Biologische middelen gebruikt voor het ontgiften van mycotoxinegecontamineerd

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Biologische middelen gebruikt voor het ontgiften van mycotoxinegecontamineerd veevoeder door Hannes VERMEULEN Promotor: Apr. Thomas De Mil Literatuurstudie in het kader Co-promotor: Prof. dr. Siska Croubels van de Masterproef 2014 Hannes Vermeulen

2

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Biologische middelen gebruikt voor het ontgiften van mycotoxinegecontamineerd veevoeder door Hannes VERMEULEN Promotor: Apr. Thomas De Mil Literatuurstudie in het kader Co-promotor: Prof. dr. Siska Croubels van de Masterproef 2014 Hannes Vermeulen

4 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

5 VOORWOORD Hierbij zou ik graag mijn dank uiten aan een aantal personen. In de eerste plaats dank ik mijn promotor, Apr. Thomas De Mil, die de begeleiding van deze literatuurstudie op zich heeft genomen. Zonder zijn tijd, raad en verbeteringen was dit werk nooit tot stand gekomen. Zijn uitgebreide feedback was van onschatbare waarde. Ook zou ik willen mijn co-promotor prof. dr. Siska Croubels bedanken. Mede dankzij haar ervaring heb ik van deze literatuurstudie een afgewerkt geheel kunnen vormen. Daarnaast wil ik mijn vriendin bedanken voor het nalezen van mijn werk en de hulp bij de opmaak. Ten slotte dank ik mijn ouders voor de financiële en de morele steun gedurende heel mijn studie.

6 INHOUDSOPGAVE VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING EN TREFWOORDEN... 1 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN... 2 INLEIDING... 3 LITERATUURSTUDIE Overzicht en structuur van de belangrijkste mycotoxinen Inleiding Aflatoxines Trichothecenen Ochratoxines Zearalenone Fumonisinen Carcinogeniteit Biologische middelen Inleiding Bacteriën Gram positief anaeroob Gram positief aeroob Nocardia asteroides Corynebacterium rubrum Mycobacterium fluoranthenivorans Rhodococcus erythropolis Curtobacterium Bacillus subtilis Lactobacillen Gram negatief aeroob Flavobacterium aurantiacum Pseudomonas fluorescens & Alcaligenes sp Phenylobacterium immobile Acinetobacter calcoaceticus... 10

7 2.3 Fungi Aspergillus spp Eurotium herbariorum Rhizopus spp Penicillium raistricki Exophalia spinifera en Rhinocladiella atrovirens Pleurotus ostreatus Gliocladium roseum Armillariella tabescens Fusarium spp Gisten Trichosporon mycotoxinivorans Phaffia rhodozyma - Xanthophyllomyces dendrorhous Saccharomyces cerevisiae Enzymen Inleiding Protease A Pancreatine Carboxypeptidase A α-chymotrypsin Epoxidasen Lactonohydrolasen Aflatoxin-detoxifizyme Protozoa Tetrahymena pyriformis Andere Commercieel beschikbare biologische producten Inleiding Eubacterium BBSH Trichosporon mycotoxinivorans Saccharomyces cerevisiae Enzymen Mycotoxinebinders Wettelijk kader rond voederadditieven BESPREKING REFERENTIELIJST... 22

8 SAMENVATTING EN TREFWOORDEN Mycotoxinen zijn belangrijke contaminanten van diervoeders. Ze kunnen een enorme economische schade veroorzaken, zijn nefast voor het dierenwelzijn, en zijn overal ter wereld aanwezig. Voederadditieven ter bestrijding van mycotoxine-contaminatie kunnen in 2 categorieën ingedeeld worden: mycotoxine-binders en mycotoxine-detoxifiers. Deze literatuurstudie handelt over bruikbare biologische producten als voederadditieven. Biologische producten kunnen mycotoxinen binden en/of degraderen, vooral deze laaste categorie is veelbelovend. Tot nu toe zijn weinig commerciële producten beschikbaar, dit komt deels doordat veel onderzoeken omtrent dit onderwerp nog onvolledig zijn en moeten worden uitgebreid. De meest beloftevolle producten voor de toekomst als mycotoxine-metaboliseerders zijn de volgende organismen. Eubacterium BBSH 797 is een grampositieve bacterie die kan deoxynivalenol deactiveren. Trichosporon mycotoxinivorans is een gist die ochratoxine A en in mindere mate zearalenone kan metaboliseren. Aspergillus niger is een schimmel die zeer veel voorkomt en een brede waaier aan mycotoxinen kan verwerken. Bacillus subtilis wordt volgens een recent onderzoek als zeer beloftevol beschouwd voor de detoxificatie van zearalenone. Een groot aantal enzymen werden reeds geïsoleerd uit deze micro-organismen, waarvan de belangrijkste vooral proteasen, epoxydasen, lactonohydrolasen en carboxypeptidasen zijn. Deze enzymen kunnen mycotoxinen gericht en efficiënt degraderen. Meer onderzoek naar de efficaciteit en veiligheid is echter vereist. Keywords: mycotoxinen detoxificatie biologisch voederadditieven micro-organismen 1

9 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN α-zea β-zea AFB1 AFB2 CPA1 DON EFSA FB1 HFB1 HT-2 OTA OTB OT-α α-zearalenol β-zearalenol Aflatoxine B1 Aflatoxine B2 Carboxypeptidase A Deoxynivalenol European Food Safety Authority Fumonisine B1 Gehydrolyseerd fumonisine B1 Gedeacetyleerd T-2 toxine Ochratoxine A Ochratoxine B Ochratoxine-α T-2 T-2 toxine ZEA Zearalenone 2

