VERGELIJKENDE STUDIE TUSSEN CONVENTIONELE BACTERIOLOGIE EN HET GEBRUIK VAN CHROMOGENE AGAR PLATEN VOOR DE DIAGNOSE VAN ENDOMETRITIS BIJ DE MERRIE

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar VERGELIJKENDE STUDIE TUSSEN CONVENTIONELE BACTERIOLOGIE EN HET GEBRUIK VAN CHROMOGENE AGAR PLATEN VOOR DE DIAGNOSE VAN ENDOMETRITIS BIJ DE MERRIE door Lisse VERA Promotoren: Dr. Jan Govaere Dr. Filip Boyen Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef 2015 Lisse Vera

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar VERGELIJKENDE STUDIE TUSSEN CONVENTIONELE BACTERIOLOGIE EN HET GEBRUIK VAN CHROMOGENE AGAR PLATEN VOOR DE DIAGNOSE VAN ENDOMETRITIS BIJ DE MERRIE door Lisse VERA Promotoren: Dr. Jan Govaere Dr. Filip Boyen Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef 2015 Lisse Vera

5 VOORWOORD In de eerste plaats wens ik mijn promotoren te bedanken. Dr. Jan Govaere in t bijzonder omdat hij mij de kans gaf dit onderwerp verder uit te werken. Dr. Filip Boyen wens ik uitdrukkelijk te bedanken voor zijn leidende hand en kritische blik tijdens dit onderzoek. Daarnaast wens ik ook niet alleen Valérie de Lange, maar de gehele dienst Voortplanting en Verloskunde van de Grote Huisdieren Universiteit Gent te bedanken voor het verzamelen van de nodige stalen. Lars Hulpio ben ik dank verschuldigd voor het identificeren en invriezen van de kiemen en de hulp bij het uitvoeren van de verschillende testen. Daarnaast wens ik, niet te vergeten, mijn ouders, grootouders en vriend te bedanken. Niet alleen voor het kritisch nalezen van mijn werk, maar vooral voor alle steun die zij mij gedurende het schrijven van deze Masterproef en eigenlijk gedurende mijn gehele studieperiode verleend hebben. Tot slot wens ik alle professoren, dierenartsen en academische personeelsleden te bedanken voor het enthousiast overdragen van hun waardevolle kennis gedurende de afgelopen zes jaar.

6 INHOUD SAMENVATTING... 1 INLEIDING... 2 LITERATUURSTUDIE Staalname technieken voor bacteriologische screening van de uterus bij de merrie Preparatie van de merrie Non-guarded endometriale swabs Guarded endometriale swabs Low volume uteriene flush Conventionele bacteriologie Selectie, verzamelen en transporteren van stalen Identificatie van de oorzakelijke bacteriën Direct microscopisch onderzoek Het aanleggen van culturen Het uitvoeren van biochemische testen Samenvatting van de criteria voor identificatie van pathogene bacteriën Bacteriologische diagnose aan de hand van chromogene agar platen Wat zijn chromogene agar platen Voordelen betreffende het gebruik van chromogene agar platen Nadelen betreffende het gebruik van chromogene agar platen De meest voorkomende kiemen die endometritis veroorzaken bij de merrie Escherichia coli Identificatie aan de hand van conventionele bacteriologie Identificatie aan de hand van chromogene agar platen Streptococcus spp Identificatie aan de hand van conventionele bacteriologie Identificatie aan de hand van chromogene agar platen Staphylococcus spp Identificatie aan de hand van conventionele bacteriologie Identificatie aan de hand van chromogene agar platen Proteus spp Identificatie aan de hand van conventionele bacteriologie Identificatie aan de hand van chromogene agar platen Enterococcus spp Identificatie aan de hand van conventionele bacteriologie Identificatie aan de hand van chromogene agar platen Klebsiella pneumoniae... 21

7 4.6.1 Identificatie aan de hand van conventionele bacteriologie Identificatie aan de hand van chromogene agar platen Pseudomonas aeruginosa Identificatie aan de hand van conventionele bacteriologie Identificatie aan de hand van chromogene agar platen Gisten Identificatie aan de hand van chromogene agar platen Taylorella equigenitalis Identificatie aan de hand conventionele bacteriologie Identificatie aan de hand van chromogene agar platen ONDERZOEK Materialen en methoden Staalname Enten van de stalen Identificatie van de pathogene kiemen Conventionele bacteriologische identificatie Identificatie van de kiemen aan de hand van chromogene agar platen Resultaten DISCUSSIE EN CONCLUSIE LITERATUURLIJST BIJLAGEN Bijlage 1: Schematisch overzicht van de isolatiemethoden van de drie meest voorkomende endometritis veroorzakende kiemen bij de merrie... 45

8 SAMENVATTING Bij merries verdacht van endometritis kan de diagnose onder andere gesteld worden door het nemen van een representatief staal van het endometrium en het uitvoeren van een conventioneel bacteriologisch onderzoek om de oorzakelijke kiem te identificeren. Hiervoor dient het staal opgestuurd te worden naar een gespecialiseerd laboratorium. Een alternatief hiervoor zou het identificeren van de endometritis veroorzakende kiem door de praktiserende dierenarts zelf kunnen zijn, met behulp van chromogene agar platen. Deze chromogene agar platen zijn afkomstig uit de humane geneeskunde. Ze zijn ontworpen voor de diagnose van Urinary Tract Infections (UTI) veroorzakende kiemen. Deze chromogene platen bevatten specifieke substraten, die wanneer ze gehydrolyseerd worden door enzymen van pathogene micro-organismen een welbepaalde kleur vrijstellen. Op basis van de kleur die kolonies vertonen kunnen aldus de verschillende kiemen geïdentificeerd worden. Dankzij het gebruik van deze chromogene platen zouden tijd en kosten bespaard kunnen worden, de interpretatie zou daarenboven moeten kunnen gebeuren zonder specifieke bacteriologische training. In dit onderzoek werden 68 stalen genomen van merries verdacht van endometritis, waarvan 37 positief testten. Aan de hand van deze stalen werd de nieuwere methode, het enten van de stalen op chromogene agar platen, vergeleken met de conventionele bacteriologische identificatiemethode. Alle stalen werden hiervoor geënt op zowel een bloed agar plaat, een MacConkey agar plaat als een chromogene agar plaat (Chrome UTI Agar). Uit dit onderzoek bleek dat de identificatie van de pathogene kiemen, aan de hand van deze chromogene platen, niet zuiver op basis van kleur kan gebeuren. Er moet daarentegen gebruik gemaakt worden van verschillende biochemische testen om tot een waarschijnlijkheidsdiagnose te komen. Het is eveneens gebleken dat de meest voorkomende endometritis veroorzakende kiemen bij de merrie (Streptococcus spp., Staphylococcus spp. en E.coli) het moeilijkst te identificeren zijn aan de hand van deze platen, wat het gebruik van deze platen voor dit specifiek doel in vraag stelt. Zo werd aangetoond dat zowel Streptococcus spp. als Staphylococcus spp. truquoise-blauw kunnen kleuren, afhankelijk van het al dan niet produceren van het enzyme β- glucosidase. E. Coli geeft roze kolonies, maar bepaalde Staphyloccus spp. eveneens. Klebsiella spp. (donkerblauw) en Pseudomonas spp. (bruin) zijn wel eenvoudig te identificeren dankzij hun specifieke kleur. Over Proteus spp. en Enterococcus spp. kan geen uitspraak gedaan worden, daar deze kiemen hier niet geïdentificeerd werden. Trefwoorden: chromogene agar platen, endometritis, merrie, Chrome UTI Agar, bacteriologie

