Het secretoom van Trichoderma reesei QM6a als bron van accessorische enzymen voor de hydrolyse van lignocellulose

Transcriptie

1 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar Het secretoom van Trichoderma reesei QM6a als bron van accessorische enzymen voor de hydrolyse van lignocellulose Jeroen Feys Promotor: Dr. ir. Yves Briers Tutor: Nathalie Bouly Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie

2

3 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar Het secretoom van Trichoderma reesei QM6a als bron van accessorische enzymen voor de hydrolyse van lignocellulose Jeroen Feys Promotor: Dr. ir. Yves Briers Tutor: Nathalie Bouly Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie

4 Auteursrecht De auteur en promotor geven toelating om deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met de betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten van deze scriptie. 5 juni 2015 Promotor Dr. ir. Yves Briers Auteur Jeroen Feys

5 Woord vooraf Deze thesis is het resultaat van een jaar in het labo op Campus Schoonmeersen onderzoek te doen. Deze masterproef zou er niet geweest zijn, had ik niet kunnen rekenen op de vele mensen die ik via deze weg wil bedanken. Allereerst wil ik mijn promotor Ingeborg Stals en later op het jaar Yves Briers bedanken voor het aanreiken van het onderwerp en de begeleiding. Mijn grootste dank gaat uit naar Nathalie Bouly, bij wie ik altijd terecht kon met vragen en die mij steeds de juiste richting uit stuurde. Ik wil haar ook bedanken voor het nalezen van mijn scriptie. Maria Fonseca wil ik ook bedanken om mij wegwijs te maken in het labo. Mijn medestudenten zijn ook zeer belangrijk in het labo. Zonder hen was de sfeer niet zo goed geweest, en zou naar school komen een veel grotere opdracht geweest zijn iedere morgen. Bij deze dus bedankt Ann Lefere, Sarah De Saeger en Arne Dumarey. Mijn ouders wil ik ook bedanken voor de steun die ze me geven en de kans die ik krijg om deze opleiding te volgen. Verder wil ik ook mijn vrienden bedanken om tussen de experimenten door mijn batterijen weer helpen op te laden.

6 Abstract De enzymatische hydrolyse van lignocellulose biomassa is een heel complex proces waarbij verschillende enzymen in een bepaalde relatie staan ten opzichte van elkaar. Deze kunnen elkaars werking versterken, verzwakken of geen invloed hebben op elkaar. In deze thesis is het de bedoeling om het secretoom van de industrieel meest gebruikte producent van enzymen, RUT-C30, te supplementeren met het secretoom van een voorouder van deze enzymproducent, QM6a. Deze secretomen worden afgekort als QM voor QM6a en RM voor RUT-C30. In de eerste stap van het proces wordt gekeken in welke verhouding QM6a en RUT-C30 de grootste hoeveelheid suikers vrijstellen. Hierbij is de relatieve verhouding van de vrijstelling vooral van belang. De beste verhouding RM/QM is 8/2. Hierna wordt onderzocht in welke mate de twee verschillende enzymmengsels een impact hebben op elkaar met betrekking tot glucose. Er wordt een synergieniveau bekomen van 1.18, wat er op duidt dat het toevoegen van QM6a wel degelijk een positieve invloed op de vrijstelling van glucose van lignocellulose biomassa. Met behulp van HPAEC-PAD worden ook nog andere suikermonomeren gekwantificeerd. Kernwoorden: enzymatische hydrolyse, RUT-C30, QM6a, lignocellulose biomassa, synergie The enzymatic hydrolysis of lignocellullosic biomass is a very complex process, in which different enzymes behave different in relation to each other. They can strengthen, weaken or have no influence on each other. In this thesis, it is the intention to supplement the secretome of the industrially most used producer of enzymes, RUT-C30, with the secretome of an ancestor of this producer, QM6a. The secretomes will be abbreviated as QM for QM6a, and RM for RUT-C30. The first step of the process is to find in which ratio QM6a and RUT-C30 have the best yield. In this part, the relationship between the yields are important. The best ratio of RM/QM is 8/2. The experiments conducted hereafter are to find what impact these enzyme mixtures have on each other. In the end there is a level of synergy of 1.18, indicating that the addition of QM6a does have a positive influence on the yield of glucose of lignocellulosic biomass. Using HPAEC- PAD, other sugar monomers were detected. Keywords: enzymatic hydrolysis, RUT-C30, QM6a, lignocellulosic biomass, synergy

7 Inhoud Inhoud... 1 Lijst met afkortingen... 3 Lijst met figuren... 4 Lijst met tabellen... 5 Inleiding... 6 Literatuurstudie Algemeen productieproces bio-ethanol Opbouw van lignocellulose biomassa Cellulose Hemicellulose Lignine Miscanthus Voorbehandeling Chemische voorbehandeling Zuur Base Voorbehandeling met betrekking tot Miscanthus Enzymatische hydrolyse CAZy classificatie van enzymen Biomassa-afbraak Cellulose-afbraak Lignine-afbraak Hemicellulose-afbraak Optimaliseren van enzymatische hydrolyse Carbohydraat bindende modules Substraatverandering Eindproductinhibitie Aanwezigheid van lignine Synergie Fermentatie Trichoderma reesei Enzymcocktail Evolutie

8 Materiaal en Methoden Materiaal Toestellen Producten Methoden Enzymproductie Opgroeien Trichoderma reesei Opzuivering enzymen Karakteristieken van de enzymmengsels Proteïneconcentratiebepaling SDS-PAGE Fractioneren van de enzymmengsels Enzymatische hydrolyse Chromogene modelsubstraten Additietesten-experimenten Resultaten en bespreking Karakterisering van de enzymmengsels Hydrolyse van chromogene modelsubstraten Fractionaties Synergie-experimenten Additie-experimenten Tijdsexperiment Algemeen besluit Referentielijst Bijlage

9 Lijst met afkortingen SHF SiSF LPMO CAZy CBM UV NTG LA PDA APS AA:Bis TEMED SDS-PAGE GOD-POD ABTS PES BSA pnp cnp ILVO Seperate Hydrolysis and Fermentation Simultanious Saccharification and Fermentation Lytic Polysaccharide Monooxygenases Carbohydraat Active Enzymes Carbohydraat Bindende Module Ultraviolet Nitrosoguanidine Linear Acceleration Potato Dextrose Agar Aminopersulfaat Acrylamide/Bis-Acrylamide Tetremethylethyleendiamine Sodium Dodecylsulfaat- Polyacrylamide Gelelektroforese Glucoseoxidase-peroxidase 2,2 -azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonzuur) Polyethersulfon Bovine Serum Albumine Para-Nitrofenol Chloro-Nitrofenol Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek HPAEC-PAD High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection 3

10 Lijst met figuren Figuur 1 Schematische voorstelling van het SSF productieproces (Viikari, Vehmaanpera, and Koivula 2012)... 8 Figuur 2 Structuur van lignocellulose (van Zyl et al. 2011)... 9 Figuur 3 Cellobiose opgebouw uit twee cellulose-eenheden (Yikrazuul 2008) (links)... 9 Figuur 4 Cellulose microfibrillen met intra- en intermoleculaire waterstofbruggen (Ophardt) (rechts) 9 Figuur 5 Arabino-4-O-methylglucuronoxylaan: xylaan hoofdketen met glucuronzuur en arabinose zijgroepen (Van Dyk and Pletschke 2012) Figuur 6 Galactoglucomannaan: glucomannaan hoofdketen met galactosyl en acetyl zijgroepen (Van Dyk and Pletschke 2012) Figuur 7 Precursoren van lignine (Albizati and Tracewell 2012) Figuur 8 Niet-voorbehandelde biomassa (A) en voorbehandelde biomassa (B) (Yoshida et al. 2008) Figuur 9 Invloed van voorbehandelingen (Zheng, Pan, and Zhang 2009) Figuur 10 Cellulose met bijhorende enzymen (van Zyl et al. 2011) Figuur 11 Arabinoglucuronoxylaan en enzymen die nodig zijn voor de afbraak ervan (Sun et al. 2012) Figuur 12 Cartoonweergave van Cel7A werkzaam op cellulose. (Beckham 2015) Figuur 13: Voorstelling van lignine-inhibtie (Li et al. 2014) Figuur 14 Fermentatie (van Zyl et al. 2011) Figuur 15 Evolutiepatroon (UV= ultra violet NTG=nitrosoguanidine LA= lineair acceleration) (Seidl et al. 2008) Figuur 16 Invloed van SDS (Roy and Kumar 2014) Figuur 17 SDS-PAGE opstelling ("SDS-PAGE opstelling") Figuur 18 DEAE-Sepharose ("Schematic structure of DEAE-Sepharose") Figuur 19 Verloop van de gradiënt bij de fractionatie van QM Figuur 20 Schematische werkwijze voor de fractionering van eiwitmengsels (Ltd 2006) Figuur 21 Specifieke activiteit (U/mg) op modelsubstraten Figuur 22 SDS-PAGE van de verschillende fracties en de zuivere enzymmengsels Figuur 23 Monomeeropbrengst van de verschillende verhoudingen RM/QM Figuur 24 Galactosevrijstelling bij verschillende verhoudingen RM/QM Figuur 25 Enzymatische conversie van glucose in de tijd Figuur 26 Enzymatische conversie van arabinose in de tijd Figuur 27 Enzymatische conversie van galactose in de tijd Figuur 28 Enzymatische conversie van xylose in de tijd

11 Lijst met tabellen Tabel 1 Samenstelling verschillende biomassa s (Van Dyk and Pletschke 2012) Tabel 2 Invloed NaOCl-voorbehandeling op Miscanthus (Yoshida et al. 2008) Tabel 3 Alle klassen van CAZymen, met EC nummer en beschrijving van de activiteit Tabel 4 Verschillende glycosidehydrolasen uitgescheiden door T. reesei CL847 (Couturier et al. 2012) Tabel 5 Verhoudingen additietesten (RM= secretoom van RUT-C30, QM=secretoom van QM6a) Tabel 6 Verschillende reactiemengsels bij synergie-experimenten Tabel 7 Gradiënt HPAEC-PAD Tabel 8 Enzymconcentratie na de iedere opzuiveringstap Tabel 9 Specifieke activiteit (U/mg) op verschillende modelsubstraten Tabel 10 Concentratie van de enzymfracties na samenvoegen bepaalde fracties Tabel 11 Samenstelling Miscanthus, verkregen via N. Bouly Tabel 12 Verwerking glucose-opbrengst

