Biologie: E-practicum 1

Transcriptie

1 1.Inleiding en celkweek Biologie: E-practicum 1 CELKWEEK, CELDELING EN CELCYCLUS, KLIEVING EN VROEGE EMBRYONALE ONTWIKKELING. De vraagjes van het e-practicum zijn enkel een aanzet tot verder nadenken over deze materie. Neem zelf notities en maak tekeningen (schetsen), zodat je goed studiemateriaal hebt om je voor te bereiden op het examen. De link naar het e-practicum blijft gedurende twee weken beschikbaar. Om het practicum volledig te doorlopen, reken je 3 uur. Je bent niet verplicht het practicum in één keer af te werken, als je het volledige practicum maar binnen de termijn van twee weken hebt doorlopen. Tijdens practica komt er weinig of geen nieuwe leerstof aan bod. Het is een aanvulling bij de cursus en hoorcolleges, een hulpmiddel om beter inzicht te krijgen in de leerstof. Je krijgt geen puntenscore voor ieder practicum, maar de practica zullen op het eindexamen in januari ook ondervraagd worden. Aan het eind van ieder vragenblok, verschijnt er feedback op je vragen. Indien het combinatievragen betreft, krijg je enkel de vraag opnieuw te zien met de combinaties die je zelf had ingevoerd. Dit betekent dus dat je een foutieve combinatie maakte en dat je het antwoord op deze vraag best nog eens opnieuw opzoekt in je handboek of cursus. Tot slot: iedere student is verplicht deze sessies met de nodige aandacht te doorlopen. Het is een aanzet om zelfstandig je verantwoordelijkheid te nemen in je eigen studeren. Inleiding: Dieren, hoewel allen meercellig georganiseerd, doorlopen van generatie tot generatie steeds een eencellig stadium: de bevruchte (zygote) of onbevruchte (parthenogenese) eicel. Zeker tijdens de embryonale ontwikkeling (= toename aantal cellen), maar ook tijdens hun ganse bestaan, blijft de nood aanwezig tot celvermenigvuldiging (= celvervanging). Alle cellen, behorend tot eenzelfde individu, bezitten eenzelfde genotype. In diercellen (= eukaryote celtype) zit dit genotype gematerialiseerd in afzonderlijke chromosomen (chromatinedraden in de interfase cel). Vermenigvuldiging van eukaryote cellen vereist aldus een mechanisme waarbij de chromosomen ondanks hun complexe structurele organisatie (= solenoïd model, chromatine/chromosoom), op een onveranderlijke manier worden doorgegeven aan de dochtercellen. Bij eukaryota zitten de chromosomen bovendien gecompartimentaliseerd binnen de celkern

2 en dienen de dochtercellen van de oudercel ook additionele elementen (celmachinerie), aanwezig in het cytoplasma en het plasmalemma, te verwerven. Mitose of eukaryote celdeling verwijst daarom naar een specifiek proces dat al deze bovenstaande behoeften op een correct reproduceerbare manier laat verlopen. Doelstelling: Via observatie en redenering wordt het probleem van celvermenigvuldiging inzichtelijk uitgewerkt. Naast louter herkennen van delingsstadia is het vooral de bedoeling dat de achterliggende betekenis en de intrinsieke karakteristieken van mitose duidelijker worden. Anderzijds wil dit practicum duidelijk maken dat mitose of eukaryote celvermenigvuldiging op zichzelf onvoldoende is om, vertrekkende van de eencellige zygote, een meercellig organisme te maken. Daarom wordt in een tweede practicumonderdeel ruime aandacht besteed aan processen als blastulavorming, gastrulatie en tot standkoming van de 3 kiembladen of orgaanvormende gebieden en dit bij een eenvoudig modelorganisme: de zeester (zie ook hoorcollege). Opdracht 1: Parthenogenese Tracht zelf het begrip parthenogenese te definiëren en geef twee voorbeelden van diersoorten waarbij dit proces gebeurt. Parthenogenese: feedback. Parthenogenese is een vorm van ongeslachtelijke (of maagdelijke) voortplanting waarbij vrouwtjes nakomelingen krijgen zonder de hulp van mannetjes. De maagdelijke vrouwtjes leggen spontaan eitjes of baren jongen. Voorbeelden vindt men bij de bijen, waar uit een onbevrucht eitje een dar ontstaat, en bij vele soorten bladluizen. Een belangrijk onderdeel van het examen is begrippen verklaren. Kom je nieuwe begrippen tegen in de cursus of tijdens het hoorcollege, dan is het belangrijk dat je zelf op zoek gaat naar de betekenis ervan. Raadpleeg hiervoor in de eerste plaats je handboek of kijk eens op internet. Op toledo vind je een lijst van begrippen, die gaandeweg het semester aan bod komen. Al de begrippen kunnen op deze manier ondervraagd worden. Opdracht 2: Solenoïd model Maak een schets van de verschillende spiralisatie niveaus om van een DNA helix tot een chromosoom te komen. Op die manier krijg je een overzicht van de verschillende stappen die een DNA helix, georganiseerd in chromatine, nodig heeft om te spiraliseren (condenseren) tot een chromosoom tijdens de mitose. Duid op je schets de volgende begrippen aan: chromosoom, chromatide, centromeer, chromatine, nucleosoom, histonen, kinetochoor Solenoïd model: feedback.