9 INLEIDING Endometritis is een veel voorkomende aandoening van de genitale tractus bij de merrie. De diagnose kan gesteld worden aan de hand van histologie, cytologie en/of cultuur (microbiologie), na het nemen van representatieve stalen. Deze stalen kunnen op verschillende manieren genomen worden, ofwel aan de hand van een guarded-swab, een cytologiebrush of een uteriene flush. In dit werk, dat een uitbreiding is op, en een verderzetting van mijn Masterproef deel 1: Gebruik van chromogenic agar plates voor snelle diagnose van endometritis bij de merrie, is het voornamelijk de bedoeling om dieper in te gaan op het klassiek bacteriologisch onderzoek: correcte staalname, isolatie en identificatie van de kiemen en de interpretatie van de bekomen resultaten. Daarnaast zullen de resultaten, bekomen aan de hand van de conventionele bacteriologische methode vergeleken worden met de resultaten bekomen door gebruik te maken van een nieuwere, mogelijk snellere en eenvoudigere isolatie- en identificatiemethode: het enten van de stalen op een chromogene agar plaat. De plaat die hiervoor zal gebruikt worden is de Chrome UTI Agar (Brillance UTI Agar) van Oxoid Microbiology Products. Het principe van deze chromogene agar platen is eenvoudig. De platen bestaan uit een cultuurmedium (agar) dat chromogene substraten bevat. Wanneer deze chromogene substraten gehydrolyseerd worden door enzymen van specifieke pathogene micro-organismen stellen zij een welbepaalde kleur vrij. Zo worden kolonies bekomen met een specifieke kleur, wat een snelle en precieze identificatie van de kiemen zou moeten mogelijk maken. Het voordeel van deze methode zou zijn dat ze snel en eenvoudig is en dus door elke praktiserende dierenarts zelf zou moeten kunnen uitgevoerd en geïnterpreteerd worden. Tevens zou het staal niet moeten opgestuurd worden naar een gespecialiseerd laboratorium, waardoor niet enkel tijd, maar ook kosten zouden kunnen bespaard worden. Het opzet van deze studie is dan ook niet alleen het isoleren en identificeren van de meest voorkomende bacteriën die endometritis veroorzaken bij de merrie, maar is voornamelijk gericht op het vergelijken van de resultaten bekomen met de twee methoden, om zo te achterhalen of de isolatie en identificatie van endometritis veroorzakende bacteriën met chromogene agar platen dezelfde resultaten oplevert als met de klassieke methoden en aldus eenvoudig in de praktijk zou kunnen gebruikt worden, zonder noodzakelijke bacteriologische training van de praktiserende dierenarts, enkel en alleen op basis van de kleur van de kolonies. 2

10 LITERATUURSTUDIE 1. Staalname technieken voor bacteriologische screening van de uterus bij de merrie 1.1 Preparatie van de merrie Hierbij dient vooraf opgemerkt te worden dat de laboresultaten slechts zo goed zijn als de genomen stalen hun toelaten te zijn. Een juiste en zorgzame techniek is dus een strikte vereiste (Quinn et al., 2002a; Carter en Wise, 2004b; McKinnon et al., 2011b). De staart van de merrie moet gebandageerd en opzij gebonden worden, om elke vorm van contaminatie te vermijden (McKinnon et al., 2011b). Vervolgens is het noodzakelijk de vulva en perineum streek herhaaldelijk te wassen met povidoneiodine scrub om contaminatie van de genitale tractus te vermijden (Overbeck et al., 2010). Wanneer deze desinfectantia regelmatig en overvloedig gebruikt worden voor het reinigen van de vulva en perineum streek, kan de kolonisatie van de fossa clitoridis door resistente micro-organismen zoals Klebsiella Pneumonia en Pseudomonas aeruginosa in de hand gewerkt worden (McKinnon et al., 2011b). Daarom is het noodzakelijk telkens grondig te spoelen na het wassen (LeBlanc et al., 2007; McKinnon et al., 2011b). 1.2 Non-guarded endometriale swabs Hiervoor wordt een steriel vaginaal speculum in de vagina ingebracht, doorheen het speculum is de cervix zichtbaar. Een swab, die op een steriele inseminatiepipet bevestigd is, wordt doorheen het speculum via de cervix in de uterus binnengebracht. De swab dient enkele keren over het endometriale oppervlak rondgedraaid te worden gedurende 15 tot 30 seconden, om voldoende uterussecreet op te nemen. Vervolgens wordt de swab opnieuw doorheen het speculum verwijderd (Ball et al., 1988; Nielsen, 2005; Riddle et al., 2007; McKinnon et al., 2011b; Walter et al., 2012). Het is noodzakelijk de swab onmiddellijk in amies choarcoal transportmedium te plaatsen (Ball et al., 1988; Riddle et al., 2007; McKinnon et al., ; Walter et al., 2012). 1.3 Guarded endometriale swabs Deze manier van staalname geniet de voorkeur ten opzichte van de non-guarded methode. Met deze methode wordt een meer representatief staal genomen, met andere woorden zonder contaminatie uit de vagina. Er kan gebruik gemaakt worden van de double-gloved techniek of van speciaal hiertoe ontworpen swabs. Deze worden beschermd door een omhulsel, zodat de swab op een steriele wijze tot aan de cervix kan gebracht worden. Beide, swab en omhulsel, worden doorheen de cervix gebracht. Eens in de uterus wordt de swab doorheen het omhulsel doorgeschoven. Op deze manier kan een zo representatief mogelijk, niet gecontamineerd staal van de uterus genomen worden. Nadien wordt de swab opnieuw in het omhulsel getrokken en verwijderd (McKinnon et al., 2011b). Een contacttijd van 15 tot 30 seconden met het endometrium is ook hier noodzakelijk (Ball et a., 1988; LeBlanc et al., 2007; Riddle et al., 2007; McKinnon et al., 2011b;,Walter et al., 2012). De swab dient 3

