NEISSERIA GONORRHOEAE ROTORGENE VALIDATIE

Transcriptie

1 pagina 1 / 16 I) Scope Implementatie van een moleculaire test: Parameter: Neisseria gonorrhoeae kwalitatief Matrix: Urine (M) en genitale wissers (V) in eswab transportmedium Toestel: Rotorgene 6000 (Qiagen) Techniek: Real-time PCR Kit: Diagenode Neisseria gonorrhoeae real-time PCR kit + Qiagen Quantifast Probe PCR Master Mix Een nieuwe moleculaire test is nodig ter vervanging van de vroegere in-house NG NASBA assay, die specificiteitsproblemen vertoonde (commensale Neisseria species werden opgepikt). De kit van Diagenode is CE-IVD approved en is gevalideerd in combinatie met de Nuclisens EasyMAG en de Rotorgene De Master Mix wordt apart aangekocht bij Qiagen (Quantifast Probe PCR Master Mix). Onze start-en elutievolumes zijn verschillend met wat in de bijsluiter wordt aangeraden, dus zullen we de LOD opnieuw moeten bepalen. De kit is gebaseerd op het artikel A duplex Neisseria gonorrhoeae real-time polymerase chain reaction assay targeting the gonococcal pora pseudogene and multicopy opa genes. Namray Goire, Michael D. Nissen, Genevera M. LeCornec, Theo P.Sloots, David M. Whiley. Diagnostic Microbiology and infectious disease 61 (2008) 6-12 en gebruikt dezelfde primers en probes voor de detectie van Neisseria gonorrhoeae. Hierdoor kunnen we de data uit dit artikel en gerelateerde artikels gebruiken in het validatiedossier. II) Literatuurstudie (1) Neisseria gonorrhoeae Real-Time PCR (Rotor-Gene 3000/6000/Q) User Manual Diagenode Vs4 ( ) (2) A duplex Neisseria gonorrhoeae real-time polymerase chain reaction assay targeting the gonococcal pora pseudogene and multicopy opa genes. Goire N, Nissen MD, LeCornec GM, Sloots TP, Whiley DM. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008: 61: (3) Comparison of three in-house multiplex PCR assays for the detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis using real-time and conventional detection methodologies. Whiley DM, Sloots TP. Pathology 2005; 37: (4) Evaluation of opa-based real-time PCR for detection of Neisseria gonorrhoeae. Sepehr. N. Tabrizi, Shujun chen, John Tapsall, Suzanne M. Garland. Sex Transm Dis 2005; 32:

2 pagina 2 / 16 (5) Noninvasive testing for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Cook RL, Hutchison SL, Ostergaard L, BraithwaiteRS, Ness RB; Ann Intern Med 2005; 142: (6) Nucleic acid amplification Testing for Neisseria gonorrhoeae: An ongoing challenge. Whiley DM, Tapsall JW, Sloots TP. J Mol Diagn 2006; 8: (7) Uptodate versie Neisseria gonorrhoeae infections in women. (8) Uptodate versie Neisseria gonorrhoeae infections in men. (9) 2009 European (IUSTI/WHO) guideline on the diagnosis and treatment of gonorrhoea in adults. Bignell C; IUSTI/WHO. Int J STD AIDS. 2009; 20: (10) Neisseria gonorrhoeae. Marrazzo JM, Handsfield HH, Sparling PF. In Principles and practice of infectious diseases, 7 th edition. Mandell et al. p (11) Specimen Collection, Transport, and Processing: Bacteriology. Thomson RB. In Manual of Clinical Microbiology, 9 th edition. Murray et al. p (12) Neisseria. Janda WM, Gaydos CA. In Manual of Clinical Microbiology, 9 th edition. Murray et al. p (13) Evaluation of self-collected vaginal swab, first void urine, and endocervical swab specimens for the detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in adolescent females. Fang J, Husman C, DeSilva L, Chang R, Peralta L. J Pediatr Adolesc Gynecol Dec;21(6): (14) ASM Clinical Procedures Microbiology 3 rd edition (2010) Neisseria gonorrhoeae Cultures. (15) Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infections MMWR October 18, 2002/Vol. 51/ No. RR-15. (16) Comparison of M4 and M4RT Media for Transporting Cervical Swab Samples for PCR Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Jaber Aslanzadeh and Mathew Jones Department of Laboratory Medicine, University of Connecticut Health Center, Farmington, Connecticut. Annals of Clinical & Laboratory Science, vol. 32, no. 1, 2002 (17) Diagnostiek en behandeling van seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA). NVDV in samenwerking met NVMM. Versie III) Validatie III A) Analytisch 1) Analytische sensitiviteit (detectielimiet = LOD) Externe gegevens (literatuur)