3 DNA materiaal wordt op verschillende niveaus opgewonden. De DNA dubbele helix Het draaien van de helix rond de kern van histoneiwitten (nucleosomen). De parelsnoer van nucleosomen wordt nogmaals rond een centrale as van histon 1- eiwitten gewikkeld. Op die manier bekom je een chromatinedraad. Wanneer de cel gaat delen, worden de chromatine draden nog verder opgewonden, zodat chromosomen zichtbaar worden. Van heel wat figuren wordt er verwacht dat je deze zelf schematisch kan tekenen. Maak tijdens het studeren voor jezelf schetsen en schema's. Het is een hulpmiddel om meer inzicht in de materie te krijgen. CELKWEEK Bij een in vitro celkweek worden cellen van een stabiele cellijn uitgezaaid in kweekflesjes, voorzien van het nodige medium. Deze kweekflesjes worden in een incubator geplaatst. Het tellen van cellen gebeurt aan de hand van een Bürker telkamer. Het onderscheid tussen levende en dode cellen kan aangetoond worden met trypaanblauw. Deze testkleurstof kleurt dode cellen blauw. Levende cellen nemen de kleurstof niet op en blijven ongekleurd. Gedifferentieerde cellen kunnen moeilijk in kweek gehouden worden, omwille van hun zeer

4 geringe delingscapaciteiten. Meestal wordt gewerkt met tumorcellen of stamcellen (totipotent of pluripotent). Noodzakelijke eisen voor een kweekmedium zijn: Energievoorziening voor de cel Bouwstenen voor aanmaak van zelf te synthetiseren biomoleculen Biomoleculen die de cel zelf niet kan synthetiseren Zorgen dat de cel osmotisch in evenwicht is Bufferend vermogen Opdracht: celdensiteit Om de celdensiteit te bepalen, maakt men gebruik van een Bürker telkamer. Er werd een verdunning gemaakt met trypaanblauw in verhouding 1 op 1. Bereken aan de hand van onderstaande figuur de celdensiteit (= aantal levende cellen/ml). Vul enkel het decimale getal in dat je bij je berekening bekomt voor het aantal cellen per ml Het aantal levende cellen = 41 Berekening: 41 x 10 4 x 2 = 82 x 10 4 cellen/ml = cellen/ml