11 eveneens in amies choarcoal transportmedium geplaatst te worden (Ball et al., 1988; Riddle et al., 2007; McKinnon et al., 2011b; Walter et al., 2012). 1.4 Low volume uteriene flush Indien er vloeibare inhoud of purulent materiaal in de uterus aanwezig is kan dit geaspireerd worden. Van deze inhoud kan vervolgens een swab genomen worden, wat als representatief staal voor verder onderzoek kan dienen (McKinnon et al., 2011b). Als alternatief of als geen vloeistof of pus aanwezig is, kan overgegaan worden tot een uteriene spoeling, anders gezegd een low volume uteriene flush (LeBlanc et al., 2007). Hierbij wordt een uteriene katheder manueel via de vagina ingebracht, met gebruik van een steriele handschoen. De katheder wordt doorgeschoven doorheen de cervix, tot in de uterus. Dit totdat de katheder zich net voorbij de cervix, in de uterus bevindt. Via deze weg wordt nu 20 tot 60 ml steriele fysiologische oplossing in de uterus gebracht (LeBlanc et al, 2007; McKinnon et al., 2011b). Er wordt gebruik gemaakt van fysiologische oplossing in plaats van ringer lactaat, omdat aangetoond werd (LeBlanc et al., 2007) dat de veranderingen in ph van de efflux, geassocieerd met isolatie van bacteriën, groter waren bij het gebruik van een fysiologische oplossing. Vervolgens wordt de uterus rectaal gepalpeerd en gemanipuleerd om de vloeistof zoveel mogelijk over het volledige endometrium te verspreiden. Dit om een zo representatief mogelijk staal van de volledige uterus te bekomen. Nadien wordt zoveel mogelijk vloeistof opnieuw uit het uteriene lumen geaspireerd. Van het bekomen staal wordt 4 ml apart gehouden voor ph bepaling, de rest wordt gecentrifugeerd. Nadien worden swabs genomen van de verkregen pellet, deze kunnen dienen als representatief staal. Met deze techniek worden merries die als negatief bestempeld werden, aan de hand van de swab methode, vaak alsnog onderkend. Dit omdat met de swab methode enkel een beeld verkregen wordt van het endometriale oppervlak net craniaal van de cervix. Met de uteriene spoeling daarentegen, wordt een beeld verkregen van het volledige endometriale oppervlak (LeBlanc et al., 2007). 2. Conventionele bacteriologie 2.1 Selectie, verzamelen en transporteren van stalen Het bacteriologisch onderzoek is noodzakelijk voor het correct identificeren van het etiologisch agens en de bijhorende antimicrobiële gevoeligheid van de gevonden pathogenen (Quinn et al., 2002a; Carter en Wise, 2004b). Hiervoor is het belangrijk dat een, op een correcte manier genomen en dus representatief staal (Quinn et al., 2002a; Carter en Wise, 2004b; Songer en Post, 2005a; McKinnon et al., 2011b) opgestuurd wordt naar een veterinair laboratorium. Hierbij moeten enkele specifieke punten in acht genomen worden. Idealiter wordt het staal genomen voor het aanwenden van één of andere antimicrobiële therapie. De stalen moeten daarenboven genomen worden op de plaats waar het pathogeen hoogst waarschijnlijk aanwezig is en moeten gecollecteerd worden met zo weinig mogelijk contaminatie. Bij warm weer kan koeling van de stalen noodzakelijk zijn (Quinn et al., 2002a; Songer en Post, 2005a). De swabs moeten tevens getransporteerd worden in een geschikt, niet nutritioneel, transport medium (Quinn et al., 2002; Carter en Wise, 2004; Songer en Post, 2005), zoals bijvoorbeel amies choarcoal transportmedium (Ball et al., 1988; Riddle et al., 2007; McKinnon et al., 2011b; Walter et al., 2012), om de pathogene kiemen in leven de houden en overgroei van eventuele 4

12 contaminanten te voorkomen (Songer en Post, 2005a). Amies choarcoal transportmedium neutraliseert toxines en bevat groei inhibitoren, dit medium is voornamelijk aanbevolen voor Taylorella equigenitalis. Stuart s medium is tevens een geschikt transportmedium en is aangeraden voor de meeste aerobe en aerotolerante micro-organismen. De swabs mogen nooit in een bacteriostatische zoutoplossing of media die ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) bevatten geplaatst worden. (Songer en Post, 2005a). Het is ook steeds aangeraden een korte anamnese bij te voegen, betreffende de diersoort, de leeftijd, klinische symptomen, eventuele ingestelde therapieën, waarschijnlijkheidsdiagnose, etc. (Quinn et al., 2002a; Carter en Wise, 2004b; Songer en Post, 2005a). 2.2 Identificatie van de oorzakelijke bacteriën De identificatie van de oorzakelijke bacteriën kan gebeuren aan de hand van direct microscopisch onderzoek van het staal door middel van een gekleurd uitstrijkje, in combinatie met cultuur en biochemische karakteristieken en/of immunologische en moleculaire methoden (Quinn et al., 2002a; Carter en Wise, 2004b; Songer en Post, 2005a) Direct microscopisch onderzoek Met de klinische symptomen en de te verwachten pathogenen in het achterhoofd wordt eerst een direct microscopisch onderzoek uitgevoerd (Quinn et al., 2002a; Carter en Wise, 2004b; Songer en Post, 2005a). Hierbij wordt een uitstrijkje gemaakt van het verkregen staal, wat vervolgens gekleurd wordt (Quinn et al., 2002a; Songer en Post, 2005a). De gram kleuring vormt de basis voor de fenotypische karakterisatie van de bacterie (Songer en Post, 2005a). Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen gram positieve of gram negatieve bacteriën en het uitzicht van de bacteriën (bijvoorbeeld kokken of staafjes), tevens wordt een idee verkregen van het aantal aanwezige bacteriën in het staal (Songer en Post, 2005a). De gram kleuring wordt standaard gebruikt voor het kleuren van bacteriën in uitstrijkjes. Tijdens het ontkleuringsproces met alcohol wordt het kristalviolet weerhouden in de celwand van gram positieve bacteriën, welke dus paars kleuren. De gram negatieve kiemen daarentegen worden wel ontkleurd door de alcohol en worden nadien aangekleurd met fuchsine of safranine, waardoor deze kiemen rood kleuren. Vervolgens werden de preparaten afgelezen met een microscoop (1000x vergroting) Het aanleggen van culturen De keuze van het cultuurmedium en de atmosferische conditie, die essentieel zijn voor de isolatie van bacteriën, hangt af van de te verwachten kiemen (Quinn et al., 2002a). Voor routine gynaecologisch onderzoek wordt meestal geënt op bloed agar en MacConckey agar (Quinn et al., 2002a; Carter en Wise, 2004b; McKinnon et al., 2011b). 5

