Gebruik van flow cytometrie voor bepaling van de fytoplanktongemeenschap

Transcriptie

1 Gebruik van flow cytometrie voor bepaling van de fytoplanktongemeenschap Reinhoud de Blok 14 oktober 2016 Universiteit Gent: Wim Vyverman, Koen Sabbe Vlaams instituut voor de zee (VLIZ): Lennert Tyberghein

2 Inhoudsopgave Introductie Belgische kustzone Kaderrichtlijn water Monitoring fytoplankton Cytosense flowcytometer Materiaal en methoden Opstelling Cytosense Output Cytosense Clustering functionele fytoplanktongroepen Resultaten Fytoplankton biomassa Fytoplankton diversiteit Ruimtelijke variatie fytoplankton Phaeocystis sp. bloei Discussie Vragen

3 Introductie

4 Belgische kustzone Belgisch deel van de Noordzee is relatief ondiep (< 30m) complex systeem van zandbanken Verticaal homogeen gemixte water column Z-W inflow van Noord Atlantisch water via het Engels kanaal N-O inflow van zoet nutrientrijk water via de Rijn, Maas en de Schelde Hoge concentratie suspended particulate matter (SPM) Voorjaarsbloei van diatomeeën gevolgd na depletie van silica door een Phaeocystis bloei µm Lu et al. (2014)

5 Kaderrichtlijn water Fytoplankton is een belangrijke indicator voor de waterkwaliteit Kaderrichtlijn water Verbeteren van de kwaliteit van grond- en oppervlaktewater zodat het water chemisch en ecologisch (weer) gezond wordt Fytoplankton relevant binnen mariene richtlijnen (Marine Strategy Framework Directive) Good Environmental Status: D1. Biological diversity; D2. Non-indegenous species; D4. Foodwebs; D5. Euthrophication Ecologische status fytoplankton berekend met Ecological Quality Ratio 90 ste percentiel chlorofyl a (biomassa) Diversiteit en kwantiteit van de fytoplanktongemeenschap Andere toetsnormen voorgesteld, bv. Phaeocystis 4*10 6 cellen\l (Lancelot et al. 2009) Routine monitoring fytoplankton belangrijk

6 Monitoring fytoplankton Verschillende methodes mogelijk Microscopie Hoog taxonomisch niveau, lage ruimtelijke en temporele resolutie, arbeidsintensief HPLC pigment fingerprinting Laag taxonomisch niveau, lage ruimtelijke en temporele resolutie Remote sensing Geen sampling, hoge ruimtelijke en temporele resolutie, laag taxonomisch niveau Next generation sequencing Hoog taxonomisch niveau, lage ruimtelijke en temporele resolutie Cytosense flow cytometer Functionele fytoplanktongroepen, hoge ruimtelijke en temporele resolutie Wat is flow cytometrie en hoe kan dit gebruikt worden voor routine monitoring van fytoplankton? Genitsaris et al. 2015

7 Flow cytometrie Fytoplankton cellen passeren de laserstraal uitgelijnd in de transportvloeistof Verstrooing van het licht wordt opgevangen door de forward scatter detector en side scatter detector Grootte, vorm en celinhoud fytoplankton Fluorescentie detectoren op verschillende golflengtes kunnen specifieke pigmenten van het fytoplankton detecteren bv. fycoerythrines en chlorofyl a

8 Cytosense flow cytometer Cytosense is een scanning flow cytometer Per cel worden er 55 verschillende parameters bepaald Camera module Foto s gecombineerd met scan profielen (Fontana et al. 2014)

9 Materiaal en Methoden

10 Opstelling Cytosense Cytosense flow cytometer is geïnstalleerd aan boord van het onderzoeksschip Simon Stevin Verbonden met het underway system van de Simon Stevin Water wordt constant opgepompt van 3 meter diepte Tijdens iedere campagne wordt er gemeten met de Cytosense Semi-continu metingen (~ 30 minuten) Abiotische factoren worden in parallel gemeten O.a. saliniteit, temperatuur, opgelost zuurstof Weergegeven resultaten zijn van de Lifewatch monitoring campagnes (2016) Stations in Belgische kustzone (n=9 / n=17) O.a. nutrienten, CTD, SPM