12 Inleiding In 2001 werd 97% van alle vloeibare transportbrandstof afgeleid van petroleum. Om de afhankelijkheid hiervan, en de prijsverandering door onrust in het Midden-Oosten te verminderen moet het ergens anders gezocht worden. Het broeikaseffect, door fossiele brandstoffen veroorzaakt, is nog nooit zo groot geweest. Regeringen zijn daarom bezig met te investeren in onderzoek naar de productie van biobrandstoffen op grote schaal. De EU wil dat tegen % van de transportbrandstoffen bestaan uit biobrandstof. De productie van de eerste generatie biobrandstoffen is wereldwijd al overal op punt gesteld. Aan deze biobrandstof zijn echter ook nog nadelen verbonden. In veel landen wordt nog steeds gedebatteerd over het gebruik van voedingsgewassen voor de productie van biobrandstoffen. De productie van tweede generatie biobrandstoffen kan een antwoord bieden op de problematiek van het food vs fuel debat. Hierbij wordt gebruik gemaakt van argiculturele reststromen, zoals maïsstro, en energiegewassen, zoals Miscanthus. (Van Dyk and Pletschke 2012). Het lignocellulotisch ethanol heeft een gunstig broeikasgasprofiel en kan de afhankelijkheid van olie doen verminderen. Het kan ook een boost geven aan landbouwgemeenschappen; waar resten nu verbrand worden, kan dit dan verkocht worden als substraat voor de biobrandstoffen. De enzymatische omzetting van biomassa naar monomere suikers is een zeer complexe en dure operatie. De enzymen moeten geproduceerd worden in levende systemen en zijn meestal niet echt thermostabiel. De enzymatische hydrolyse is dan ook de grootste bottleneck door de recalcitrantie van de plantencelwand. De verhouding cellulose, hemicellulose en lignine variëren van soort tot soort, wat een totaaloplossing voor een efficiënte hydrolyse nog bemoeilijkt. Filamenteuze fungi zijn de beste biomassa degradeerders omdat ze veel enzymen produceren. In de industrie wordt vooral Trichoderma reesei veel gebruikt. Deze schimmel staat er om bekend dat ze overmatig veel cellulasen produceert en werd dan ook aan verschillende rondes van mutatie onderworpen om een nog betere producent van enzymen te verkrijgen. Een nadeel van T. reesei is dat het genoom niet veel genen bevat voor andere enzymen dan cellulasen, zoals hemicellulasen (Couturier et al. 2012). Er wordt tegenwoordig veel onderzoek gedaan naar enzymmengsels om tot een efficiëntere hydrolyse te komen. Deze enzymmengsels worden op verschillende manieren bekomen. Men kan vertrekken van een aantal kernenzymen en hierbij andere enzymen supplementeren om zo tot een superieure samenstelling te komen. Een andere manier is verschillende, reeds bestaande mengsels bij elkaar voegen. De enzymen werken samen op het substraat op een synergetische manier, wat wil zeggen dat de enzymen samen een hogere opbrengst zullen leveren dan som van de werkingen apart. Dit zal onderzocht worden in deze thesis. De 6

13 uitscheidingen van Trichoderma reesei QM6a en RUT-C30 hebben een verschillend enzymprofiel. Door QM6a, of fracties hiervan, te supplementeren bij een bepaalde hoeveelheid RUT-C30 moet een betere hydrolyse van het lignocellulose substraat bekomen worden. 7

14 Literatuurstudie 1 Algemeen productieproces bio-ethanol Het gebruikelijke proces om ethanol vrij te stellen uit lignocellulose biomassa bestaat uit vier stappen: 1) Voorbehandeling: hierbij wordt de structuur van de biomassa afgebroken 2) Enzymatische hydrolyse: lignocellulose afbreken tot monomeren 3) Fermentatie: pentosen en hexosen omzetten tot ethanol 4) Destillatie: scheiding van ethanol van de andere componenten Het traditioneel proces om biomassa om te zetten naar ethanol steunt op SHF, seperate hydrolysis and fermentation of SSF, simultaneous saccharification and fermentation. In SHF werken de gist en de enzymen beide bij hun optimale condities. Het nadeel is dat er hierbij sprake is van eindproductinhibitie van de enzymen. In figuur 1 is SSF weergegeven, hierbij kan eindproductinhibitie in geval van de hydrolyse vermeden worden. Een nadeel is echter dat de condities in geen van beide delen optimaal zijn omdat de hydrolyse en fermentatie beide bij verschillende temperaturen optimaal verlopen. De condities zijn wel zodanig gekozen dat er toch meer rendement behaald wordt in vergelijking met SHF (Viikari, Vehmaanpera, and Koivula 2012; Margeot et al. 2009). In wat volgt zal op de eerste drie stappen dieper ingegaan worden. Figuur 1 Schematische voorstelling van het SSF productieproces (Viikari, Vehmaanpera, and Koivula 2012) 8

15 2 Opbouw van lignocellulose biomassa Om de enzymatische hydrolyse van biomassa volledig te begrijpen, moet de structuur van het te hydrolyseren product gekend zijn. Dit is niet altijd even gemakkelijk. Lignocellulose is namelijk zeer complex en de structuur verschilt van plant tot plant. In oudere planten zijn de celwanden zeer sterk en dan nog eens bijgestaan door een secundaire celwand. Deze celwanden beschermen de plant en bieden weerstand aan enzymen (Phitsuwan, Sakka, and Ratanakhanokchai 2013). Figuur 2 Structuur van lignocellulose (van Zyl et al. 2011) De drie voornaamste componenten van lignocellulose zijn lignine, hemicellulose en cellulose. Deze zijn georganiseerd in een complexe structuur. Bundels van cellulose worden omgeven door hemicellulose en bijeengehouden door waterstofbindingen. Dit netwerk wordt dan nog eens verder afgesloten door het waterbestendige lignine zoals te zien is op figuur 2 (Phitsuwan, Sakka, and Ratanakhanokchai 2013). 2.1 Cellulose Cellulose (C 6 H 10 O 5 )x is een homopolymeer opgebouwd uit cellobiose-monomeren (Figuur 3). Dit bestaat uit twee D-glucose moleculen gelinkt via een β-1,4-glycosidische binding. Ieder molecule is geïnverteerd ten opzichte van zijn buurmolecule, hierdoor is cellulose een rechtlijnig polymeer. Verschillende lineaire cellulose-polymeren liggen dicht tegen elkaar en vormen via intra- en inter-moleculaire waterstofbruggen dicht opeengepakte microfibrillen (Figuur 4) (Phitsuwan, Sakka, and Ratanakhanokchai 2013). Figuur 3 Cellobiose opgebouw uit twee cellulose-eenheden (Yikrazuul 2008) (links) Figuur 4 Cellulose microfibrillen met intra- en intermoleculaire waterstofbruggen (Ophardt) (rechts) 9

16 2.2 Hemicellulose Hemicellulose (C 5 H 8 O 4 )m is een verzamelnaam voor verschillende polysacchariden die voorkomen in de plantencelwand zoals: xyloglucaan, xylaan, mannaan en glucomannaan (Figuur 5 en 6). Deze bestaan uit verschillende bouwstenen: D-xylose, D-arabinose, D- glucose, D-galactose en verschillende suikerzuren. Xylaan is het meest voorkomend en bestaat uit β-1,4-gelinkte xylopyranose-eenheden. Op deze structuren kunnen zijgroepen staan, die de oplosbaarheid beïnvloeden en kristallisatie verhinderen. Hierdoor blijft het hemicellulose flexibel. De verschillende zijgroepen verschillen ook nog eens van plant tot plant. Om de zijgroepen af te breken zijn er nog andere enzymen nodig dan die voor de ruggengraat. Tussen hemicellulose en lignine komen ook covalente bindingen voor. Dit bemoeilijkt verder de enzymatische afbraak. Hemicellulose heeft een lager moleculair gewicht in vergelijking met cellulose. De dominante component hiervan in hard hout en grassen is xylaan. De zachtere houtsoorten bestaan vooral uit glucomannaan. Het hemicellulose dient als verbinding tussen cellulose en lignine. Dit geeft de volledige structuur een grotere stijfheid. Hemicellulose begint op te lossen in water van 180 C, maar is ook zeer afhankelijk van de ph. Hemicellulose is het meest gevoelig voor thermisch-chemische voorbehandelingen (Hendriks and Zeeman 2009). Figuur 5 Arabino-4-O-methylglucuronoxylaan: xylaan hoofdketen met glucuronzuur en arabinose zijgroepen (Van Dyk and Pletschke 2012) Figuur 6 Galactoglucomannaan: glucomannaan hoofdketen met galactosyl en acetyl zijgroepen (Van Dyk and Pletschke 2012) 10

17 2.3 Lignine Lignine (C 9 H 10 O 3 (OCH 3 ) )n is een onregelmatige macromecule die bestaat uit verschillende groepen, die voorkomen zonder herhalende structuur. Het gaat hierbij vooral over p- coumarylalcohol, coniferylalcohol en sinapylalcohol (Figuur 7). Lignine omringt de polysacchariden om ze te voorzien van structuur, mechanische versterking en waterbestendigheid en dient als scherm tegen enzymatische aanvallen (Phitsuwan, Sakka, and Ratanakhanokchai 2013). Lignine begint op te lossen vanaf 180 C bij neutrale ph. De oplosbaarheid ervan is ook afhankelijk van de verhouding van de precursoren (Hendriks and Zeeman 2009). In Tabel 1 is te zien dat de drie verschillende componenten in verschillende verhoudingen aanwezig zijn afhankelijk van plant tot plant. Figuur 7 Precursoren van lignine (Albizati and Tracewell 2012) Tabel 1 Samenstelling verschillende biomassa s. Percentage as buiten beschouwing gelaten. De verschillende lijnen zijn percentages bekomen door verschillende onderzoekers (Van Dyk and Pletschke 2012) 11

18 2.4 Miscanthus Miscanthus is een grasachtige plant met zeer hoge jaarlijkse opbrengst per hectare. De hoeveelheid suikers in Miscanthus komt overeen met de meest gebruikte lignocellulose biomassa s zoals tarwestro en rijststro. Deze hoeveelheid ligt rond 62%. Na een NaClO 2 voorbehandeling daalt de lignine-inhoud tot 8.6%. Dit is een zeer grote verbetering in vergelijking met niet-voorbehandelde biomassa (Tabel 2). Tabel 2 Invloed NaOCl-voorbehandeling op Miscanthus (Yoshida et al. 2008) Bij grasachtige eenzaadlobbige planten is al veel vastgesteld dat arabinoxylaan een veel voorkomend hemicellulose is. Dit is ook het geval bij Miscanthus sinensis. Na verder onderzoek werd vastgesteld dat xylose het meest voorkomt bij Miscanthus, en dat arabinose minder dan 5% van de totale suikers uitmaakt. Uit verder onderzoek blijkt ook dat glucose het meest voorkomend hexose is (Yoshida et al. 2008). 3 Voorbehandeling De enzymatisch hydrolyse van niet-voorbehandelde biomassa bereikt een plateau bij ongeveer 20% conversie. Alleen als er zeer grote hoeveelheden enzym gebruikt worden, ligt de hydrolyse iets hoger. Dit is echter economisch niet haalbaar. Verschillende eigenschappen van het lignocellulose dragen bij tot recalcitrantie: kristalliniteit van de cellulose, specifiek oppervlak, graad van polymerisatie, bescherming van cellulose door lignine en hemicellulose en de graad van acetylatie van het hemicellulose. Hoeveel elke factor relatief bijdraagt aan de recalcitrantie is niet duidelijk. De variabiliteit van al deze factoren laat zien hoe complex de lignocellulose matrix effectief is. Tussen verschillende soorten substraat bestaat er veel verschil in deze factoren (Zheng, Pan, and Zhang 2009). De voorbehandeling heeft als doel het aanpassen van de lignocellulosematrix. Gewenste effecten van een voorbehandeling zijn (1) een groter contactoppervlak, (2) dekristallisatie van cellulose en (3) afbreken van hemicellulose en/of lignine. Door de combinatie van chemische en fysische reacties bestaan er veel verschillende technieken om de biomassa te behandelen (Margeot et al. 2009). Hierdoor is er voor bijna elke soort substraat een techniek die beter geschikt is dan een andere. De enzymatische degradatie is hierdoor substraats- en voorbehandelingsspecifiek. Het is tevens ook niet 12

