Antigenicity of schistosome glycans. Summary

Transcriptie

1 Antigenicity of schistosome glycans Summary

2 Summary Schistosomiasis or bilharzia is one of the major parasitic diseases of the world. The disease is caused by Schistosoma worms, which live in the blood vessels of the human host. The different stages of the life cycle interact in a specific way with the host, thereby sometimes manipulating the physiological/immunological mechanism for their own benefit. To survive the parasite must evade and/or resist the immune system of the host; glycoconjugates seem to play an important role in this. More and more structural data on schistosome glycosylation have become available, however, the exact biological role of most of these structures is still unknown. In this thesis, the glycosylation of schistosomes and the humoral response to carbohydrate epitopes are studied. In the general introduction (Chapter 1) the reader is introduced to human schistosomiasis and to glycoconjugates. The parasite and its life cycle, distribution, pathology, control and diagnosis of schistosomiasis are outlined and a general overview of glycoconjugates, their biosynthesis and function is given. In particular, glycoconjugates of schistosomes are highlighted. A brief overview of the structural data of schistosomal glycoconjugates and their expression in the different life cycle stages is presented. Furthermore, the host immune response to schistosome glycoconjugates and the function of these glycoconjugates are described. In Chapter 2, the enzymatic synthesis of primarily fucosylated glycans such as Lewis x, LDN-F and LDN-DF are described. These glycans were coupled to BSA to yield neoglycoconjugates. Subsequently, these neoglycoconjugates were used to screen a panel of monoclonal antibodies obtained from Schistosoma- infected or immunized mice. Twenty-five monoclonal antibodies were identified and used to localize the fucosylated structures in various stages of the parasite using immunocytochemical analysis. The fluorescence staining of the identified MAbs showed characteristic patterns. The MAbs that showed reactivity with LDN-DF stained miracidia, egg shells and whole cercariae and the excretory system of adult worms including the flame cells. The LDN-F structure was predominantly present in the parenchyma of adult worms, on miracidia and in the proximal part of cercariae. The Lewis x epitope was found in the gut, on the tegument of adult worms, on eggshells and on the oral sucker of cercariae. Finally, the anti-ldn MAbs stained the tegument of adult worms and miracidia. In Chapter 3, MAbs were identified using glycoproteins carrying carbohydrate structures that are shared by antigens of schistosomes and allergenic plant antigens. One MAb was selected and further characterized and it was shown to recognize truncated biantennary N-glycans Man 3 GlcNAc 2 -R. Additionally, this structure was shown to occur on many glycoproteins of schistosomes, invertebrates and also on a restricted number of vertebrate glycoproteins. Despite the fact that the MAbs had been isolated from infected mice, sera of individuals infected with S. 2

3 mansoni had similar levels of antibodies against this carbohydrate structure in comparison with sera of controls. In Chapter 4, the immunogenicity of the neoglycoconjugates described in Chapter 2 were studied in different groups of individuals infected with Schistosoma species. Specific IgM and IgG antibodies against LDN, LDN-DF and Lewis x were detected in sera of individuals infected with S. japonicum, S. haematobium and S. mansoni. Almost all infected individuals displayed a positive immune response to the LDN-DF epitope, whereas a lower and more variable immune response to LDN and Lewis x was observed. Anti-LDN-DF antibodies measured in sera from individuals infected with S. mansoni were predominantly of the IgM isotype, while IgG predominated the response in S. japonicum-infected individuals. In S. haematobium infected individuals, both isotypes were observed. Chapter 5 deals with the development of the humoral anti-glycan immune response of chimpanzees either or not vaccinated with radiation-attenuated S. mansoni cercariae. In this study, we used a broader panel of neoglycoconjugates carrying carbohydrates structures, which were mainly characteristic for schistosomes. During the acute phase of infection both vaccinated and infected chimpanzees produced high levels of IgG antibodies to LDN-DF and F-LDNαGal, while high levels of IgM antibodies were found against the trimeric Lewis x epitope. Low levels of IgM and IgG antibodies against LDN, LDN-F and Lewis x were found. Overall, the vaccinated chimpanzees displayed lower anti-carbohydrate antibody levels compared to control animals. Finally, the effect of praziquantel treatment and re-exposure on the anti-glycan immune response of S. japonicum infected pigs was studied and described in Chapter 6. Sera of pigs infected with S. japonicum contained anti-ldn, anti-lewis x and anti-ldn-df antibodies during the acute phase of infection. After treatment with praziquantel the level of all anticarbohydrate antibodies decreased rapidly in comparison with control pigs. The treated pigs were 100% resistant to re-exposure and serum of these pigs showed an increase in the level of anti-ldn-df antibodies one week after re-exposure. This effect could not be demonstrated for anti-ldn or anti-lewis x antibodies. The increase in the level of anti-ldn-df antibodies is probably induced by schistosomula and not by eggs remaining in tissue as seen for S. mansoni infections. Further studies are needed to evaluate the possibility of using the LDN-DF epitope as a potential marker for exposure to S. japonicum cercariae. Many questions can be posed about the function of these glycans and how they are involved in the complex immune responses of infected hosts to the parasite. It is hoped that a better understanding of the structures and functions of schistosome glycans provide new insights into the complex host-parasite relationship and may also contribute to the development of an effective anti-schistosome vaccine.