10 INLEIDING Mycotoxinen zijn kleine, toxische metabolieten die gevormd worden door fungi. Deze fungi kunnen landbouwgewassen koloniseren en besmetten tijdens het oogsten of de opslag. Schimmels die mycotoxinen produceren zijn onder andere Fusarium spp., Aspergillus spp. en Penicillum spp.. Er werden reeds meer dan 400 verschillende mycotoxinen beschreven. Mycotoxinen kunnen toxisch, mutageen, carcinogeen en/of immunosuppressief zijn. Ze kunnen ook interfereren met hormonale functies. Mycotoxinen zijn een wereldwijd probleem, al verschilt hun voorkomen naargelang het klimaat. Ze zijn nefast voor het welzijn van het dier en kunnen economische schade berokkenen. De meeste mycotoxinen zijn chemisch zeer stabiel en kunnen opslag, fermentatie of andere verwerkingsprocessen doorstaan. Enkel zeer hoge temperaturen zijn enigszins doeltreffend in het bestrijden van mycotoxinen (Bullerman en Bianchini, 2007), dit kan echter nadelig zijn voor de voedingswaarde en smaak. Ze zijn dan ook heel moeilijk te verwijderen. Men kan de strategieën voor mycotoxine-bestrijding beschouwen in 2 fasen: voor of na de oogst. De belangrijkste strategie vóór de oogst is het verhinderen van mycotoxineproductie door bestrijding van schimmelgroei op de gewassen. Daarnaast is bestrijding van schimmelgroei tijdens de opslag ook een belangrijk onderdeel, toevoegen van mycotoxine-binders en -modifiers is de meest toegepaste strategie na de oogst. Detoxificatie van reeds gecontamineerde gewassen kan gebeuren door het verminderen van de biologische beschikbaarheid van de aanwezige mycotoxinen. Dit kan op twee manieren worden gerealiseerd: ofwel via (klei)mineralen, ofwel via biologische middelen. De eerste categorie werd reeds uitvoerig bestudeerd en beschreven (Jard et al., 2011, Diaz et al., 2004). Mineralen kunnen worden gebruikt als mycotoxinebinders, deze vormen niet-resorbeerbare complexen met de mycotoxinen in de gastro-intestinale tractus van een dier. Het gevormde complex passeert door het dier zonder geabsorbeerd te worden en wordt zo uitgescheiden. Er zijn reeds diverse commerciële preparaten beschikbaar met minerale mycotoxinebinders. Over de tweede categorie daarentegen is veel minder gekend. Biologische producten kunnen ook als mycotoxinebinders gebruikt worden, of kunnen dienen als transformerende agentia. Gistcelwandextracten en mannan-oligosacchariden zijn de belangrijkste biologische binders. Biotransformatie van mycotoxinen kan gebeuren door bacteriën, gisten, schimmels, enzymen en zelfs protozoa. Reeds heel wat agentia werden beschreven en in vitro onderzocht, maar slechts weinig van deze producten werden eveneens in vivo getest. De klinische beschikbaarheid van mycotoxine-modifiers is dan ook zeer laag. Tot op heden zijn slechts enkele commerciële producten beschikbaar op de markt. In deze literatuurstudie wordt een overzicht gegeven van de verschillende bestaande biologische producten voor mycotoxine-bestrijding beschikbaar in de hedendaagse literatuur. 3

11 LITERATUURSTUDIE 1 Overzicht en structuur van de belangrijkste mycotoxinen 1.1 Inleiding Er zijn veel mycotoxinen gekend, enkel de meest relevante voor de praktijk worden hieronder besproken. 1.2 Aflatoxines Aflatoxines worden vooral geproduceerd door bepaalde stammen van Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nomius, A. bombycis en A. pseudotamari (Bennett en Klich, 2003). Aflatoxines worden voorlopig in 4 categorieën ingedeeld: aflatoxine B1 (AFB1), aflatoxine B2 (AFB2), aflatoxine G1 en aflatoxine G2. Van deze vier is AFB1 de meest toxische (Squire, 1981). AFB1 is een difuro-coumaro-cyclopentenone, waarbij de twee furaan ringen essentieel zijn voor de toxiciteit van het mycotoxine (Fig. 1.). De dubbele binding in de terminale furaanring is daarbij belangrijk voor de graad van de toxiciteit (Wogan et al., 1971). Fig. 1. Structuur van resp. AFB1 en aflatoxicol (uit Wu et al., 2009) AFB1 wordt microsomaal geoxideerd naar het reactieve AFB1-8,9-epoxide. Deze metaboliet kan covalente bindingen met DNA of met proteïnes aangaan. Hierdoor worden hepatocellulaire carcinoma gevormd (Eaton en Gallagher, 1994). Detoxificatie van de metaboliet kan op drie manieren gebeuren: glutathion conjugatie door een glutathion-s-transferase, hydrolyse door een epoxide hydrolase, of metabolisatie naar minder toxische structuren zoals aflatoxine Q1 (Gallagher et al., 1996). Aflatoxine M1 is een toxische metaboliet van AFB1 die wordt uitgescheiden in de melk. Hierover bestaan strenge richtlijnen. 4

12 1.3 Trichothecenen Trichothecenen zijn sesquiterpene epoxiden. Ze inhiberen de proteïnesynthese in eukaryote cellen. De belangrijkste trichothecenen zijn deoxynivalenol of vomitoxine (DON) en T-2 toxine (T-2). Beiden worden voornamelijk gevormd door Fusarium spp., meer bepaald F. graminearum, F. poae en F. culmorum (Rocha et al., 2005). De belangrijkste trichothecenen kunnen worden opgedeeld in 4 categorieën: type A (bv. T-2), type B (bv. nivalenol), type C (bv. crotocine) en type D (bv. fusarenon-x) (Ueno, 1977). DON en T-2 zijn sesquiterpenoïden met een alkeengroep op C-9-10, een epoxygroep op C en een aantal acetoxy- en hydroxylgroepen. De epoxygroep op C is essentieel voor hun toxiciteit (Desjardins et al., 1993). T-2 heeft geen carbonylgroep op C-8 terwijl DON die wel heeft (Fig. 2., Fig. 3.). Fig. 2. Structuur van resp. T-2 en HT-2 (uit Jard et al., 2011) Fig. 3. Structuur van resp. DON en DOM-1 (uit Jard et al., 2011) DON en T-2 induceren dermale irritatie, intestinale hemorrhagieën, leukopenie, cellulaire destructie in de thymus en een verhoogde vasculaire permeabiliteit (Ueno, 1984). Trichothecenen grijpen in op de 60S ribosomale unit, waar ze delen van de proteïne synthese kunnen inhiberen (Cundliffe et al., 1977). T-2 heeft meer inhibitorische activiteit dan DON (Thompson et al., 1986). Uit onderzoek blijkt dat acetylatie op C-10 het inhibitorisch potentieel vermindert. Recent vond Pestka (2007) dat T-2 en DON ook mitogeen-geactiveerde proteïne kinases activeren en apoptose induceren via een proces dat ook wel ribotoxische stress response wordt genoemd. De belangrijkste metabolieten van DON en T-2 zijn respectievelijk de-epoxy-deoxynivalenol (DOM-1) en gedeacetyleerd T-2 (HT-2). Beide metabolieten zijn minder toxisch dan hun precursoren. 5

13 1.4 Ochratoxines Ochratoxine A (OTA) is het belangrijkste ochratoxine en wordt geproduceerd door Aspergillus ochraceus en Penicillium verrucosum (Duarte et al., 2010). OTA is een phenylalanine met een dihydro-isocoumarine-groep op gebonden (Fig. 4). OTA heeft 3 natuurlijke analogen en zes synthetische analogen (Xiao et al., 1995). Het heeft hepatotoxische, nefrotoxische, teratogene en carcinogene effecten. Fig. 4. Structuur van resp. OTA en OT-α (uit Jard et al., 2011) OTA heeft verschillende werkingsmechanismen: het kan de cellulaire mitochondriale respiratie verstoren door inhibitie van succinaat dehydrogenase en cytochroom C oxidase (Wei et al., 1985), OTA wijzigt het mitochondriaal membraantransport systeem en veroorzaakt inhibitie van ATPase op de binnenste membraan (Meisner en Chan, 1974). Ook inhibitie van de enzymen die voorkomen in het phenylalanine metabolisme kan veroorzaakt worden (Creppy et al., 1983). 1.5 Zearalenone Zearalenone of F-2 toxine (ZEA) is een resorcyclisch zuur, het wordt geproduceerd door F. graminearum, F. culmorum, F. cerealis, F. equiseti, F. crookwellense en F. semitectum. ZEA heeft een C-1,2 dubbele binding en een ketongroep op C-6 (Fig. 5) (Urry et al., 1966). Fig. 5. Structuur van resp. ZEA en α/β-zea (uit Jard et al., 2011) ZEA en zijn metabolieten binden competitief op de oestrogeen-receptor. De effecten hangen af van de reproductieve status van het dier (Tiemann en Dänicke, 2007). Veel voorkomende symptomen zijn oedeem en erytheem van de vulva, anovulatie, melkklierzwelling, nymphomanie, embryonale sterfte en teratogene effecten. ZEA heeft ook hemotoxische effecten. 6