5 Hoeveel cellen (met een celcyclus van 8 uur) moet je uitplaten om na exact 2 dagen 64 miljoen cellen te verkrijgen? Geef het antwoord in de vorm van een decimaal getal. 20 Na 2 dagen (= 48 uren) zijn er 6 cycli (van 8 uren) doorlopen. Bij iedere cyclus krijgen we een verdubbeling van het aantal cellen. 64 miljoen / 2 6 = 1 miljoen cellen. Celgroei- en mortaliteitscurve. Teken een celgroei- en mortaliteitscurve aan de hand van de gegeven data. Op dag 0, start van het experiment, werden cellen van een stabiele cellijn, in een gelijk aantal, uitgezaaid in kweekflesjes. De kweekflesjes, voorzien van het nodige medium, worden onder correcte kweekomstandigheden in de incubator geplaatst. Met telkens een interval van 24 uur werden willekeurig drie flesjes uit de incubator gehaald en het aantal aanwezige cellen per flesje (uitgedrukt in aantal cellen per ml) werd bepaald met behulp van een Bürker telkamer. Het tellen van de cellen gebeurde in aanwezigheid van trypaanblauw kleurstof, zodat het aantal levende en dode cellen apart genoteerd werden. De resultaten zijn weergegeven in onderstaande tabel. Aantal (x 10 4 ) levende en (dode) cellen/ml. Maak op basis van deze gegevens een celgroei- en mortaliteitscurve. (Tip: bereken eerst een gemiddelde van de drie flesjes). Tracht voor jezelf deze curve kritisch te analyseren en zoek een antwoord op de volgende vragen. Kan je voor jezelf een verklaring geven voor de vorm van deze groei- en mortaliteitscurve? Waarom bereiken de cellen een groeistop na continu doorkweken in hetzelfde medium? Welke gegeven informatie bevestigt deze hypothese? Geef een benaderende verdubbelingstijd van deze cellijn. Is in ideale omstandigheden de toename van het aantal cellen lineair of exponentieel?

6 Aan een groeicurve onderscheiden we volgende fasen: exponentiële fase, medium uitputtingsfase, lagfase, vergiftigingsfase. Plaats deze in de juiste volgorde en vul deze termen ook aan op je getekende groeicurve. Opdracht 3: Feedback. Groei kinetica van dierlijke celkweek. Bij optimale kweekomstandigheden vertonen cellen een karakteristiek groeipatroon (zie figuur). Een initiële lag fase, waarin er een verhoogde celactiviteit is, maar schijnbaar geen gestegen celgroei. De duur van deze fase hangt af van verschillende factoren. De lag fase wordt gevolgd door een log fase, waarin we een exponentiële groei vaststellen met hoge metabole activiteit. De cellen bereiken een stationaire fase, waar geen verdere groei is door uitputting van het groeimedium. Dit kan door accumulatie van toxische stoffen of door te weinig vrije ruimte. Indien er geen stappen worden ondernomen, zullen de cellen dood gaan. Dit resulteert in de verval fase van de groei curve. De verdubbelingstijd (= de tijd die nodig is om het aantal cellen te verdubbelen) wordt berekend in de logfase.

7 2.Celcyclus CELCYCLUS Inleiding Via specifieke DNA kleuring (Fuelgenkleuring, Fluoroescentiemerkers) kan de hoeveelheid DNA, aanwezig in een celkern, gekwantificeerd worden. Meting van de DNA hoeveelheid, aanwezig in de cel voorafgaand aan, tijdens en volgend op het delingsproces, heeft geleid tot het begrip celcyclus. Duid de juiste volgorde aan. G1, G1 checkpoint, G2, G2 checkpoint, S, M S, G1, G1 checkpoint, G2, G2 checkpoint, M G1, G1 checkpoint, S, G2, G2 checkpoint, M G1, S, G1 checkpoint, G2, G2 checkpoint, M Duid aan wat er precies gebeurt in elk stadium van de celcyclus. Indien je sommige combinaties fout maakt, lees dan nog eens in je handboek pg. 35 wat de verschillende stadia van de celcyclus precies inhouden. DNA replicatie Bijmaken van essentiële celorganellen en uitoefenen van celfunctie Controle punt dat na gaat of de verdubbeling van het genetisch materiaal correct is verlopen. Voorbereiding op de delingsfase Mitose en cytokinese Controle punt dat bepaalt of de cel al dan niet klaar is voor overstap naar de S fase S G2 G1 checkpoint M G2 checkpoint G1 Vervolledig de volgende zin door de correcte term te selecteren. Men definieert het proces cytokinese als zijnde een celdeling. Cytokinese is bijgevolg een proces dat volgt op CELDELING (MITOSE) een kerndeling. Hieronder zie je preparaten van de verschillende fasen van het mitose proces. Benoem de verschillende fasen van mitose en maak er een schets van. Tracht voor jezelf te formuleren wat er precies gebeurt tijdens de verschillende fasen.