4 Samenvatting Schistosomiasis of bilharzia is een van de belangrijkste parasitaire infectieziekten in de wereld. De ziekte wordt veroorzaakt door Schistosoma wormen, die in de bloedvaten van de mens leven. Schistosomen hebben een complexe levenscyclus waarbij een zoetwaterslak als tussengastheer en de mens als definitieve gastheer optreedt. De volwassen wormen kunnen lange tijd in de mens overleven. Zij produceren echter grote hoeveelheden eieren die ernstige pathologische problemen kunnen veroorzaken bij geïnfecteerde individuen. De verschillende levensstadia van schistosomen reageren ieder op een specifieke manier met de gastheer, waarbij ze soms ten behoeve van zichzelf gebruik maken van de gastheer s physiologische/immunologische mechanismen. Om te kunnen overleven moet de parasiet het immuunsysteem van de gastheer ontwijken en/of weerstaan, hierbij blijken glycoconjugaten (geglycosyleerde eiwitten of lipiden) een belangrijke rol te spelen. In de afgelopen jaren is er een grote hoeveelheid aan structurele data van schistosomale glycoconjugaten bekend geworden, echter, de exacte biologische functie van de meeste van deze structuren is nog niet bekend. In dit proefschrift werden de glycosylering van schistosomen en de humorale immuun respons die gericht is tegen glycoconjugaten bestudeerd. Hoofdstuk 1 geeft een algemene inleiding over schistosomiasis in de mens en over glycoconjugaten, met onderwerpen zoals de levenscyclus van de parasiet, de verspreiding, de pathologie, de bestrijding en de diagnose van Schistosoma infecties. Verder wordt een overzicht gegeven van glycoconjugaten in het algemeen, de synthese en hun mogelijke functies. In het bijzonder worden glycoconjugaten van schistosomen belicht. Een korte samenvatting van de structurele data die bekend zijn over schistosomale glycoconjugaten en waar deze structuren in de verschillende levensstadia voorkomen is beschreven. Tenslotte wordt de immuun respons die gericht is tegen de schistosomale glycoconjugaten in de gastheer en de mogelijke functie van de schistosomale glycoconjugaten beschreven. Om de functie van schistosomale koolhydraat structuren in de parasiet-gastheer interactie te kunnen bestuderen, hebben we enzymatisch verschillende eindstandige koolhydraat structuren gesynthetiseerd. Het is nl erg moeilijk om voldoende materiaal te isoleren van de verschillende stadia van de parasiet, en dan houden we nog geen rekening met het risico van contaminatie met gastheer structuren. De enzymatische synthese van voornamelijk gefucosyleerde glycanen zoals Lewis x, LDN-F en LDN-DF wordt beschreven in hoofdstuk 2. Deze glycanen werden gekoppeld aan BSA zodat we neoglycoconjugaten kregen. Vervolgens hebben we deze neoglycoconjugaten