19 mogelijk om één van de effecten van de voorbehandeling apart te bestuderen. Een ideale voorbehandeling: (Pienkos and Zhang 2009) - produceert een goed verteerbaar eindproduct. - breekt bijna geen pentosen af. - inhibeert de volgende stappen van de hydrolyse/fermentatie niet. - heeft zo weinig mogelijk mechanische voorbehandeling nodig. - kan werken op grote hoeveelheden. - is eenvoudig uit te voeren. - is economisch en ecologisch verantwoord. - zorgt voor een hoge recuperatie van de beschikbare carbohydraten. Er zijn veel verschillende soorten voorbehandelingen, waarin er twee grote categorieën te onderscheiden zijn. De fysische worden hier buiten beschouwing gelaten en de chemische zullen verder worden uitgelicht. 3.1 Chemische voorbehandeling Het doel van een chemische voorbehandeling is in de eerste plaats de bioafbreekbaarheid van cellulose te verbeteren door lignine te verwijderen. Een ander bijkomend voordeel is dat tegelijk ook de graad van polymerisatie en de kristalliniteit van de cellulose daalt Zuur De meest gebruikte voorbehandelingen zijn deze op basis van verdund zuur. De hoofddoelstelling hiervan is dus het hydrolyseren van de hemicellulose en de cellullose onaangetast laten. Op deze manier is de verteerbaarheid van de cellulose al stukken beter. Het hemicellulose kan ook volledig niet-enzymatisch gehydrolyseerd worden tot monomere suikers. Hierbij gaan er echter veel suikers verloren. De opgeloste hemicellulose-oligomeren kunnen leiden tot furfural of hydroxymethylfurfural. Het opgelost lignine zal ook snel neerslaan in de zure omstandigheden, wat een neveneffect is. Hierdoor zal de doorlaatbaarheid van het substraat terug dalen. Het meest gebruikte zuur is zwavelzuur. Dit heeft echter een paar grote nadelen, waarvan één is dat het veel afbraakproducten vormt die fermentatie inhiberen (Zheng, Pan, and Zhang 2009). Een ander groot nadeel is dat bij zure voorbehandelingen er vluchtige producten ontstaan. Deze gaan dan verloren, wat de uiteindelijke conversie verlaagt. Deze vluchtige producten kunnen wel omgezet worden tot methaan (Hendriks and Zeeman 2009). 13

20 3.1.2 Base Een basische voorbehandeling is in feite een delignificatieproces waarbij een groot deel van het hemicellulose mee opgelost wordt. Dit gebeurt via een verzepingsreactie van de intermoleculaire esterbindingen tussen het hemicellulose xylaan en andere componenten, zoals lignine. Het substraat zwelt ook op. Door deze gezwollen staat is het beter bereikbaar voor de enzymen, de polymerisatiegraad en de kristalliniteit dalen, het intern oppervlak stijgt, de ligninematrix wordt verscheurd en de verbindingen tussen het lignine en de carbohydraten breken. Het proces verwijdert ook verschillende zijgroepen op het hemicellulose, zoals acetylgroepen en uronzuurgroepen, die de bereikbaarheid van hemicellulose en cellulose voor de enzymen vermindert. Over het algemeen wordt bij alkalische voorbehandelingen een lage temperatuur gebruikt, maar wel gedurende een lange periode. De concentratie van de basen mag ook niet te groot zijn, anders kunnen er ongewenste nevenreacties optreden. Het gaat hierbij dan vooral over de decompositie van de eindgroepen en opgeloste polysacchariden. Er kunnen ook suikers als eindgroep afgebroken worden. Dit kan een voordelig effect hebben op de conversie. Echter door het laag moleculair gewicht van de gevormde producten is er veel kans dat als het afbreekt, het in de vorm van CO 2 zal vervluchtigen. Een ander groot nadeel is dat de basen zich omzetten in zouten die dan opgenomen worden in de biomassa. Bij de extractie van de alkali zal het lignine oplossen, terug condenseren en zich herverdelen op een andere manier. Dit werkt de positieve effecten van het verwijderen van het lignine tegen. Nog een ander nadeel is dat het gebruik van alkali zorgt voor een densere cellulosestructuur, wat de enzymatische hydrolyse niet bevordert (Hendriks and Zeeman 2009; Zheng, Pan, and Zhang 2009). 14

21 3.1.3 Voorbehandeling met betrekking tot Miscanthus In deze thesis zal gewerkt worden met Miscanthus, dat voorbehandeld werd met een base. In de volgende alinea wordt de impact besproken van een andere basische voorbehandeling op de enzymatische degradatie van het substraat. Op figuur 9 is grafisch voorgesteld wat de eigenlijke bedoeling is van een voorbehandeling. Figuur 8 Niet-voorbehandelde biomassa (A) en voorbehandelde biomassa (B) (Yoshida et al. 2008) Op figuur 8 is duidelijk het verschil te zien tussen een niet-voorbehandeld staal Miscanthus, grafiek A en een gedelignineerd staal Miscanthus, grafiek B. De initiële snelheid ligt veel hoger. Dit komt onder andere omdat het aantal vrije substraat sites, waaraan enzymen kunnen binden, veel groter is geworden. De enzymen worden ook niet meer aspecifiek gebonden door de lignine fractie. Hierdoor is het vrije aantal enzymen veel hoger, en zal de initiële hydrolysesnelheid hoger liggen. Hoewel delignificatie de kristalliniteit niet zal doen verminderen of zelfs zal doen toenemen, is er uiteindelijk een veel hogere conversie te zien. Dit wil dus zeggen dat vooral lignine de hydrolyse inhibeert, en niet de kristalliniteit van het substraat (Yoshida et al. 2008). 4 Enzymatische hydrolyse Figuur 9 Invloed van voorbehandelingen (Zheng, Pan, and Zhang 2009) Bij de enzymatische hydrolyse van lignocellulose zijn er heel veel verschillende enzymen nodig. Van deze enzymen behoren er veel tot de klasse van de glycosidehydrolasen. In 2010 werd voor het eerst beschreven dat oxidoreductasen ook betrokken zijn bij de afbraak van cellulose (LPMO s of lytic polysaccharide monooxygenases). Daarnaast zijn er ook nog hemicellulasen en ligninasen nodig om het pad vrij te maken voor de afbraak van de cellulose. 15

22 Er zijn drie soorten die niet direct inwerken op de cellulose, maar wel de enzymatische hydrolyse bevorderen. Deze indirecte enzymen zijn: - niet-enzymatische eiwitten die de celwand losser maken. - lignine afbrekers. - enzymen die pretreatment groepen afbreken (Banerjee, Scott-Craig, and Walton 2010). 4.1 CAZy classificatie van enzymen Alle katalytische en carbohydraat-bindende modules van enzymen betrokken bij de afbraak, opbouw of het veranderen van glycosidische bindingen, zijn beschreven in de CAZydatabase. De enzymklassen die momenteel beschreven worden, zijn voorgesteld in tabel 3. Tabel 3 Alle klassen van CAZymen, met EC nummer en beschrijving van de activiteit Glycoside Hydrolase GH E.C Hydrolyse en/of herschikken van glycosidische bindingen Glycosyl Transferasen GT E.C.2.4.x.y Vorming van glycosidische bindingen Polysaccharide lyasen PL E.C Non-hydrolytische splitsing van glycosidische bindingen Carbohydraat Esterasen CE E.C Hydrolyse van Carbohydraatesters Auxiliary Activities AA E.C.1.1.x.y Redox enzymen die samenwerken met CAZymen De klasse die het meest betrokken is bij de enzymatische afbraak van biomassa zijn de hydrolasen. De hydrolasen hydrolyseren de glycosidische binding tussen twee koolhydraten of tussen een koolhydraat en een andere groep. Een zuur (protondonor) katalyseert samen met een nucleofiel (base) de hydrolyse van de glycosidische binding. Bij deze reactie is ook steeds een watermolecule betrokken. Afhankelijk van de afstand tussen deze twee katalytische aminozuren zal de anomere configuratie van het carbohydraat al dan niet veranderen (Davies and Henrissat 1995). De naamgeving van de enzymen gebeurt meestal op basis van het substraat dat gehydrolyseerd wordt en soms op basis van het mechanisme. De CAZyhydrolasen worden ingedeeld in verschillende families op basis van gelijkheden in aminozuursequenties. De verschillende families worden gegroepeerd in clans op basis van hun driedimensionale structuur. 16

23 In de CAZy-database zijn recent ook andere enzymen opgenomen. De lytic polysaccharide mono-oxygenasen worden samen met de enzymen die instaan voor de afbraak van lignine onderverdeeld in een nieuwe klasse: de auxiliary enzymes (Levasseur et al. 2013). 4.2 Biomassa-afbraak Cellulose-afbraak Bij de afbraak van cellulose zijn verschillende GH-klassen betrokken, zoals hierboven reeds vermeld. Een eerste soort zijn de endo-β-1,4- glucanasen, deze vallen de celluloseketting random aan op de amorfe plekken van de cellulose. Op de plekken waar dit enzym zijn werk gedaan heeft, kunnen de exoglucanasen aanvallen, waarbij cellobiose vrijkomt. Dit wordt dan uiteindelijk gesplitst in glucose moleculen door β-glucosidasen. Dit proces wordt voorgesteld op figuur 10. In de meeste gevallen versterken de endoglucanasen en de cellobiohydrolasen elkaar. Dit is te wijten aan het synergetisch effect dat de enzymen op elkaar hebben. De enzymen bezitten veelal een groeve op hun oppervlak. In deze groeve zitten waterstofbindingen en aromatische aminozuren, deze aminozuren fungeren als hydrofobe platformen. Op deze manier kunnen de suikers gebonden worden op het oppervlak. Dit zijn dus de suikerbindingsites. Andere enzymen vormen een tunnel zodat het substraat volledig omgeven is door enzym. (Banerjee, Scott- Craig, and Walton 2010) Lignine-afbraak Figuur 10 Cellulose met bijhorende enzymen (van Zyl et al. 2011) Er wordt algemeen aangenomen dat de afbraak van lignine nodig is om toegang te verschaffen aan de enzymen om hemicellulose en cellulose af te breken. Sommige microorganismen verwijderen eerst het lignine en kunnen moeilijk cellulose afbreken (white rot fungi) andere kunnen geen lignine afbreken (brown rot fungi) en nog andere breken zowel cellulose als hemicellulose af (soft rot fungi). De afbraak van lignine is energetisch niet de meest rendabele pathway, en tijdens de evolutie zijn er dus veel pathways ontstaan die enkel 17

24 cellulose en hemicellulose aanvallen. De degradatie van lignine is een oxidatief proces waarbij fenyloxidasen de belangrijkste enzymen zijn. Het ligninepolymeer wordt afgebroken tot aromatische radicalen. Deze radicalen vallen dan uiteen in verschillende producten. De simpelere producten kunnen dan opgenomen in het katabolisme van de schimmels (Sanchez 2009) Hemicellulose-afbraak Voor de hydrolyse van de verschillende soorten hemicellulose in de natuur (zie Figuur 5 en 6) zijn er veel verschillende enzymen nodig (Figuur 11). Het hemicellulose wordt uiteindelijk gesplitst in suikermonomeren en zuren. Als voorbeeld hiervan wordt in figuur 11 de structuur en hydrolyse van arabinoglucuronoxylaan voorgesteld. Het aantal betrokken enzymen en hun CAZy classicificatie staat vermeld tussen haakjes (Sanchez 2009). Bij dit substraat zijn er veel zijgroepen die allemaal verwijderd moeten worden zodat de xylanasen en xylosidasen hun werk kunnen doen. Het gaat hier over feruloylesterasen (CE1) waarbij ferulazuur vrijkomt, een acetylxylaanesterase (CE1) waarbij azijnzuur vrijkomt, verschillende α-larabinofuranosidasen (GH43, 51 en 53) en een α-glucuronidase (GH 67). Als alle zijgroepen verwijderd zijn, kunnen de endoxylanasen (GH10 en 11) de hoofdketen op willekeurige plaatsen splitsten. De β-xylosidasen (GH 3 en 43) kunnen dan aparte xylose monomeren afsplitsen. Figuur 11 Arabinoglucuronoxylaan en enzymen die nodig zijn voor de afbraak ervan (Sun et al. 2012) Bij de hemicellulasen werden drie verschillende soorten van synergie geïdentificeerd nl. homeosynergie, waarbij synergie optreedt bij twee enzymen die de hoofdketting van het hemicellulase breken. Heterosynergie waarbij er samenwerking is tussen een enzym dat de 18

