Antigen receptor triggering and apotopic pathways in neoplastic B cells Mackus, W.J.M.

Transcriptie

1 UvA-DARE (Digital Academic Repository) Antigen receptor triggering and apotopic pathways in neoplastic B cells Mackus, W.J.M. Link to publication Citation for published version (APA): Mackus, W. J. M. (2003). Antigen receptor triggering and apotopic pathways in neoplastic B cells General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( Download date: 28 Jan 2017

2 Samenvattingg voor niet ingewijden SAMENVATTINGG VOOR NIET INGEWIJDEN BB cel immuniteit en apoptose Hett immuunsysteem is het afweermechanisme van het lichaam dat beschermt tegenn ziekteverwekkende micro-organismen (pathogenen) zoals virussen en bacteriën.. Het immuunsysteem bestaat uit verschillende typen witte bloedcellen die pathogenenn kunnen herkennen en de verwijdering hiervan kunnen bewerkstelligen. Eenn type van deze witte bloedcellen is de B lymfocyt, ook wel de B cel genoemd. Doorr binding van een specifiek stukje van een pathogeen (antigeen) aan de antigeenn receptor (ofwel B cel receptor, BCR) kan een B cel de aanwezigheid van eenn pathogeen herkennen. De BCR bevindt zich op het oppervlak van de B cel. Dee samenstelling van de BCR verandert gedurende allerlei stadia van de B cel ontwikkeling.. Dit ontstaat door breuken en mutaties in het DNA waaruit de BCR gevormdd wordt. Zo wordt de diversiteit en de specificiteit van deze receptor bepaald.. Om er zeker van te zijn dat de BCR een juiste verandering heeft ondergaan,, is selectie van de B cel dus van wezenlijk belang. Selectie is gebaseerdd op signalering via de BCR. Dit leidt er toe dat B cellen met de juiste BCRR uit kunnen groeien tot volwaardige B cellen, zoals geheugen B cellen en plasmaa cellen. Anderzijds worden B cellen met een niet-functionele of zelfs potentieell gevaarlijke BCR gericht tegen het eigen lichaam, wat kan leiden tot auto-immuniteit,, opgeruimd. Dit vindt plaats via geprogrammeerde celdood. Dit process wordt ook wel apoptose genoemd en is voor het onderhouden van een goedee balans in de cellen van het immuunsysteem onmisbaar. Apoptosee is een actief proces uitgevoerd door een specifieke groep enzymen (caspases).. Na activatie knippen caspases de voor de cel belangrijke eiwitten stuk. Hierdoorr valt de cel uit elkaar en kunnen de celfragmenten opgeruimd worden. Er zijnn twee belangrijke paden waarlangs de signalen die apoptose initiëren caspases kunnenn activeren (zie hoofdstuk 1, Fig. 1): Als eerste het extrinsieke pad (signaleringg vindt plaats vanaf het celoppervlak) en daarnaast het intrinsieke pad (signaleringg vindt plaats via de mitochondria, de energiecentrale van de cel). Regulatiee van caspase activatie wordt tevens gecontroleerd door de families van Bcl-22 en inhibitor-of-apoptose (IAP) eiwitten (zie hoofdstuk 1, Fig. 1). BB cel chronische lymfatische leukemie BB cel chronische lymfatische leukemie (B-CLL) is een tumor die gekenmerkt wordt doorr een opeenhoping van langlevende B cellen. Een kenmerk van B-CLL cellen is datt ze nauwelijks celdeling ondergaan. Er wordt dus verondersteld dat de toename vann de tumor eerder het gevolg is van defecten in de apoptose regulatie waardoor dezee cellen niet verwijderd kunnen worden in plaats van een vermeerdering door activatiee van de celgroei. En hoewel in 80% van alle B-CLL gevallen veranderingen inn het DNA gevonden worden is een specifieke oorzaak van de ziekte nog niet bekendd en een curatieve behandeling is nog steeds niet mogelijk. B-CLL cellen hebbenn een kenmerkende vorm die goed onder de microscoop waarneembaar is. Daarnaastt brengen de tumorcellen specifieke eiwitten op hun oppervlak tot expressie.. Aan de hand van deze kenmerken kan door middel van enkele eenvoudigee bepalingen in het laboratorium de ziekte vastgesteld worden

