UvA-DARE (Digital Academic Repository) Direct-acting antiviral therapy for chronic hepatitis C de Bruijne, J. Link to publication

Transcriptie

1 UvA-DARE (Digital Academic Repository) Direct-acting antiviral therapy for chronic hepatitis C de Bruijne, J. Link to publication Citation for published version (APA): de Bruijne, J. (2012). Direct-acting antiviral therapy for chronic hepatitis C General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( Download date: 10 jan. 2017

2 SAMENVATTING VOOR NIET INGEWIJDEN

3 ACHTERGROND In 1991 werd het medicijn interferon geregistreerd voor de behandeling van HCV infectie. Interferon is een eiwit dat antivirale activiteit bewerkstelligt door het afweersysteem te In 1989 werd het hepatitis C virus (HCV) ontdekt. Wereldwijd zijn naar schatting 170 miljoen stimuleren. De behandeling bestond uit 3-wekelijkse injecties onder de huid gedurende 6 mensen geïnfecteerd met HCV, hetgeen neerkomt op 3% van de wereldbevolking. Dit aantal tot 12 maanden waarbij een genezingspercentage van ongeveer 10% werd bereikt. Naast groeit jaarlijks met 3-4 miljoen nieuwe HCV infecties. HCV is een enkelstrengs RNA virus dat de kleine kans van slagen veroorzaakt interferon echter ook veel bijwerkingen. Griepachtige via bloed kan worden overgedragen. Naast injecterend drugsgebruik zijn bloedtransfusies verschijnselen, vermoeidheid, depressie, haaruitval, jeuk, emotionele labiliteit, huiduitslag en behandeling met onsteriele of niet goed gesteriliseerde instrumenten de belangrijkste en gewichtsverlies behoren tot het uitgebreide scala aan bijwerkingen die interferon kan transmissie routes. Sinds 1992 wordt donorbloed in de westerse wereld getest op aanwezigheid veroorzaken. van HCV en zodoende komt deze vorm van transmissie bijna niet meer voor. Seksuele Ribavirine, oorspronkelijk ontwikkeld voor behandeling van andere virale infecties, werd overdracht is zeer zeldzaam met uitzondering van humaan immunodeficiëntie virus (HIV-) als tweede medicijn geregistreerd voor de antivirale therapie van chronische hepatitis C. In positieve homoseksuele mannen. combinatie met interferon verbeterde het genezingspercentage aanzienlijk, tot ongeveer 35%. Infectie met HCV verloopt meestal zonder symptomen waardoor een acute HCV infectie zelden De voornaamste bijwerking van ribavirine is een dosisafhankelijke bloedarmoede. wordt waargenomen. Van de HCV geïnfecteerde patiënten is ongeveer 25% in staat het virus Sinds het begin van deze eeuw is interferon aangepast door polyethyleen-glycol te koppelen spontaan te klaren zonder antivirale therapie en 75% ontwikkelt een chronische infectie. Er is aan interferon (peg-interferon). Peg-interferon wordt minder snel uitgescheiden door sprake van een chronische HCV infectie als het HCV RNA langer dan zes maanden aanwezig de nieren waardoor er een stabiele, hoge concentratie in het bloed en weefsel aanwezig is, waarbij het virus de levercel gebruikt om zich in te vermenigvuldigen. Chronische hepatitis blijft. Het genezingspercentage van combinatietherapie met peg-interferon en ribavirine C is een langzaam progressieve ziekte die bij de meeste patiënten geen of weinig klachten steeg tot ongeveer 60%. Bijkomende voordelen van peg-interferon zijn een gereduceerde geeft. De ernst van een chronische HCV infectie kan variëren van minimale ontsteking van de doseringsfrequentie (wekelijks) en een significante verminderde intensiteit van de interferongerelateerde lever tot ernstige ontstekingsactiviteit met bindweefsel (fibrose) of littekenweefsel (cirrose) bijwerkingen. 