25 zijgroepen verwijderd en een enzym dat de hoofdketting splitst. Anti-synergie treedt op wanneer het ene enzym een negatief effect heeft op een ander. Een hypothese over heterosynergie bij hemicellulasen is dat de enzymen die op de hoofdketting inwerken een verbeterde activiteit zullen vertonen als de zijgroepen eerst verwijderd worden. De reden hiervoor is dat deze zorgen voor sterische hinder voor het eerste enzym. Deze hulp enzymen worden aanzien als een soort voorbehandeling. De synergie wordt dan als sequentieel beschouwd. Dit werkt echter niet in alle gevallen en is erg afhankelijk van de specificiteit van de enzymen. Onderzoek naar het al dan niet sequentieel zijn van de synergie kan heel belangrijk zijn in het verstaan van de karakteristieken van enzymen en de mechanismen van samenwerking (Van Dyk and Pletschke 2012). 4.3 Optimaliseren van enzymatische hydrolyse Om maximale saccharificatie te bekomen zijn er veel verschillende factoren van belang. Het gaat hierbij over ph, substraat/volume, temperatuur en ook de verhouding van de verschillende enzymen ten opzicht van elkaar is van groot belang. Deze factoren hangen sterk af van de gebruikte voorbehandelingsmethode en het type substraat. Er moet een goede verhouding zijn tussen cellulasen en hemicellulasen. Om een goed ratio te bekomen van cellulasen/hemicellulasen moet de verhouding cellulose/hemicellulose, en de samenstelling van het hemicellullose gekend zijn (Chandel et al. 2012). Als alle factoren goed zitten, zal dit een betere suikeropbrengst teweegbrengen. Bij te hoge substraatconcentraties zal er echter substraatinhibitie optreden. Algemeen heeft men gevonden dat de ideale substraatconcentratie 5% is. In deze thesis zullen de experimenten worden uitgevoerd met 2% substraat omdat het de bedoeling is om de effecten van supplementaties te evalueren en niet om een maximale saccharificatie te verkrijgen. De enzymen die instaan voor de afbraak van hemicellulose zijn vaak in te lage concentraties aanwezig in commerciële cocktails om efficiënte afbraak te verkrijgen. De verschillende enzymmengsels supplementeren, kan helpen met de degradatie van lignocellulose. De verschillende enzymen kunnen elkaar dan versterken in de afbraak hiervan. Er zijn veel verschillende benaderingen om de hydrolyse te verbeteren (Hu, Arantes, and Saddler 2011b; Hu, Arantes, and Saddler 2011a) Carbohydraat bindende modules Cellulasen zijn veelal modulaire enzymen, opgebouwd uit een katalytische module en een carboyhydraat bindende module (CBM). Het CBM is verantwoordelijk voor de binding van het enzym op het substraat en verhoogt de werking op kristallijne substraten terwijl de activiteit op amorfe en oplosbare substraten niet verandert. Een CBM kan gezien worden als intramoleculaire synergie (Van Dyk and Pletschke 2012). De CBM s kunnen in verschillende families van modules geplaatst worden op basis van hun sequenties en secundaire opvouwing. 19

26 Er zijn ook verschillende types CBM s. Type A bindt het enzym op de onoplosbare, kristallijne substraten, terwijl type B de enzymen op de oplosbare substraten zal binden. Type C zorgt voor een binding op kleinere suikers (Levasseur et al. 2013). Het CBM is gescheiden van de katalytische module door een linker peptide. Bij enzymen afkomstig van schimmels draagt deze linker verschillende O-glycanen, zoals te zien is op figuur 12. Deze linker is partieel flexibel en helpt bij de beweging van de twee modules op het cellulose oppervlak (Viikari, Vehmaanpera, and Koivula 2012). De snelheid waarmee de modulaire cellobiohydrolasen over het substraat glijden is ongeveer 3.5 nm/s. Dit komt overeen met 3 hydrolytische splitsingen per seconde. Als men dit nu vergelijkt met enzymen waarbij het CBM verwijderd is, bekomt men ongeveer dezelfde snelheid. Hieruit wordt geconcludeerd dat het CBM enkel zorgt voor een betere binding met het substraat en verder geen katalytische werking heeft (Viikari, Vehmaanpera, and Koivula 2012). Figuur 12 Cartoonweergave van Cel7A werkzaam op cellulose. De gele delen zijn de O-glycosidische bindingen van de linker. Groen is de cellulose en de blauwe deeltjes de N-glycosilatie (Bechham 2015) Substraatverandering De snelheid waarmee enzymen cellulose omzetten tot vrije suikers is heel sterk afhankelijk van de morfologie van het substraat. Deze morfologie wordt echter door de enzymen zelf veranderd, en dit niet altijd in hun eigen voordeel. Naargelang de enzymatische afbraak vordert, daalt de snelheid ervan. Verandering van de substraatmorfologie kan hier voor een verklaring zijn. In het begin van de enzymatische hydrolyse gaan de enzymen vooral binden op de amorfe regio s. Hierdoor verminderen de amorfe regio s van de cellulose. De adsorptie stijgt echter, dit komt doordat er door de afbraak van de bovenste lagen, onderliggende lagen vrijkomen. Hierdoor groeit het beschikbare oppervlak aan. De activiteit van de enzymen daalt 20

27 echter. Hier zijn niet-productieve bindingen op de cellulose de grootste boosdoener. De meest plausibele verklaring voor de irreversibele adsorptie van enzymen, samen met de verminderde mobiliteit ervan, is dat de cellulasen steeds meer gevangen zitten op plaatsen aan het oppervlak waar ze minder actief zijn. De cellulasen kunnen een keten ook niet meer lossen als ze niet meer in staat zijn om deze verder af te breken. Dit komt doordat het omliggende cellulosemateriaal als een fysische barrière werkt. Een efficiënte manier om deze cellulasen vrij te stellen is door het omliggende materiaal af te breken door complementaire enzymactiviteiten. Synergie is dus heel belangrijk (Eibinger et al. 2014) Eindproductinhibitie Een andere soort inhibitie is eindproductinhibitie. Dit komt bijvoorbeeld voor bij β- glucosidasen. Deze splitsen het cellobiose tot glucose. Als er echter te veel glucose aanwezig is in de oplossing, zal dit binden met het enzym. Hierdoor is het enzym niet meer in staat om cellobiose te splitsen. Bij verdere onderzoeken is gebleken dat enkel het glucose zorgt voor de inhibitie van de β-glucosidasen. Dit werd bewezen door tijdens de hydrolyse hoeveelheden mannose, xylose en andere suikers toe te voegen. De activiteit van de glucosidasen verminderde niet (Chandel et al. 2012). Eindproduct-inhibitie heeft samen met de thermische inactivatie en irreversibele adsorptie van de enzymen een rechtstreeks effect op het enzymatische hydrolyseproces. Er zijn verschillende methoden om deze inhibitie te reduceren, zoals hoge concentraties enzymen gebruiken, toevoegen van extra β-glucosidasen tijdens de hydrolyse en het verwijderen van de gevormde suikers door ultrafiltratie. De makkelijkste manier om eindproductinhibitie te overwinnen is SSF. Economisch gezien is dit de meest rendabele optie omdat verschillende aparte stappen samen kunnen gebeuren in één enkel vat (Chandel et al. 2012). Een nadeel van deze techniek is dat de condities goed moeten zijn voor de micro-organismen die instaan voor de saccharificatie en fermentatie. Deze condities zijn niet optimaal voor de enzymen, hierdoor is een hogere enzymlading nodig om dezelfde hydrolyse te verkrijgen en dit drijft de kosten op (Van Dyk and Pletschke 2012) Aanwezigheid van lignine De inhibitie door lignine wordt aan twee verschillende mechanismen toegewijd. Het enzym kan niet-specifiek gebonden worden op het lignine of het lignine kan als fysische wand werken waardoor de enzymen niet meer aan het cellulose oppervlak geraken. Na onderzoek werd duidelijk dat de inhibitie het meest veroorzaakt wordt door het blokkeren van de enzymen door afgezette lignine druppeltjes. 21

28 Men weet dat cellulasen de cellulose laag per laag hydrolyseren. Ze starten op het oppervlak en glijden zo verder in één richting, als één groot enzym langs de celluloseketens. Als er een ligninedruppel op het oppervlak terechtkomt, stopt dit niet alleen de beweging van de enzymen, het vermindert ook de toegankelijkheid tot de dieper gelegen lagen. Het feit dat de hydrolyse na verloop van tijd weer op gang komt, kan verklaard worden op twee verschillende wijzen. De eerste is dat er een soort van blokkage op het oppervlak komt. Dit resulteert dan in een vertraging of ophouden van de enzymen. Na verloop van tijd staan er zoveel enzymen tegen dit druppeltje te duwen dat dit weer verwijderd wordt en de hydrolyse opnieuw op gang kan komen. Dit wordt geïllustreerd in figuur 13. In een andere theorie worden de ligninedruppels afgepeld door kleine, aangrenzende fibrillen die losgemaakt worden door enzymatische hydrolyse. De hydrofobiciteit van deze fibrillen wordt veranderd door de hydrolyse waardoor ze in staat zijn de ligninedruppeltjes van het cellulose oppervlak te verwijderen. Welke van deze twee mechanismen effectief voorkomt, is moeilijk te bepalen. Experimenten leunen aan bij de eerste theorie, maar hierover is nog geen sluitend bewijs. Wat wel duidelijk is, is dat inhibitie veel meer effect heeft op lagere enzymconcentraties (Li et al. 2014) Synergie Figuur 13: Voorstelling van lignine-inhibtie. De grijze bollen zijn cellulasen, de oranje rechthoeken is lignine, de zwarte strepen zijn cellulose (Li et al. 2014). Er wordt gesproken van synergie als de opbrengst van twee verschillende factoren samen hoger is dan de som van deze twee factoren apart. De graad van synergie is dan het quotiënt van de opbrengst van de factoren samen, gedeeld door de som van de factoren apart. Bij de enzymatische conversie wordt dit sterk beïnvloed door de concentratie van de enzymen. Het is bijvoorbeeld mogelijk dat de twee enzymen op dezelfde bindingsplaats willen binden, en zo met elkaar in competitie treden. Daarom gaat men meestal uit van een gemiddelde enzymconcentratie. Dit komt neer op mg proteïnen/l of 5.5 µm (Van Dyk and Pletschke 2012). In deze thesis wordt een lading gebruikt van 500 µg/ml, wat overeenkomt met 500 mg/l. Synergie verschilt ook van substraat tot substraat, temperatuur en ph waarbij de onderzoeken uitgevoerd zijn (Van Dyk and Pletschke 2012). Een nadeel van onderzoeken naar synergie is dat het maximale synergieniveau niet altijd overeenkomt met de maximale hydrolyse van het substraat. Er moet nog meer onderzoek gedaan worden naar de correlatie tussen synergie en maximale hydrolyse. Onderzoeken naar synergie kunnen gebaseerd zijn op 22

