HOE GROOT ZIJN POLLENKORRELS OF ERYTROCYTEN?

Transcriptie

1 Practicumopdracht 1: Laser diffractie 33 Practicumopdracht 1 HOE GROOT ZIJN POLLENKORRELS OF ERYTROCYTEN? Laser interferentie en diffractie 1. Inleiding Als licht een hindernis passeert, bijvoorbeeld wanneer het door een smalle opening moet of als er zich een voorwerpje in een lichtbundel bevindt, dan treedt er diffractie op (ook buiging genoemd). Als licht door een smalle spleet gaat, dan buigt het licht af aan de zijkanten van de spleet, en de afgebogen lichtbundels interfereren met elkaar. Als gevolg verkrijgt men niet alleen licht recht achter de spleet, maar ook daarnaast. Deze combinatie van diffractie en interferentie leidt tot het ontstaan van een ingewikkeld intensiteitsprofiel. De grootte van dat profiel is omgekeerd evenredig met de grootte van het object dat de diffractie veroorzaakt: de effecten worden belangrijk als de grootte van het object in de buurt komt van de golflengte van licht. Hierdoor komt het trouwens dat we diffractieverschijnselen in het dagelijkse leven niet meteen opmerken. De omgekeerd evenredigheid tussen de grootte van het intensiteitsprofiel en de grootte van het object levert echter ook bijzonder krachtige toepassingsmogelijkheden voor diffractie. Heel kleine objecten leveren heel grote diffractiepatronen: net voor de allerkleinste objecten zullen we m.b.v diffractie dus nauwkeurige metingen kunnen doen, gebruik makend van eenvoudig meetmateriaal zoals een lat en een lintmeter. Om interferentiepatronen te bekomen, is het wel nodig dat de lichtgolven coherent zijn (in de theoriecursus gaan we hier dieper op in). Voeger was het niet makkelijk om licht met een zekere coherentie te bekomen, maar sinds de uitvinding van de laser beschikken we over lichtbronnen die intense bundels coherent licht leveren. Met behulp van de laser kunnen we dan ook makkelijk experimenteren met diffractie en interferentie. In deze proef zullen we m.b.v. diffractie en interferentie de breedte van smalle lijntjes bepalen, en de breedte en afstanden van roosterlijnen. We gebruiken dezelfde technieken om de grootte van rode bloedcellen en van stuifmeelkorrels te bepalen: omdat deze dingen erg klein zijn, leveren ze een groot diffractiepatroon, zodat we met behulp van een gewone meetlat, nauwkeurig de diameter van een rode bloedcel kunnen bepalen! 2. Toepassingen Diffractie treedt op bij alle soorten elektromagnetische straling: niet alleen bij zichtbaar licht maar ook bij X-stralen en radiogolven bijvoorbeeld. X-stralen kunnen bovendien doordringen in ondoorzichtige materie en ze hebben een zeer kleine golflengte. Hierdoor kan men X-stralen diffractie gebruiken om de interne structuur van kristallen te

2 Practicumopdracht 1: Laser diffractie 34 achterhalen. De interpretatie van X-stralen diffractiebeelden is erg ingewikkeld maar de bekomen informatie is uniek. Op die manier heeft men de ruimtelijke structuur van DNA en hemoglobine ontdekt. Op de cd-rom vind je onder Meer weten de geschiedenis en het principe van X-stralen diffractie. De bepaling van de korrelgrootte in poeders en colloïdale suspensies kan men in de industrie en voor onderzoeksdoeleinden eveneens doen aan de hand van diffractie. 1. De dubbele helix structuur van DNA wordt dankzij X-stralen diffractie in kaart gebracht door James Watson ( ) en Francis Crick ( ) in Zij bouwen een model gebaseerd op Röntgen verstrooiingsdata van Rosalind Franklin. Crick, Watson en Wilkins delen hiervoor in 1962 de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde. Biografie Rosalind Franklin 2. Cursus Elementaire X-stralen diffractie voor biologen waarin ook veel toepassingen vermeld worden. X-stralen diffractie voor biologen 3. De structuurbepaling van proteïnen steunt ook op X-stralen diffractie. Op de cd-rom lees je meer over hoe je moleculen, zoals eiwitten, zichtbaar kan maken (elektronen microscopie vs. X-stralen diffractie). Foto s van moleculen 3. Theoretische achtergrond (a) Diffractie Als zich in een lichtbundel een voorwerp bevindt, treedt aan de randen van dit voorwerp diffractie of buiging op. In de opstellingen onderstellen we vlakke inkomende golffronten en meten we voldoende ver van het diffracterend object zodat Fraunhoferdiffractie kan ondersteld worden (zie theoriecursus). Men toont aan dat buiging aan een licht doorlatende spleet of een spleetvormig obstakel (bijv. een haar) dezelfde diffractie figuren genereren. De formule die de plaats van de minima in de diffractie figuur geeft, is: b sin m met m 1,2,3... (1) Hierbij is b de spleetbreedte, λ de golflengte van het gebruikte licht en θ de hoek tussen de voorwaartse richting en de richting van het "m de " minimum