264 vorming in de lever. Bij ongeveer 20% van de geïnfecteerden ontstaat in de loop van 20 tot jaar cirrose. Als er sprake is van cirrose is er een kans van 1-5% per jaar op het ontstaan van Een andere belangrijke ontdekking was het vóórkomen (bestaan) van verschillende HCVstammen leverkanker. Cirrose kan leiden tot een verminderde bloeddoorstroming door de lever, met (genotype). Er zijn zeven HCV genotypen, waarvan wereldwijd vooral de genotypen kans op ernstige bloedingen uit slokdarmvaten of tot leverfalen (decompensatie). Enkele veel 1, 2, 3 en 4 voorkomen. Dit onderscheid is belangrijk omdat de respons en duur van de voorkomende symptomen bij een gedecompenseerde lever cirrose zijn buikvocht, verwardheid antivirale therapie verschilt per genotype. Patiënten met chronische hepatitis C genotype 1 of en geelzucht. Welke patiënten met chronische hepatitis C een snelle toename van leverschade 4 worden standaard 48 weken behandeld. Patiënten met genotype 2 of 3 worden standaard 24 ontwikkelen is vooralsnog niet met zekerheid te voorspellen. Wel is bekend dat de ziekte weken behandeld. De duur van de behandeling hangt verder af van de HCV RNA hoeveelheid langzamer voortschrijdt bij vrouwen en diegenen die op jonge leeftijd zijn besmet, maar sneller bij aanvang van en tijdens de behandeling. Patiënten waarbij na vier weken behandeling geen bij patiënten met vet in de lever (steatose), overmatige alcohol of cannabis consumptie, of met HCV RNA meer aantoonbaar is, is een kortere behandeling praktisch even effectief (24 weken een co-infectie met hepatitis B virus (HBV) of HIV. bij genotype 1 of 4; 12 tot 16 weken bij genotype 2 of 3). De kans op een blijvende virologische Cirrose en leverkanker als gevolg van chronische HCV infectie zijn op dit moment de belangrijkste respons bij chronische hepatitis C is ~80% bij genotype 2 en 3, ~65% bij genotype 4 en ~45% bij redenen voor levertransplantatie in Europa en de Verenigde Staten. Jaarlijks overlijden er genotype 1, het meest voorkomende genotype in de Westerse wereld. Een herbehandeling na mensen aan de gevolgen van chronische hepatitis C door een gedecompenseerde een eerdere onsuccesvolle behandeling heeft een lage kans van slagen. Naast de suboptimale levercirrose of leverkanker. Chronische hepatitis C is in toenemende mate een wereldwijd virale respons is de antivirale therapie kostbaar, langdurig en hebben de meeste patiënten last gezondheidsprobleem. Er bestaat geen vaccin om infectie met HCV te voorkomen. De van significante bijwerkingen. Bij ernstige bijwerkingen is dosisreductie van peg-interferon en verwachting is dat leverkanker en de sterfte door leverfalen verder zullen toenemen in de ribavirine regelmatig noodzakelijk, echter niet wenselijk gezien de verminderde kans op een komende decennia. Adequate antivirale therapie is van essentieel belang om leverschade als blijvende virale respons. gevolg van HCV infectie te stoppen en verdere verspreiding van HCV te voorkomen. Het doel van antivirale behandeling is om HCV blijvend kwijt te raken. Een blijvende virale Nieuwe antivirale middelen worden momenteel ontwikkeld om het genezingspercentage respons wordt gedefinieerd als onmeetbaar HCV RNA zes maanden na het stoppen van de te verbeteren, de behandelduur te verkorten en de bijwerkingen te reduceren. Kennis over antivirale therapie. Het verdwijnen van de leverontsteking, stoppen van fibrose-/ cirrosevorming de HCV levenscyclus is de afgelopen jaren enorm toegenomen. De ontdekking van een en voorkomen van leverkanker is het uiteindelijke doel. laboratorium model om virus vermenigvuldiging (replicatie) te bestuderen was essentieel

4 voor de ontwikkeling van nieuwe generatie geneesmiddelen voor chronische hepatitis C. In en aanvullend onderzoek (bloedonderzoek, urineonderzoek, echo van de bovenbuik, tegenstelling tot peg-interferon en ribavirine, blokkeren deze nieuwe geneesmiddelen specifiek hartfilmpjes). Na goedkeuring van bovengenoemde onderzoeken door een onafhankelijke de levenscyclus van HCV. De HCV levenscyclus bestaat uit een gecompliceerd samenspel van commissie volgt een studie bij een kleine groep patiënten met chronische hepatitis C om virale en gastheer factoren en kan worden onderverdeeld in de volgende fases: 1) virale entree wederom