3 Summaries s B-CLLL is een van de meest voorkomende B cel tumoren in de Westerse wereld. Gemiddeldd zullen 2.7 op de personen deze ziekte krijgen. Het is een vorm vann kanker die voornamelijk bij oudere mensen voorkomt aangezien de ziekte gemiddeldd rond het 65 e levensjaar gediagnosticeerd wordt. Tegenwoordig echter wordenn steeds meer jongere mensen met deze ziekte in de kliniek gezien. Het risicoo om de ziekte te ontwikkelen neemt toe naarmate men ouder wordt. Het risico voorr mannen om de ziekte te ontwikkelen is daarbij twee keer zo groot dan voor vrouwen.. Het klinisch verloop van B-CLL is zeer divers: waar sommige patiënten eenn lange overleving hebben en geen therapie nodig hebben, maken andere patiëntenn een agressief ziekteverloop door die een intensieve behandeling vereist enn uiteindelijk tot een vroegtijdige dood kan leiden. Gedurendee het onderzoek van dit proefschrift is door wetenschappers ontdekt datt het verschil in ziekteverloop aan de hand van het aantal mutaties in de BCR vann de B-CLL cel bepaald kan worden. Patiënten kunnen zodanig in twee groepen verdeeldd worden: enerzijds patiënten met een ongemuteerde BCR op hun B-CLL cellenn en anderzijds patiënten met mutaties in de BCR. Ongemuteerde patiënten hebbenn een progressief ziekteverloop en een slechtere prognose. De gemiddelde overlevingg van deze groep patiënten bedraagt zo'n 6 jaar. De gemuteerde patiëntenn daartegenover hebben een langere klachtenvrije periode en een overlevingg van ten minste 10 jaar. Doelstellingg van het proefschrift Dee studies beschreven in dit proefschrift richten zich met name op de volgende vragen;; (1) wat zijn de functionele gevolgen van BCR activatie voor de B cel, (2) watt ligt ten grondslag aan de disfunctionele apoptose regulatie in B-CLL cellen, en, (3)) hoe beïnvloeden interacties van B cellen met andere cellen de inductie van B cell apoptose? Inn hoofdstuk 2 & 3 worden de biochemische processen na stimulatie van hett extrinsieke en het intrinsieke pad op het niveau van de mitochondria bestudeerd.. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een in vitro (buiten het lichaam) cel systeemm (Ramos cellen). Daarnaastt is de apoptose regulatie in B-CLL cellen, direct na afname van deze cellenn bij patiënten bestudeerd. Zo wordt in hoofdstuk 4 bestudeerd of er tussen de tweee klinisch verschillende patiëntengroepen een verschil in de gevolgen van apoptosee van B-CLL cellen na BCR stimulatie is. Tevens is de aan- of afwezigheid vann een bepaald eiwit in deze twee patiëntengroepen bepaald. Disregulatie van apoptosee in B-CLL hoeft zich niet te beperken tot de anti-apoptotische regulatoren. Daaromm is de expressie van alle regulatoren die een rol spelen in apoptose geanalyseerdd in zowel gezonde B cellen als B-CLL cellen (hoofdstuk 5). In het laatstee hoofdstuk is de specificiteit voor herkenning van antigeen van een ander typee witte bloedcel, de T cel, in B-CLL patiënten bestudeerd (hoofdstuk 6). Dee resultaten van het promotieonderzoek Activatiee van de BCR kan leiden tot enerzijds een arrest in celdeling (groeiarrest) enn anderzijds apoptose van de B cel. In hoofdstuk 2 is het oorzakelijk verband 114 4