29 productformatie, substraatverandering of reactiesnelheid. Deze kunnen uitgevoerd worden met zowel zuivere enzymen als met enzymmengsels. Zuivere enzymen Er zijn verschillende manieren om onderzoek te doen naar synergie van enzymen. Bij één ervan wordt gewerkt met pure enzymen. Het grootste nadeel van deze techniek is dat er maar heel weinig enzymen verkrijgbaar zijn in zuivere vorm, daarenboven zijn degene die wel verkrijgbaar zijn niet voldoende gekarakteriseerd met betrekking tot de activiteit op complexe substraten en inhibitorreacties. Men vertrekt hierbij van een klein aantal kernenzymen (Banerjee et al. 2010). Deze zijn meestal twee cellobiohydrolasen, een endoglucanase, een β- glucosidase, een endo-β-1,4-xylanase en een β-xylosidase. Via een bepaald stappenplan wordt dan gezocht naar extra enzymen om een betere hydrolyse te verkrijgen van afzonderlijke substraten. De eerste stap is een onderzoek naar de samenstelling van het substraat. Op basis hiervan kan men bepaalde enzymen toevoegen. De op maat gemaakte mengsels worden dan geëvalueerd naar monomeeropbrengst en indien nodig worden de verhoudingen van enzymen nog gewijzigd. Op deze manier kan voor ieder substraat een ideaal enzymmengsel verkregen worden (Banerjee et al. 2010; Van Dyk and Pletschke 2012). Mengsels Een andere manier om betere hydrolyse van lignocellulose biomassa te verkrijgen, is het supplementeren van verschillende enzymmengsels met elkaar. Dit kan gebeuren door gebruik te maken van commercieel verkrijgbare mengsels of met zelfgemaakte enzymmengsels. Deze zelfgemaakte enzymmengsels zijn de uitscheidingen van de verschillende organismen. Deze mengsels worden ook de secretomen genoemd. De verschillende secretomen worden apart onderzocht en geëvalueerd naar hoeveelheid reducerende suikers die vrijgesteld worden. Om de effectieve verbetering van de gesupplementeerde enzymmengsels te kunnen onderzoeken, moet gewerkt worden met een even grote hoeveelheid proteïnen als de aparte secretomen (Couturier et al. 2012; Van Dyk and Pletschke 2012). In deze thesis zal op deze manier met de secretomen van Trichoderma reesei QM6a en RUT-C30 gewerkt worden. 23

30 5 Fermentatie De mogelijkheid om ethanol te produceren van cellulose hydrolysaten hangt af van een paar cruciale factoren zoals de hoeveelheid suiker en de incubatiecondities. De meeste productie van ethanol komt voort uit de micro-organismen die hexosen fermenteren. Deze fermentatie kan uitgevoerd worden door een breed spectrum aan stammen. In theorie kunnen ook organismen gebruikt worden die pentosen fermenteren, maar de ethanoltolerantie van deze organismen is meestal heel laag, en er is ook veel meer incubatietijd nodig om succesvolle fermentatie te verkrijgen. De natuurlijke stammen van S. cervisiae kunnen geen pentose suikers fermenteren, hierdoor is deze onbruikbaar in bioraffinaderijen. Hiervoor werden deze stammen genetisch gemodificeerd zodat ze in staat zijn om zowel pentosen als hexosen te fermenteren die aanwezig zijn in lignocellulose hydrolysaten. Deze stammen worden ook gebruikt omdat ze nog belangrijke kenmerken hebben zoals hoge ethanol opbrengsten in aanwezigheid van fermentatie-inhibitoren zoals furfuralen, fenolen en zwakke zuren. De gemodificeerde micro-organismen kunnen de kost van de ethanolproductie zeer sterk verlagen (Chandel et al. 2012). 6 Trichoderma reesei Figuur 14 Fermentatie (van Zyl et al. 2011) T. reesei is een saprofiet omdat het een deel van de genen die instaan voor de afbraak van materiaal dat zich in levende planten bevindt, zoals pectine niet bezit. Het bezit ook geen feruoylesterasen. Hierdoor is de schimmel niet in staat om hemicellulose volledig af te breken. In tegenstelling tot wat er zou kunnen verwacht worden heeft de T. reesei slechts een zeer beperkt aantal genen voor glycosidehydrolasen en ook veel minder enzymen met een carbohydraat bindende module. De genen die instaan voor de verschillende enzymen zijn geclusterd. Dit geeft een evolutionair voordeel, omdat op deze manier de genexpressie efficiënter kan geregeld worden. T. reesei is een secundaire kolonisator. Andere bacteriën en schimmels breken eerst het hemicellulose af, hierna slaat T. reesei zijn slag met sterke expressie van cellulasen. Sommige stammen produceren tot 100g extracellulair proteïne per liter. Andere schimmels kunnen niet volgen (Martinez et al. 2008). 24

31 6.1 Enzymcocktail Omdat Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) in staat is om een grote hoeveelheid eiwit uit te scheiden, wordt deze filamenteuze schimmel industrieel veel gebruikt om cellulasen te produceren (Sanchez 2009). De enzymcocktail van de T. reesei CL847 bestaat voor 90% uit twee cellobiohydrolasen en twee endoglucanasen, terwijl de β-glucosidasen minder dan 1% van de cocktail uitmaken (Dutta et al. 2012). Hieronder staan de belangrijkste glycosidehydrolasen opgesomd die betrokken zijn bij de afbraak van lignocellulose biomassa en uitgescheiden worden door T. reesei CL847 (Couturier et al. 2012). Tabel 4 Verschillende glycosidehydrolasen uitgescheiden door T. reesei CL847 (Couturier et al. 2012). β-xylosidase GH3 Exoxylobiose hydrolyse xylosidase I GH3 Exoxylobiose, xylaan en cellulose hydrolyse Vrijstellen van glucose eenheden van niet-reducerende uiteinden β-glucosidase GH3 van verschillende substraten Random hydrolyse van 1,6-β-D- glucosidische bindingen in 1,6- endo-glucanase II GH5 β-d-glucanen Endohydrolyse van 1,4 α-d-glycosidische bindingen in mannanase I GH5 polysacchariden met drie of meer glucose eenheden Cellobiohydrolase II Vrijstellen van cellobiose bij de niet-reducerende uiteinden van CBH 2 GH6 cellulose cellobiohydrolase I Vrijstellen van cellobiose bij de reducerende uiteinden van CBH 1 GH7 cellulose endo-glucanase I GH7 Endohydrolyse van 1,4-β-D-glycosidische bindingen in cellulose xylanase III GH10 Endohydrolyse van 1,4-β-D-glycosidische bindingen in xylaan xylanase II GH11 Endohydrolyse van 1,4-β-D-glycosidische bindingen in xylaan endo-glucanase III GH12 Endohydrolyse van 1,4-β-D-glycosidische bindingen in cellulose Hydrolyse van eindstandige, niet-reducerende α-d galactose α-galactosidase GH27 residuen Hydrolyse van 1,4-α-D-galactosiduronische verbindingen in polygalacturonase GH28 pectaat Endohydrolyse van 1,6-β-D-galactosidische bindingen in arabinogalactaan proteïnen. Stellen 1,6-β-galactobiose en endo-galactanase GH30 galactose vrij Hydrolyse van eindstandige 1,2-gelinkte α-d mannose residuen α-1,2 mannosidase GH47 in oligo-mannose Hydrolyse van eindstandige niet-reducerende α-larabinofuranoside arabinofuranosidase residuen in α-l-arabinosiden GH54 25

32 β-1,3 glucanase arabinofuranosidase endo-glucanase VI xyloglucanase Hydrolyse van β-d-glucose eenheden van de niet reducerenden GH55 uiteinden van 1,3-β-D glucaan, met vrijstelling van α-glucose Hydrolyse van eindstandige niet reducerende α-larabinofuranoside residuen in hemicellulose GH62 GH74 Endohydrolyse van 1,4-β-D-glycosidische bindingen in cellulose GH74 Hydrolyseren van xyloglucaan naar xyloglucaanoligosacchariden 6.2 Evolutie Trichoderma reesei werd voor het eerst geïsoleerd op de Solomon-eilanden tijdens de Tweede Wereldoorlog. De originele stam is de QM6a stam (Peterson and Nevalainen 2012; Seidl et al. 2008). Het was snel duidelijk dat deze schimmel veel cellulasen kan produceren. Deze eigenschap werd een voordeel in plaats van een nadeel toen de vraag naar alternatieve brandstoffen bleef groeien. De QM6a stam werd onderworpen aan directe evolutie met als doel de wilde stam te modificeren tot een stam die meer nog enzymen produceert. In Rutgers University in Amerika werd via een efficiënte screening, UV radiatie en chemische mutagenese een hypercellulolytische stam RUT-C30 bekomen. Deze stam produceert ongeveer 20 mg proteïnen per ml, wat ongeveer 20 keer zoveel is als QM6a. RUT-C30 is dan ook katabolisch gederepresseerd (Peterson and Nevalainen 2012). De stam is echter niet alleen op het vlak van enzymproductie veranderd, maar ook op fysiologisch vlak. Het endoplasmatisch reticulum is tot zeven keer, en de myceliale proteïne-inhoud is vijf keer groter dan in QM6a. Er is ook een kleurverschil merkbaar tussen de oorspronkelijke en de gemodificeerde stam (Peterson and Nevalainen 2012). Daarnaast zijn er ook veranderingen merkbaar in de sporenvorming tussen de verschillende stammen (Seidl et al. 2008). Het grootste en belangrijkste verschil tussen QM6a en RUT-C30 is natuurlijk het verschil in enzymproductie. RUT-C30 produceert qua hoeveelheid veel meer enzymen en heeft hierdoor een veel hogere enzymatische activiteit op bepaalde substraten. Op lactose bestaat het enzymmengsel geproduceerd door RUT-C30 slechts voornamelijk uit één enzym, namelijk CBH1. De minder gemodificeerde stammen scheiden een grotere heterogeniteit qua enzymen uit. (Peterson and Nevalainen 2012). Figuur 15 Evolutiepatroon (UV= ultra violet NTG=nitrosoguanidine LA= lineair acceleration) (Seidl et al. 2008) Een belangrijk verschil tussen de oorspronkelijke stam en RUT-C30 is dat deze laatste een verkorte sequentie heeft in het cre1 gen (Peterson and Nevalainen 2012). Dit gen produceert 26

33 het cre1 proteïne dat ervoor zorgt dat de enzymproductie onderdrukt wordt in de aanwezigheid van glucose. De RUT-C30 stam is dus katabolisch gederepresseerd en produceert dus enzymen terwijl er glucose aanwezig is. Nog een verschil is dat er een frameshift-mutatie is in het gen dat codeert voor de glycosylatie van het glucosidase II. RUT- C30 mist ook nog andere genfragmenten, die wel aanwezig zijn in de wild-type stam. De genen die verdwenen zijn, hebben vooral te maken met het primair metabolisme, zoals dehydrogenasen, transport eiwitten en proteïnen die te maken hebben met het ontgiften van de cel (Peterson and Nevalainen 2012; Seidl et al. 2008). 27

34 Materiaal en Methoden 1 Materiaal 1.1 Toestellen Laminaire flow: SCANLAF Master Safety Class 2 QBD2 Digital Dry Block Heating System Gelelektroforese systeem (Bio-Rad) Thoma telkamer Microscoop Nikon YS100 Megafuge 1.0R Heraeus Amicon stirred cell Centricon Merck Millipore DEAE-Sepharosekolom Econo System 1.2 Producten Potato Dextrose Agar voedingsbodem o 39.5 g PDA in 1 liter AD o Autoclaveren Ammoniumpersulfaat (w/v 10%) o 10g/100 ml ammoniumpersulfaat Scheidingsgel (12%) o 2 ml 30% v/v AA:Bis (37.5:1) Acrylamide/Bis-Acrylamide o 1.75 ml MiQ o Scheidingsbuffer 1.5 M Tris-HCl ph ml o 25 µl 10% APS o 10 µl TEMED (Tetramethylethyleendiamine) Stapelgel (4%) o ml 30% v/v AA:Bis (37.5:1) 28