informatie te verkrijgen over de veiligheid en werkzaamheid (fase 1b studie). Dit is in de levercel, 2) vertaling van het virale genoom (HCV RNA) naar een eiwit, 3) splitsen van tevens het moment waar voor het eerst kan worden gekeken naar de effectiviteit (virusafname) het virale eiwit in afzonderlijke eiwitten, 4) virus replicatie met behulp van virale- en gastheer van de onderzoeksmedicatie. Bij een positief resultaat vinden er vervolgstudies plaats om de eiwitten en 5) samenvoeging en transport van het nieuwe virusdeeltje buiten de cel. Het HCV juiste dosering en het genezingspercentage vast te stellen (fase 2), gevolgd door studies naar genoom codeert voor een eiwit welke wordt gesplitst in 3 structurele en 7 niet-structurele het behandeleffect in grote groepen patiënten (fase 3). Als alle bovengenoemde fases met een virale eiwitten. De structurele eiwitten vormen het kapsel en envelop van het virusdeeltje. De goed resultaat worden afgerond, kan een medicijn worden geregistreerd. De klinische studies niet-structurele eiwitten zijn betrokken bij de virale replicatie en vormen een belangrijk doelwit beschreven in dit proefschrift betreffen fase 1a/b studies. voor antivirale therapie. De replicatiesnelheid van HCV is enorm hoog en daarbij beschikt het enzym, verantwoordelijk voor de replicatie (HCV polymerase), niet over een corrigerend systeem. Hierdoor ontstaan er frequent veranderingen (mutaties) in het virale genoom. Deze FOCUS VAN DIT PROEFSCHRIFT mutaties kunnen vervolgens leiden tot virale resistentie en therapie falen. De vooruitgang van de laatste jaren op het gebied van chronische hepatitis C behandeling is Het onderzoek beschreven in dit proefschrift heeft zich voornamelijk gericht op de klinische indrukwekkend. Momenteel worden er tientallen verschillende antivirale geneesmiddelen evaluatie en het werkingsmechanisme van verscheidene nieuwe antivirale geneesmiddelen onderzocht die direct ingrijpen op verschillende fases van de HCV levenscyclus. Protease- en voor patiënten met chronische hepatitis C. De veiligheid en werkzaamheid van meerdere polymeraseremmers zijn het verst in ontwikkeling en zijn in staat om de virushoeveelheid binnen antivirale geneesmiddelen in laboratoriummodellen, gezonde vrijwilligers en chronische enkele dagen vrijwel volledig te onderdrukken. Proteaseremmers blokkeren specifiek het virale hepatitis C patiënten wordt beschreven. Daarbij werd met behulp van verschillende bepalingen 266 NS3/4A protease, verantwoordelijk voor het splitsen van het virale eiwit in functionele eiwitten. onderzocht in hoeverre virale resistentie ontstaat tijdens therapie en de invloed van resistentie 267 Polymeraseremmers worden onderverdeeld in twee verschillende groepen, de zogenaamde op de behandeluitkomst. Tevens werd bestudeerd of de resistentie die ontstaat tijdens nucleoside- en non-nucleoside analogen. Beide remmen de HCV replicatie op verschillende antivirale therapie bleef voortbestaan na afloop van de behandeling. wijze: nucleosiden beëindigen de nucleotide keten en non-nucleosiden veranderen de structuur en daarmee de functie van het HCV polymerase. Monotherapie met een direct werkend antiviraal geneesmiddel is niet krachtig genoeg om een BEVINDINGEN blijvende virale respons te bewerkstellingen. Het blijft daarom vooralsnog noodzakelijk om nieuwe geneesmiddelen te combineren met peg-interferon en ribavirine. De eerste generatie In hoofdstuk 2 wordt de vroege ontwikkeling van JTK-652, een HCV infectie remmer, beschreven proteaseremmers zijn inmiddels geregistreerd voor de behandeling van chronische hepatitis in verschillende cellijnen. Ook werd de veiligheid en werkzaamheid onderzocht bij gezonde C, genotype 1. Het slagingspercentage van de behandeling bij nooit eerder behandelde vrijwilligers en patiënten met chronische hepatitis C genotype 1. Uit preklinisch onderzoek patiënten verbetert met behulp van proteaseremmers van ~45% tot ~70%. Daarnaast kan de blijkt dat JTK-652 HCV infectie tegengaat, door de entree van HCV in de levercel te blokkeren. behandelduur met proteaseremmers bij het merendeel van de patiënten worden verkort van Verschillende, oplopende doseringen van JTK-652 bleken veilig en werden goed getolereerd 48 naar 24 weken, afhankelijk van de HCV RNA afname na 4 weken behandelen. door gezonde vrijwilligers. Het vervolgonderzoek vond plaats bij 10 patiënten met chronische hepatitis C gedurende 28 dagen. Gedurende het onderzoek moesten 2 patiënten vroegtijdig De ontwikkeling van nieuwe medicijnen verloopt volgens een vast patroon. Allereerst worden stoppen door huiduitslag. De huiduitslag kon niet met zekerheid worden toegeschreven aan medicijnen getest in verschillende cellijnen en laboratoriummodellen om de werkzaamheid de onderzoeksmedicatie aangezien een van deze patiënten placebo ontving. Behoudens de en mogelijk schadelijke effecten op celniveau te onderzoeken. Daarna worden kleine (muizen, huiduitslag werd JTK-652 goed getolereerd en de bijwerkingen waren over het algemeen ratten) en grote (honden) dieren blootgesteld aan de onderzoeksmedicatie om de veiligheid gering. JTK-652 had geen invloed op de virushoeveelheid in patiënten, ondanks de antivirale en bloedspiegels vast te stellen. Op basis daarvan kan een bepaalde (lage) dosis van de werkzaamheid in laboratoriummodellen. Verdere ontwikkeling van JTK-652 werd om die reden onderzoeksmedicatie worden gegeven aan gezonde vrijwilligers (fase 1a studie). Gedurende niet voortgezet. een fase 1a studie vindt er tijdens en na dosering van de onderzoeksmedicatie uitgebreide controle plaats door middel van het vastleggen van symptomen, lichamelijk onderzoek,

5 Proteaseremmers vormen op dit moment de meest onderzochte groep van HCV-specifieke ondersteunend voor een eenmaal daagse dosering. In een vervolgstudie (niet beschreven in dit medicijnen en hebben een sterke antivirale werking. Nadelen van de eerste generatie proefschrift) werd IDX320 gecombineerd met IDX184, een HCV-specifieke polymeraseremmer. geregistreerde proteaseremmers telaprevir en boceprevir zijn het driemaal daagse Gedurende dit onderzoek werden er leverenzym afwijkingen gevonden bij gezonde vrijwilligers. doseringsschema en de (forse) bijwerkingen. De zoektocht naar krachtige protease- en Verder laboratoriumonderzoek wees uit dat IDX320 mogelijk schadelijk zou zijn voor humane polymeraseremmers zonder bijwerkingen en een eenmaal daagse dosering duurt voort en levercellen. Het verantwoordelijke agentschap voor geneesmiddelenontwikkeling (Food and is onderzocht in hoofdstuk 3, 4, 5 en 6 waarbij achtereenvolgens het effect van narlaprevir, Drug Administration) in de Verenigde Staten besloot hierop verdere ontwikkeling van IDX320 te IDX320, PHX1766 en IDX375 wordt beschreven. stoppen. Ook deze studie illustreert, ditmaal ten gevolge van geneesmiddelen interactie, dat een succesvolle fase 1b studie geen garantie is voor verdere ontwikkeling van een studiemedicijn. Narlaprevir is een HCV-specifieke proteaseremmer en werd in combinatie met ritonavir onderzocht in een fase 1b studie beschreven in hoofdstuk 3. Ritonavir is oorspronkelijk De veiligheid en werkzaamheid van PHX-1766, een HCV-specifieke proteaseremmer, werd ontwikkeld voor de anti-retrovirale therapie bij HIV-infecties. Niet zozeer vanwege de antivirale onderzocht en beschreven in hoofdstuk 5. Er werd gebruik gemaakt van een speciale activiteit maar vanwege het remmen van cytochroom P450-3A4 (CYP3A4). Het remmen van studieopzet waarbij de dosis van PHX1766 werd verhoogd op basis van vastgestelde (geringe) CYP3A4 resulteert in hogere bloedspiegels van HIV-specifieke proteaseremmers met als gevolg bijwerkingen en afwijkingen bij aanvullend onderzoek van lagere doseringen. Het voordeel van minder frequente dosering en minder virale resistentie. Dit was echter nog nooit aangetoond deze studieopzet