8 Hieronder zie je opnieuw de preparaten van verschillende fasen van het mitose proces. Duid de juiste volgorde aan: Dit antwoord is correct! Indien je alle informatie nog eens wil nakijken, bekijk dan figuur 28 in je illustratiebundel en lees in je handboek pagina 36 en 37. In welke fase van de mitose zijn de chromosoomaantallen het best te tellen? Anafase Telofase Metafase Profase Kan je dit ook zien op voorgaande delingsfiguren? Tracht voor jezelf een verklaring te noteren. Ja

9 Neen 3. Klievingsdeling en embryonale ontwikkeling Feedback klievingsdelingen. A: Deze eicel heeft zeer weinig dooier. Oligolecithale eieren ondergaan een holoblastische klieving (= een volledige klieving). Dit soort eicellen komt voor bij de mens (de vroege klievingen zijn holoblastische klievingen), zie ook het filmpje van de ontwikkeling van de mens, dat je op het einde van het practicum kan bekijken. B: Dit is een eitype met extreem veel dooier in de eigenlijke eicel. Een kippenei is een voorbeeld van een telolecithaal ei. Telolecithale eieren ondergaan een discoã dale of schijfvormige klieving.

10 C: Hierbij ligt de dooier centraal met daarrond een dunne doorlopende cytoplasmatische cortex. Centrolecithale eieren komen bijvoorbeeld voor bij insecten. Centrolecithale eieren ondergaan een periblastische of oppervlakkige klieving. VROEGE EMBRYONALE ONTWIKKELING van de zeester (Asteria rubens). Inleiding: De stekelhuidigen of Echinodermata nemen een sleutelpositie in op de fylogenetische stamboom. In tegenstelling tot de overige ongewervelden (Invertebrata - Achordata), die als Protostomia worden aangeduid, bezitten de Echinodermata uitgesproken kenmerken die verwijzen naar hun verwantschap met de Chordata - Vertebrata, waartoe ook de zoogdieren en dus ook de mens behoren. Tijdens de embryonale ontwikkeling, die overeenkomstig de biologische recapitulatiewet een licht werpt op de fylogenetische oorsprong of ontstaansgeschiedenis van de groep waartoe het ontwikkelend individu behoort, is heel duidelijk waarneembaar dat de blastoporus of oermond, zichtbaar vanaf het gastrula stadium, later ontwikkelt tot anus en de mond een nieuwgevormde opening vertegenwoordigt. Echinodermata zijn dus net als chordata vertegenwoordigers van echte Deuterostomia-organismen. Verdere evidentie voor deze op het eerste zicht onverwachte evolutionaire verwantschap, kan men concluderen uit de manier waarop het derde, namelijk het mesodermale, kiemblad wordt gevormd. De blaasvormige laterale afsplitsingen vanuit de darm illustreren heel duidelijk de betekenis en oorsprong van het enterocoeloom. Beide observaties, later aangevuld met meer biochemisch fysiologische data (bvb. het gemeenschappelijk gebruik van creatinine fosfaat voor de snelle aanmaak van ATP), liggen aan de basis van de door Romer geformuleerde hypothese betreffende de evolutie van de Chordata - Vertebrata uit (een) invertebrate voorouder(s). Doelstelling: Inzicht verwerven in de vroeg embryonale ontwikkeling bij dieren aan de hand van totaalpreparaten en doorsneden, representatief voor opeenvolgende ontwikkelingsstadia. Naast de herkenning en benoeming van chronologisch opeenvolgende stadia, dient hierbij nagedacht over de modaliteiten waarop specifiek bij de hier bestudeerde zeester deze ontwikkeling wordt gerealiseerd. Bekijk aandachtig het filmpje over de ontwikkeling van de zeester. Het filmpje opent in een nieuw venster, om nadien verder te gaan met het practicum, sluit je dit venster. Probeer voor jezelf, op basis van het filmpje dat je zojuist bekeken hebt, een antwoord te zoeken op onderstaande vragen: Wat is de bedoeling van Meiose?