35 o 1.5 ml MiQ o ml Stapelbuffer 0.5 M Tris-HCl ph 6.8 o 25 µl APS o 10µl TEMED (Tetremethylethyleendiamine) Reducing SDS staal buffer o 25 µl β-mercaptoethanol o 475 Laemmli staalbuffer Loopbuffer o M Tris; 6g o M Glycine; 28.8 g o 0.1 % (w/v) SDS; 2g o Aanlengen tot 2 l en op ph 8.3 brengen Kleuringsoplossing o Coomassie Briljant Blue R250; 1 g o Methanol; 500 ml o Azijnzuur; 100 ml o MiQ; 400 ml Ontkleuringsoplossing o Methanol; 300 ml o Azijnzuur; 100 ml o MiQ; 600 ml Fysiologische oplossing o 9 g/l NaCl o Cryoprotectans: 20% v/v glycerol; 0.025% v/v Tween 20 Minimaal medium o Precultuur Stock (g/l) Volume (50 ml totaal) Finale concentratie (g/l) glucose ml 20 (NH 4 ) 2 SO ml 5 CaCl 2. 2H 2 O 8 5 ml 0,8 MgSO 4.7H 2 O 12 5 ml 1,2 29

36 KH 2 PO ml 15 MnSO 4.H 2 O 0, µl 16,8*10-4 FeSO 4.7H 2 O µl 5*10-3 CoCl 2.6H 2 O 0, µl 36,65*10-4 ZnSO 4.7H 2 O 0, µl 26,71*10-4 Aqua Destillata / 4 ml / o Inductiecultuur Stock (g/l) Volume (300 ml totaal) Finale concentratie (g/l) Miscanthus Vast / 0,50% (NH 4 )2SO ml 5 CaCl 2.2H 2 O 8 5 ml 0,6 MgSO 4.7H 2 O 12 5 ml 1,2 KH 2 PO ml 15 MnSO 4.H 2 O 0, µl 16,8*10-4 FeSO 4. 7H 2 O µl 50*10-4 CoCl 2.6H 2 O 0, µl 36,65*10-4 ZnSO 4.7H 2 O 0, µl 26,71*10-4 AD / 174 ml / Hoogmolaire scheidingsbuffer o g NH 4 Ac in 500 ml AD = A o 8.58 ml HAc in 500 ml AD = B o ml A mengen met ml B Laagmolaire scheidingsbuffer o A en B 60x verdunnen o ml A mengen met ml B Glucose-Oxidase-Peroxidase reagens o U Glucose Oxidase GOD o U Peroxidase POD o 50 mg 2,2 -azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonzuur) ABTS o Aanlengen tot 100 ml met NaOAc/HAc buffer ph

37 4% Substraat o 1.6 g NH 3 -voorbehandelde Miscanthus in 40 ml 0.1 M NaOAc/HAc buffer ph 5.0 (Miscanthus werd verkregen via het ILVO) 2 Methoden 2.1 Enzymproductie Opgroeien Trichoderma reesei Doel De eerste stap van het onderzoek is het opgroeien van de schimmelstammen (QM6a en RUT- C30) die de enzymmengsels produceren. Deze worden verkregen als gelyofiliseerde sporen van VTT in Finland. Principe De gelyofiliseerde sporen worden opgegroeid op pertiplaten met Potato Dextrose Agar. De sporen worden geoogst met behulp van fysiologisch water. Er wordt hiervan 1 ml op een gesporuleerde plaat gebracht en verspreid gestreken met een Drigalski spatel. De fysiologische oplossing verrijkt met sporen wordt dan overgebracht naar de volgende plaat, tot een voldoende geconcentreerde sporenoplossing wordt bereikt. Werkwijze 39.5 g PDA-agar/l AD Autoclaveren 25 ml agar gieten per petriplaat Streepentingen uitvoeren Platen incuberen o Deel bij 21 C in het licht o Deel bij 37 C in het donker Sporen oogsten met behulp van fysiologisch water o Deel invriezen bij -80 C o Deel om mee verder te werken Tellen van het aantal sporen per ml met behulp van Telkamer van Thoma 31

38 Precultuur Principe In de precultuur van minimaal medium worden er 2.5*10 8 sporen geënt in 50 ml. Deze worden 5 dagen geïncubeerd bij 28 C en 100 rpm. In totaal worden er 12 preculturen ingezet, 4 Rut-C30 culturen en 8 QM6a. Inductiecultuur Principe Na 5 dagen tot een week incubatie van de precultuur wordt deze overgebracht in een inductiecultuur met hierin 300 ml medium. De enige koolstofbron hierin is Miscanthus. De schimmels zullen nu enzymen moeten produceren om de noodzakelijke koolstof te kunnen opnemen. Deze incubatie gebeurt bij 28 C en 100 rpm. Voor de RUT-C30 stam wordt één precultuur aan één inductiecultuur toegevoegd, terwijl voor de QM6a stam worden twee preculturen aan één inductiecultuur toegevoegd. Dit wordt gedaan omdat de QM6a een veel kleinere hoeveelheid enzym produceert in vergelijking met de RUT-C30 stam. Om toch aan een voldoende hoge concentratie QM6a secretoom te geraken worden er dus twee preculturen aan één inductiecultuur toegevoegd. In totaal worden dus 8 inductieculturen ingezet Opzuivering enzymen Doel Na de pre- en inductiecultuur wordt een mengsel bekomen van verschillende bestanddelen. Dit bestaat uit gesecreteerd enzym, partieel gemetaboliseerde biomassa en de schimmel. Hieruit moet een zo zuiver mogelijk enzymmengsel bekomen worden. Principe Deze opzuivering bestaat uit veel verschillende stappen. Het is de bedoeling de grootste en meest aanwezige onzuiverheden eerst te verwijderen en zo verder te werken tot een zo zuiver mogelijk mengsel bekomen wordt. De eerste stap is dus een centrifugatie, gevolgd door verschillende filtraties om de concentratie op te drijven. In de laatste stap wordt het mengsel steriel gemaakt en ontzout. Alle gebruikte filters zijn Polyethersulfonmembranen (PES). Als cellulosefilters zouden gebruikt worden, zouden de cellulasen zich vastzetten en de filter aantasten. Hierdoor zou de filtratie niet effectief verlopen. De filters hebben een bepaalde cut-off waarde. Alle bestandelen met een lager moleculair gewicht dan deze waarde zullen door de filter kunnen lopen, terwijl grotere worden tegengehouden. Op deze manier kan het mengsel opgeconcentreerd worden aan 32

39 hoogmoleculaire stoffen. De stalen worden in de laatste stap ontzout door middel van een Econo-Pack 10DG kolom. De kolom is gevuld met Bio-Gel P-6D. Deze poly-acrylamide gel heeft een hoge recuperatie, zonder dat er biologisch actief materiaal uit de kolom lekt. De gebruikte 10DG kolom heeft een MWCO van 6000 Da. De componenten groter dan 6000 Da zullen dus door de kolom elueren, en de kleinere worden tegengehouden ("Econo-Pac 10DG Columns Instruction Manual"). Werkwijze Centrifugatie: 10 minuten bij 4000 rpm en 10 C Filtratie: Amicon Stirred Cell o PES-filter met moleculaire cut-off van Dalton Filtratie: Centricon in centrifuge bij 4000 rpm en 10 C Staal dialyseren met NaOAc/HAc buffer ph 5.0 Steriliseren: PES-filter met 0.2 µm poriëngrootte Ontzouten met Econo-Pack 10DG kolom 2.2 Karakteristieken van de enzymmengsels Proteïneconcentratiebepaling Doel Om de hoeveelheid eiwit te bepalen in een mengsel wordt gebruikt gemaakt van de DC Biorad Protein Assay. Deze methode is gebaseerd op de Lowry-assay, maar werd verbeterd om tijd te besparen. De assay is gebaseerd op interactie tussen het proteïne met koper en het Folin reagens. Deze methode is veel gevoeliger dan bv. een ultraviolet absorbantiespectrum te nemen bij 280 nm. De reactie wordt opgesplitst in twee stappen. De reactie van het koper met de alkali De reductie van Folin reagens door het koper gebonden eiwit (Lowry et al. 1951) Principe Het signaal dat verkregen wordt is lineair met de concentratie eiwit tussen 0.2 en 2.0 mg/ml. Er wordt een ijklijn gemaakt met Bovine Serum Albumine en het onbekend eiwit wordt in verschillende concentraties onderzocht. Van de verschillende concentraties zal er meestal wel één in het ijklijn gebied liggen. Door terug te rekenen met de overeenstemmende verdunning kan de concentratie van het oorspronkelijk mengsel berekend worden. 33

40 Werkwijze Maak een verdunningsreeks BSA tussen 0 en 2 mg/ml 5 µl staal op microtiterplaat Voeg 25 µl DC Bio Rad Protein Assay reagens A toe Voeg 200 µl DC Bio Rad Protein Assay reagens B toe Neem na 15 minuten absorbantie op bij 655 nm Doel SDS-PAGE Bij Soduim Dodecyl Sulfaat Poly-Acrylamide GelElektroforese worden proteïnen gescheiden, enkel en alleen op basis van hun grootte. Op figuur 16 is te zien wat de impact is van het SDS op het proteïne. Het SDS heeft een denaturerend effect en zorgt ervoor dat de functionele groepen van de eiwitten geen invloed meer hebben. Enkel de grootte zal nog een rol spelen omdat het SDS aan iedere eiwitketen een even grote negatieve lading geeft. Principe De gel zelf is samengesteld uit acrylamide en bisacryalamide dat polymeriseert onder katalyse van TEMED. De poriën in de gel zijn allemaal van uniforme grootte. De verhouding acrylamide/bisacrylamide zal de grootte van de poriën bepalen, en zo ook de range van eiwitten die gescheiden kunnen worden. In één laantje wordt een ladder geladen waarvan voor alle proteïnen geweten is hoe groot ze zijn. Op deze manier kan men dan van onbekende proteïnemengsels schatten hoe groot de eiwitten zijn die er in zitten. Figuur 16 Invloed van SDS (Roy and Kumar 2014) Figuur 17 SDS-PAGE opstelling ("SDS-PAGE opstelling") Zoals op figuur 17 te zien is zal een elektrische spanning over de gel aangelegd worden. Hierdoor zullen de negatief geladen eiwitten migreren naar de positieve anode onderaan de gel. 34

41 Werkwijze De gel bestaat uit twee verschillende delen, een stapelgel en een scheidingsgel. Het gieten van de gel gaat als volgt: Scheidingsgel tussen de platen pipetteren tot ongeveer 1 cm onder de rand Om een mooie rechte scheiding te hebben en het O 2 te verwijderen, opvullen tot boven met isopropanol Scheidingsgel laten polymeriseren en isopropanol terug afgieten Rest terug opvullen met stapelgel en kammetje er in zetten Wachten tot stapelgel gepolymeriseerd is en kammetje terug verwijderen De effectieve scheiding verloopt op volgende manier: Eiwitstaal verdunnen naar 1 mg/ml 10 µl staal mengen met 10 µl Reducing SDS staalbuffer o Het β-mercaptoethanol breekt de disulfidebindingen 2 minuten op 100 C zetten om de eiwitten volledig te denatureren 10 µl op de gel brengen 180 Volt aanleggen Laten lopen totdat blauwe kleurfronten bijna van het gel lopen Gel kwartier laten kleuren met kleuringsoplossing Gel terug laten ontkleuren met ontkleuringsoplossing Gel drogen Doel Fractioneren van de enzymmengsels Het uitgescheiden enzymmengsel van QM6a zal met behulp van een DEAE- Sepharosekolom door anionuitwisseling gescheiden worden in verschillende fracties. Met behulp van deze fracties kunnen additieexperimenten uitgevoerd worden. Figuur 18 DEAE-Sepharose ("Schematic structure of DEAE-Sepharose") Principe Bij deze scheiding is de reactiegroep die het anion vasthoudt, diethylaminoethanol en de drager sepharose (Seperation Pharmacie Agarose). Figuur 18 is hiervan een voorstelling. Er worden negatieve ionen uitgewisseld, er is dus sprake van anionuitwisselingschromatografie. De gebonden proteïnen worden geëlueerd door de concentratie zout stelselmatig op te drijven 35