5 gebruikt om een set van 200 monoklonale antilichamen, die verkregen zijn van Schistosomageïnfecteerde of geimmuniseerde muizen, te screenen op herkenning van bovengenoemde glycaan structuren. Uiteindelijk zijn er vijfentwintig monoklonale antilichamen geïdentificeerd. Deze monoklonale antilichamen werden gebruikt om de aanwezigheid van deze gefucosyleerde structuren aan te tonen in de verschillende stadia van de parasiet gebruik makende van immunocytochemische analyze. De anti-ldn-df monoklonale antilichamen kleurden de miracidia, de eischalen en cercariae, en het excretie systeem van de volwassen worm inclusief vlamcellen aan. De LDN-F structuren waren vooral aanwezig in het parenchym van de volwassen worm, in de miracidia en in het proximale gedeelte van de cercariae. De Lewis x epitoop werd gevonden in de darm en het tegument van de volwassen worm, op ei-schalen en op de orale zuignap van de cercariae. Tenslotte, kleurden de anti-ldn monoklonale antilichamen het tegument van de volwassen worm en de miracidia aan. Een andere manier om monoklonale antistoffen te identificeren is het gebruik maken van glycoproteinen met bekende koolhydraat structuren. In hoofdstuk 3 zijn hiervoor glycoproteinen gebruikt die koolhydraat structuren bevatten die zowel bij helminthen, planten, insecten en weekdieren voorkomen, maar die tot nu toe niet gevonden zijn bij zoogdier glycoproteinen. Eén monoklonaal antilichaam werd geselecteerd en verder gekarakteriseerd. Dit monoklonaal herkende het getrunceerde biantennaire N-glycaan Man 3 GlcNAc 2 -R. Deze structuur bleek aanwezig te zijn op vele glycoproteinen van schistosomen, invertebraten en ook op een selecte groep van vertebrate glycoproteinen. Ondanks het feit dat het monoklonaal is geïsoleerd uit geïnfecteerde muizen, hadden sera van mensen die geïnfecteerd waren met S. mansoni geen verhoogde concentratie van antilichamen tegen deze koolhydraat structuur in vergelijking met niet-geïnfecteerde mensen. De gesynthetiseerde epitopen werden verder gebruikt om de humorale immuun respons van individuen die geïnfecteerd zijn met verschillende soorten Schistosoma te bestuderen (hoofdstuk 4). Sera van individuen die geïnfecteerd zijn met S. japonicum, S. haematobium en S. mansoni bevatten specifieke IgM en IgG antilichamen tegen LDN, LDN-DF en Lewis x. Bijna alle geïnfecteerde individuen hadden een positieve immuun respons tegen het LDN-DF epitoop, terwijl er een veel lagere en meer variabele immuun respons tegen LDN en Lewis x werd gemeten. De anti-ldn-df antilichamen in sera van individuen die geïnfecteerd waren met S. mansoni waren voornamelijk van het IgM isotype, terwijl in sera van S. japonicumgeïnfecteerde individuen het IgG isotype overheerste. Beide isotypes waren aanwezig in S. haematobium geïnfecteerde individuen.

6 Daarnaast is de ontwikkeling van de anti-glycaan antilichaam respons in S. mansoni geïnfecteerde chimpansees en het effect van vaccinatie met bestraalde S. mansoni cercariae bestudeerd (hoofdstuk 5). Voor deze studie hebben we een bredere set van neoglycoconjugaten gebruikt. Deze neoglycoconjugaten bevatten koolhydraat structuren die vooral karakteristiek zijn voor schistosomen. Tijdens de acute phase van de infectie, bevatten zowel de controle als de gevaccineerde chimpansees hoge concentraties van IgG antilichamen tegen LDN-DF en F- LDNαGal, terwijl er hoge concentraties van IgM antilichamen werden gevonden tegen de trimeer Lewis x epitoop. Sera van beide groepen hadden lage concentraties van IgG en IgM antilichamen tegen LDN, LDN-F en Lewis x. Over het geheel hebben de gevaccineerde chimpansees een lagere concentratie van anti-glycaan antilichamen in hun sera in vergelijking met de controle dieren. Naast het bestuderen van de ontwikkeling van de humorale immune response in mensen en chimpansees, hebben we gekeken wat het effect was van een Praziquantel behandeling op de ontwikkeling van glycaan respons (hoofdstuk 6). Varkens werden geïnfecteerd met S. japonicum cercariae en vervolgens behandeld met Praziquantel. Een deel van de varkens werd na behandeling voor de tweede keer blootgesteld aan S. japonicum cercariae. Sera van de geïnfecteerde varkens bevatten o.a. antilichamen die gericht zijn tegen LDN, Lewis x en LDN- DF. Tijdens de acute phase van de infectie was de concentratie van deze antilichamen het hoogst. Na behandeling nam de concentratie van alle anti-glycaan antilichamen in sera af in vergelijking met de controle varkens. De behandelde varkens waren 100% resistent tegen herinfectie. De concentratie van anti-ldn-df antilichamen nam direct na herinfectie toe. Deze toename in concentratie werd niet gevonden voor de andere anti-glycaan antilichamen. De toename van LDN-DF antilichamen wordt waarschijnlijk geïnduceerd door schistosomula en niet door eieren zoals bij S. mansoni infecties. Verdere studies zijn nodig om te kunnen evalueren of de LDN-DF epitoop inderdaad als potentiele marker voor blootstelling aan S. japonicum infecties kan dienen. Vele vragen kunnen worden gesteld over de functie van deze glycanen en hoe ze betrokken zijn bij de complexe immuun respons van de geïnfecteerde gastheer naar de parasiet. We hopen dat een betere kennis van structuren en functies van schistosomale glycanen leidt tot nieuwe inzichten in de complexe parasiet-gastheer interactie en misschien bijdraagt tot de ontwikkeling van een effectiever anti-schistosomaal vaccin.