13 Bloed agar is een rijk medium, dat de groei van de meeste snelgroeiende pathogene bacteriën toelaat. Het bestaat uit trypticase soya agar aangerijkt met 5% schapenbloed. Met behulp van deze agar kan tevens het hemolytisch patroon van de kiem beoordeeld worden (Quinn et al., 2002a). Sommige bacteriën produceren extracellulaire enzymes, zoals hemolysine, die de rode bloedcellen in de bloed agar lyseren. Dit exotoxine diffundeert rondomrond de kolonie, wat zorgt voor een destructie van de rode bloedcellen in het medium rondomrond de kolonies, hierdoor verandert het medium van uitzicht. Er bestaan verschillende soorten van hemolyse. Alpha-hemolyse betekent een partiële lyse van de rode bloedcellen, waardoor een groen-grijze tot bruine ontkleuring van de agar onstaat rondomrond de kolonies. Deze alpha-hemolyse is het gevolg van de reductie van hemoglobine tot methemoglobine. Beta-hemolyse betekent een complete lyse van de rode bloedcellen rondomrond de gevormde kolonies, de bloed agar wordt aldus volledig ontkleurd. Gamma hemolyse betekent geen aanwezigheid van hemolyse, het medium ondergaat geen veranderingen rondomrond de gegroeide kolonies. MacConckey agar is een meer selectief medium dat galzouten bevat, waardoor het zeer goed bruikbaar is voor de isolatie van Enterobacteriaceae en andere gram negatieve bacteriën. Het laat tevens de differentiatie tussen lactose fermenterende en niet lactose fermenterende kiemen toe. Kolonies die lactose kunnen fermenteren kleuren roze op deze agar omdat het medium neutraal rood als ph indicator bevat. Lactose fermenterende kiemen zullen zure bijproducten vormen en aldus zal de ph indicator rood-roze verkleuren. Niet lactose fermenterende kiemen daarentegen zullen de peptiden in het medium metaboliseren, waardoor er alkalische bijproducten ontstaan en de ph indicator en vervolgens ook de kolonies aldus een wit-gele kleur zullen vertonen. MacConckey agar bestaat met en zonder crystal violet en met of zonder natrium chloride. Natrium chloride wordt weggelaten uit het medium, om een elektrolyten deficiëntie te creëren in het medium, waardoor het zwermen van Proteus spp. over de agar plaat voorkomen wordt. Het crystal violet wordt uit het medium weggelaten om groei van Staphylococcus spp., Enterococcus spp. en Myobacterium spp. toe te laten (Quinn et al., 2002a). De MacConckey agar die meestal standaard gebruikt wordt is deze met crystal violet en NaCl. De geïnoculeerde media worden in een incubator geplaatst, met de gewenste atmosferische omstandigheden (bloed platen met extra CO 2 en MacCockey platen zonder extra CO 2 ), aan een temperatuur van 35 tot 37 C, wat de optimale groei temperatuur is voor de meeste pathogene bacteriën. De platen dienen te worden gecontroleerd op groei na 24 en 48 uur (Songer en Post, 2005a; McKinnon et al., 2011b). De platen moeten geïnoculeerd worden gebruik makend van een specifieke techniek (Fig.1). Met behulp van een entoog wordt een deel van het te enten staal opgenomen. Vervolgens wordt met het entoog plat tegen de agar plaat in een zigzaggende beweging gewreven(1). Daarna wordt de agar plaat graden gedraaid waarbij het entoog opgeheven wordt en vanuit de vorige entplaats zigzaggend verder gestreken wordt. Dit wordt nog 2 maal herhaald (3,4). Op een gegeven moment (4) zal het staal dusdanig verdund zijn, dat op deze plaats een discrete groei van individuele kolonies 6

14 verkregen wordt. Dit is een essentieel gebeuren, zeker voor de identificatie van pathogenen uit stalen die mogelijks microbiologische contaminanten, afkomstig van de normale flora of de omgeving, bevatten. Definitieve identificatie van een potentieel pathogeen agens, vereist subcultuur van een geïsoleerde kolonie, welke dan kan onderworpen worden aan biochemische testen (Quinn et al., 2002a). Figuur 1 Incubatietechniek om geïsoleerde kolonies te bekomen op een cultuur medium (9) Het uitvoeren van biochemische testen Biochemische tests zijn gebaseerd op de katabolische activiteit van de bacteriën. Een indicator systeem wordt meestal gebruikt om het gebruik van een bepaald substraat aan te tonen (Songer en Post, 2005a). Hieronder zullen de meest relevante biochemische testen in het kader van dit onderzoek verder beschreven worden. Katalase test: katalase is een enzyme dat geproduceerd wordt door vele aerobe en facultatief anaerobe micro-organismen. Het zorgt voor het omzetten van waterstofperoxide in water en zuurstof (Quinn et al., 2002a). 2 H 2 O > 2 H 2 O + O 2 Tijdens de aerobe ademhaling ontstaat waterstofperoxide, dit is giftig voor het micro-organisme. Katalase voorkomt dus dat het micro-organisme zou afsterven door het waterstofperoxide af te breken. De aanwezigheid van het enzyme katalase is heel eenvoudig waar te nemen door één druppel waterstofperoxide in contact te brengen met koloniemateriaal. Wanneer de kiemen het enzyme bezitten wordt onmiddellijk een bruisreactie waargenomen, bij afwezigheid van het enzyme gebeurt er niets ( Oxidase test: dit is een eenvoudige en goedkope test die gebruikt wordt om strikt aerobe microorganismen zoals de endometritis bij de merrie veroorzakende kiemen Pseudomonas spp. te onderscheiden van facultatief anaerobe micro-organismen zoals de Enterobacteriaceae. Met deze test worden ademhalingsenzymen aangetoond die in strikt aerobe micro-organismen in hoge concentraties aanwezig zijn (Quinn et al., 2002a). Er wordt hiervoor koloniemateriaal op een speciaal hiertoe ontworpen papiertje gebracht. Dit papiertje bevat N,N-dimethyl-p-phenyleendiamine en ALFA-naphtol 7