42 procent B van 5 mm tot 300 mm van de NaOAc/HAc buffer van ph 5.0. Dit wordt uitgevoerd met behulp van het Econo System van Biorad aan een pompsnelheid van 1 ml/min. Op figuur 19 is het tijdsverloop van het experiment gegeven en op figuur 20 wordt het experitment schematisch weergegeven. Tijdsverloop: tijd (min) Effect van de concentratie: Figuur 19 Verloop van de gradiënt bij de fractionatie van QM Eerste 25 minuten: alle ongebonden proteïnen lopen van de kolom Tussen 25 en 135 minuten: verschillende proteïnen die met verschillende sterktes gebonden zijn aan de kolom lopen er af Tussen 135 en 210 minuten: alle resterende proteïnen lopen ook van de kolom Tussen 210 en 212 minuten: de kolom wordt opnieuw gebruiksklaar gemaakt 36

43 Figuur 20 Schematische werkwijze voor de fractionering van eiwitmengsels (Ltd 2006) Werkwijze 5 ml onverdund enzymmengsel met concentratie 1.37 mg/ ml op de kolom brengen Tijdsprogramma starten UV-detector meet absorbanties in functie van de tijd Hieruit verschillende fracties beoordelen op aanwezigheid van proteïnen Verschillende fracties samenvoegen aan de hand van het elutieprofiel Opconcentreren met vivaspintubes tot goede concentratie of een klein volume 2.3 Enzymatische hydrolyse Chromogene modelsubstraten Doel De activiteit van de verschillende enzymmengels wordt bestudeerd aan de hand van verschillende chromogene modelsubsraten. Via deze chromogene substraten worden de belangrijkste glycosidehydrolase activiteiten gekwantificeerd. Celluloseafbraak wordt geschat door middel van de activiteit op: cnp-β-d-glucopyranoside, pglc cnp-β-d-lactobioside, clac De hemicelluloseactiviteit wordt bekeken door de vrijstelling van verschillende suikers die voorkomen in hemicellulose te kwantificeren: pnp-α-l-arabinofuranoside, para pnp-α-d-galactopyranoside, pgal cnp-β-d-xylopyranoside, cxyl 37

44 pnp-β-d-mannopyranoside, pman De esterase activiteit wordt bekeken aan de hand van pnp-acetaat. De eenheid waarin uiteindelijk gewerkt wordt is de specifieke activiteit (U/mg). Deze wordt gedefinieerd als de hoeveelheid cnp/pnp in µmol die ontstaat per mg enzym per minuut bij de gebruikte reactieomstandigheden, namelijk 37 C, ph 5.0, 100 µl 1 mmol/l substraat en 20 µl van een aangepaste enzymverdunning (Couturier et al. 2012). Principe Aan de hand van de verschillende substraten zullen de verschillende activiteiten bepaald worden. Dit wordt gedaan door het enzymmengsel te laten reageren met het substraat. De reactie wordt na een half uur stilgelegd door een ph verhoging. Aan de hand van een ijklijn kan de concentratie vrijgestelde chromogene groepen berekend worden. Werkwijze 100 µl van 1 mmol/l substraat per well in een microtiterplaat 20 µl aangepaste enzymverdunning toevoegen 30 minuten incuberen bij 37 C Reactie stopzetten door toevoegen van 130 µl 1 mol/l Na 2 CO 3 Absorbantie bij 415 nm opnemen Aan de hand van pnp/cnp-ijklijn terugrekenen Additietesten-experimenten Substraat Werkwijze Het substraat is NH 3 -voorbehandelde Miscanthus. Dit wordt bekomen door 5 g biomassa, in 400 ml 10% NH 3 in een Parr-reactor te laten reageren gedurende 3 uur bij 125 C. Dit werd uitgevoerd door ing. Jeroen De Mey, waarvoor dank. De ph na de laatste wasbeurt was 8.0 en had een gewicht van 154 g. Dit werd opnieuw gedroogd. Eens gedroogd werd het nog vermalen. Eens vermalen werd dit 3 keer gewassen met AD. Het gewassen substraat werd dan opnieuw gedroogd. Hierna werd 1.6g van het substraat gesuspendeerd in 40 ml 0.1M NaOAc/HAc buffer van ph 5.0 om uiteindelijk een concentratie van 4% te bekomen. 38

45 Experimenten Doel Om te antwoorden op de probleemstelling van deze thesis worden er verschillende additieexperimenten uitgevoerd, waarbij verschillende hoeveelheden RM en QM samengevoegd worden. Hierbij wordt uitgegaan van een steeds gelijke hoeveelheid enzym en gelijke hoeveelheid substraat. Op basis van de resultaten kan de verhouding waarvoor de hydrolyse het best is bekomen worden. In een vervolgexperiment zal de synergie van de verhouding, die de grootste verbetering geeft, bepaald worden. Principe Het gaat hierbij over 250 µg enzym en 2% NH 3 -voorbehandelde Miscanthus. Rut-C30 wordt beschouwd als hoofdenzymmengsel en zal gesupplementeerd worden met verschillende hoeveelheden QM6a. De totale hoeveelheid enzym is wel steeds gelijk. Anders zijn de mogelijke verbeteringen in enzymatische degradatie misschien niet te wijten aan de verschillende enzymen van QM6a, maar ook aan de grotere totale hoeveelheid enzym aanwezig in het reactiemengsel. De concentratie van substraat en enzymen moet ook steeds gelijk zijn. Daarom wordt het totale reactievolume aangelengd met buffer van geschikte ph om aan een concentratie van 2% substraat en 500 µg/ml enzym. De concentratie van RM is 9.96 mg/ml en van QM 1.37 mg/ml. Tabel 5 Verhoudingen additietesten (RM= secretoom van RUT-C30, QM=secretoom van QM6a) onverdund RM (µl) onverdund QM (µl) Buffer (µl) 10/0 RM/QM 25, ,9 9/1 RM/QM 22,6 18,3 209,1 8/2 RM/QM 20,1 36,6 193,4 7/3 RM/QM 17,6 54,8 177,6 6/4 RM/QM 15,1 73,1 161,8 5/5 RM/QM 12,6 91,4 146,1 2/8 RM/QM 5,0 146,2 98,78 0/10 RM/QM 0 182,7 67,25 De breuken in de eerste kolom stellen de verhoudingen voor waarin de mengsels worden toegevoegd. Op basis van de resultaten kan hieruit de beste ratio bekomen worden. Werkwijze 250 µl substraat per epje toevoegen Geschikte hoeveelheid RM toevoegen 39

46 Geschikte hoeveelheid QM toevoegen Buffer toevoegen om geschikte substraatverdunning te bekomen 72 uur incuberen bij 50 C en 1050 rpm 4 minuten koken om reactie stop te zetten Centrifugeren bij rcf Verdunning maken van bovenstaande vloeistof met AD Glucosemeting uitvoeren Principe synergie-experimenten Bij het bepalen van de synergie worden er drie verschillende reacties uitgevoerd, telkens in drievoud. In een eerste reactiemengsel worden beide enzymmengsels (RM en QM) in de vooraf bepaalde verhouding (gebaseerd op de resultaten van de additie-experimenten) samengevoegd. In het tweede reactiemengsel wordt enkel RM toegevoegd, in dezelfde hoeveelheid als aanwezig in het eerste reactiemengsel. In het derde reactiemengsel wordt enkel QM toegevoegd opnieuw evenveel als aanwezig in het eerste reactiemengsel. Hierdoor is de som van de enzymconcentraties in reactiemengsels 2 en 3 gelijk aan de enzymconcentratie in reactiemengsel 1. Tabel 6 Verschillende reactiemengsels bij synergie-experimenten Reactiemengsel RM QM Buffer Na 24h RM QM Buffer 1 40,2 µl 0 459,8 µl 0 73,2 µl 26,8 µl 2 40,2 µl 0 459,8 µl µl 3 73,2 µl 0 426,8 µl µl Door de vrijgestelde monosacchariden van reactiemengsels 2 en 3 op te tellen wordt de theoretische som bepaald van de twee enzymmengsels. Met deze waarde kan dan de synergie tussen de twee enzymmengsels bepaald worden. Dit wordt als volgt gedefinieerd: Er worden in totaal 7 stalen op verschillende tijdstippen (2h, 4h, 6h, 24h, 30h, 48h en 72h) genomen. Hierdoor kan de vrijstelling van monosacchariden in functie van de tijd gevolgd worden. De stalen worden gekookt om de reactie stil te leggen. Na 24h reactie wordt in reactiemengsel 1 de juiste hoeveelheid QM toegevoegd om de impact hiervan te bekijken. De concentratie substraat wordt op ieder moment in elk reactiemengsel gelijk gehouden. Daarom wordt na 24h een hoeveelheid QM samen met buffer toegevoegd aan reactiemengsel 1 om tot 100 µl extra te komen. Bij reactiemengsel 2 en 3 wordt enkel 100 µl buffer toegevoegd. 40

47 Werkwijze 500 µl substraat nemen Geschikte hoeveelheid RM of QM toevoegen Aanlengen tot 1000 µl met NaOAc/HAc buffer 0.1M ph 5.0 Stalen nemen na 2h, 4h, 6h en 24h: o Op en neer pipetteren om te homogeniseren o 100 µl homogeen staal nemen o Opkoken o Glucosemeting Na 24h: o R en Q: 100 µl NaOAc/HAc buffer 0.1M ph 5.0 toevoegen o T: 43.9 µl Q en 56.1µl NaOAc/HAc buffer 0.1M ph 5.0 toevoegen Stalen nemen na 30h, 48h, 72h Glucosemetingen Doel De verschillende addities worden vergeleken op basis van glucosevrijstelling. Dit wordt gedaan door de hoeveelheid glucose die vrijgesteld wordt te meten met behulp van het GOD- POD reagens. Dit zorgt voor een kleurverandering die kwantitatief kan gemeten worden bij 415 nm. Principe De hoeveelheid vrijgesteld glucose van de verschillende enzymmengsels wordt bepaald door middel van het GOD-POD reagens. Glucose oxidase katalyseert volgende reactie: β-d-glucose + O 2 gluconzuur + H 2 O 2 Het tweede deel van de bepaling is het Peroxidase. Dit katalyseert volgende reactie: DH 2 + H 2 O 2 2 H 2 O + D Het anorganisch chromogeen DH 2 wordt omgezet tot de gekleurde component D door middel van H 2 O 2. De absorbantie, en dus de concentratie, is een maat voor de hoeveelheid glucose in het oorspronkelijk mengsel. Het chromogeen substraat is 2,2 -azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonzuur) waarvan de absorbantie wordt bepaald met behulp van een colorimeter bij 405 nm. Doordat het enzym zo specifiek is, is het mogelijk om glucose alleen te meten in aanwezigheid van andere suikers zonder eerst een scheiding uit te voeren. 41