11 Kan gelijk welke cel meiose ondergaan? Verduidelijk je antwoord. Wat is het opvallende verschil tussen een vroege en een late blastula? Op onderstaande figuur zie je een eicel die net meiose heeft ondergaan. Hoe heet de kleine cel (?) die ontstaat tijdens de meiose? Poolgranula Poollichaampje Blastomeer. Zygote Dit antwoord is correct. Zie ook figuur 113 in de illustratiebundel. Primaire oã cyten ondergaan een meiose I en geven zo het ontstaan enerzijds aan genetisch verschillende secundaire oã cyten en anderzijds aan kleine, niet-functionele poollichaampjes. Welke afbeelding stelt een bevruchte eicel voor? Tracht voor jezelf te formuleren waarom. 2, omwille van de lichter wordende cortex van de cel. 1, omwille van het zichtbare fertilisatiemembraan. 1, omwille van de donkere opvulling van de cel. 2, omwille van de duidelijke dikkere celmembraan (= oã lemma). Dit antwoord is correct. Op figuur 1 zie je duidelijk het doorschijnende vliesje rond de bevruchte eicel, het fertilisatiemembraan.

12 Bestudeer onderstaande figuur. Welke klievingsdeling heeft de zeester? Holoblastische klieving. Periblastische klieving. Discoà dale klieving. Dit antwoord is correct! Net zoals bij de mens vertoont de zygote van een zeester holoblastische klievingsdelingen. Welk eitype heeft de zeester?

13 Centrolecithaal ei. Telolecithaal ei. Oligolecithaal ei. Dit antwoord is correct! Zoals eerder vermeld zijn de klievingsdelingen bij de zeester gelijkaardig aan die bij de mens. Aangezien ook in de eicel van een zeester maar weinig dooier aanwezig is en hierdoor een holoblastische klieving kan optreden, spreken we bij de zeester eveneens van een oligolecithaal ei. Hoe staan de delingsfiguren of klievingsvlakken in opeenvolgende klievingen t.o.v. elkaar? Loodrecht. Parallel. Dit antwoord is correct! Zie onderstaande figuur.

14 Hoe evolueert het volume van het totale embryo tijdens de klievingsdelingen? Gelijk aan de zygote. Kleiner dan de zygote. Groter dan de zygote. Dit antwoord is correct! Ter illustratie, zie onderstaande figuur. Hoe evolueert het volume van de individuele blastomeren? Het volume van de blastomeren blijft gelijk. Het volume van de blastomeren neemt toe. Het volume van de blastomeren neemt af. Dit antwoord is correct! Als je weet dat het volume van de zich delende zygote tijdens de klievingsdelingen constant blijft, is het logisch dat de gevormde cellen steeds kleiner worden en hun volume bijgevolg afneemt. Het onderstaande preparaat is een...

15 Gastrula Blastula Morula Zygote Helaas, dit antwoord is niet correct. Tip: deze structuur lijkt op een wel bepaalde vrucht, waaraan het zijn naam te danken heeft. In onderstaande figuur zie je enkele embryonale ontwikkelingsstadia van de zeester. Tracht aan de hand van de slides over embryonale ontwikkeling (zie hoorcollege), de stadia te benoemen en duid de cijfercombinatie aan die deze stadia in een juiste chronologische volgorde plaatst

16 Dit antwoord is niet correct. Als je weet dat jouw antwoord overeen komt met: "late blastula, vroege blastula, vroege gastrula, late gastrula", redeneer dan nog een keer opnieuw en kijk ter controle naar de figuren in je handboek. Het onderstaande preparaat is een... Zygote Morula Gastrula Blastula Dit antwoord is correct! Benoem vervolgens de aangeduide structuren van het preparaat.