14 Metabolisatie van ZEA gebeurt vooral in de lever en de intestinale mucosae. Volgens Olsen et al. (1981) zijn er 2 metabolisatie pathways voor zearalenone: hydroxylatie door 3α- en 3β- hydroxy steroid dehydrogenasen met vorming van α-zearalenol (α-zea) en β-zearalenol (β-zea), en conjugatie van ZEA en zijn metabolieten met glucuronzuur door uridine difosfaat glucuronyl transferasen. De metabolieten α-zea en β-zea zijn stereoisomeren. β-zea heeft een 2,5 keer lagere affiniteit voor de oestrogeen-receptor dan ZEA, terwijl α-zea een 92 keer hogere bindingsaffiniteit heeft (Malekinejad et al., 2006). 1.6 Fumonisinen Fumonisinen worden onder andere geproduceerd door F. verticillioides and F. proliferatum. Fumonisine B1 (FB1) is het meest prevalente en belangrijkste fumonisine (Fig. 6). Fumonisine B2, B3 en B4 komen minder voor en ontbreken een hydroxylgroep op respectievelijk C-10, C-5 en zowel C-5 als C-10 (Voss et al., 2007). HFB1 is de belangrijkste metaboliet van FB1 bij detoxificatieprocessen. Fig. 6. Structuur van resp. FB1 en HFB1 (uit EFSA, 2009) Door zijn sterke gelijkenis met sfingolipiden is FB1 een potente inhibitor van sphinganine N-acyl transferase (ceramide synthase) (Merrill et al., 2001). Hierdoor wordt de afbraak van sphinganine verhinderd en treedt accumulatie op, terwijl de productie van complexe sphingolipiden vermindert. Dit heeft apoptotische, cytotoxische en groeiremmende effecten. FB1 heeft cardiotoxische effecten met Porcine Pulmonary Edema tot gevolg in varkens (Haschek et al., 2001). Het veroorzaakt Equine Leukoencephalomalacia in paarden (Kellerman et al., 1990). De natuurlijk voorkomende aminopentol isomeren zouden toxische effecten hebben door hun structurele analogie aan sphingoidbasen (Humpf et al., 1998). FB1 wordt niet gemetaboliseerd maar onveranderd uitgescheiden (Martinez et al., 1999). 1.7 Carcinogeniteit Volgens IARC, het International Agency for Research on Cancer, zijn aflatoxines zeker carcinogeen voor mensen (IARC, 1993). Vooral levertumoren worden vastgesteld (IARC, 2002). Aflatoxine M1, dat voorkomt in melk, is potentieel carcinogeen. OTA is ook potentieel carcinogeen en werd gelinkt aan Balkan endemische nefropathie. AFB1 werd ingedeeld in groep 1, dit is de groep van kankerverwekkende producten. Aflatoxine M1, OTA en de fumonisinen werden in groep 2B ingedeeld, de groep van de potentieel carcinogene producten. DON, ZEA en T-2 werden in groep 3 ingedeeld. Dit is de groep waarvoor te weinig gegevens bekend zijn om uitspraak te doen over de carcinogeniteit. 7

15 2 Biologische middelen 2.1 Inleiding Hieronder volgt een overzicht van de verschillende soorten biologische middelen die kunnen gebruikt worden als mycotoxine detoxifier in voeder besmet met mycotoxinen. Zowel de transformerende agentia als de mycotoxinebinders worden vermeld. Een onderverdeling wordt gemaakt volgens hun taxonomie en/of structuur. De overkoepelende groepen zijn bacteriën, fungi, gisten, enzymen en protozoa. De bacteriën werden in groepen opgedeeld aan de hand van een gramkleuring en hun vermogen om zuurstof te verbruiken, daar dit de meest gebruikte indelingsmethoden zijn. 2.2 Bacteriën Gram positief anaeroob Eubacterium is een gram-positieve anaerobe bacterie met een onregelmatige staafvorm die niet motiel is en geen sporen vormt. De BBSH 797 stam werd geïsoleerd uit boviene pensinhoud (Binder et al., 2000) en werd genoemd naar zijn ontdekkers. Tijdens het productieproces wordt BBSH 797 gestabiliseerd door middel van vriesdrogen en het inbedden in protectieve substanties (voornamelijk organische polymeren). Zo wordt de stabiliteit van de kiem tijdens opslag en tijdens passage door de gastro-intestinale tractus gegarandeerd (Heidler en Schatzmayer, 2003). BBSH 797 is in staat om trichothecenen te deactiveren. Dit gebeurt via reductie van de 12,13-epoxide ring (Schatzmayr et al., 2006). DON bijvoorbeeld, het belangrijkste trichotheceen, wordt enzymatisch gereduceerd door een epoxidase van E. BBSH 797 tot zijn niet-toxische metaboliet de-epoxydeoxynivalenol (DOM-1) Gram positief aeroob Nocardia asteroides Arai et al. stelden in 1967 vast dat Nocardia asteroides IFM 8 in staat was tot biotransformatie van AFB1. N. asteroides is een gram-positieve, aerobe, catalase-positieve staafvormige bacterie. N. spp. kan wereldwijd in organisch rijke grond gevonden worden (Wu et al., 2009) Corynebacterium rubrum Corynebacterium spp. is een gram-positieve, catalase-positieve bacterie die niet motiel is en geen sporen vormt. C. spp. is staafvormig en kan licht gebogen of recht zijn. C. rubrum, zo genoemd wegens de rode kleur van zijn kolonies, kan aflatoxinen detoxificeren (Shapira, 2004). 8

