zich tussen de eerste drie ringen en de laatste twee ringen. Deze regio speelt een belangrijke rol bij het inbrengen van de C-terminus van nisine in het membraan (Hasper et al., 2004). In hoofdstuk 3 is het scharniergebied van het lantibioticum nisine aangepast door het variëren van de lengte, van één tot zes aminozuren. De antimicrobiële activiteit van de varianten werd getest tegen 10 verschillende indicator bacteriestammen, hetzij in vloeibaar medium of met behulp van agarplaten. De resultaten geven aan dat de lengte van het scharniergebied van groot belang is voor de activiteit van nisine. Verkorting vermindert de activiteit dramatisch, terwijl het verlengen met één of twee hydrofobe aminozuren de activiteit maar matig verlaagde. Nisine remt efficiënt de groei van Gram-positieve bacteriën en resistentie tegen nisine wordt zelden waargenomen. De activiteit van lantibiotica is ten minste een 100-voud lager tegen bepaalde Gram-negatieve bacteriën. Dit wordt veroorzaakt door het feit dat Gram-negatieve bacteriën een buitenmembraan hebben die de peptiden hindert bij het bereiken van lipid II, dat gelegen is in de binnenmembraan ~ 111 ~

5 (Erridge et al., 2002). Verbetering van de activiteit van lantibiotica tegen Gram-negatieve bacteriën kan worden bereikt als de peptiden het buitenmembraan effectiever doordringen. In hoofdstuk 4 werden verscheidene peptiden die actief zijn tegen Gram-negatieve bacteriën (b.v. apidaecin 1b, oncocin), of delen daarvan, gefuseerd aan de C-terminus van nisine (of ingekorte varianten hiervan).. De activiteit van deze fusie-peptiden werd getest tegen Gram-negatieve pathogenen. De resultaten toonden aan dat wanneer een 8 aminozuren (PRPPHPRL) van de staart van apidaecin 1b aan nisine werd gekoppeld, de activiteit van nisine tegen Escherichia coli CECT101 meer dan twee maal werd verhoogd. Dit onderzoek demonstreert de werking van een nieuwe en veelbelovende strategie om de activiteit van lantibiotica tegen Gram-negatieve bacteriën te verhogen. Incorporatie van onnatuurlijke aminozuren (ncaas) in eiwitten is een methode om nieuwe eigenschappen aan eiwitten te geven. Nisine bevat geen tryptofaan residuen. In hoofdstuk 5 werd een systeem gebouwd om tryptofaan-analogen in te bouwen in nisine, waarbij de modificatie machinerieën van nisine (NisBTC) en de overexpressie van tryptofanyl-trna synthetase (TrpRS) zijn inbegrepen. Tryptofaan en drie verschillende tryptofaan analogen (5-fluoroTrp (5FW), 5-hydroxyTrp (5HW) en 5-methylTrp (5MeW)) werden met succes op vier verschillende posities van nisine (I1W, I4W, M17W en V32W) geïncorporeerd. De incorporatie-efficiëntie van tryptofaan analogen in de mutanten I1W, M17W en V32W waren meer dan 97%, terwijl de mutant I4W een relatief lage incorporatie efficiëntie vertoonde (69%-93%). De affiniteit van de peptiden voor de kation-ionenuitwisseling en omgekeerde fasechromatografie kolommen werd aanzienlijk verminderd door incorporatie van 5HW. De antimicrobiële activiteit van zowel de I1W- als de 5FW-analoog halveerde ten opzichte van nisine zonder tryptofaan, terwijl de antimicrobiële activiteit van de 5HW-analoog met een factor vier daalde. De 5FW analoog I4W toonde ook een 2 keer verminderde activiteit in vergelijking met nisine. Voor de mutant M17W en zijn 5HW analoog werd een 32 ~ 112 ~

6 maal verminderde activiteit waargenomen ten opzichte van die van nisine. Samenvattend beschrijft dit proefschrift drie verschillende strategieën om nisine te modificeren. Dit is nuttig om bijvoorbeeld de antimicrobiële activiteit hoger of specifieker te maken, of om bijvoorbeeld de stabiliteit te verbeteren. In dit proefschrift is voornamelijk nisine gebruikt als start punt hoewel dit onderzoek ook te vertalen is naar andere lantibiotica en misschien ook andere RiPPS. Echter, er zijn nog veel vragen die open staan en is er meer onderzoek nodig om een volledig beeld te krijgen van de relatie tussen de structuur van een antimicrobieel peptide en de antimicrobiele activiteit, zodat in de toekomst verbeterde lantibiotica kunnen worden verkregen. ~ 113 ~

7