3 pagina 3 / 16 Bijsluiter: Diagenode Neisseria gonorrhoeae Real-time PCR (1) In de bijsluiter wordt onvoldoende informatie gegeven over de LOD. We kunnen enkel terugvinden dat de LOD 10 copies/pcr reactie bedraagt. Vermits de LOD bepaald werd zonder extractie zal de LOD per matrix opnieuw bepaald worden in dit validatiedossier. Evaluation of opa-based real-time PCR for detection of Neisseria gonorrhoeae. Sepehr. N. Tabrizi, Shujun chen, John Tapsall, Suzanne M. Garland. Sex Transm Dis 2005; 32: (4) dit artikel beschrijft een analytische gevoeligheid van 1 kopie/pcr reactie (zonder extractie) en enkel aan de hand van de Opa PCR reactie. We hebben besloten te werken met een kit die 2 NG targets opspoort, nl de opa genen en het pora pseudogen pora pseudogen: het pora pseudogen is afwezig in commensale Neisseria en het pora gen van Neisseria meningitidis is voldoende verschillend van N.gonorrhoeae. Hierdoor is het pora gen een prima target voor de detectie van NG. Opa genen: de opa genen zijn multicopy genen (11 tot 13 copies/genoom) en zijn sterk geconserveerd binnen de verschillende N.gonorrhoeae strains. Het grote aantal copy numbers geeft de test een hoge gevoeligheid, maar vermindert ook het aantal vals negatieven. Wanneer er zich een mutatie of deletie voordoet in één van de opa-genen, worden de andere opa genen toch nog steeds opgepikt. Andere beschreven targets zoals 16S en cppb (cryptisch plasmide) geven specificiteitsproblemen of zijn niet aanwezig in sommige N.gonorrhoeae strains (cppb) Interne verificatie Om de LOD te bepalen werden beide matrices (urine en swabs) gespiked met Neisseria gonorrhoeae afkomstig van de firma Vircell ( copies/µl). De gebruikte Neisseria strain in deze controle is DSMZ n 9188 LOD Neisseria gonorrhoeae in urine 500 copies/ml 150 copies/ml 50 copies/ml 25 copies/ml 12.5 copies/ml

4 pagina 4 / 16 Positief (33,29) Positief Positief Positief (Ct = 39,96) Positief (33,09) Positief Positief Positief (32,92) Positief Positief Positief (34,56) Positief Positief Positief (31,95) Positief Positief Positief (33,77) Positief Positief Positief (33,46) Positief Negatief Positief (32,39) Negatief Positief Positief (33,33) Positief Positief Positief (33,13) Positief (33,33) Positief (34,43) Positief (32,21) Positief (34,37) Positief (33,50) Positief (33,41) Positief (33,89) Positief (33,23) Positief (35,18) Positief (34,18) Zwak positief Neisseria gonorrhoeae urine (gemiddelde -3,3 Ct) Ct = 30,1 LOD Neisseria gonorrhoeae Eswab transportmedium 5000 copies/ml 2500 copies/ml 1250 copies/ml 625 copies/ml 312 copies/ml Positief Positief Positief Positief (35,49) Positief (33,91) Positief (34,04) Positief (36,03) Positief (34,53) Positief (35,28) Positief (34,79) Positief (35,35) Positief (35,04) Positief (34,97) Positief (36,39) Positief (32,27) Positief (34,64)

5 pagina 5 / 16 Positief (35,31) Positief (34,95) Positief (33,47) Positief (35,62) Positief (34,54) Positief (36,41) Positief (34,90) Zwak positief Neisseria gonorrhoeae eswab (gemiddelde -3,3 Ct) Ct = 31,6 Conclusie: - De LOD (met een 95% betrouwbaarheidinterval) voor eswabs in transportmedium bedraagt 312 copies/ml - De LOD (met een 95% betrouwbaarheidinterval) voor urine bedraagt 150 copies/ml. 2) Analytische specificiteit/cross-reactiviteit Externe gegevens (literatuur) Evaluation of opa-based real-time PCR for detection of Neisseria gonorrhoeae. Sepehr. N. Tabrizi, Shujun chen, John Tapsall, Suzanne M. Garland. Sex Transm Dis 2005; 32: (4) De Opa assay werd getest op cross-reactie met volgende micro-organismes: - N. meningitidis - N. subflava - N. lactamica - N. cinerea - N. flavescens - 37 isolaten van niet-neisseria species die voorkomen in de urogenitale regio. De assay vertoonde geen enkele amplificatie met deze micro-organismes. Comparison of three in-house multiplex PCR assays for the detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis using real-time and conventional detection methodologies. Whiley DM, Sloots TP. Pathology 2005; 37: (3).