16 Mycobacterium fluoranthenivorans Mycobacteriën zijn aeroob, niet-motiel en zuurvast. Mycobacterium fluoranthenivorans sp. nov. DSM44556 T kan AFB1 degraderen (Hormisch et al., 2004). In 2005 vond Teniola et al. dat cel-vrije extracten van de stam deze degradatie sneller en completer uitvoerden. Er werd een hoge degradatiegraad vastgesteld met een breed temperatuursspectrum Rhodococcus erythropolis Rhodococcus erythropolis is een aerobe, gram-positieve, niet-motiele, catalase-positieve actinomyceet. Alberts et al. constateerden in 2006 dat R. erythropolis AFB1 kon reduceren. Er werd een hoge degradatiegraad vastgesteld met een breed temperatuursspectrum Curtobacterium Curtobacterium sp. stam behoort tot de orde van de Actinomycetales. Het zijn gram-positieve bodembacteriën. Er werd vastgesteld dat C. sp. stam T-2 kan omzetten in T-2-triol via HT-2 toxine, zonder vorming van neosolaniol en T-2 tetraol (Ueno et al., 1983) Bacillus subtilis Bacillus subtilis is een gram-positieve, facultatief anaerobe bacterie die in de bodem voorkomt. Recent werd een isolaat gevonden, namelijk B. subtilis ANSB01G, dat in staat is tot degradatie van ZEA (Lei et al., 2014) Lactobacillen Lactobacillen zijn gram-positieve, facultatief anaerobe bacteriën. Deze groep bacteriën bevat vooral bacteriën uit de geni Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus en Streptococcus. Sommige stammen zoals L. rhamnosus GG en L. rhamnosus LC-705 worden gebruikt om mycotoxinen te verwijderen, vooral AFB1. Ze hebben hoofdzakelijk een adsorberende werking (El- Nezami et al., 1998) Gram negatief aeroob Flavobacterium aurantiacum Flavobacterium aurantiacum is een gram-negatieve, niet-motiele staafvormige bodembacterie. Er werd vastgesteld dat F. aurantiacum een hoge capabiliteit heeft tot detoxificatie van aflatoxines (Ciegler et al., 1966). Later werd vastgesteld dat AFB1 deels gemetaboliseerd werd door en deels geadsorbeerd werd aan F. aurantiacum cellen (Line et al., 1994) Pseudomonas fluorescens & Alcaligenes sp. Pseudomonas fluorescens en Alcaligenes sp. zijn aerobe, gram-negatieve staafvormige bacteriën. Ze kunnen samen worden gebruikt in een gemengde cultuur met F. aurantiacum. Deze gemengde cultuur kan ZEA degraderen, waarbij phenanthreen als co-substraat kan worden gebruikt (Megharaj et al., 1997). 9

17 Phenylobacterium immobile Phenylobacterium is een aerobe, gram-negatieve, catalase positieve staafvormige of kokvormige bacterie. P. immobile is de enige bekende species en in staat om OTA te detoxificeren (Wegst en Lingens., 1983) Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter is een aerobe, gram-negatieve bacterie met een coccobacillaire morfologie. A. calcoaceticus kan OTA detoxificeren (Hwang en Draughon, 1994). 10

18 2.3 Fungi Aspergillus spp. Aspergillus spp. zijn fungi waarvan een groot deel in staat is om aflatoxines te produceren. Bepaalde species kunnen echter ook mycotoxinen degraderen. A. spp. is een sterk aerobe draadvormige schimmel (Geiser et al., 2007). In tabel 1 vindt men een opsomming van de verschillende A. spp. die in staat zijn tot degradatie van mycotoxinen met hun substraat. Tabel 1. Aspergillus spp. in staat tot degradatie van mycotoxinen Aspergillus spp. Voorkomen Mycotoxine Metaboliet Referentie A. niger In de bodem en op voedsel AFB1 ZEA OTA Eerst aflatoxicol-a, dan aflatoxicol-b ZEA-sulfaat OT-α Nakazato et al., 1990 Jard et al., 2010 Varga et al., 2000 A. flavus Opslag van granen en groenten AFB1 Eerst aflatoxicol-a, dan aflatoxicol-b Nakazato et al., 1990 A. candidus Warme bodems, AFB1 Aflatoxine D Wu et al., 2009 stoffig graan, plantenrotting (in aanwezigheid van asparagines) A. parasiticus Zwarte olijven AFB1 Onbekend Wu et al., 2009 NRRL 2999 en NRRL 3000 A. fumigatus In de bodem en rottingsprocessen OTA OT-α Varga et al., Eurotium herbariorum Eurotium is een xerofiele schimmel en wordt typisch gevonden in tropische en subtropische regio s. E. herbariorum is in staat AFB1 om te zetten tot aflatoxicol via hetzelfde proces als A. flavus, A. niger en Rhizopus spp.. E. herbariorum kan aflatoxine B1 omzetten tot aflatoxicol via het reduceren van de cyclopentenone carbonylgroep van aflatoxine B1. Aflatoxine B1 wordt eerst omgezet in aflatoxicol-a, waarna deze metaboliet verder wordt omgezet tot aflatoxicol-b door bepaalde organische zuren die geproduceerd worden door de fungi (Nakazato et al., 1990) Rhizopus spp. Rhizopus spp. is in staat AFB1 om te zetten tot aflatoxicol via hetzelfde process als Aspergillus flavus, A. niger en E. herabriorum (Nakazato et al., 1990). Er werd vastgesteld dat R. stolonifer, R. oryzae en R. microsporus in staat zijn ZEA te degraderen (Varga en Toth, 2005), maar verder onderzoek naar de efficaciteit is nodig. Degradatie van OTA werd ook gevonden voor R. stolonifer, R. microsporus, R. homothallicus en R. oryzae (Varga et al., 2004). 11

19 2.3.4 Penicillium raistricki Penicillium raistrickii NRRL 2038 kan AFB1 metaboliseren tot AFB2 (Wu et al., 2009). AFB2 heeft echter bijna dezelfde toxiciteit als AFB Exophalia spinifera en Rhinocladiella atrovirens Exophalia spinifera en Rhinocladiella atrovirens kunnen fumonisine B1 metaboliseren tot gehydrolyseerd fumonisine B1 (HFB1) met vorming van vrij tricarbalylzuur (Blackwell et al., 1999) Pleurotus ostreatus Pleurotus ostreatus of de gewone oesterzwam is een basidiomyceet en is een van de meest gekweekte eetbare paddenstoelen ter wereld. Hij is in staat verschillende extracellulaire laccase isoenzymen te produceren, waaronder phenoloxidase A1b, phenoloxidase A2 en phenoloxidase C (Palmieri et al., 2000 en Sánchez, 2009). Degradatie van OTA en OTB door P. ostreatus werd vastgesteld na solid-state fermentatie van gecontamineerde gerst (Engelhardt, 2002). Na een incubatieperiode van vier weken werd nog 23% van de initiele hoeveelheid OTA en 3% van de initiele hoeveelheid OTB gedetecteerd. Formatie van OT-α en OT-β werd gevonden, wat wijst op hydrolyse als eerste stap in het degradatieproces Gliocladium roseum Gliocladium roseum kan ZEA detoxificeren door opening van de lactone-ring (El-Sharkawy en Abul- Hajj, 1988) Armillariella tabescens Armillariella tabescens kan AFB1 degraderen tot een minder toxische metaboliet door het openen van de difuraanring (Liu et al., 1998). Het verantwoordelijke multienzyme werd aflatoxin-detoxifizyme genoemd Fusarium spp. Verschillende F. spp. kunnen mycotoxinen produceren. Voornamelijk trichothecenen, zearalenone en in mindere mate fumonisinen worden door F. spp. geproduceerd. Er werd echter vastgesteld dat bepaalde F. spp. ook de mogelijkheid hebben om T-2 om te zetten tot HT-2 (Beeton en Bull, 1989). 12

