Heterologous expression and secretion of Clostridium perfringens [beta]-toxoid by Bacillus subtilis Nijland, Reindert

Transcriptie

1 Heterologous expression and secretion of Clostridium perfringens [beta]-toxoid by Bacillus subtilis Nijland, Reindert IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2007 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Nijland, R. (2007). Heterologous expression and secretion of Clostridium perfringens [beta]-toxoid by Bacillus subtilis s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Nederlandse samenvatting Heterologe expressie en secretie van Clostridium perfringens -toxoid door Bacillus subtilis Al zolang als mensen bier drinken en kaas en worst eten wordt er gebruik gemaakt van micro-organismen voor het bevorderen van zowel gezondheid als plezier. De toepassing van micro-organismen is tegenwoordig veel uitgebreider en verfijnder omdat geavanceerde technologie het mogelijk maakt de specifieke eigenschappen van een bepaald micro-organisme te veranderen zodat deze kan worden ingezet voor specifieke doeleinden. Doel Het doel van het onderzoek was het begrijpen van het mechanisme van de productie en secretie van het doeleiwit van dit proefschrift, -toxoid, door de bacterie Bacillus subtilis, en hierdoor het optimaliseren van de productie van -toxoid. -toxoid -toxoid is een onschadelijk gemaakt toxine (giftig eiwit) afkomstig uit de ziekteverwekkende bacterie Clostridium perfringens. C. perfringens is vooral schadelijk voor dieren zoals schapen en varkens en veroorzaakt ernstige diarree. Het -toxoid is een potentieel onderdeel van een vaccin tegen deze ziekteverwekkende bacterie. Het -toxoid is een genetisch gedetoxificeerde (niet langer giftige) variant van het normaal in C. perfringens voorkomende -toxine. In -toxoid zijn drie aminozuren (de bouwstenen van eiwitten) veranderd ten opzichte van het -toxine. Deze wijziging heeft de toxiciteit van het eiwit verminderd, terwijl het eiwit nog wel een immuun respons in muizen en varkens kan veroorzaken. De ingeënte dieren worden dus niet ziek maar wel resistent. Deze twee kenmerken maken het -toxoid tot een uitstekende vaccincomponent. Bacillus subtilis De bacterie Bacillus subtilis komt in de bodem algemeen voor. B. subtili staat bekend vanwege zijn capaciteit om grote hoeveelheden industrieel relevante eiwitten te produceren en te secreteren (uit te scheiden naar zijn omgeving), zoals lipases en proteases (vet- en eiwitafbrekende enzymen). Vaak zijn dit eiwitten die de bacterie van nature in kleine hoeveelheden produceert, de zogenaamde homologe eiwitten.

3 Addendum Door selectie en/of genetische modificatie is men er in geslaagd de bacterie nu veel meer van een bepaald eiwit te laten secreteren. Jammer genoeg is de productie van heterologe eiwitten (eiwitten die niet van nature in het organisme voorkomen) een stuk moeilijker. Ondanks dit probleem heeft het gebruik van B. subtilis vele voordelen. Omdat de bacterie niet gevaarlijk is voor mensen en er erg veel over bekend is, is het gebruik ervan door de FDA goedgekeurd voor een groot aantal productieprocessen (Generally Recognized As Safe). Verder is het kweken relatief eenvoudig, goedkoop en is het mogelijk de bacteriën in zeer hoge dichtheden te laten groeien. Omdat B. subtilis één van de best geschikte productieorganismen kon zijn voor de productie en secretie van -toxoid, is dit onderzoek opgezet. Dit is gedaan in samenwerking met Intervet, een farmaceutisch bedrijf in diergeneesmiddelen, onderdeel van Akzo Nobel. Zoals gezegd was het doel van het onderzoek het ontrafelen van het mechanisme achter de secretie van -toxoid door B. subtilis. Het -toxoid moest dus niet alleen worden gemaakt, maar ook nog worden uitgescheiden in het groeimedium, zodat industriële productie van het eiwit rendabel zou kunnen zijn. Het geproduceerde -toxoid zou als recombinant onderdeel van een vaccin tegen besmetting met C. perfringens in dieren kunnen worden gebruikt. Hoofdstuk 1: Inleiding in eiwitsecretie Hoofdstuk 1 bespreekt het proces van eiwitsecretie in B. subtilis. Alle bekende knelpunten in de productie en secretie van eiwitten worden beschreven (zie ook Fig. 1). Tevens worden de uit de literatuur bekende mogelijkheden om deze problemen op te lossen genoemd. Daarnaast wordt de octrooi literatuur over eiwitsecretie in Bacillus besproken. De verzamelde informatie en de oplossingen die in Hoofdstuk 1 worden voorgesteld zijn een goed uitgangspunt voor diverse projecten gericht op de optimalisatie van eiwitproductie en secretie door B. subtilis. Hoofdstuk 2: B. subtilis promoters voor eiwitexpressie Om een industrieel rendabel project te beginnen, was er de behoefte om nieuwe promotersystemen te ontwikkelen die zouden kunnen worden geoctrooieerd zodat het productieproces beschermd kon worden. De promoter zit in het DNA voor het gedeelte dat de code voor het eiwit bevat, en bepaald de expressie hiervan. In hoofdstukken 2 en 3 worden twee verschillende promotersystemen beschreven. Hoofdstuk 2 beschrijft de karakterisering van twee in B. subtilis aanwezige promoters die potentieel interessant zijn voor de expressie van gesecreteerde eiwitten zoals -toxoid. De regulatie van beide promoters is bepaald in dit onderzoek, en er is een octrooi is verleend voor het gebruik van deze promoters voor heterologe eiwitexpressie. 134