15 die in aanwezigheid van het enzyme cytochroom oxidase C onmiddellijk donkerpaars verkleuren. Indien deze paarse kleur verschijnt wordt de test dus als zijnde positief beschouwd ( Indol test: dit is een test die de aanwezigheid van het enzyme tryptofanase bevestigt door aantonen van indol, een splitsingsproduct van het aminozuur tryptofaan. Tryptofaan + H 2 O = indol + CH 3 COCOOH + NH 3 De te onderzoeken stammen worden geënt in 5 ml tryptonwater en gedurende 24 uur geïncubeerd bij 37 C. Na de incubatieperiode worden enkele druppels Kovac s reagens toegevoegd. Bij aanwezigheid van het enzyme tryptofanase zal indol gevormd worden, wat reageert met Kovac s reagens onder vorming van een rode kleurstof. Indien aldus een rode kleur verschijnt wordt de test als zijnde positief beschouwd ( Methylrood test: de methylrood test wordt gebruikt om darmbacteriën te identificeren op basis van hun glucosemetabolisme. Alle darmbacteriën produceren aanvankelijk pyrodruivenzuur uit glucose. Sommige darmbacteriën gaan vervolgens het pyrodruivenzuur omzetten in andere zure eindproducten zoals melkzuur, azijnzuur en mierenzuur. Methylrood is een ph indicator, die omslaat van geel naar rood bij een ph lager dan 4.2. Wanneer aldus deze zure eindproducten geproduceerd worden, zal een rode kleuromslag plaatsvinden (positieve methylrood test). Andere darmbacteriën gaan het pyrodruivenzuur omzetten tot neutrale eindproducten. De kleuromslag zal dus niet plaatsvinden, een gele kleur betekent dus een negatieve methylrood test ( Urease test: met de urease test wordt nagegaan of de kiem in staat is ureum om te zetten in ammoniak. De ph indicator die hiervoor gebruikt wordt is fenolrood. Urease positieve bacteriën zetten het ureum om in ammoniak, waardoor de ph stijgt en het medium een felroze kleur gaat vertonen. Proteus spp. doen dit binnen de 3 tot 5 uur, de meeste andere Enterobacteriaceae zijn urease negatief ( PYR spot test: dit is een test waarmee de aanwezigheid van het hydroloserend vermogen van de kiem voor pyrrolindonyl-b-naphthylamide (PYR) getest wordt. Deze test kan gebruikt worden om een onderscheid te maken tussen Enterococcus spp. en Streptococcus spp. Als de PYR test positief is gaat het om Enterococcus spp., als deze negatief is om Streptococcus spp. (CHROMagar). Bile esculin test: dit is een test die gebruikt wordt om bacteriën te identificeren die esculin kunnen hydrolyseren in de aanwezigheid van gal. Deze test kan gebruikt worden om streptokokken afkomstig uit Lancefield groep D en enterokokken te onderscheiden van de overige streptokokken. Het principe van deze test is dat het bile esculin medium esculin en peptone bevat voor de voeding van bacteriën. Daarnaast bevat het medium ook nog gal, wat andere gram positieve bacteriën, behalve enterokken en streptokokken uit de Lancefield groep D, inhibeert. Esculin is een glycoside dat bestaat uit glucose en esculetine. Deze verbindigen worden makkelijk gehydrolyseerd onder zure omstandigheden, maar enkel enterokokken en streptokokken uit lancefield groep D kunnen dit in aanwezigheid van gal. Het 8

16 aanwezige esculin zal dan reageren met een kleurindicator en de agar zal donkerbruin tot zwart verkleuren, het verschijnen van een donkerbruine tot zwarte kleur over meer dan de helft van de agar na 48 uur incubatie betekent een positieve test. Een positieve test wil dus zeggen dat de kiem in staat is esculin te hydrolyseren tot glucose en esculetine in aanwezigheid van gal, de desbetreffende kiem is aldus een streptokok behorende tot de Lancefield groep D, of een enterokok. Een negatieve test wil zeggen dat de kiem een streptokok is, die niet behoort tot de Lancefield groep D ( Coagulase test: deze test wordt gebruikt op coagulase positieve stafylokokken, zoals Staphyloccus aureus, te onderscheiden van coagulase negatieve stafylokokken. Coagulase is een enzyme dat fibrinogeen (oplosbaar) uit het plasma omzet in fibrine (onoplosbaar). Er bestaan 2 soorten van coagulase, het gebonden en het ongebonden. De slide coagulase test wordt uitgevoerd om het ongebonden coagulase te detecteren. Hierbij wordt een druppel plasma op een draagglaasje aangebracht, waaraan wat materiaal van de te testen kolonies wordt toegevoegd. Bij een positieve test verschijnt na 5 tot 10 seconden klontervorming of zogenaamde coagulatie ( Samenvatting van de criteria voor identificatie van pathogene bacteriën Eerst wordt de morfologie en de kleur van de kolonie beoordeeld, evenals de aan- of afwezigheid van hemolyse op bloed agar. Het gram positief of gram negatief karakter speelt tevens een grote rol. Ook de motiliteit en de mogelijkheid om te groeien op MacConckey agar zijn belangrijke criteria. Daarnaast worden bijkomende biochemische testen uitgevoerd. Zo wordt onder andere de reactie in de katalase en oxidatie test beoordeeld. Ook andere, eerder beschreven biochemische testen zoals een indol test of methylrood test kunnen uitgevoerd worden, om alzo, via een beslissingsboom, tot een waarschijnlijkheidsdiagnose te komen (Quinn et al., 2002a; Carter en Wise, 2004b; Songer en Post, 2005a). De beslissingsbomen die in het kader van dit onderzoek gebruikt werden, worden verderop weergegeven. 3. Bacteriologische diagnose aan de hand van chromogene agar platen 3.1 Wat zijn chromogene agar platen Chromogene agar platen zijn sinds 1990 commercieel beschikbaar (McKinnon et al., 2011a; Perry en Freydiere, 2007). Ze werden ontworpen voor de humane geneeskunde, meer specifiek voor de identificatie van Urinary Tract Infection (UTI) veroorzakende kiemen. Het principe van deze agar platen is dat ze verschillende chromogene substraten bevatten die, wanneer ze gehydrolyseerd worden door specifieke enzymen van bepaalde pathogene bacteriën, een welbepaalde kleur vrijstellen. Op deze manier vertonen de verschillende bacteriële kolonies een specifieke kleur, wat identificatie van sommige pathogene bacteriën met een hoge specificiteit toelaat (Samra et al., 1998; Chaux et al., 2002; Perry en Freydiere, 2007; McKinnon et al., 2011a). 9

17 De chromogene agar platen die kunnen gebruikt worden voor de identificatie van endometritis veroorzakende kiemen zijn deze uit de humane afkomstige, chromogene media die gebruikt worden voor de isolatie en identificatie van urineweginfecties veroorzakende pathogenen. De verschillende agar platen die kunnen gebruikt worden, worden weergegeven in onderstaande tabel (Tabel 1). De enige chromogene agar plaat die tot op heden getest is voor het identificeren van endometritis veroorzakende kiemen bij de merrie is de Chrome UTI Agar, ook wel Brilliance UTI Agar genoemd, van Oxoid Microbiology Products (McKinnon et al., 2011a). Tabel 1 Weergave van de verschillende chromogene agar platen die zouden kunnen gebruikt worden voor de identificatie van endometritis veroorzakende kiemen Chromgene agar platen gebruikt voor de isolatie en Auteur identificatie van pathogenen die UTI veroorzaken Chrome UTI Agar Miles en Wren (2005) CHROMagar Orientation Samra et al. (1998) Chaux et al. (2002) Miles en Wren (2005) CPS ID2 Navarro et al. (1996) Scarparo et al. (2002) Chaux et al. (2002) Miles en Wren (2005) Rainbow UTI Agar Carracajo et al. (1999) UriSelect 3 / 4 Delport et al. (2013) Deze media zijn gebaseerd op de Cystine Lactose Electrolyte Deficient agar (CLED agar), wat ervoor zorgt dat bijna alle urinaire kiemen hierop groeien en dat tevens het zwermen van Proteus spp. over de agar plaat wordt tegengegaan ( Hieronder volgt een opsomming van de enzymen, waarvoor de commercieel beschikbare chromogene agar platen een specifiek substraat bevatten. Deze media bevatten een chromogeen substraat voor het enzyme β-glucuronidase of het enzyme β- galactosidase. Dit enzyme wordt gebruikt voor de identificatie van E. coli. E. coli produceert als enige van de Enterobacteriaceae, die vaak teruggevonden wordt in humane urinestalen, het enzyme β- glucuronidase (Perry en Freydiere, 2007). Het gebruik van β-galactosidase in plaats van β- glucuronidase vermindert de specificiteit voor de identificatie van E. coli (Perry en Freydiere, 2007). De media bevatten tevens tryptofaan, zodat tryptofaan deaminase activiteit zichtbaar wordt, wat een indicatie geeft voor de aanwezigheid van een kiem uit de PPM groep, dit wil zeggen Proteus spp., Providencia spp. of Morganella spp. (Perry en Freydiere, 2007). Ze bevatten tevens een chromogeen substraat voor het enzyme β-glucosidase, dit enzyme wordt geproduceerd door Klebsiella spp., Enterobacter spp. en Serratia spp (Perry en Freydiere, 2007), maar eveneens door sommige Streptococcus spp. en Staphylococcus spp. (Schaefler et al., 1969). 10