20 2.4 Gisten Trichosporon mycotoxinivorans Trichosporon mycotoxinivorans is een gist die geïsoleerd werd uit het abdomen van de termiet Mastodermes darwiniensis. Het is nauw verwant met de gist T. loubieri, maar verschilt in zijn vermogen tot synthese van inuline en galacthitol, en zijn onvermogen om te groeien bij 40 C. De gist is in staat OTA en ZEA te modifiëren tot niet-toxische metabolieten (Molnar et al., 2004). T. mycotoxinivorans zet OTA om in OT-α door de afsplitsing van de phenylalaninehelft van het isocoumarine-derivaat. Detoxificatie van OTA door T. mycotoxinivorans gebeurt snel en compleet (Schatzmayr et al., 2006). Het praktisch gebruik van T. mycotoxinovorans als mycotoxine modifier van OTA is veelbelovend. T. mycotoxinivorans heeft ook het vermogen om ZEA te metaboliseren tot een metaboliet zonder oestrogeen-activiteit genaamd ZOM-1 (Schatzmayr et al., 2010). Dit gebeurt door het openen van de macrocyclische ring van ZEA op de ketongroep van C6. Dit is een nieuw detoxificatieproces van ZEA. ZOM-1 is een stabiel product. Bij in vivo testen bleek ZOM-1 geen oestrogeen activiteit te vertonen, en bij in vitro testen was er geen interactie met de oestrogeenreceptor. De metabolisatie gebeurt echter traag. Slechts na 48 uur wordt een conversie gezien van 95%, wat duidelijk te traag is om in de praktijk gebruikt te kunnen worden Phaffia rhodozyma - Xanthophyllomyces dendrorhous Phaffia rhodozyma en Xanthophyllomyces dendrorhous zijn twee nauw gerelateerde gisten van het genus Blastomyces. Ze werden geisoleerd uit exsudaat van bladverliezende bomen in Japan en Alaska (Miller et al., 1976). Recente studies wezen uit dat verschillende isolaten die vroeger als P. rhodozyma werden benoemd eigenlijk zowel P. rhodozyma als X. dendrorhous bevatten (Palágyi et al., 2004). P. rhodozyma en X. dendrorhous zijn de enige bekende gisten met het vermogen om het carotenoid astaxanthine te produceren. P. rhodozyma en X. dendrorhous zijn in staat OTA te metaboliseren tot OT-α (Péteri et al., 2007). Deze conversie wordt mogelijk gemedieerd door een enzyme dat nauw gerelateerd is aan carboxypeptidase A. Het enzyme is celgebonden en werkt optimaal bij temperaturen > 30 C. Na 15 dagen incubatie bij 20 C werd een degradatiegraad van 90% waargenomen. In vitro testen wezen ook uit dat P. rhodozyma en X. dendrorhous in staat zijn tot adsorptie van OTA. De adsorptiecapaciteit van de gisten stijgt significant na hittebehandeling Saccharomyces cerevisiae Gisten en lactaat bacteriën komen voor als deel van de natuurlijke microbiële populatie in spontane voedselfermentatie en als starterculturen in de voedselindustrie. Saccharomyces cerevisiae of bakkersgist is hierbij een van de meest voorkomende en gebruikte gisten. S. cerevisiae is het belangrijkste organisme onder de mycotoxinebinders en wordt dus niet zozeer als metaboliseerder 13

21 gebruikt in tegenstelling tot de vorige organismen. De gehele gist kan gebruikt worden, maar ook afzonderlijke delen van de celwand kunnen opgezuiverd worden en als voederadditief gebruikt worden. Hierbij zijn voornamelijk de mannan-oligosacchariden en de β-glucanen belangrijk. De celwand van een gist bestaat bijna volledig uit eiwitten en carbohydraten (Fig. 7). De carbohydraat fractie bevat voornamelijk glucose, mannose en N-acetylglucosamine. Glucanen en mannanen worden ongeveer in gelijke concentratie gevonden in S. cerevesiae (EFSA, 2009). De celwand kan zowel mechanisch als enzymatisch gescheiden worden van de celinhoud (Freimund et al., 2003). Wanneer men de volledige gist wil gebruiken als detoxifier, dan kan dit zowel in levende vorm, in gedroogde vorm als in gelyseerde vorm zijn. Als men enkel de mannan-oligosacchariden wil gebruiken, dan dient men deze te extraheren uit de celwand met een alkaliene extractie-methode waarbij ook een deproteïnisatie plaatsvindt (Huang et al., 2010). De β-glucanen ten slotte kunnen met verschillende methoden worden geïsoleerd. Methodes met basen, zuren of een combinatie van beide zullen de eiwitten en andere polysacchariden van het substraat oplossen. De overgebleven residuen zijn (licht beschadigde) β-glucanen (Freimund et al., 2003). β-glucanen kunnen echter ook enzymatisch geïsoleerd worden (Freimund et al., 2003). Het is al langer bekend dat S. cerevisiae in staat is om aflatoxines te adsorberen (Oguz et al., 2001, Stanley et al., 1993). Hiervoor zouden vooral de beta-d-glucanen verantwoordelijk zijn (Yiannikouris et al., 2004). Deze carbohydraat complexen hebben een hoge bindingsneiging voor zowel ZEA als AFB1. Daarnaast worden ook FB1 en DON gebonden, maar dit gebeurt in mindere mate. Veresterde glucomannanen geïsoleerd uit S. cerevisiae hebben eveneens mycotoxine-bindende eigenschappen (Raju en Devegowda, 2000). Tot slot zijn enkele stammen van S. cerevisiae in staat om AFB1 te degraderen (Styriak en Conkova, 2002). Deze omzetting gebeurt echter zeer traag, waardoor deze methode geen praktische nut heeft. Fig. 7. Structuur van een gistcelwand 14

22 2.5 Enzymen Inleiding Er bestaan heel veel enzymen die in staat zijn tot in vitro biotransformatie van mycotoxinen. Deze literatuurstudie beperkt zich echter tot de meest voorkomende en efficiëntste van deze enzymen. Deze enzymen worden meestal geproduceerd door micro-organismen en zijn een attractief alternatief tegenover het gebruik van levende organismen voor detoxificatie van mycotoxinen aanwezig in diervoeder. Het gebruik van zuivere enzymen bevat echter ook belangrijke nadelen. Zo is er de hoge kost van het opzuiveren van de enzymen. Voor een goede werking van het enzyme zijn dikwijls coenzymen vereist. Ook ATP moet aanwezig zijn Protease A Proteases zijn enzymen die eiwitten afbreken. Ze werken het best in een zuur milieu. Protease A wordt via diverse fermentatieprocessen bekomen uit A. niger stammen (Abrunhosa et al., 2006). Protease A kan OTA hydrolyseren tot OT-α. Een detoxificatie van 87.3% werd vastgesteld na 25 uur Pancreatine Pancreatine is een mengeling van verschillende enzymen die geproduceerd worden door de exocriene cellen van de pancreas. Het bevat trypsine, amylase, lipase en protease. Pancreatine kan net zoals protease A OTA hydrolyseren, maar doet dit in mindere mate (Abrunhosa et al., 2006) Carboxypeptidase A Carboxypeptidase A (CPA1) is een exopeptidase uit de pancreas dat peptidebindingen hydrolyseert van C-terminale residuen met aromatische of alifatische zijketens (Schatzmayr et al., 2006). OTA kan aldus worden omgezet naar OT-α en phenylalanine (Pitout, 1969) α-chymotrypsin α-chymotrypsine kan net als CPA1 OTA hydrolyseren, maar dit gebeurt in mindere mate (Pitout, 1969) Epoxidasen Epoxydasen kunnen trichothecenen detoxifiëren door hun epoxy-groep om te zetten in dieen-groepen (Schatzmayr et al., 2006). Het zijn deze epoxydasen die de mycotoxine-detoxifiërende werking van Eubacterium BBSH 797 uitvoeren. 15