17 Opmerking: Indien je deze vraag foutief beantwoordt, zoek de verschillende delen van een blastula dan nog eens op in je handboek. 1. Fertilisatiemembraan 2. Blastomeer 3. Blastocoel Hieronder zie je drie opeenvolgende figuren die het gastrulatieproces illustreren. Benoem de aangeduide structuren. Opmerking: Indien je deze vraag foutief beantwoord, zoek dan het verloop van het gastrulatieproces nog eens op in je cursus en/of handboek. 1. Blastoporus 2. Archenteron 3. Coeloom De latere bestemming van de blastoporus op voorgaand preparaat is de mond.

18 Dit antwoord is helaas niet correct. Bij het gastrulatieproces van de zeester wordt eerst de anus gevormd en daarna de mond. De mond is dus nieuwvorming, terwijl de anus uit de vroegere blastoporus zal ontstaan. Alle organismen waarbij het gastrulatieproces op deze manier verloopt, worden deuterostomia of deuterostomata genoemd (deutero = tweede, stomia = mond). Bekijk het preparaat opnieuw aandachtig. Om welk soort coeloom gaat het hier? Enterocoeloom Schizocoeloom Dit antwoord is correct! Duid aan welke snedes overeen komen met de verschillende figuren.

19 Opmerking: Indien je deze vraag foutief beantwoordt, teken voor jezelf dan nog eens bovenstaande figuur en maak een tekening van de doorsnedes op plaats 1, 2 en a 2. c 3. b Hieronder zie je twee doorsnedes door gastrula stadia, waarbij de rechtse figuur op een later tijdstip is genomen. Je ziet hier namelijk een doorlopend spijsverteringsstelsel. Benoem de genummerde structuren. Weet dat de embryo's in dezelfde richting op de lengte as georiã«nteerd liggen. 1. Anus 2. Mond Hieronder zie je een zij-aanzicht, of met andere woorden een lateraal zicht. Benoem de aangeduide specialisaties van het darmkanaal.

20 1. Anus 2. Einddarm 3. Maag 4. Voordarm 5. Mondveld Hieronder zie je twee afbeeldingen van een bipinnarialarve vanuit twee verschillende gezichtspunten. Beide larven liggen in dezelfde richting op de lengte as georiã«nteerd. Maak de juiste combinatie. 1. een dorsoventraal zicht 2. een lateraal zicht Ter opfrissing van de begrippen lateraal en dorsoventraal zicht, bekijk je best onderstaande illustratie. Maakte je in voorgaande opdracht de correcte combinatie?

21 Een larvaal stadium dat sterk verschilt van het volwassen of adulte stadium, impliceert een metamorfose of vormverandering, waarbij larvale structuren door apoptosis (= geprogrammeerde celdood) opgeruimd worden. Hierbij worden de gevormde bouwstenen gebruikt voor de opbouw van de adulte weefsels en organen.

22 Bekijk aandachtig onderstaande figuren, die elk een verschillend zicht tonen op de bipinnarialarve. Maak zo mogelijk een plasticinemodel van de larve met aanduiding van de mond en anus en het verloop van de cilliënband. Hierdoor krijg je een beter inzicht in de 3D structuur van deze larve. Tijdens de volgende practica oefeningen zal je meermaals geconfronteerd worden met zowel sagittale doorsnedes als dwarse of transversale doorsnedes. Ook is het mogelijk dat je werkt met een frontale doorsnede. Het is dan ook de bedoeling dat je de betekenis van deze verschillende soorten doorsnedes goed begrijpt en in je achterhoofd houdt. Op onderstaande figuren zijn drie verschillende doorsnedes van de regenworm te zien. Combineer de figuren met de naam van de doorsnede.

23 Opmerking: Noteer dat frontale en sagittale doorsnedes beiden overlangse of longitudinale doorsnedes zijn. Probeer voor jezelf ook bijkomende vraag te beantwoorden: Bij welke doorsnede zou men duidelijk, indien aanwezig, de bilaterale symmetrie zien? A. Sagittale doorsnede B. Frontale doorsnede C. Dw arse doorsnede