was dat minder patiënten werden blootgesteld aan PHX1766 monotherapie voor HCV-specifieke proteaseremmers. In deze studie deden 40 patiënten met chronische en dus minder kans op virale resistentie en een verkorte studieduur met daarbij een afname hepatitis C genotype 1 mee. De studie bestond uit 3 delen. Het eerste deel van de studie duurde van studiekosten. Uit laboratoriumonderzoek bleek dat een lage dosis van PHX1766 in staat 1 week en patiënten ontvingen narlaprevir monotherapie driemaal daags (n=16), narlaprevir was om de virushoeveelheid sterk te reduceren. De klinische studie bestond uit eenmalige plus ritonavir tweemaal daags (n=16) of placebo (n=8). De virushoeveelheid was na narlaprevir en meervoudige (oplopende) doseringen van PHX1766 bij 57 gezonde vrijwilligers en 13 inname, al dan niet in combinatie met ritonavir, afgenomen met >90%. In de placebo groep patiënten met chronische hepatitis C, genotype 1. Tijdens deze studie werden er geen ernstige 268 was er geen virusafname. Het tweede deel van de studie duurde 2 weken waarbij de patiënten bijwerkingen waargenomen. In tegenstelling tot de werkzaamheid van PHX1766 in cellijnen was 269 opnieuw dezelfde medicatie kregen, maar dit keer in combinatie met peg-interferon. De het antivirale effect in patiënten gering, ondanks de hoge PHX1766 bloedspiegels. De oorzaak resultaten waren vergelijkbaar met het eerste deel. Direct aansluitend (deel 3) ontvingen van deze discrepantie is onduidelijk en illustreert de veelvuldig teleurstellende resultaten alle patiënten de standaardbehandeling met peginterferon en ribavirine. Door de snelle waargenomen tijdens de vroege ontwikkeling van medicijnen. virusdaling, bewerkstelligd door narlaprevir (± ritonavir) gedurende deel 2 van de studie, genas het merendeel van de patiënten na 24 of 48 weken standaardbehandeling (peg-interferon/ IDX375 is een HCV-specifieke non-nucleoside polymeraseremmer waarvan de vroege klinische ribavirine). Daarnaast bleek dat de bloedspiegels van narlaprevir fors werden verhoogd door ontwikkeling wordt beschreven in hoofdstuk 6. Het betrof een fase 1 studie waarbij de veiligheid ritonavir. Hierdoor was een eenmaal daagse dosering van narlaprevir plus ritonavir mogelijk in en farmacokinetiek van IDX375 monotherapie in oplopende doseringen werd onderzocht in de fase 2 vervolgstudie. Een eenmaal daagse dosering heeft een sterke voorkeur in verband gezonde vrijwilligers. IDX375 werd goed geabsorbeerd en de bijwerkingen waren minimaal. met een betere therapietrouw. Momenteel worden er verscheidene antivirale middelen in Vervolgens werd de antivirale werkzaamheid van IDX375 onderzocht in 3 HCV-geïnfecteerde combinatie met ritonavir voor de behandeling van chronische hepatitis C onderzocht. patiënten. Een significante virusafname werd waargenomen na 2 IDX375 giften. Daarbij heeft IDX375 een lange halfwaardetijd waardoor eenmaal daagse en maximaal tweemaal daagse Een vergelijkbare fase 1 studie met IDX320 wordt beschreven in hoofdstuk 4. IDX320 is een dosering mogelijk is. Dit zal worden onderzocht in een vervolg studie waaraan meer chronische tweede generatie HCV-specifieke proteaseremmer. De moleculaire structuur van de tweede hepatitis C patiënten zullen deelnemen. generatie proteaseremmers (macrocyclische structuur) verschilt van die van de eerste generatie geregistreerde proteaseremmers (lineaire structuur). Voordelen van tweede Recentelijk werd aangetoond dat HCV infectie met genotype 4 (HCV-4) zich de afgelopen generatie proteaseremmers zijn een eenmaal daagse dosering, minder bijwerkingen en decennia verspreid heeft in Europa. Dit komt voornamelijk door immigratie van HCV-4 een grote antivirale werkzaamheid. In deze studie werden 48 gezonde vrijwilligers en 40 geïnfecteerde patiënten uit endemische gebieden naar Europa. Wereldwijd komt HCV-4 naar chronische hepatitis C patiënten met genotype 1 onderzocht. IDX320 werd goed verdragen schatting bij 20% van de chronische hepatitis C patiënten voor; in Nederland is dit percentage zonder noemenswaardige bijwerkingen of levertest afwijkingen in het bloedonderzoek. 