23 2.5.7 Lactonohydrolasen Lactonohydrolasen kunnen de lactongroep van ZEA splitsen, waardoor deze omgezet wordt in een minder toxisch product (Takahashi-Ando et al., 2002). Het enzyme werd geïsoleerd uit de fungus Clonostachys rosea IFO Aflatoxin-detoxifizyme Aflatoxin-detoxifizyme wordt geïsoleerd uit Armillariella tabescens. Het kan AFB1 degraderen tot een minder toxische metaboliet door het openen van de difuraanring (Liu et al., 2001). 16

24 2.6 Protozoa Tetrahymena pyriformis Tetrahymena pyriformis werd geïsoleerd uit het rumen van een rund en is in staat tot degradatie van AFB1 (Wu et al., 2009). Er werd een daling van de concentratie van AFB1 van 25% vastgesteld na 30 uur. De gevormde metaboliet blijkt aflatoxicol te zijn Andere Biotransformatie van T-2 naar HT-2 door ruminale protozoa werd vastgesteld (Beeton en Bull, 1989). Degradatie van ZEA door ruminale inhoud werd ook vastgesteld, waarbij gevonden werd dat de ruminale protozoa in dit proces een grotere rol speelden dan de ruminale bacteriën (Kiessling et al., 1984). Het gaat hier echter niet om een detoxificatie-proces, aangezien ZEA vooral werd omgezet naar α-zea, dat vele malen toxischer is dan zijn precursor. 17

25 3 Commercieel beschikbare biologische producten 3.1 Inleiding Bijna alle commercieel beschikbare producten met als indicatie mycotoxine-bestrijding, zijn producten met een adsorberende werking. Meestal zijn deze producten inorganische mycotoxinebinders met als bestanddelen aluminosilicaten, actieve kool of synthetische polymeren. Er zijn weinig biologische producten beschikbaar en van deze producten zijn er maar enkele biotransformerende producten. 3.2 Eubacterium BBSH 797 Biomin BBSH 797 wordt geproduceerd door Biomin en bevat de bacterie E. BBSH 797. Dit product kan aldus gebruikt worden voor detoxificatie van trichothecenen zoals DON. De werking van dit product werd reeds uitvoerig getest en bewezen (Fuchs et al., 2002). 3.3 Trichosporon mycotoxinivorans Biomin Mycofix Plus 3.E wordt gemaakt door Biomin en bevat de gist T. mycotoxinivorans. Dit product kan aldus gebruikt worden voor detoxificatie van OTA en in mindere mate voor ZEA. De efficaciteit van T. mycotoxinivorans in de praktijk werd reeds getest en goed bevonden (Politis et al., 2005). 3.4 Saccharomyces cerevisiae Biocell, een product uitgebracht door Biocell Agri; en Biosaf, een product uitgebracht door Lesaffre, bevatten een levende gist, namelijk S. cerevisiae. Naast de eerder besproken detoxifiërende effecten, is het al langer gekend dat S. cerevisiae een positief effect heeft op de vertering (Shetty en Jespersen, 2006). 3.5 Enzymen Biomin FUMzyme bevat een fumonisine esterase dat geïsoleerd werd uit Sphingopyxis sp. MTA 144 (Heinl et al., 2010). Dit enzyme kan FB1 degraderen tot zijn niet-toxische gehydrolyseerde vorm HFB1. Het onderzoek gebeurde al enkele jaren terug, maar een commercieel product is pas recentelijk beschikbaar geworden. Amano Enzymes Inc. bracht Protease A DS op de markt. Dit is een product dat protease A bevat en zodoende OTA kan hydrolyseren (Abrunhosa et al., 2006). 18

26 3.6 Mycotoxinebinders Deze producten bevatten componenten die een wijd assortiment mycotoxinen kunnen adsorberen (tabel 2) (De Mil et al., 2013). De producten bevatten gistcelwandextracten, glucomannanpolymeren en/of β-glucanen. Allen werden grondig in vitro en in vivo onderzocht (Aravind et al., 2003, Diaz et al., 2004, Diaz et al., 2005, Ringot et al., 2005). De producten vermeld in tabel 2 zijn geen allesomvattende lijst. Tabel 2. Commercieel beschikbare biologische producten PRODUCTNAAM VERDELER INHOUD VOLGENS FABRIKANT Active MOS Orffa Mannan-oligosacchariden AgriMOS Lallemand Mannan-oligosacchariden andsorb MOS Andnutrition Clinoptiloliet, mannan-oligosacchariden andtotal Andnutrition Clinoptiloliet, mannan-oligosacchariden, antimycoticum Antaferm H25 MOS Dr. Eckel Mannan-oligosacchariden bgmos EW Nutrition Mannan-oligosacchariden Biolex MB40 Leiber Gmbh Prebiotica, β-glucanen Biosecure MP 362 Nutrecia catalana Gistcelwandextracten Captex Fusa Dox-Al Clinoptiloliet, hars, veresterde glucomannanen Captex T2 Dox-Al Clinoptiloliet, enzymen F1- Natural mycobinder TBA organics β-glucanen, gistcelwandextracten Fibosel Trouw Nutrition β-glucanen MTB 100 Alltech Veresterde glucomannanen Mycogen Emma nutrition Gistcelwandextracten Mycosorb Alltech Gistcelwandextracten Oligos JH biotech inc Mannan-oligosacchariden Safmannan Phibro animal health corp. Mannan-oligosacchariden, β-glucanen Solis MOS Novus int HSCAS, mannan-oligosacchariden Toxiroak Gold Ayurvet Mannan-oligosacchariden Toxtrap ABAC AG Plantvezels Toxynil plus dry Nutriad Veresterde glucomannanen Ultrasorb ABvista Klei, mannan-oligosacchariden, gistcelwandextracten Ultrasorb Micron Biosystem Aluminumsilicaat, mannan-oligosacchariden, gistcelwandextracten UT aflatrol Ultra Bioligics Inc Mannan-oligosacchariden Vilocym z Ayurvet Mannan-oligosacchariden, HSCAS, vitamines Yeast cell products Lesaffre Gistcelwandextracten 19