3 Practicumopdracht 1: Laser diffractie 35 Ook aan ronde openingen of obstakels (bloedcellen of pollenkorrels) ontstaat buiging. De theoretische afleiding is wiskundig ingewikkelder en leidt uiteindelijk tot analoge formules. De hoek θ tussen de rechtdoorgaande bundel d sin 1, 22 (2) en het eerste ringvormig minimum wordt gegeven door: waarbij d nu de diameter is voor de cirkelvormige opening of het obstakel. Het volgende minimum vindt men bij: d sin = 2,23 (b) Diffractie-interferentie Intensiteit 0 x Lichtvlekken: Heeft men niet één spleet maar een reeks spleten op regelmatige afstand a (roosterconstante genoemd) evenwijdig van elkaar dan zal elke spleet zijn diffractiebeeld geven op het scherm. Door de regelmaat gaan alle (bijna op elkaar vallende) diffractiebeelden nog eens onderling interfereren. Binnen de bredere diffractievlekken krijgt men nu een fijnstructuur van interferentielijnen. De hoek tussen de rechtdoorgaande bundel en het m de interferentiemaximum is gegeven door onderstaande formule: a m L sin m a= m / sin (3) A met a = roosterconstante

4 Practicumopdracht 1: Laser diffractie 36 De spleetbreedte b halen we uit het eerste ( n = 1 ) of n de diffractieminimum. In het regelmatig interferentiepatroon zien we een vlek met een uitgesproken kleinere intensiteit (een zogezegde "ontbrekende orde") tussen de interferentievlekken met grotere intensiteit. De spleetbreedte volgt dan uit : n b (4) sin waarbij nu de hoek is waaronder men de "ontbrekende orde" krijgt t.o.v. de rechtdoorgaande bundel. Zwart-wit rooster a = roosterconstante b = spleetafstand Let op!! De orde van het diffractie minimum heeft niets te maken met de orde van het (ontbrekende) interferentie maximum. Hoofdstuk over Fysische optica (c) De lichtbron: laser Een laser is een lichtbron die coherent licht produceert, d.w.z. licht dat streng monochromatisch is en met constante fase. Laserlicht is zeker geen "dodende straal". Nochtans is de grootste voorzichtigheid geboden: Kijk nooit in de straal of reflecties ervan (Doe ringen en horloges uit om reflecties te vermijden) Richt een laserstraal nooit naar anderen De lasertjes die wij in het practicum gebruiken hebben een vermogen van 1 mw, erg weinig in vergelijking met een gewone gloeilamp met een vermogen van makkelijk 100 W. De laserbundel heeft echter slechts een doormeter van

5 Practicumopdracht 1: Laser diffractie 37 ongeveer 0.7 mm, zodat de 1.0 mw vermogen geconcentreerd zit op een oppervlakje van 0.4 mm 2. Dit betekent dat er in de laserbundel een vermogendichtheid of intensiteit is van 2.6 mw/mm 2 = 2600 W/m 2 (bedenk, om dit cijfer op zijn volle waarde in te schatten, dat als we recht in de zon kijken in volle zomer we dan een intensiteit van "slechts" 1000 W/m 2 zien). Daarom de volgende conclusie: laserlicht is gewoon licht maar wel erg intens en daarom GEVAARLIJK! Hoofdstuk De laser (d) De proefopstelling Proefopstelling voor alle experimenten van dit practicum (uitgezonderd CD experiment) Detail van preparaathouder