18 De identificatie van de bacteriën gebeurt dus aan de hand van het al dan niet produceren van deze specifieke enzymen door de desbetreffende kiemen en hun bijhorende specifieke kleur op de chromogene agar platen (Carricajo et al., 1999; Miles en Wren, 2005). In onderstaande tabellen wordt weergegeven welke bacteriële enzymen gedetecteerd worden door de verschillende commercieel beschikbare media (Tabel 2) en welke kleur de meest voorkomende pathogene bacteriën zullen vertonen (Tabel 3). Tabel 2 Deze tabel geeft de gedetecteerde bacteriële enzymen door de verschilllende chromogene agar platen weer (Carricajo et al., 1999) Gedetecteerd enzyme CPS ID2 UriSelect 3 /4 Chrome UTI Agar CHROMagar Orientation β-glucuronidase + (roos) + (roos) (roos) β-galactosidase (roos) + (roos) - Tryptofaan deaminase + (bruin) + (bruin) + (bruin) + (bruin) + (bruin) Rainbow UTI Aar β-glucosidase + (blauw) + (blauw) + (blauw) + (blauw) + (blauw) Tabel 3 Deze tabel geeft het al dan niet produceren aan van specifieke enzymen door pathogene kiemen die endometritis kunnen veroorzaken bij de merrie. Aan de hand van het al dan niet produceren van deze enzymen zullen de verschillende kiemen verschillende kleuren vertonen op chromogene agar platen, wat identificatie van de bacteriën mogelijk maakt. Organisme β- galactosidase β- glucosidase Tryptofaandesaminase (TDA) β- glucuronidase Kleur van de kolonie Turquoise-blauw Enterococcus spp. Afwezig Aanwezig Afwezig Afwezig Roze Escherichia coli Aanwezig Afwezig Afwezig Aanwezig 11

19 Paars donker blauw Klebsiella spp. en Enterobacter spp. Aanwezig Aanwezig Afwezig Afwezig Bruin Proteus spp. Afwezig Afwezig Aanwezig Afwezig ( Bruin - groen doorzichtig Pseudomonas spp. Afwezig Afwezig Afwezig Afwezig Fluorescerend (onder de lamp van Wood) Normale pigmentatie Staphylococc us spp. Afwezig Afwezig Afwezig Afwezig 12

20 Normale pigmentatie Aan-of afwezig indien β- glucosidase afhankelijk van afwezig Streptococcus Afwezig de Afwezig Afwezig spp. antigenische Blauwe kleur indien β- groep glucosidase aanwezig (meestal aanwezig bij groep B en D) (Schaefler et al., 1969) Schimmels en gisten Afwezig Afwezig Afwezig Afwezig Wit 3.2 Voordelen betreffende het gebruik van chromogene agar platen Voor het aanleggen van deze culturen zouden geen gespecialiseerde laboratoria nodig zijn, zodat de stalen door de praktiserende dierenarts zelf kunnen gescreend worden op de aanwezigheid van pathogene kiemen. Slechts een minimale biologische training zou noodzakelijk zijn om de resultaten correct te interpreteren. Tevens zijn er geen transportkosten om het staal naar het labo te brengen. Bovendien is deze methode uiterst geschikt voor sterk gecontamineerde stalen, daar de verschillende kiemsoorten duidelijk opvallen dankzij hun specifieke kleur (Miles en Wren, 2005; McKinnon et al., 2011a). Een ander voordeel is dat simultane identificatie van gram positieve en gram negatieve bacteriën en zelfs schimmels en gisten mogelijk is. Dit is ook mogelijk op de klassieke platen, maar het onderscheid op de chromogene platen is eenvoudiger dankzij de verschillende kleuren die de kolonies vertonen (Samra et al., 1998). 3.3 Nadelen betreffende het gebruik van chromogene agar platen Een eerste nadeel is de licht hogere kostprijs, die pas gecompenseerd kan worden door de mindere werkuren en minder opleiding van het personeel, wanneer er vele stalen getest worden op jaarbasis (Miles en Wren, 2005; McKinnon et al., 2011a; Delporte et al., 2013). Zo kost bijvoorbeeld een bloed agar plaat 0.42, een MacConcky agar plaat 0.37 en de Chrome UTI agar 0.76 per plaat, wanneer aangekocht bij Oxoid Microbiology Products ( Chaux et al. (2002) 13

21 vermelden duidelijk dat in hun studie, uitgevoerd in de humane geneeskunde, geen onderzoek gedaan werd naar cost-benefit, maar dat het duidelijk is dat in ontwikkelde landen, waar de onderzoekstijd duur is, chromogene agar platen zeker economisch gunstig zijn. Dit door de directe, snelle identificatie van 60% van de meest voorkomende oorzakelijke kiemen van Urinary Tract Infections (UTI) bij de mens (Chaux et al., 2002), wat reagentia en tijd bespaart (Navarro et al., 1996; Chaux et al., 2002; Carricajo et al., 1999). In dit kader toonden Perry en Freydiere (2007) aan dat voor de detectie van UTI pathogenen tot 46% kosten kunnen bespaard worden op de media en 67% op het lager aantal werkuren. Bovendien bieden deze chromogene agar platen geen voordeel voor de screening en diagnose van Taylorella equigenitalis, het oorzakelijk agens van contagieuze equine metritis (CEM), daar microaerofiele incubatie hier eveneens noodzakelijk zal zijn om kiemgroei te bekomen (McKinnon et al., 2011a). 4. De meest voorkomende kiemen die endometritis veroorzaken bij de merrie Bacteriën die endometritis bij paarden veroorzaken zijn meestal opportunistische kiemen (Wittenbrink, 2012). Daarenboven wordt endometritis in de meeste gevallen veroorzaakt door een eerder klein aantal verschillende bacteriën (Albihn et al., 2003; Nielsen, 2005; Writtenbink, 2012). Door verschillende auteurs worden telkens ofwel Escherichia coli, ofwel Streptococcus spp. als meest voorkomende oorzakelijke bacteriën naar voor geschoven (zie Tabel 4). In de hierop volgende beschrijving van identificatiemethoden zal dan ook enkel rekening gehouden worden met de meest voorkomende, kleine groep van endometritis veroorzakende kiemen. Deze methode is niet sluitend wanneer alle kiemen (ook deze welke geen, of slechts heel occasioneel endometritis veroorzaken ) in acht worden genomen. De bacteriesoorten die aldus meer occasioneel gelinkt worden aan endometritis, kunnen aan de hand van de hier beschreven, beknopte identificatiemethode niet of verkeerdelijk geïdentificeerd worden. Tabel 4 Frequentie van voorkomen van de verschillende bacteriën die endometritis bij de merrie veroorzaken volgens diverse auteurs Auteur Ball et al., 1988 Albihn et al., 2003 Riddle et al., 2007 Overbeck et al., 2010 Mc Kinnon et al., 2011 Concagul en Seyrek- Intas, 2013 E.coli 25.7% 67% 17% 10.9% 33.6 % 21.9% Steptococcus spp. 14.3% 20% 34% 9.1% 27.8% 41.8% Staphylococcus spp. 2% 18.0% 7.2% Proteus spp. 7.0% 0.3% Enterococcus spp. 1% 5.41% 2.2% Klebsiella pneumoniae 8.6% <1% 1.2% Pseudomonas 2.9% <1% 11.7% 1.2% 0.6% aeruginosa Candida spp. 14.3% 2% 0.12% 14