10%. De patiëntenpopulatie uit de regio Amsterdam is divers doordat zij van verschillende De virushoeveelheid daalde fors (>90%) na dosering van IDX320 gedurende 3 dagen. De etnische afkomst zijn en tot verschillende risicogroepen behoren. Dit maakt het mogelijk om dagelijks gemeten bloedspiegels van IDX320 bleken, conform eerdere laboratorium studies, epidemiologische veranderingen van HCV-4 te onderzoeken. In hoofdstuk 7 is beschreven

6 hoe HCV-4 zich heeft verspreid in de Amsterdamse regio. Met behulp van bloedonderzoek een paar weken tot maanden weer plaats maakt voor het oorspronkelijke wild type virus. en fylogenie - een methode om te kijken naar virusevolutie en ontwikkelingsgeschiedenis - Proteaseremmers blokkeren het virale NS3/4A protease, verantwoordelijk voor het splitsen werden de diversiteit en bron van HCV-4 infectie onderzocht. Van 1999 tot 2008 werden er 133 van het virale polyproteine in functionele eiwitten. In geval van resistentie veroorzaakt door patiënten gediagnosticeerd met HCV-4 in het Academisch Medisch Centrum of de Gemeentelijke proteaseremmers zullen veranderingen zich voornamelijk manifesteren binnen het NS3/4A Geneeskundige en Gezondheidsdienst, beide in Amsterdam. De diversiteit van HCV-4 bleek protease domein. Door de aminozuurvolgorde (sequentie) van het NS3/4A gedeelte te bepalen groot. Acht verschillende subtypes werden geïdentificeerd, waarvan de subtypes 4a (37%) en kunnen veranderingen en het ontstaan van resistentie worden onderzocht. Resistentiebepaling 4d (57%) het meest voorkwamen. Op basis van de fylogenetische analyse kon het merendeel kan vandaag de dag met 3 verschillende technieken onderzocht worden, elk met een bepaalde van de HCV-4 patiënten worden onderverdeeld in 3 groepen, elk in overeenstemming met gevoeligheid. Resistentiebepaling op populatie niveau is snel, goedkoop en geeft een grove een bepaald epidemiologisch profiel. Het eerste profiel bestond uit Egyptische immigranten indruk van een viruspopulatie. Nadeel is dat virusvarianten die minder dan 20-30% deel uitmaken geïnfecteerd met HCV-4a (n=46). Het tweede profiel bestond uit Nederlandse patiënten van de totale viruspopulatie, niet worden aangetoond. Kloneren, een arbeidsintensieve geïnfecteerd met HCV-4d (n=44) waarbij de infectie hoogst waarschijnlijk is opgelopen door tweede techniek geeft, afhankelijk van de hoeveelheid klonen, een accuratere weergave van injecterend druggebruik. Het derde profiel werd gevormd door Nederlandse homoseksuele de viruspopulatie. Dit gebeurt op een dusdanige wijze dat elke sequentie een individueel virale mannen met een HIV co-infectie. Deze groep mannen (n=26) was geïnfecteerd met HCV-4d RNA representeert. De nieuwste en zeer uitgebreide sequentie bepaling (Ultra-deep pyrosequencing welke substantieel verschilde van het tweede profiel. [UDPS]) geeft de mogelijkheid om de viruspopulatie nauwkeurig te omschrijven. Een opvallende bevinding was dat het opkomen van HCV-4 per profiel, samenhing met De enorme hoeveelheid data, hoge kosten, evenals het feit dat er vooralsnog relatief weinig specifieke gebeurtenissen. Zo kon het virus bij de Egyptische immigranten worden teruggeleid ervaring is met betrekking tot de interpretatie van de resultaten, maken dat deze techniek naar de landelijke behandelcampagne in Egypte tegen de schistosomiasis parasiet. Jaren later alleen in gespecialiseerde centra kan worden verricht. bleek dat deze behandeling plaatsvond door middel van niet gesteriliseerde injectienaalden In hoofdstuk 8 beschrijven we het ontstaan en verloop van virale resistentie na behandeling waardoor HCV massaal werd verspreid. Egypte is nu het land waar chronische hepatitis C het met de NS3 proteaseremmer narlaprevir (zie ook