27 4 Wettelijk kader rond voederadditieven Een voederadditief of toevoegingsmiddel wordt in EU verordening 1831/2003 gedefinieerd als: stoffen, micro-organismen of preparaten die geen voedermiddelen noch voormengsels zijn en die opzettelijk aan diervoeder of water worden toegevoegd met name met het oog op een of meer van de in artikel 5, lid 3, vermelde functies. Deze functies worden als volgt gedefinieerd: Het toevoegingsmiddel moet: a) de eigenschappen van diervoeder gunstig beïnvloeden; b) de eigenschappen van dierlijke producten gunstig beïnvloeden; c) de kleuren van siervissen en vogels gunstig beïnvloeden; d) voldoen aan de voedingsbehoeften van dieren; e) het milieu-effect van de dierlijke productie gunstig beïnvloeden; f) de dierlijke productie, prestaties of welzijn gunstig beïnvloeden, met name door in te werken op de maag- en darmflora of op de verteerbaarheid van de diervoeders, of g) een coccidiostatische of histomonostatische werking teweeg te brengen. Mycotoxine detoxifiers worden beschreven als: stoffen ter vermindering van de verontreiniging van diervoeders met mycotoxinen: stoffen die de absorptie van mycotoxinen kunnen tegengaan of verminderen, de uitscheiding ervan kunnen bevorderen of de werkingswijze ervan kunnen wijzigen. Van de gekende mycotoxinen zijn tot op heden enkel voor aflatoxinen maximumwaarden beschreven voor diervoeders in de Europese wetgeving. Deze waarden zijn te vinden in EU richtlijn 2002/32/EC. Alle producten die erkend zijn als voederadditieven in de EU zijn opgenomen in het EU Register of Feed Additives (EU verordening 1831/2003). Voederadditieven worden volgens deze verordening in verschillende categorieën ingedeeld. Mycotoxine detoxifiers worden ingedeeld bij de technologische additieven volgens EU verorderening 386/2009. De andere categorieën zijn: sensorische additieven, nutritionele additieven, zoötechnische additieven en coccidiostatische/histomonostatische additieven. Sommige producten zoals gistcelwanden en afgeleiden worden momenteel beschouwd als voedermiddelen en worden dus gereguleerd door EU verordening 767/2009. De regulatie van voederadditieven is op deze producten dus niet van tel. Bij verordening 767/2009 zit een bijlage waar alle producten worden opgesomd die verboden of gelimiteerd zijn in voedermiddelen (annex III). Om een product te laten erkennen als voederadditief moet een bepaalde procedure gevolgd worden, zoals beschreven in EU verordening 429/2008. Een dossier moeten worden opgemaakt en ingediend worden bij de Europese Commissie en bij de European Food Safety Authority (EFSA). In dit dossier moeten de bestanddelen van het product worden beschreven, moet de veiligheid van het product aangetoond worden en moet de efficaciteit van het product bewezen worden. Productmonsters worden bij het dossier toegevoegd en alle onderzoek die gebeurd is in het kader van het dossier moet ook ingediend worden. De EFSA zal het dossier onderzoeken en een advies hierover vormen. De Europese Commissie neemt de beslissing of ze al of niet een erkenning uitreikt voor het product. Een erkenning is tien jaar geldig en kan worden verlengd, telkens in periodes van tien jaar. Eens een erkenning is uitgereikt, mag het product vermarkt worden. Bijkomstige technische en administratieve richtlijnen kunnen voorzien worden door de EFSA. Dit is het geval bij mycotoxine detoxifiers. Opdat een bedrijf voederadditieven zou mogen produceren en/of op de markt brengen, moeten zij zelf ook eerst een erkenning bekomen. Dit wordt opgelegd in EU verordening 183/2005 en wordt in België verder uitgewerkt in KB 16/01/

28 BESPREKING Door de wereldwijde aanwezigheid en impact van mycotoxinen zal het gebruik van detoxifiërende en decontaminerende producten enkel nog toenemen. Tot nu toe werden mycotoxinen vooral bestreden met mycotoxinebinders die een onoplosbaar complex vormden met de mycotoxinen. Naar de toekomst toe zal meer en meer aandacht worden besteed aan biotransformerende producten die de mycotoxinen omzetten naar minder/niet-toxische producten. Het voordeel van deze laatste categorie is dat het hier gaat om biologische producten. Deze zijn dus biologisch afbreekbaar, de kostprijs zal mogelijk een stuk lager liggen dan van de synthetische producten en ze hebben een specifieke maar efficiënte werking. Er moet wel voldoende onderzocht worden of de gevormde metabolieten daadwerkelijk minder schadelijk zijn dan hun precursoren. Momenteel zijn al veel in vitro studies gepubliceerd over biotransformerende agentia maar zijn er zeer weinig in vivo studies gebeurd. Meer in vivo trials zijn nodig om de praktische bruikbaarheid van veel producten goed te kunnen inschatten. Een groot probleem in het onderzoek naar biotransformende agentia is de beschikbaarheid van gedane studies; veel studies zijn confidentieel en bedrijfsspecifiek waardoor het heel moeilijk is om over de respectievelijke producten een objectief oordeel te vellen. Een ideale detoxifier moet aan een aantal voorwaarden voldoen. De detoxifier moet vooreerst goed mengbaar zijn met voeder. Het product mag de voedingswaarde van het voeder niet aantasten. Het moet een chemisch stabiel product zijn dat de gasto-intestinale tractus onveranderd kan passeren. Het moet zijn doelwit-mycotoxine gericht en snel omzetten naar een metaboliet die minder toxisch is dan zijn precursor. Het is een product dat idealiter goedkoop geproduceerd kan worden en dat zelf geen risico vormt voor de diergezondheid. Eubacterium BBSH 797 was het eerste product officieel geregistreerd als mycotoxine modifier. Het is tot op heden het enige beschikbare commerciële product die op een efficiënte manier DON onschadelijk maakt. In de toekomst zullen echter allicht nieuwere producten beschikbaar komen die sneller zullen werken. Naar de toekomst toe ziet vooral het gebruik van de gist Trichosporon mycotoxinivorans er zeer beloftevol uit. Er is al een commercieel product op de markt als additief, maar verder onderzoek zal de praktische toepassingsmogelijkheden van deze gist ongetwijfeld doen verbeteren. T. mycotoxinivorans kan OTA zeer snel en compleet degraderen, terwijl ook ZEA deels kan gemetaboliseerd worden. Zeer recent werd een stam van Bacillus subtilis gevonden die in staat is tot degradatie van ZEA. Door zijn hoge graad van detoxificatie en zijn lichte antimicrobiële eigenschappen lijkt dit een product die in de toekomst mogelijk een praktische betekenis kan hebben. Verder onderzoek naar de efficaciteit en bruikbaarheid is echter vereist. Andere producten waar meer onderzoek met publicatie in de internationale literatuur zal over gebeuren in de toekomst zijn Aspergillus niger en fumonisine esterase. Zij kunnen respectievelijk ZEA en fumonisinen degraderen. 21