48 Werkwijze Maak verschillende verdunningen van de glucoseoplossing en de stalen. De stalen moeten in de lineaire range van de absorbantie zitten (0.2 2 µmol/l). Van de stalen moeten dus verschillende verdunningen gemaakt worden Pipetteer 50 µl in een microtiterplaat Voeg 150 µl GOD-POD reagens toe Incubeer 30 minuten bij 37 C Meet absorbantie bij 415 nm Met behulp van een ijklijn kan de glucoseconcentratie berekend worden Kwantificeren van monosacchariden via HPAEC-PAD Doel De verschillende verhoudingen RM/QM worden na 72h reageren vergeleken op vrijstelling van verschillende monosacchariden, niet alleen glucose. Principe De suikers worden gemeten met behulp van High-Performance-Anion-Exchange Chromatography met Pulsed Amperometric Detection (HPAEC-PAD). Deze techniek laat toe om monomere suikers te meten tot op picomol niveau. Bij een zeer hoge ph kunnen de verschillende suikers zeer effectief gescheiden worden met behulp van een goede anionuitwisselaar en gekwantificeerd worden. De suikers zijn zwakke zuren, in een base milieu zullen deze dus al dan niet deels ioniseren. Op deze manier kunnen ze gescheiden worden met behulp van het anionuitwisselingsmechanisme. Het mengsel wordt eerst over een guard-kolom gelopen, op deze manier worden de grootste onzuiverheden al verwijderd, zonder dat de duurdere analytische kolom vervuild raakt. De vloeistoffase bij deze scheiding is een mengsel van 100 mm NaOH als B en MilliQ als A. De gradiënt ziet er als volgt uit: Tabel 7 Gradiënt HPAEC-PAD tijd %A %B (min) -20 0% 100% % 2% 17,55 98% 2% 42

49 Van minuut -20 tot -10 zal de kolom gespoeld worden met 100 mm NaOH om alle resterende gebonden componenten van de kolom te spoelen. Van -10 tot 0 minuten zal de kolom voorgespoeld worden met 2 mm NaOH om de kolom op de juiste ph te krijgen om de scheiding te verrichten. Op minuut 0 wordt het staal geïnjecteerd en zal tot minuut 17,55 van de kolom lopen. Door het verschil in affiniteit tussen de verschillende suikers zullen deze in een bepaalde volgorde van de kolom lopen. Als geweten is welk suiker wanneer van de kolom loopt, kan men weten welke piek bij welke suiker hoort. De concentratie van de suikers wordt bepaald aan de hand van de oxidatiepotentiaal op de goudelektrode. Deze geoxideerde stoffen vergiftigen het goudoppervlak. Dit moet geregenereerd worden door de potentiaal nog verder op te drijven tot de carbohydraten terug van het oppervlak verdreven zijn. De oxidatiestroom per suiker wordt geïntegreerd in de tijd, hieruit volgt dat de respons van de meter in Coulomb is. Met behulp van een ijklijn van de verschillende suikers kan dan de concentratie bepaald worden. De kolom die gebruikt wordt in de scheiding is CarboPac PA20. Deze kolom geeft een goede scheiding van monomere suikers en werkt zeer goed voor houtsuikers. De vaste fase in de kolom is een hydrofoob, polymeer, anion-uitwisselingshars die stabiel is van ph 0 tot 14. Werkwijze Maak een ijkreeks, verschillende suikers in één epje Verdun alle stalen 2x, 200x, 400x en 600x Pipetteer 100 µl in een vial, vloeistof moet tot op de bodem staan Vials in juiste volgorde in de autosampler zetten Via ijklijn en de bekomen waarden kan de concentratie berekend worden 43

50 Resultaten en bespreking Het doel van deze thesis is zoeken naar synergie tussen de verschillende secretomen van de Trichoderma reesei, namelijk QM6a, afgekort als QM, en RUT-C30, afgekort als RM. Deze schimmels werden opgegroeid in het labo en opgezuiverd voor gebruik. De synergie werd bepaald door middel van verschillende verhoudingen RM/QM te evalueren op basis van suikervrijstelling. De beste verhouding werd uiteindelijk opnieuw uitgevoerd en de vrijstelling van verschillende monosacchariden in de tijd gemeten. 1 Karakterisering van de enzymmengsels Als eerste stap in dit onderzoek werd het secretoom van RUT-C30 (hierna afgekort tot RM) en QM6a (hierna afgekort als QM) geïsoleerd. Dit secretoom bevat de enzymen die lignocellulose afbreken. Na het opgroeien van de schimmels werden de enzymmengsels verkregen zoals beschreven in Deze mengsels werden in twee stappen opgeconcencentreerd. De eerste stap in het concentratieproces werd uitgevoerd met behulp van een Amicon zuiveringsset. Dit werd gebruikt omdat dit een relatief groot volume op een snelle manier kan verkleinen en zo de concentratie kan verhogen. De mate van verhogen van de concentratie is niet gelijk voor beide enzymmengsels omdat van het RUT-C30 secretoom een groter volume overgehouden werd na de Amicon in vergelijking met het QM6a secretoom. De tweede stap van de opzuivering werd gedaan met een Centricon. Met de Amicon is het niet meer mogelijk om kleine volumes nog kleiner te krijgen, in tegenstelling tot de Centricons. In de derde stap werd het enzymmengsel ontdaan van alle zouten door middel van een Econo 10 DG kolom. De componenten groter dan 6000 Dalton zullen sneller van de kolom lopen dan de kleinere. De enzymen lopen dus eerst van de kolom en kunnen opgevangen worden. In tabel 8 is te zien wat de uiteindelijke proteïneconcentratie is van de twee mengsels. Na iedere stap in het concentratieproces werd een meting van de proteïneconcentratie uitgevoerd met behulp van de DC Biorad Protein Assay, zoals beschreven in Deze resultaten bevestigen wat in de literatuur veel beschreven staat, namelijk dat RUT-C30 een veel grotere hoeveelheid enzym produceert dan QM6a (Seidl et al. 2008). Tabel 8 Enzymconcentratie na de iedere opzuiveringstap Staal Na Amicon Na Centricon Na ontzouten (4ml) RM 3.8 mg/ml mg/ml 9.96 mg/ml QM 0.9 mg/ml 2.2 mg/ml 1.37 mg/ml 44

51 specifieke activiteit (U/mg) 1.1 Hydrolyse van chromogene modelsubstraten Via modelsubstraten kan er snel een idee gevormd worden van de enzymactiviteiten die aanwezig zijn in de verkregen mengsels en op basis hiervan kunnen de mengsels vergeleken worden. Deze modelsubstraten stellen bij enzymatische omzetting een chromogene groep vrij waarvan de concentratie door absorptiemetingen kunnen vergeleken worden met een standaard ijklijn. Aan de hand daarvan kan kwantitatief de specifieke activiteit voor de verschillende types enzym-activiteit berekend worden. De activiteit op cellulose wordt geschat door middel van de activiteit op CNP-Glc en CNP-Lac. De hemicellulose-activiteit wordt geschat door middel van PNP-Ara, PNP-Gal, PNP-Man en CNP-Xyl. De esteraseactiviteit wordt geschat door middel van PNP-Ac. Omdat niet ieder enzymmengsel dezelfde activiteit vertoont op gelijke substraten werd bij ieder substraat een andere hoeveelheid van de verschillende enzymmengsels toegevoegd. Tabel 9 Specifieke activiteit (U/mg) op verschillende modelsubstraten QM RM verhouding CNP-Glc 1,17 0,038 30,6 CNP-Xyl 0,246 0,372 0,661 CNP-Lac 0,052 0,402 0,130 PNP-Ara 0,033 0,098 0,339 PNP-Gal 0,878 0,088 9,93 PNP-Man 0,184 0,022 8,50 PNP-Ac / 0,075 / 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 QM RM 0,400 0,200 0,000 CNP Glc CNP Xyl CNP Lac PNP Ara PNP Gal PNP Man PNP Ac Figuur 21 Specifieke activiteit (U/mg) op modelsubstraten. Blauwe balken zijn QM, rode balken zijn RM 45

52 Figuur 21 kan nu vergeleken worden met tabel 4. Het meest uitgesproken verschil tussen QM en RM is op het vlak van glucose vrijstelling. Dit zal te maken hebben met het β-glucosidase dat in veel grotere hoeveelheden aanwezig is in QM. Bij de vrijstelling van galactose en mannose zijn er ook grote verschillen merkbaar tussen de twee verschillende enzymmengsels. Het gaat hierbij over de activiteit van α-galactosidase, een endo-galactanase, een mannanase en een α-1,2-mannosidase die hoger is in QM. Bij de xylose-activiteit zullen de verschillen niet zo n grote impact hebben op de enzymatische hydrolyse wanneer het RM-enzymmengsel gesupplementeerd wordt met QM, aangezien er slechts een klein verschil is in xyloseactiviteit tussen beide secretomen. Dit wil zeggen dat in beide mengsels ongeveer dezelfde concentratie aan dezelfde enzymen zit nl. β-xylosidase, xylosidase I, xylanase III en xylanase II. Een hiaat van dit experiment is dat de vrijstelling van cellobiose niet opgemeten werd. Deze werking is volgens de literatuur veel sterker vertegenwoordigd in RM dan in QM. Dit heeft te maken met het cellobiohydrolase II (CBH II) en nog meer met de overmatige aanwezigheid van cellobiohydrolase I (CBH I) in het secretoom van RUT-C30 (Peterson and Nevalainen 2012). De activiteit op CNP-Lac is wel opgemeten. Hiermee worden de activiteiten van CBHI en endoglucanase I (EGI) opgemeten. Hierbij is duidelijk dat RM dit een stuk meer vrijstelt. De vrijstelling van arabinose is in beide gevallen laag, maar relatief zit er wel een significant verschil tussen de twee enzymmengsels. RM bezit dus een grotere arabinofuranosidaseactiviteit dan QM. De esterase-activiteit is in beide enzymmengsels laag, dit komt overeen met wat ook in de literatuur beschreven staat (Martinez et al. 2008). 1.2 Fractionaties Door middel van een DEAE-sepharose kolom (anionuitwisseling) werd een deel van het QM6a enzymmengsel gefractioneerd op basis van verschillen in negatieve lading tussen de verschillende enzymen aanwezig in het mengsel. Op deze manier kan de impact van de verschillende fracties, die verschillende enzymen bevatten, onderzocht worden door ze apart te supplementeren. Op basis van het bekomen elutieprofiel werden de vijftig opgevangen fracties samengevoegd tot vier stalen, zoals te zien is in tabel 10. Als verschillende fracties samen één piek vormden op het elutieprofiel, werden deze samengevoegd omdat dit over enzymen gaat die ongeveer op hetzelfde moment van de kolom elueren. De concentratie van de eerste twee fracties is echter te klein om goede experimenten mee uit te voeren. De grootste hoeveelheid eiwit is aanwezig in staal 4, dat de fracties 31 tot en met 50 bevat. 46

53 Tabel 10 Concentratie van de enzymfracties na samenvoegen bepaalde fracties Fractie Concentratie (mg/ml) 1 tot 20 0,124 mg/ml 21 tot 25 0,322 mg/ml 26 tot 30 1,028 mg/ml 31 tot 50 25,597 mg/ml Figuur 22 SDS-PAGE van de verschillende fracties en de zuivere enzymmengsels Figuur 22 toont een SDS-PAGE gel met de verschillende stalen. Van iedere fractie werd 10 µg eiwit op de gel gezet. Omdat de concentratie van de eerste twee stalen echter zeer laag was, werd er een precipitatieprotocol uitgevoerd om toch een voldoende hoeveelheid eiwit op de gel te kunnen zetten. Het is duidelijk te zien dat de scheiding gewerkt heeft. De verschillende stalen hebben op verschillende hoogtes bandjes. Dit wijst erop dat de enzymen gescheiden zijn. Staal 3 en 4 bevatten wel dezelfde dominante eiwitband. Ook de niet-gefractioneerde enzymmengsels QM en RM zijn weergeven. Het verschil tussen QM en RM is duidelijk. QM vertoont een veel groter spectrum aan enzymen te zien aan de vele verschillende bandjes over de volledige 47