4 Nederlandse samenvatting Figuur 1. Een schematische weergave van het eiwit secretieproces in Bacillus subtilis. De cijfers in de figuur geven de 6 stappen aan van DNA naar gesecreteerd eiwit: 1: Het DNA wordt afgelezen en gekopieerd naar mrna. 2: Het mrna wordt door het ribosoom (R) vertaald in een keten van aminozuren. Deze keten begint met het Signaal peptide (SP). 3: Het signaal peptide wordt herkend en gebonden door het signaalherkennings partikel (SRP) en dit complex bindt zich aan de het eiwit FtsY. Via FtsY wordt het hele complex naar het secretieapparaat gebracht. 4: Het secretie-apparaat (SecYEG en SecA) transporteren de keten van aminozuren over het membraan naar de celwand. 5: Het signaal peptide afgeknipt door het signaal peptidase (Spase), en het eiwit vouwt tot zijn definitieve structuur, geholpen door chaperonnes zoals PrsA, HtrA en HtrB (5). Is er iets mis met het eiwit dan vouwt het niet of verkeerd, en wordt het eiwit afgebroken door celwand proteases en HtrA of HtrB (5a). 6: Het gevouwen eiwit komt buiten de cel terecht en het proces is klaar (6). Als het eiwit niet goed is gevouwen of er is iets anders mis dan wordt het afgebroken in de celwand of buiten de cel (6a) door extracellulaire proteases (AprE, NprE, etc.). Hoofdstuk 3: De-repressie promotersysteem voor eiwitexpressie Hoofdstuk 3 beschrijft een nieuwe strategie om eiwitproductie te bereiken. We ontwikkelden een nieuw expressiesysteem dat is gebaseerd op het verwijderen van de rem op promoter (de-repressie). Met dit expressiesysteem lukte het de productie van -toxine te verkrijgen door een stof uit het medium te verwijderen. Een bijkomend 135

5 Addendum voordeel van dit systeem is dat ook de expressie van proteases (eiwit afbrekende enzymen) wordt onderdrukt op het moment dat het gewenste eiwit wordt gemaakt. Hoofdstuk 4: Heterologe expressie van -toxoid Overexpressie van het doeleiwit van dit proefschrift, het -toxoid van C. perfringens, wordt beschreven in hoofdstukken 4 en 5. Hoofdstuk 4 beschrijft de verscheidene strategieën waarmee is geprobeerd om -toxoid te produceren. Jammer genoeg lukte het niet de secretie van -toxoid door B. subtilis flink te verhogen (maximaal 1,0 μg/ml culture). Het lukte wel om een hoge intracellulaire productie (200 μg/ml culture) verkrijgen. Zeer interessant was ook de observatie dat in tegenstelling tot B. subtilis, het volledige -toxoid wel kon worden gesecreteerd in twee andere bacteriën, waaronder een bacterie uit kaas (Lactococcus lactis), waarbij we gebruikmaken van het zelfde DNA plasmide dat in B. subtilis niet goed werkte. De redelijke hoeveelheid (5 tot 10 μg/ml) -toxoid die door deze bacteriën werd gemaakt liet zien dat het voordelig kan zijn om plasmiden te ontwerpen die gemakkelijk in verschillende productie gastheren kunnen worden toegepast. Hoofdstuk 5: Efficiënte secretie van -toxoid wordt beïnvloed door één aminozuur De strategieën beschreven in hoofdstuk 4 waren helaas niet erg succesvol voor secretie in B. subtilis. Daarom zijn we gaan kijken naar het -toxoid eiwit zelf. Het originele, onveranderde -toxine wordt zeer efficiënt door B. subtilis gesecreteerd, terwijl dat niet lukte met het -toxoid. Hoofdstuk 5 beschrijft hoe we de veranderingen van de drie aminozuren in -toxoid één voor één terug veranderden in het oorspronkelijke aminozuur. Deze experimenten toonden aan dat het verschil tussen hoge en lage secretie aan één van de drie veranderde aminozuren kon worden toegeschreven. De nieuwe hoog-gesecreteerde -toxoid constructen werden getest op toxiciteit, en deze eiwitten waren 5 keer minder giftig dan het originele -toxine. Momenteel wordt de toepasbaarheid van deze nieuwe -toxoid s in een vaccin onderzocht. Onze resultaten laten zien dat de gastheer op veel manieren kan worden aangepast, maar dat de intrinsieke eigenschappen van een heteroloog eiwit een beslissende rol kunnen spelen bij het optimaliseren van de eiwitproductie. Om te onderzoeken wat op het genregulatieniveau tussen overexpressie van -toxine en -toxoid gebeurde, werden verscheidene transcriptoom analyses uitgevoerd. Uit de uitgevoerde analyses bleek dat er sprake was van stress in de celwand, veroorzaakt door verkeerd gevouwen gesecreteerde eiwitten. 136