22 4.1 Escherichia coli E. coli is een gram negatieve, staafvormige kiem, tot 3µm groot, die behoort tot de Enterobacteriaceae (Quinn et al., 2002b; Songer en Post, 2005b). E. coli is een snelle groeier, na 24 uur aerobe incubatie worden op bloed agar crème-kleurige kolonies gevonden (McKinnon et al., 2011b; Markey et al., 2013). De kiem groeit dus goed op de meeste media (Quinn et al., 2002b) en vertoont hemolyse op bloed agar (Quinn et al., 2002b; Writtenbrink, 2012). Sommige E. coli stammen zijn niet hemolytisch, maar deze worden beschouwd als non-pathogeen in de uterus van de merrie (Albihn et al., 2003). E coli. is een enterische bacterie, die galzouten tolereert en dus groei vertoont op de MacConckey agar (Quinn et al., 2002b). E. coli vertoont lactose fermentatie en kleurt aldus roze op deze agar, dankzij de productie van zure restproducten uit lactose (Quinn et al., 2002b). E. coli is oxidase negatief (Quinn et al., 2002b; Songer en Post, 2005b) en katalase positief. Beweeglijkheid is aanwezig bij een temperatuur van 30 C (Quinn et al., 2002b). De kiem is Indol positief. De indol test bevestigt de aanwezigheid van het enzyme tryptofanase, door het aantonen van indol, een splitsingsproduct. E. coli vertoont ook een positieve reactie in de methylrood test wat wil zeggen dat E. coli in staat is uit pyruvaat mierenzuur, azijnzuur en melkzuur te maken, wat de ph van het medium doet dalen (Quinn et al., 2002b). E. coli kan op deze manier aldus onderscheiden worden van de andere Enterobacteriaceae, zoals Prouteus spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., E. coli is een frequent voorkomende opportunistische kiem die een grote variatie aan infecties kan veroorzaken bij alle gedomesticeerde huisdieren (Quinn et al., 2002b; Carter en Wise, 2004a). Het is één van de belangrijkste, meest voorkomende bacterie die endometritis veroorzaakt bij de merrie (Ball et al., 1988; Albihn et al., 2003; Overbeck et al, 2010; McKinnon et al., 2011a; Writtenbrink, 2012; Concagul en Seyrek-Intas, 2013). E. coli geeft meestal geen klinische symptomen van endometritis, maar uit zich meestal bij de merrie als een oorzaak van repeat breedering (Albihn et al., 2003) Identificatie aan de hand van conventionele bacteriologie Gramkleuring : Gram negatieve staafjes Bloed agar: duidelijke groei na 24 uur (crème-kleurige kolonies) MacConckey agar: groei aanwezig (roze kolonies) Oxidase-test: negatief Katalase-test: positief De oorzakelijke kiem behoort zeker tot de Enterobacteriaceae Indol test: positief Methylrood test: positief De oorzakelijke kiem is E. coli 15

23 4.1.2 Identificatie aan de hand van chromogene agar platen E. coli kleurt roze op Chrome UTI Agar, en vormt kolonies van 2-3mm grootte (McKinnon et al., 2011a). Dit werd aangetoond aan de hand van stalen specifiek genomen voor het identificeren van de oorzakelijke kiemen die endometritis veroorzaken bij de merrie (McKinnon et al., 2011a). Dit dankzij de aanwezigheid van een chromogeen substraat voor het enzyme β-galactosidase in de Chrome UTI Agar (Carricajo et al., 1999). In de humane geneeskunde, voor het identificeren van UTI pathogenen, werd aangetoond dat E. coli roos-paars kleurt, zowel op Chrome UTI Agar (Carricajo et al., 1999; Chaux et al, 2002; Miles en Wren, 2005), CPS ID2 (Carricajo et al., 1999; Chaux et al, 2002; Miles en Wren, 2005), CHROMagar Orientation (Samra et al., 1998; Carricajo et al., 1999; Miles en Wren, 2005), Rainbow UTI Agar (Carricajo et al., 1999) als UriSelect 3 (Carricajo et al., 1999). Dit dankzij de aanwezigheid van een chromogeen substraat voor de detectie van β-glucuronidase in CPS ID2 en Uriselect 3 en een chromogeen substraat voor de detectie van β- galactosidase in Chrome UTI Agar en CHROMagar Orientation (Carricajo et al., 1999). Om zeker te zijn dat het om E. coli gaat, moet hier tevens een indol test uitgevoerd worden. Is deze positief, dan bevestigt dit de aanwezigheid van E. coli. Dit omdat op diverse media sommige Salmonella, Shigella, Citrobacter en Enterobacter spp. ook roze kleuren (Carricajo et al., 1999; Chaux et al., 2002), deze kiemen zijn echter meestal geen oorzakelijke kiemen van endometritis bij de merrie. 4.2 Streptococcus spp. Streptococcus spp. zijn gram positieve, aerobe (facultatief anaerobe) kokken (Songer en Post, 2005b; Writtenbrink, 2012). Ze hebben een diameter tot 1 µm en vormen kettingen van verschillende lengte. Ze vergen verrijkte media, wegens hun complexe nutritionele vereisten (Quinn et al., 2002b; Songer en Post, 2005b). Ze vormen kleine, meestal hemolytische, translucente kolonies op bloed agar (Quinn et al., 2002b). Ze vertonen geen groei op MacConckey agar, zijn katalase (Quinn et al., 2002b) en oxidase (Samra et al., 1998; Quinn et al., 2002b) negatief en niet beweeglijk (Quinn et al., 2002b). Streptococcus spp. worden gezien als één van de meest voorkomende kiemen die endometritis veroorzaken bij de merrie (Ball et al., 1988; LeBlanc en Causey, 2009; Overbeck et al., 2010; McKinnon et al., 2011a; Writtenbrink, 2012; Concagul en Seyrek-Intas, 2013). In tegenstelling tot E. coli gaat endometritis veroorzaakt door deze kiem meestal gepaard met klinische symptomen. Onder klinische symptomen wordt verstaan minstens één van de drie volgende symptomen: vaginale uitvloei, aanwezigheid van vloeistof in het uteriene lumen gedurende de luteale fase, aanwezigheid van een representatief aantal ontstekingscellen op een cytologische preparaat (Albihn et al., 2003). Streptococcus equi is de meest voorkomende oorzakelijke Streptococcus spp.; Streptococcus equi bestaat uit twee subspecies: Streptococcus equi subspecies zooepidemicus (SEZ) en Streptococcus equi subspecies equi (SEE), beide behorend tot de Lancefield groep C (Writtenbrink, 2012). SEZ is een pyogene bacterie (Quinn et al., 2002b; Writtenbrink, 2012). Het is de meest voorkomende oorzaak van genitale infecties bij de merrie, epididymitis bij de hengst en navel infecties bij veulens (Carter en Wise, 2004a). Streptococcus equi subspecies equi is tevens een pyogene bacterie die, 16