6 pagina 6 / 16 Vermits het pora (pseudo)gen enkel voorkomt bij N.meningitidis en N. gonorrhoeae en niet bij andere commensale Neisseria, werden 20 N. meningitidis isolaten getest op crossreactiviteit. Geen enkel isolaat vertoonde cross-reactie. Interne verificatie De goede specificiteit van onze N.gonorrhoeae werd reeds aangetoond in het labo: QCMD stalen NG09-08 en NG08-06, positief voor N.lactamica, werden niet opgepikt door onze assay. Ook staal NG08-09, positief voor N.cinerea, werd niet opgepikt. 3) Test limitaties: 3.1 Storage & transport Externe gegevens: Bijsluiter Diagenode (1) - Zowel urinestalen als wissers moeten getransporteerd worden op kamertemperatuur of op 4 C voor een transport van langere termijn. - Urinestalen moeten bewaard worden op 4 C gedurende maximum 24 uur of op - 20 C (of -80 C) voor langere periodes - Wissers moeten bewaard worden op kamertemperatuur gedurende maximum 24 uur of op 4 C voor langere periodes. Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infections MMWR October 18, 2002/Vol. 51/ No. RR-15 (15) - Urinestalen kunnen getransporteerd worden 24 uur op kamertemperatuur of 5 dagen op 2-8 C. - Wissers kunnen getransporteerd worden in een aangepast medium 5 dagen op 2-27 C of 7 dagen op 2-8 C - Urinestalen kunnen worden ingevrozen op -20 C en getest worden tot 60 dagen na afname - Wissers kunnen ingevrozen worden op -70 C en getest worden tot 60 dagen na afname Interne verificatie 1. Aan de hand van de inter-run resultaten blijkt dat Urine en eswabs gedurende ten minste 3 dagen stabiel zijn op 2-8 C.

7 pagina 7 / Na aankomst in het labo wordt het staal zo snel mogelijk in lysis buffer gebracht en bewaard op -80 C tot van start wordt gegaan met de extractie. Om aan te tonen dat het DNA stabiel blijft in lysis buffer bij bewaring op -80 C, wordt lysis buffer gespiked met NG DNA, lage concentratie (Vircell) en gedurende 14 dagen bewaard op -80 C. 09/02/2010 (1) Ct = 34,13 23/02/2010 (2) Ct = (1) Staal in lysis buffer, getest vóór invriezen (2) Staal in lysis buffer, getest na 14 dagen invriezen op -80 C Conclusie: stalen kunnen zonder problemen in lysis buffer bewaard worden op -80 C gedurende 2 weken 3.2 Inhibitie Een experiment aangaande inhibitie is gepland van zodra we over een geïnhibeerd staal beschikken. 4) Accuraatheid Voor het bepalen van de accuraatheid maken we gebruik van QCMD stalen. Staal Diagnenode NG kit NASBA Verwacht resultaat (QCMD) QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Negatief Negatief Negatief QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Negatief Positief Negatief QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Negatief Negatief Negatief QCMD NG Negatief Positief Negatief QCMD NG Positief Positief Positief QCMD NG Negatief Negatief Negatief Conclusie:

8 pagina 8 / 16 Met de QCMD stalen vertoont onze assay een excellente sensitiviteit en specificiteit (100% correct voor 2008 en 2009). Er is een 100% agreement met de te verwachten resultaten en daarmee wordt voldaan aan het accuracy criterium. 5) Precision (reproduceerbaarheid) 5a) Inter-run De stalen werden bewaard op 2-8 C tijdens de verschillende inter-run experimenten. Urine Positief staal: urine gespiked met een 1/1000 verdunning van een 0,5 McFarland oplossing van Neisseria gonorrhoeae ATCC-stam (lot ) Zwak positief staal: urine gespiked met een 1/ verdunning van een 0,5 McFarland oplossing van een Neisseria gonorrhoeae ATCC-stam (lot ) POSITIEF VOOR Datum Ct-waarde 26/01/ ,0 26/01/ ,04 26/01/ ,79 27/01/ ,08 27/01/ ,54 27/01/ ,09 28/01/ ,28 28/01/ ,24 28/01/ ,77 Gemiddelde 26,54 SD 0,44 ZWAK POSITIEF VOOR Datum Ct-waarde 21/01/ ,23 21/01/ ,13 21/01/ ,32 22/01/ ,06