4 Samenvattingg voor niet ingewijden tussenn groeiarrest en apoptose na BCR activatie bestudeerd. Stimulatie van de BCRR resulteerde in zowel groeiarrest als geprogrammeerde celdood van Ramos B cellen.. Incubatie van cellen in medium met daaraan toegevoegd de chemische stof natriumbutyraatt (n-but), waarvan het bekend is dat dit leidt tot groeiarrest, resulteerdee ook in apoptose. Het geven van een costimulatoir signaal, zoals activatiee van CD40 of het toedienen van TNF-a aan de celkweek, had als gevolg datt groeiarrest en apoptose van elkaar losgekoppeld konden worden. Het costimulatoiree signaal zorgde ervoor dat groeiarrest geïnduceerd door zowel BCR activatiee als incubatie met n-but versterkt werd. De apoptose inductie werd echter geremd.. Hiermee werd aangetoond dat BCR-gemedieerde groeiarrest in B cellen niett vanzelfsprekend wordt gevolgd door geprogrammeerde celdood. Dit geeft de BB cel de mogelijkheid gedurende een langere periode de signalen te integreren die nodigg zijn voor selectie van deze B cel. Verscheidenee studies aangaande de inductie van apoptose na BCR activatie tonenn aan dat het enzym caspase 3 geactiveerd wordt door middel van het intrinsiekee pad onafhankelijk van het extrinsieke pad. De detectie van verschillen in knippatronenn van caspase 3 in de aanwezigheid van zvad, een algemene remmer vann caspases, suggereert dat in BCR-geïnduceerde apoptose een niet-caspaseachtigg eiwit een rol speelt bij de uiteindelijke activatie van caspase 3. Door het vergelijkenn van de twee genoemde apoptose paden in Ramos B cellen werden de voorwaardenn voor apoptose inductie bestudeerd (hoofdstuk 3). Beide paden maaktenn gebruik van het pro-apoptotische eiwit Bax. Ze verschilden echter in het momentt en de caspase-afhankelijkheid voor het verlagen van de mitochondriale integriteit.. Dit kan duiden op een verschil in activatie van vroege pro-apoptotische regulatorenn in beide paden. Daarnaast werd aangetoond dat initiële activatie van caspasee 3 gemedieerd kon worden door caspase 9, zelfs in de aanwezigheid van dee remmer zvad. Het bewijs dat een specifiek BCR enzym een rol zou spelen werdd niet gevonden. Zoalss bovengenoemd (zie "B-CLL") bleek uit studies van derden dat B-CLL patiëntenn in twee groepen ingedeeld kunnen worden, gebaseerd op het aantal mutatiess in de BCR. Daarnaast is vastgesteld dat de B-CLL cellen van deze twee groepenn het eiwit ZAP-70 verschillend tot expressie brengen. In hoofdstuk 4 werd onderzochtt hoe de ZAP-70 eiwit expressie correleerde met de mutatiestatus. Tegelijkertijdd werd onderzocht of de verschillen in het klinisch karakter van beide B-CLLL subgroepen konden liggen in de verschillen in de functionele gevolgen van BCRR activatie. Alleen ongemuteerde B-CLL patiënten bleken specifiek ZAP-70 tot expressiee te brengen in hun B-CLL cellen, daarmee een positieve correlatie bevestigend.. Er waren geen verschillen tussen beide patiëntengroepen wat betreft dee apoptose ten gevolge van het in kweek houden van B cellen in medium of na toevoegingg van cytostatica in de kweek. In ongemuteerde patiënten echter leidde BCR-activatiee tot een vermindering van het aantal tumorcellen dat apoptose ondergingg ten gevolge van het kweken in medium. Tevens leidde dit tot een verlaagdee gevoeligheid van de tumorcellen voor cytostatica. Deze resultaten tonen aann dat in ongemuteerde patiënten signalering via de BCR interfereert met de uiteindelijkee inductie van apoptose. Dit suggereert dat chemotherapie in deze 115 5