11 Output Cytosense Cytogram Scatterplot met onderscheidende parameters (bv. Total FL Red, Total FL Orange) Handmatige clustering Clustering gebaseerd op: Lengte forward scatter Sideward scattering Fluorescentie karakteristieken

12 Output Cytosense - Synechococcus spp.

13 Output Cytosense - Cryptofyten

14 Output Cytosense - Nanofytoplankton

15 Output Cytosense - Microfytoplankton

16 Clustering functionele fytoplanktongroepen Hoge sideward scatter Fytoplankton met hoge scattering, zoals de calcium carbonaat skeletjes van coccolithophores Microfytoplankton met hoge fluorescentie rood Grotere fytoplankton, zoals diatomeeën en dinoflagellaten Nanofytoplankton met lage fluorescentie rood Kleinere fytoplankton, zoals diatomeeën en dinoflagellaten Nanofytoplankton met lage fluorescentie rood Eencelllige Phaeocystis Nano/microfytoplankton met hoge fluorescentie oranje Grotere fycoërytrine bevattend fytoplankton, zoals cryptofyten Pico/nanofytoplankton met lage fluorescentie oranje Kleine fycoërytrine bevattend fytoplankton, zoals Synechococcus spp.

17 Resultaten (voorlopig)

18 Fytoplankton biomassa Chl a proxy fytoplankton biomassa Ecological Quality Ratio Chl a concentratie bepaald dmv High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Cytosense flowcytometer meet totale fluorescentie rood Geschikt als proxy voor fytoplankton biomassa (R 2 = 0.81)

19 Fytoplankton diversiteit (feb-mei) Lage fytoplankton biomassa Diverse clusters aanwezig Start van de voorjaars fytoplankton bloei Hogere fytoplankton biomassa in het noord-oosten Middelste stations: Phaeocystis sp. dominate cluster Februari Maart

20 Fytoplankton diversiteit (feb-mei) Hogere biomassa in het zuid-westen Dominant cluster: Phaeocystis sp. Einde bloei Phaeocystis sp. April Mei

21 Ruimtelijke variatie fytoplankton

22 7 Ruimtelijke variatie fytoplankton

23 Phaeocystis sp. bloei Chl a Phaeocystis sp. berekend uit Cytosense totale fluorescentie rood (lineaire regressie) Chl a Phaeocystis sp. geschat dmv HPLC pigment fingerprinting met CHEMTAX

24 Phaeocystis sp. bloei Phaeocystis sp.: Cytosense FCM HPLC pigment fingerprinting met CHEMTAX Bloei opgepikt met beide methodes Verschil bij lage concentraties

25 Discussie

26 Discussie Cytosense flowcytometer: Efficient, hoge ruimtelijke en temporele resolutie Inzicht in de fytoplankton dynamiek in de Belgische kustzone Clustering gebaseerd op scattering en fluorescentie karakteristieken Handmatig, maar software pakketten beschikbaar (bv. Easyclus) Laag taxonomisch niveau, maar wel functionele fytoplanktongroepen Voorjaars Phaeoocystis bloei is waarneembaar met de Cytosense Foto s geven inzicht in de soorten binnen functionele fytoplanktongroepen Vergelijking met andere meetmethodes (bv. HPLC pigment fingerprinting, microscopie) Vergelijkbare Phaeocystis bloei duur en grootte bepaald met verschillende methodes Monitoring data Belgische kustzone kan gebruikt worden voor toetsing waterkwaliteit Chlorofyl a, diversiteit fytoplankton, Phaeocystis sp. bloei ( 4*10 6 cellen/l)

27 Acknowledgements Universiteit Gent: Wim Vyverman, Koen Sabbe en Celine Allewaert Vlaams instituut voor de zee (VLIZ): Dre Cattrijsse, Klaas Deneudt, Thanos Gkritzalis, Tjess Hernandez, Jonas Mortelmans en Lennert Tyberghein

28 Vragen