9 pagina 9 / 16 22/01/ ,81 22/01/ ,92 25/01/ ,86 25/01/ ,62 25/01/ ,02 Gemiddelde 34,66 SD 0,88 eswab wisser in Amies transportmedium Positief staal: Amies transportmedium gespiked met een 1/1000 verdunning van een 0,5 McFarland oplossing van Neisseria gonorrhoeae ATCC stam (lot ) Zwak positief staal: Amies transportmedium gespiked met een 1/ verdunning van een 0,5 McFarland oplossing van Neisseria gonorrhoeae ATCC stam (lot ) POSITIEF VOOR Datum Ct-waarde 26/01/ ,18 26/01/ ,34 26/01/ ,56 27/01/ ,39 27/01/ ,54 27/01/ ,54 28/01/ ,92 28/01/ ,61 28/01/ ,43 Gemiddelde 28,5 SD 0,21 ZWAK POSITIEF VOOR Datum Ct-waarde 26/01/ ,45 26/01/ ,45 26/01/ ,07 27/01/ ,06 27/01/ ,99 27/01/ ,05 28/01/ ,03

10 pagina 10 / 16 28/01/ ,80 28/01/ ,58 Gemiddelde 32,16 SD 0,26 Conclusie: Zowel voor eswabs als voor urine is de standaarddeviatie op de inter-run variatie < 1 en hiermee wordt voldaan aan de vooropgestelde eisen. 5b) Intra-run Alle intra-run experimenten werden uitgevoerd in combinatie met de inter-run experimenten. Urine Positief staal 26,08 (27/10/2010) Positief staal 26,54 Positief staal 26,09 Zwak positief staal 34,06 Zwak positief staal 34,81 Zwak positief staal 34,92 Negatief urinestaal Niet gedetecteerd Negatief urinestaal Niet gedetecteerd Negatief urinestaal Niet gedetecteerd SD = 0,27 Gemiddelde Ct = 26,24 SD = 0,47 Gemiddelde Ct = 34,6 E-swab wisser in Amies transportmedium Positief staal 28,39 (27/10/2010) Positief staal 28,54 Positief staal 28,54 Zwak positief staal 32,06 Zwak positief staal 31,99 Zwak positief staal 32,05 Negatief staal Niet gedetecteerd Negatief staal Niet gedetecteerd Negatief staal Niet gedetecteerd SD = 0,09 Gemiddelde Ct = 28,49 SD = 0,04 Gemiddelde Ct = 32,03 Conclusie:

11 pagina 11 / 16 Zowel voor eswabs als voor Urine worden de vooropgestelde intra-run criteria gehaald. De resultaten zijn kwalitatief gelijk en - SD < 0,5 voor positieve stalen - SD < 1 voor zwak positieve stalen 6) Lineariteit (enkel voor kwantitatieve assays) Niet van toepassing. De N. gonorrhoeae is een kwalitatieve test 7) Verificatie referentiewaarden Voor een beperkte verificatie van de referentiewaarde (niet gedetecteerd), hebben we volgende stalen getest: - drie urinestalen (M) van patiënten niet verdacht voor NG-infectie Staal Resultaat Niet gedetecteerd Niet gedetecteerd Niet gedetecteerd - drie eswabs van genitale stalen, niet verdacht voor NG-infectie (bacteriologische kweek) Staal Resultaat Niet gedetecteerd Niet gedetecteerd Niet gedetecteerd Conclusie: alle stalen gaven als resultaat niet gedetecteerd. Dit bevestigt de referentiewaarde van de Neisseria gonorrhoeae test. 8) Methodevergelijking Alvorens de NG assay van Diagenode te implementeren werden een aantal patiëntenstalen met 2 verschillende methodes geanalyseerd (Diagenode versus in-house NASBA). Een positief staal werd ter bevestiging opgestuurd naar het ASZ. Patiëntennummer NG Diagenode NASBA ASZ (in-house Real-time PCR) Negatief Negatief