29 REFERENTIELIJST Alberts, J. F., Engelbrecht, Y., Steyn, P. S., Holzapfel, W. H., van Zyl, W. H. (2006). Biological degradation of aflatoxin B1 by Rhodococcus erythropolis cultures. International Journal for Food Microbiology 109, Arai T., Tatsuya I., Koyama Y. (1967). Antimicrobial activity of aflatoxins. Journal of Bacteriology 93, Abrunhosa L., Santos L., Venancio, A. (2006). Degradation of ochratoxin A by proteases and by a crude enzyme of Aspergillus niger. Food Biotechnology 20, Geciteerd door EFSA (2009). Beeton S., Bull A. T. (1989). Biotransformation and detoxification of T-2 toxin by soil and freshwater bacteria. Applied and Envionmental Microbiology 55, Bennett J. W., Klich M. (2003). Mycotoxins. Clinical Microbiology Reviews 16, Geciteerd door Devreese et al. (2013a). Binder E. M., Heidler D., Schatzmayr G., Thimm N. (2000). A Novel Feed Additive to Counteract Trichothecene Toxicosis in Pig Production. Voordracht: 16th International Pig Veterinary Society Congress, Melbourne, Australië September Blackwell B. A., Gilliam J. T., Savard E. M., Miller J. D., Duvick J. P. (1999). Oxidative deamination of hydrolyzed fumonisin B1 (AP1) by cultures of Exophiala spinifera. Natural Toxins 7, Bullerman L. B., Bianchini A. (2007). Stability of mycotoxins during food processing. International Journal of Food Microbiology 119, Ciegler A., Lillehoj E. B., Peterson R. E., Hall H. H. (1966). Microbial detoxification of aflatoxin. Applied Microbiology 14, Creppy E. E., Stormer F. C., Kern D., Röschenthaler R., Dirheimer G. (1983). Effects of ochratoxin A metabolites on yeast phenylalanyl-trna synthetase and on the growth and in vivo protein synthesis of hepatoma cells. Chemico-Biological Interactions 47, Cundliffe E., Davies J. E. (1977). Inhibition of Initiation, Elongation, and Termination of Eukaryotic Protein Synthesis by Trichothecene Fungal Toxins. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11, De Mil T., Eeckhout M., Van Ranst E., De Backer P., & Croubels S. (2013). Field study to identify frequently used mycotoxin detoxifiers in Belgium. 35th Mycotoxin Workshop, Gent, mei Desjardins A. E., Hohn T. M., Mccormick S. P. (1993). Trichothecene biosynthesis in fusarium species - chemistry, genetics, and significance. Microbiological Reviews 57,

30 Devreese M., De Backer P., Croubels S. (2013a). Overview of the most important mycotoxins for the pig and poultry husbandry. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 82, Devreese M., De Backer P., Croubels S. (2013b). Different methods to counteract mycotoxin production and its impact on animal health. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 82, Diaz D. E., Hagler W. M., Blackwelder J. T., Eve J. A., Hopkins B. A., Anderson K. L., Jones F. T., Whitlow L. W. (2004). Aflatoxin binders II: Reduction of aflatoxin M1 in milk by sequestering agents of cows consuming aflatoxin in feed. Mycopathologia 00, 1-8. Diaz G. J., Cortes A., Roldan L. (2005). Evaluation of the efficacy of four feed additives against the adverse effects of T-2 toxin in growing broiler chickens. Journal of Applied Poultry Research 14, Geciteerd door EFSA (2009). Duarte S. C., Pena A., Lino C. M. (2010). A review on ochratoxin A occurrence and effects of processing of cereal and cereal derived food products. Food Microbiology 27, Eaton D. L., Gallagher E. P. (1994). Mechanisms of aflatoxin carcinogenesis. Annual Reviews in Pharmacology and Toxicology 34, EFSA (2009). Review of mycotoxin-detoxifying agents used as feed additives: mode of action, efficacy and feed/food safety. El-Nezami H., Kankaanpaa P., Salminen S., Ahokas J. (1998). Ability of dairy strains of lactic acid bacteria to bind a common food carcinogen, aflatoxin B1. Food and Chemical Toxicology 36, El-Sharkawy S., Abul-Hajj Y.J. (1988). Microbial cleavage of zearalenone. Xenobiotica 18, Geciteerd door EFSA (2009). Engelhardt G. (2002). Degradation of Ochratoxin A and B by the White Rot Fungus Pleurotus ostreatus. Mycotoxin Research 18, Freimund S., Sauter M., Käppeli O., Dutler H. (2003). A new non-degrading isolation process for 1,3- β-d-glucan of high purity from baker's yeast Saccharomyces cerevisiae. Carbohydrate Polymers 54, Fuchs E., Binder E. M., Heidler D., Krska R. (2002). Structural characterization of metabolites after the microbial degradation of type A trichothecenes by the bacterial strain BBSH 797. Food Additives and Contaminants 19, Geciteerd door EFSA (2009). Gallagher E. P., Kunze K. L., Stapleton P. L., Eaton D. L. (1996). The kinetics of aflatoxin B1 oxidation by human cdna-expressed and human liver microsomal cytochromes P450 1A2 and 3A4. Toxicology and Applied Pharmacology 141, Geiser D. M., Klich M. A., Frisvad J. C., Peterson S. W., Varga J., Samson R. A. (2007). The current status of species recognition and identification in Aspergillus. Studies in Mycology 59,

31 Haschek W. M., Gumprecht L. A., Smith G., Tumbleson M. E., Constable P. D. (2001). Fumonisin toxicosis in swine: an overview of porcine pulmonary edema and current perspectives. Environmental Health Perspectives 109, Heidler D., Schatzmayr G. (2003). A new approach to managing mycotoxins. World Poultry 19, Heinl S., Hartinger D., Thamhesl M., Vekiru E., Krska R., Schatzmayr G., Moll W.D., Grabherr R. (2010). Degradation of fumonisin B-1 by the consecutive action of two bacterial enzymes. Journal of Biotechnology 145, Hormisch D., Brost I., Kohring G. W., Giffhorn F., Kroppenstedt R. M., Stackebrandt E., Färber P., Holzapfel W. H. (2004). Mycobacterium fluoranthenivorans sp. nov., a fluoranthene and aflatoxin B1 degrading bacterium from contaminated soil of a former coal gas plant. Systematic and Applied Microbiology 27, Geciteerd door Wu et al. (2009). Huang G. L., Yang Q., & Wang Z. B. (2010). Extraction and deproteinization of mannan oligosaccharides. Zeitschrift für Naturforschung 65c, Humpf H. U., Schmelz E. M., Meredith F. I., Vesper H., Vales T. R., Wang E., Menaldino D. S., Liotta D. C., Merrill A. H. Jr. (1998). Acylation of Naturally Occurring and Synthetic 1-Deoxysphinganines by Ceramide Synthase. The Journal of Biological Chemistry 273, Hwang C. A., Draughon F. A. (1994). Degradation of ochratoxin A by Acinetobacter calcoaceticus. Journal of Food Protection 57, Geciteerd door EFSA (2009). IARC (1993). Mycotoxins. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans 56, IARC (2002). Some Mycotoxins. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans 82, Jard G., Liboz T., Mathieu F., Guyonvarc h A., André F., Delaforge M., Lebrihi A. (2010). Transformation of zearalenone to zearalenone sulfate by Aspergillus sp. World Mycotoxin Journal 3, Jard G., Liboz T., Mathieu F., Guyonvarc h A., Lebrihi A. (2011). Review of mycotoxin reduction in food and feed: from prevention in the field to detoxification by adsorption or transformation. Food Additives and Contaminants Part A 28, Kamimura H. (1986). Conversion of Zearalenone to Zearalenone Glycoside by Rhizopus sp. Applied and Environmental Microbiology 52, Kellerman T. S., Marasas W. F., Thiel P. G., Gelderblom W. C., Cawood M., Coetzer J. A. (1990). Leukoencephalomalacia in two horses induced by oral dosing of fumonisin B1. The Onderstepoort Journal of Veterinary Research 57,