hoofdstuk 3). Narlaprevir monotherapie (deel 270 meest voorkomt. Het HCV-4a subtype, gevonden onder (ex-)druggebruikers, kon worden herleid 1) werd na een therapievrije maand gevolgd door combinatietherapie met narlaprevir en peginterferon 271 naar de periode , samenhangend met de populariteit van injecterend drugsgebruik (deel 2). Deze studieopzet was uniek voor het onderzoeken van resistentie gezien de in Nederland. De opkomst van HCV-4d bij HIV-positieve homoseksuele mannen valt samen twee opeenvolgende narlaprevir behandelperiodes. Uit eerdere fase 1b monotherapie studies met een toename van risicovol seksueel gedrag na de invoering van anti-retrovirale therapie met proteaseremmers bleek dat resistentie al na 1 dag kan ontstaan. Wat de gevolgen op de in Dit onderzoek toont aan dat HCV-4 infectie in Nederland toeneemt door toevloed van viruspopulatie zouden zijn van een tweede behandelperiode met een proteaseremmer was immigranten uit endemische landen, lokale verspreiding onder druggebruikers en recentelijk onbekend. Middels resistentie analyse op populatieniveau werd, na het voltooien van deel bij HIV-positieve homoseksuele mannen. Nieuwe antivirale therapieën zijn vooralsnog gericht 2, de viruspopulatie van alle patiënten die narlaprevir ontvingen (n=32) onderzocht. Bij vijf op patiënten met genotype 1 infectie, zoals eerder vermeld het meest voorkomende genotype patiënten werd virale resistentie aangetoond en bij deze patiënten werden uitgebreide klonale in de Westerse wereld. Wij pleiten voor de ontwikkeling van geneesmiddelen die ook werkzaam resistentiebepalingen verricht voor, tijdens en na afloop van de behandeling. Virale resistentie zijn tegen HCV-4 infectie. werd niet gevonden bij start van de antivirale therapie. Na de eerste week narlaprevir monotherapie was een klein deel van de viruspopulatie bij vier patiënten veranderd door De combinatie van de zeer hoge replicatiesnelheid van HCV en een polymerase dat niet over de aanwezigheid van verschillende resistente varianten. Gedurende de therapievrije maand een systeem beschikt om replicatiefouten te corrigeren, maakt dat er gemakkelijk en in hoge verdwenen deze varianten grotendeels. Tijdens de tweede narlaprevir behandelperiode werd frequentie mutaties ontstaan tijdens het virale replicatieproces. Binnen een patiënt bestaat het wild type virus snel en volledig overheerst door de aanwezigheid van resistente virus de HCV viruspopulatie voornamelijk uit een enkele dominante fitte virusstam ( wild type ) varianten. Geen enkele patiënt met virale resistentie bereikte na afloop van de aansluitende met een hoge replicatie snelheid ( fitness ) en zijn er slechts in zeer lage frequenties andere standaardbehandeling met peg-interferon en ribavirine een blijvende virale respons. Bij virusstammen met een lagere replicatie snelheid (quasispecies) aanwezig. Uit de heterogene 3 patiënten was na 3 jaar follow-up het oorspronkelijke wild type virus wederom dominant viruspopulatie kunnen tijdens de behandeling met proteaseremmers quasispecies worden aanwezig en waren de eerder gevonden resistente varianten niet meer aantoonbaar. Echter uitgeselecteerd die ongevoelig voor deze therapie zijn. Deze resistente quasispecies kunnen in in de overige 2 patiënten bestond de viruspopulatie uit het wild type virus en, in mindere de aanwezigheid van een proteaseremmer uitgroeien tot de dominante virusstam en leidden mate, uit resistente virusvarianten. Deze studie demonstreert dat 1) narlaprevir resistentie kan tot falen van de therapie. Enkele resistentiestudies hebben aangetoond dat de resistente veroorzaken, 2) deze studieopzet resistente virus varianten uitselecteert, 3) resistentie leidt viruspopulatie, die ten tijde van de virologische doorbraak of relaps de overhand heeft, binnen tot falen van de therapie en 4) dat jaren na beëindigen van de antivirale therapie resistente virusvarianten aanwezig kunnen blijven.