12 pagina 12 / Negatief Negatief Negatief Negatief Negatief Negatief Negatief Negatief Negatief Negatief Positief - Positief (ASZ) Negatief Negatief Conclusie: - Negatieve patiëntenstalen die zowel met de kit van Diagenode als met de in-house NASBA werden uitgevoerd vertonen een 100% agreement. De vroegere in-house NASBA assay gaf vaak aanleiding tot vals positieve resultaten, maar de negatieve predictieve waarde van deze assay lag heel hoog. (goede QCMD score wat betreft de negatieve stalen). - Een positief patiëntenstaal werd ter bevestiging opgestuurd naar het ASZ en werd daar eveneens positief bevonden. III B) Diagnostisch Clinical validation of a Real-time Polymerase Chain reaction Detection of Neisseria gonorrhoeae pora Pseudogene Versus Culture Techniques Het artikel maakt gebruikt van hetzelfde target gene, maar andere primer en probe sequenties. 360 stalen werden geanalyseerd aan de hand van een pora pseudogen real-time PCR en werden eveneens op cultuur gezet. Bij discrepante resultaten werd sequencing van het volledige pora pseudogen en het 16S rrna gen uitgevoerd. PCR + PCR - Totaal Cultuur Cultuur Totaal Specificiteit = 100% voor PCR en 100% voor cultuur Sensitiviteit = 100% voor PCR en 71% voor cultuur Positive predicitive value (PPV) = 100% voor PCR en 100% voor cultuur Negatieve predictive value (NPV) = 100% voor PCR en 93% voor cultuur III C) Klinisch

13 pagina 13 / 16 Wie moet getest worden? De aanbevelingen volgens de European (IUSTI/WHO) Guideline on the Diagnosis and Treatment of Gonorrhoea in Adults zijn als volgt (level of evidence IV, graad C aanbeveling) (9): - Symptomen of tekens van urethrale afscheiding bij mannen - Vaginale afscheiding met risicofactoren voor SOA (leeftijd <30 jaar, nieuwe sexpartner) - Mucopurulente cervicitis - Sexpartner van een persoon met een SOA of PID (pelvic inflammatory disease) - Acute epididymo-orchitis bij mannen <40 jaar - Acute PID - SOA-screening van jonge volwassenen - Screening van personen met een nieuwe of multipele sexpartners - Purulente conjunctivitis in een neonaat Welk is de aanbevolen techniek voor de diagnose van een gonokokken infectie? - Gramkleuring Indien correct uitgevoerd heeft de gramkleuring een gevoeligheid van 90-95% en een specificiteit van % voor de diagnose van gonorroe bij symptomatische mannen. De aanwezigheid van polymorphonucleaire leukocyten met intracellulaire Gram-negatieve diplokokken kan hier beschouwd worden als diagnostisch (8-10, 12). Bij asymptomatische mannen daalt de gevoeligheid (8). Bij symptomatische vrouwen heeft de gramkleuring slechts een sensitiviteit van 60% (7). - Cultuur Cultuur is de enige goed gevalideerde test voor de diagnose van rectale en pharyngeale infecties en biedt tevens een isolaat voor het uitvoeren van een gevoeligheidsbepaling (10). Problemen met cultuur kunnen voortkomen uit het feit dat gonokokken relatief moeilijk kweekbare organismen zijn. Instucties voor staalafname, transport en isolatie moeten dan ook strict worden opgevolgd (9). Gevoeligheidsbepalingen voor gonokokken zijn geïndiceerd na het falen van een therapie, in geval van gedissemineerde infectie en in het kader van surveillantie van antmicrobiële resistenties (10). - Moleculaire testen NAATs (nucleic acid amplificiation techniques) bieden een aantal voordelen t.o.v. cultuur: verhoogde gevoeligheid, het staal vereist geen aanwezigheid van levende bacteriën waardoor de transportcondities minder stringent zijn, de techniek kan uitgevoerd worden op nietinvasieve stalen zoals urine (6, 9).