6 Practicumopdracht 1: Laser diffractie Werkwijze en uitvoering Experiment 1: Hoe dik is een haar? Zet de laser aan. De rode lichtbundel verschijnt. We werken met een HeNe laser waarvan het licht een golflengte heeft van 632,8 nm. Pluk een haar bij een medestudent en kleef dit met wat tape op de preparaathouder. Breng het haar in de bundel. Op een scherm ongeveer 1 meter verder verschijnen de diffractievlekjes. Bepaal de precieze schermafstand L met de meetlat. Meet de afstanden A tussen de heldere lichtvlek van de rechtdoorgaande laserbundel en het eerste, vierde en hoogste orde minimum dat je kan waarnemen. Bevestig hiervoor een papier op het scherm en duidt de posities der minima aan met potlood. Meet nadien de afstanden A op het papier met een meetlat. Bereken telkens de dikte b van het haar met zijn fout steunend op formule (1) en wetende dat: A zodat m L sin tg b (5) L A Vergelijk de bekomen waarden grafisch en bereken het gewogen gemiddelde. Met welke orde krijg je de hoogste nauwkeurigheid (kleinste fout!) op b? Hoe kan je eenvoudig de meetnauwkeurigheid verdubbelen? Merk op dat bij de grootste nauwkeurigheid we een precisie halen die met geen enkele conventionele mechanische meettechniek haalbaar is! Experiment 2: Hoe groot zijn bloedcellen, pollenkorrels en microsfeertjes? De diffractie aan ongeordende cirkelvormige obstakels of partikels geven allen ringvormige diffractiefiguren die verder NIET geordend interfereren juist door de willekeurig chaotische posities van de diffracterende objecten. Er ontstaat zo een korrelig circulair diffractiefiguur waaruit de gemiddelde diameter d van de partikels kan berekend worden. De waarde van d volgt dan uit formule (2). De dubbele hoek 2 θ volgt uit de diameter D van het eerste cirkelvormig minimum op het scherm en de schermafstand L: of voor het tweede cirkelvormig minimum: 1 D d. =1,22 n of d = 2,44 nl/d 2 L d = 4,47 L/D (7) : de golflengte van de laser in het medium waarin de meting gebeurt (lucht : n=1, water: n=1,33 ) n ter herinnering: = n / n lucht n Bekijk de diffractiefiguren van bloedcellen, pollen en farmaceutische microsfeertjes met L = 0,25 m. De preparaten van rode bloedcellen en pollenkorrels zijn bevestigd in de preparaathouder (verschuif (horizontaal) en (6)

7 Practicumopdracht 1: Laser diffractie 39 schroef (verticaal) het preparaat tot het in de laserbundel komt), de gele microsfeertjes in suspensie zitten in het glazen cuvet (eerst opschudden, voorzichtig hanteren!). Biologiestudenten: Bereken de diameter van de rode bloedcellen en de pollenkorrels, zonder foutberekening. Farmacie- en Biochemiestudenten: Bereken de diameter van de rode bloedcellen en de microsfeertjes, zonder foutberekening. Kijk voor SEM en LM foto s van stuifmeel en bloedcellen op de cd-rom. Microsfeertjes en farmacie Microsfeertjes zijn kleine, kunststof bolletjes die beschikbaar zijn in alle mogelijke afmetingen tussen 0.05 en 1000 µm. Deze partikels kennen erg veel toepassingen in uiteenlopende disciplines zoals immunologie, celbiologie, kankertherapie, geologie en hydrologie, calibratie van meettoestellen, Wij gebruiken in het practicum fluorescerende polystyreen partikels voor bloedstroomdeterminatie. Vroeger werden hiervoor radioactieve microsfeertjes als tracers gebruikt. De fluorescerende partikels zijn chemisch inert en kunnen maanden in het proefdier blijven voor analyse. Er bestaan ook holle sfeertjes die biocompatibel en bioafbreekbaar zijn. Tijdens de afbraak kan het verwerkte geneesmiddel op een gecontroleerde manier vrijkomen. Voorbeelden van bestanddelen die geïncorporeerd kunnen worden in de partikels zijn: peptiden, proteïnen, plasmide DNA, oligonucleotiden, antibiotica, hormonen, cytostatica in kankerbehandeling, De partikels kunnen parenteraal, oraal, nasaal, pulmonair of oculair worden toegepast. Experiment 3: Diffractie-interferentie met verschillende reflectieroosters Reflectie-diffractieroosters worden gebruikt om licht te splitsen in kleuren en zo absorptie- en emissiespectra te meten. We gebruiken een rooster-spectrometer in practicumopdracht Hoe lang is de groef op een CD? Zet het scherm met wit papier dicht bij de laser en richt de bundel door het gaatje van het scherm (en natuurlijk ook een gaatje in het papier! ).