6 Nederlandse samenvatting Hoofdstuk 6: Functie van B. subtilis YkoJ Het opvallendste resultaat van de transcriptoom analyse die in Hoofdstuk 5 wordt beschreven was de sterke inductie van een gen met een onbekende functie, ykoj. Hoofdstuk 6 beschrijft de functionele analyse van ykoj. YkoJ is een klein gesecreteerd eiwit. Zeer verrassend bleek dat het verwijderen van ykoj uit het genoom de secretie van -toxoid niet beïnvloedde. Sterker nog, het weglaten had geen enkel effect op de expressie van enig ander gen van B. subtilis. In tegenstelling tot verwijdering, veroorzaakte de overexpressie van YkoJ een groeiremming van B. subtilis en uiteindelijk gingen alle cellen dood. Opvallend is dat de overproductie van de uit B. subtilis afkomstige YkoJ in L. lactis geen groeiremming oplevert. De precieze functie van YkoJ is nog niet duidelijk, maar wij veronderstellen dat het de samenstelling van de celwand van B. subtilis beïnvloedt. Hoofdstuk 7: Discussie L. lactis is een alternatieve secretie gastheer Zoals aangetoond met zowel -toxoid als YkoJ is de secretie van deze eiwitten efficiënter door L. lactis dan door B. subtilis. L. lactis, een bacterie uit kaas, staat niet bekend om zijn uitmuntende capaciteit voor eiwitsecretie. Wel heeft L. lactis veel minder proteases dan B. subtilis, en zijn belangrijkste extracellulaire protease, HtrA, kan zonder gevolgen voor de celgroei worden uitgeschakeld, wat tot betere secretie leidt. De capaciteit van L. lactis om eiwit te secreteren is veel lager dan de capaciteit van B. subtilis. Dit komt hoofdzakelijk omdat L. lactis een zuiver fermentatief organisme is, en hierdoor niet efficiënt met zijn energiebronnen omgaat. Inspanningen die momenteel worden geleverd om L. lactis voor eiwitsecretie te optimaliseren zijn niettemin veelbelovend. Deze recente ontwikkelingen kunnen tot significante verbetering van de eiwitsecretie capaciteit leiden. In de nabije toekomst zal dit L. lactis tot een serieus alternatief voor B. subtilisl maken. Fine-tunen voor toekomstig succes Het project is succesvol afgesloten. Het bleek dat het aanpassen van de productie gastheer niet de juiste methode was, maar dat het probleem lag bij de intrinsieke eigenschappen van het -toxoid eiwit. Door dit eiwit zelf aan te passen is de secretie van het -toxoid van C. perfringens door B. subtilis aanzienlijk verbeterd. Hoewel het originele -toxoid niet in hoge concentraties is verkregen, zijn er nieuwe -toxoid mutanten ontwikkeld die een verminderde giftigheid hebben in vergelijking met het normale -toxine. Deze worden wel met een hoge opbrengst door B. subtilis gesecreteerd. Toekomstig onderzoek dat zich specifiek concentreert op het fine-tunen van deze nieuwe -toxoid eiwitten heeft de potentie om de toxiciteit nog meer omlaag te brengen zonder dat de secretie efficiëntie negatief wordt beïnvloed. 137

7