5 Summaries s patiëntenn minder effectief is ten gevolge van continue signalering via de BCR, wat mogelijkk de slechtere klinische prognose van deze patiënten kan verklaren. Doorr een uitvoerige analyse van de expressie van zowel anti- als proapoptotischee regulatoren in normale en tumor B cellen via RT-MLPA analyse werd opp moleculair niveau inzicht verkregen in de apoptose regulatie van B cellen (hoofdstukk 5). Als eerste werd aangetoond dat normale B cellen uit diverse stadia vann de B cel ontwikkeling een bepaalde apoptose regulatoren verschillend tot expressiee brengen. Tegen de verwachting in toonde de vergelijking van de expressiee van apoptose regulatoren in normale en tumor B cellen aan dat niet alleenn anti-apoptotische maar bovenal pro-apoptotische regulatoren anders tot expressiee kwamen in B-CLL cellen. Dit heeft als gevolg dat zowel het extrinsieke alss het intrinsieke apoptose pad geblokkeerd wordt wat mogelijk de verlengde levensduurr van deze tumorcellen verklaard. Paradoxaal was dat met name een specifiekee groep van regulatoren binnen de Bcl-2 familie sterk opgereguleerd was. Tijdenss het in kweek houden van B-CLL cellen in medium maar bovenal na toevoegingg van cytostatica werd een sterke opregulatie van het pro-apoptotische Pumaa gedetecteerd. Dit ging gepaard met een sterke mate van apoptose. Vergelijkingg van het basis apoptose profiel van B-CLL cellen van ongemuteerde en gemuteerdee patiënten resulteerde niet in specifieke verschillen. Na incubatie van dee B-CLL cellen van beide subgroepen met cytostatica werd echter een sterkere toenamee in Puma expressie waargenomen in tumorcellen van ongemuteerde B- CLLL patiënten. Deze resultaten suggereren dat het klinisch verschil tussen de twee patiëntenn groepen voort kan komen uit het verschil in capaciteit om na BCR activatiee Puma-gerelateerde apoptose te induceren. Naastt de expansie van B cellen wordt B-CLL gekenmerkt door een sterke toenamee in het aantal T cellen, een andere type witte bloedcel. Er zijn aanwijzingenn dat dit met name T cellen betreft waarvan de functie voornamelijk bestaatt uit het opwekken van een respons op cellen die antigenen presenteren zodatt deze cellen opgeruimd worden. Dit soort T cellen wordt ook wel cytotoxische TT cel genoemd. Door de gelijktijdige toename van deze cytotoxischet cellen en B- CLLL cellen is geopperd dat de cytotoxische T cel zijn respons tegen de B-CLL cel richtt in een poging deze laatste op te ruimen. Aangezien concreet bewijs voor deze hypothesee echter ontbreekt werd de samenstelling van het T cel compartiment en hunn vermogen om een gerichte immuunrespons op te wekken onderzocht (hoofdstukk 6). Analyse van de T cel eiwitten toonde aan dat vergeleken met gezondee vrijwilligers B-CLL patiënten daadwerkelijk verhoogde absolute aantallen alss percentages cytotoxische T cellen hadden. Gebruikmakend van een recent ontwikkeldee nieuwe techniek werd aangetoond dat de specificiteit van deze cytotoxischee T cellen gericht was tegen het veelvuldig voorkomend cytomegalovirus.. Opmerkelijk was dat de toename in T cellen alleen gedetecteerd werdd in die B-CLL patiënten die geïnfecteerd waren met het cytomegalovirus. De toenamee van T cellen werd dus niet waargenomen in B-CLL patiënten die niet geïnfecteerdd zijn met het cytomegalovirus. Dit duidt aan dat de specificiteit van dezee T cellen eerder relateert aan een chronische virale infectie dan dat die specifiekk is voor het herkennen van B-CLL cellen

6 Samenvattingg voor niet ingewijden Dee implicaties van deze studies aangaande de functionele gevolgen van BCR activatiee en de identificatie van afwijkingen in de apoptose paden van tumor B cellenn is bediscussieerd in hoofdstuk 7. De bevindingen in dit proefschrift suggererenn dat het verschil in klinisch karakter tussen de ongemuteerde en gemuteerdee groepen van B-CLL patiënten gerelateerd kan zijn aan een verschil in capaciteitt in BCR-signalering en/of het activeren van Puma-afhankelijke apoptose. ZAP-700 eiwit expressie schijnt een rol te spelen in de BCR-signalering wat verder onderzoekk aangaande de associatie tussen ZAP-70 en B-CLL rechtvaardigd. Deze nieuwee gegevens hebben het begrip aangaande de apoptose regulatie van leukemischee B cellen vergroot en een model voor apoptose regulatie in B-CLL is gepresenteerdd (Hoofdstuk 7, fig 1). Uiteindelijk zijn er aan de hand van de laatste ontwikkelingenn in de literatuur, gecombineerd met de gegevens in dit proefschrift, voorstellenn gedaan betreffende het ontwikkelen van nieuwe anti-tumor medicijnen. Hett is en blijft dus uitermate belangrijk dat onderzoek naar het ontstaan van B cel tumoren,, met de daaraan gekoppelde toepassingen voor therapie, door kan blijven gaan

7