8 Practicumopdracht 1: Laser diffractie 40 De CD zet je loodrecht op de bundel op L 20 cm. De gereflecteerde bundel valt dan dicht bij de opening en je ziet ook één of twee diffractie orden. De roosterafstand a tussen de opeenvolgende banen wordt gegeven door: m L a (8) A waarbij A de afstand op het scherm is tussen de reflectie van 0 de orde en de m de orde. Bereken de roosterafstand a zonder foutberekening. Bereken met dit gegeven hoeveel toeren of omwentelingen de groef op de CD heeft en de totale lengte van de groef indien men er van uitgaat dat de minimale diameter van de groef 3 cm en de maximale 11 cm is. 2. Lineair rooster Richt de laserbundel op het rooster. Na doorgang door het rooster zie je een duidelijke reeks punten (= interferentie "lijnen") op het scherm. Terug is sin θ A / L waar A nu de afstand is tussen de centrale vlek (0 de orde) en de gekozen m de orde van de interferentie maxima. Neem nu L =1 meter. Bepaal de afstand A tussen de centrale vlek en de uiterste m de zichtbare interferentieorde. Met behulp van formule (8) bereken je dan de roosterafstand a. Bepaal ook de spleetbreedte b met formule (5) (zonder foutberekening). Denk eraan dat de waarde van m in formule (5) voor de diffractie niet dezelfde is als de waarde die m heeft in formule(8) voor de interferentie. 3. Tweedimensionaal rooster Een twee dimensionaal rooster van ronde zwarte schijfjes met roosterafstanden h en v geeft ook aanleiding tot een diffractie-interferentiefiguur. De circulaire diffracties van alle schijfjes gaan nu weerom interfereren en geven interferentiepunten zowel horizontaal als vertikaal volgend uit dezelfde formules als hoger vermeld. De afstanden v en h volgen uit : h V v = m L / A h = n L / A v (met L 1 m) h

9 Practicumopdracht 1: Laser diffractie 41 waarbij nu A v de afstand is tussen de centrale interferentieorde en de bovenste of onderste zichtbare interferentieorde op m elementaire afstanden en A h de afstand tussen de centrale interferentieorde en de uiterst linkse of rechtse heldere interferentieorde (n de orde ). De positiebepaling van een "ontbrekende interferentieorde" laat dan toe de diameter van de diffractieschijfjes te bepalen. In dit geval kan men dus niet alleen v en h bepalen maar ook d zijnde de diameter van het (ronde) verstrooiend schijfje. Bereken d met formule (6) (wel mèt foutberekening ). D is nu de diameter van de wat donkere cirkel waarop de eerste reeks verdwijnende interferentieorden liggen. Soms ziet men zelfs een tweede donkere cirkel zodat formule (7) gebruikt kan worden. Vat de resultaten van alle experimenten samen in een overzichtelijke tabel. Vermeld alle resultaten in 10-6 m of µm. Door het opmeten van de positie van de diffractieminima en de interferentiespots heb je zowel de diameter van de schijfjes als hun onderlinge afstanden bepaald. Op gelijkaardige wijze, maar met veel complexere berekeningen, kan men de schikking van atomen bepalen in een 3-dimensionaal kristalrooster, en kon men de dubbele helix structuur van DNA achterhalen m.b.v. X-stralen diffractie. SCHAKEL DE LASER UIT BIJ HET EINDE VAN DE PROEF