14 pagina 14 / 16 De NVDV & NVMM bevelen voor de diagnostiek van gonorrhoeae volgende testen aan (versie 2011) (17): - eerste keuze: NAAT-testen - tweede keuze: kweek - optioneel: kweek met resistentie-bepaling in aanvulling op NAAT (niet noodzakelijk bij i.m. standaardtherapie, verruimt wel keuzemogelijkheden therapie.) Welk is het aanbevolen specimen voor mannen en vrouwen voor het uitvoeren van een PCR gonokokken? Uit een systematische review van Cook et al (5) bleek dat bij vrouwelijke patiënten de voorkeur moet gegeven worden aan genitale wissers. Bij mannen zijn zowel een urinestaal als een urethrale afname mogelijk: Vrouwen: 4 studies met PCR assays geven een gepoolde sensitiviteit en specificiteit van 55,6% en 98,7% voor urinestalen en 94,2% en 99,2% voor cervicale stalen. Mannen: 4 studies met PCR assays geven een sensitiviteit en specificiteit van 90,4% en 99,7% voor urinestalen en 96,1% en 99% voor urethrale stalen. Ook uit de studie van Fang et al (13) vertoonde urinestalen een lagere gevoeligheid (88.6%) in vergelijking met endocervicale wissers (95.5%). De European (IUSTI/WHO) Guideline on the Diagnosis and Treatment of Gonorrhoea in Adults vermeldt dat urinestalen bij vrouwen niet worden aanbevolen wegens de lagere gevoeligheid in vergelijking met genitale wissers (9). IV) Conclusie PCR is onze standaard-test voor diagnostiek van gonokokken-infecties. De vooropgestelde criteria voor de validatie van de Neisseria gonorrhoeae assay werden behaald en dus kan deze test geïmplementeerd worden in het labo moleculaire diagnostiek. Bij eventuele veranderingen aan de kit zal nagegaan worden of extra/nieuwe validatie nodig is. Het gaat hier om een dynamisch validatiedossier waar op elk moment nieuwe gegevens kunnen aan toegevoegd worden.

15 pagina 15 / 16 ADDENDUM 1 Aangezien wij op zeer regelmatige basis stalen ontvangen van het MCH te Leuven voor Neisseria gonorrhoeae bepalingen, hebben wij een beperkte LOD validatie uitgevoerd op het wisser transportmedium dat door het MCH gebruikt wordt (= Microtest M4RT Transport, 3 ml (remel)). Het transportmedium werd gespiked met Neisseria gonorrhoeae DNA (Vircell) en testen werden uitgevoerd op 200 µl transportmedium. Concentratie Ct-waarde 500 copies/ml 37, copies/ml 36, copies/ml 38, copies/ml 36, copies/ml 36, copies/ml 34,88 Concentratie Ct-waarde 312 copies/ml 37, copies/ml 36, copies/ml 39, copies/ml 36, copies/ml 36, copies/ml Negatief Conclusie: Uit deze validatie blijkt dat de NG LOD in het M4RT medium vergelijkbaar is met de NG LOD in eswab transportmedium (312 copies/ml). Ook de publicatie van Jaber Aslanzadeh and Mathew Jones (16) tonen aan dat M4RT een geschikt medium is voor de detectie van Neisseria gonorrhoeae.

16 pagina 16 / 16 ADDENDUM 2 Vitek heeft vaak problemen met identificatie van gonokokken. Het algoritme werd aangepast. Vanaf nu: wanneer op de bodem groei is die suggestief is voor gonokokken, met passende gramkleuring (gramnegatieve kokken) en oxidase positief, wordt een PCR ingezet. Als de PCR positief is, is alles afgerond. Indien de PCR negatief is, wordt de stam verder geïdentificeerd door middel van MALDI-TOF. ATCC werd geënt en geïncubeerd op een GC-lect bodem. Na incubatie werden twee 0,5 Mc Farland oplossingen aangemaakt. De eerste oplossing werd gemaakt met nuclease vrij water (Qiagen) en de tweede oplossing werd aangemaakt met PBS. Van beide oplossingen werd een 1/100 verdunning aangemaakt met nuclease vrij water en van deze verdunning werd 200 µl in een 2 ml lysis buffer tube gebracht. 0,5 Mc Farland aangemaakt in Ct- waarde NG assay Nuclease-vrij water 17,91 Nuclease-vrij water 18,02 Nuclease-vrij water 17,39 PBS 18,70 PBS 19,25 PBS 19,12 Conclusie: Beide oplossingen geven gelijkaardige Ct-waarden. Toch gaat onze voorkeur uit naar de 0,5 Mc Farland die aangemaakt is in Nuclease vrij water. Een 1/100 verdunning van de 0,5 Mc Farland kan zonder problemen gebruikt worden voor de NG assay.