24 daarentegen niet wordt beschreven als endometritis veroorzakende kiem bij de merrie. Het is de veroorzaker van droes bij het paard Identificatie aan de hand van conventionele bacteriologie Gramkleuring: gram positieve kokken Bloed agar: translucente puntvormige kolonies met beta-hemolytische zone MacConckey agar: geen groei Oxidase test: negatief Katalase test: negatief De oorzakelijke kiem is een Streptococcus spp. Lancefield grouping noodzakelijk voor verdere specifieke typering Identificatie aan de hand van chromogene agar platen Op Chrome UTI Agar groeit deze kiem goed en geeft kleine, lichtblauwe-turquoise kolonies van 0.5-1mm. Dit werd aangetoond aan de hand van stalen specifiek genomen voor het identificeren van de oorzakelijke kiemen die endometritis veroorzaken bij de merrie ( McKinnon et al., 2011a). In de humane geneeskunde, voor het identifieren van UTI pathogenen, werd tevens aangetoond dat Streptococcus spp. lichtblauwe-turquoise kolonies vormt, zowel op Chrome UTI Agar plates (Chaux et al., 2002; Miles en Wren, 2005), CPS ID2 (Chaux et al., 2002; Miles en Wren, 2005) als op CHROMagar Orientation (Samra et al., 1998; Miles en Wren, 2005). Streptococcus spp. zijn echter moeilijk te onderscheiden van Enterococcus spp. Hier wordt verder dieper op ingegaan (zie 4.5). Het blauw kleuren van de kolonies geldt enkel als de desbetreffende kiem het enzyme β-glucosidase produceert. Het is beschreven dat Streptococcus spp., behorend tot de antigenische groep B en D, vaak dit enzyme produceren (Schaefler et al., 1969). Het is eveneens beschreven dat SEZ, behorend tot de Lancefield groep C, het enzyme β-glucosidase produceert. De Streptococcus spp. die dit enzyme niet produceren zouden kolonies met een normale pigmentatie (witte kolonies) vertonen op chromogene agar platen ( 4.3 Staphylococcus spp. Staphylococcus spp. zijn gram positieve, aerobe, maar facultatief anaerobe (Quinn et al., 2002b) kokken. Ze vormen paren, druiventros-achtige clusters of komen solitair voor (Songer en Post, 2005b; Quinn et al., 2012b). Ze groeien goed op de meeste media en vormen middelmatig grote witte of gouden (S. aureus) kolonies op bloed agar (Quinn et al., 2002b; Songer en Post, 2005b), ze zijn niet beweeglijk (Quinn et al., 2002b). S. aureus en de S. intermedius groep vertonen hemolyse op bloed agar (Quinn et al., 2002b). Staphylococcus spp. zijn katalase positief (Quinn et al., 2002b) en oxidase negatief (Markey et al, 2013). Staphylococcus aureus in het bijzonder is coagulase positief, de meeste commensale Staphylococcus spp. daarentegen zijn coagulase negatief. Coagulase is een 17

25 enzyme dat geproduceerd wordt door sommige Staphylococcus spp. en is geassocieerd met pathogeniciteit (Chaux et al., 2002; McKinnon et al., 2011a; Markey et al., 2013). Staphylococcus spp. behoren tot de familie Staphylococcaceae. Staphylococcus is in het algemeen het meest geïsoleerde genus uit veterinaire stalen (Songer en Post, 2005b). Staphylococcus spp. komen voor als commensale kiemen op de huid en op muceuze membranen, maar kunnen ook omgevingscontaminanten zijn. Infecties kunnen dus zowel endogeen als exogeen van oorsprong zijn. Ze veroorzaken meestal pyogene infecties (Quinn et al., 2002b). De kiemen zijn tevens zeer stabiel in de omgeving (Quinn et al., 2002 b). Staphylococcus aureus is het frequentst geïsoleerde Staphylococcus sp. uit endometritis stalen bij de merrie (Albihn et al., 2003) Identificatie aan de hand van conventionele bacteriologie Gramkleuring: gram positieve kokken Bloed agar: witte of goudkleurige (S. aureus) kolonies met aanwezigheid van hemolyse (S. aureus en S. intermedius groep) MacConckey agar: geen groei Oxidase test: negatief Katalase test: positief De oorzakelijke kiem is een Staphylococcus spp Identificatie aan de hand van chromogene agar platen Op Chrome UTI geeft deze kiem witte kolonies van 2-3mm. Dit werd aangetoond aan de hand van stalen specifiek genomen voor het identificeren van de oorzakelijke kiemen die endometritis veroorzaken bij de merrie (McKinnon et al., 2011a). In de humane geneeskunde, voor het identificeren van UTI pathogenen, werd aangetoond dat Staphylococcus spp. tevens witte kolonies vormt, zowel op CPS ID2 (Chaux et al., 2002) als op CHROMagar Orientation (Samra et al., 1998). In een studie van Chaux et al. (2002) werd aangetoond dat Chrome UTI Agar een lagere detectie limiet vertoonde dan de CPS ID2 agar, voor coagulase negatieve Staphylocccus. Staphylococcus aureus kleurt goud-geel, op zowel Chrome UTI Agar, CHROMagar Orientation als CPS ID2, (Miles en Wren, 2005), Staphyloccus saprophyticus daarentegen kleurt roze op CPS ID2, CHROMagar Orientation (Carricajo et al., 1999; Miles en Wren, 2005) en Chrome UTI Agar ( Op Uriselect 3 groeien Staphylococcus spp. niet (Carricajo et al., 1999). In contrast hiermee is het beschreven (Schaefler et al., 1969) dat bepaalde Staphylococcus spp., zoals onder andere Staphylococcus aureus, het enzyme β-glucosidase produceren en aldus geen witte of normaal gepigmenteerde, maar turquoise-blauw kolonies zouden vertonen. 18