7 Tijdens anti(retro)virale therapie bij HIV en HBV infecties kan virale resistentie persisteren C patiënten wordt pas sinds 2007 onderzocht. De werking van deze medicijnen, die direct waardoor patiënten minder goed reageren op een (her)behandeling. Het is vooralsnog aangrijpen op de HCV levenscyclus, op de viruspopulatie is slechts gedeeltelijk bekend. De casus onduidelijk of resistentie persisteert in lage frequenties of volledig verdwijnt na het staken gepresenteerd in hoofdstuk 11 beschrijft een uniek beloop van een antivirale behandeling in van de antivirale therapie voor HCV infecties. Het persisteren van resistentie heeft mogelijk studieverband met een combinatie van telaprevir, peg-interferon en ribavirine. Deze patiënt nadelige gevolgen voor patiënten die een herbehandeling met een proteaseremmer moeten was in 2003 tweemaal behandeld met peg-interferon en ribavirine, waarbij het HCV RNA ondergaan. In hoofdstuk 9 onderzochten we de viruspopulatie bij 15 patiënten die gedurende aantoonbaar bleef en beide keren faalde de therapie. Gezien de aanwezige levercirrose ten 2 weken werden behandeld met de proteaseremmer telaprevir. Door middel van kloneren en gevolge van de chronische HCV infectie werd besloten om een derde behandeling met telaprevir, UDPS werd het NS3/4A domein vóór, en 4 jaar na de behandeling met telaprevir getypeerd. peg-interferon en ribavirine voor de duur van 48 weken te starten in een fase 2 studie. De Met beide technieken werden, voorafgaand aan de behandeling, resistentie varianten in een behandeling verliep voorspoedig en het virus was niet meer aantoonbaar tussen week 4 en 40. zeer lage frequentie aangetoond. Na 4 jaar werd de resistentiebepaling herhaald en werden Op week 40 moest de behandeling gestopt worden in verband met laboratoriumafwijkingen er met beide technieken vergelijkbare percentages van resistente virusvarianten aangetoond. ten gevolge van de antivirale therapie. De laboratoriumafwijkingen normaliseerden na het Slechts bij een patiënt werd een significante toename van twee resistente virusvarianten stoppen van de antivirale behandeling, echter het HCV RNA werd wederom detecteerbaar: waargenomen. Uit deze studie blijkt dat het persisteren van resistente virusvarianten bij HCV hetgeen een virologische terugkeer (relaps) genoemd wordt. De virale hoeveelheid steeg tot infecties na behandeling met telaprevir zeldzaam, maar niet uitgesloten, is. vergelijkbare hoogte als ten tijde van de start van de therapie. Uit resistentie analyse bleek dat Hoofdstuk 10 beschrijft de ontwikkeling en invloed van virale resistentie op (her)behandeling de viruspopulatie volledig was vervangen door telaprevir resistente varianten. Buitengewoon met de macrocyclische proteaseremmer TMC435. Zes HCV genotype 1 patiënten ontvingen opvallend was dat het HCV RNA tijdens vervolgafspraken, in de afwezigheid van antivirale TMC435 monotherapie gedurende 5 dagen. Anderhalf jaar later ontvingen dezelfde patiënten therapie, wederom niet aantoonbaar werd gedurende meer dan een jaar. Helaas werd ook combinatietherapie met TMC435, peg-interferon en ribavirine gedurende 4 weken, gevolgd deze HCV RNA negatieve periode beëindigd door het terugkomen van HCV RNA. Resistentie door 44 weken standaardbehandeling (peg-interferon/ribavirine). Resistentiebepaling vond analyse van deze tweede relaps toonde aan dat alle resistente varianten weer volledig waren 272 plaats door middel van 3 technieken (populatie niveau, kloneren en UDPS) voorafgaand aan verdwenen. Deze casus illustreert dat de complexiteit van de antivirale behandeling voor 273 beide behandelperiodes. Na de eerste TMC435 behandelperiode hadden alle 6 patiënten chronische hepatitis C door de ontwikkeling van deze nieuwe antivirale middelen waarschijnlijk varianten op de 4 belangrijke resistentie posities van het NS3/4A domein. Een patiënt overleed zal gaan toenemen. Daarbij komt dat we de invloed op de viruspopulatie door toedoen van de na de eerste behandelperiode en kon daarom niet worden herbehandeld. De oorzaak van nieuwe antivirale therapieën nog niet volledig kunnen overzien. overlijden was niet verwant aan de hepatitis C therapie. Resistentie bepaling op populatie niveau toonde dat de viruspopulatie bij start van de tweede behandel periode vergelijkbaar Het bereiken van een blijvende virale respons bij chronische hepatitis C patiënten is lange was ten opzichte van de eerste behandelperiode. Echter, de gevoelige UDPS techniek liet tijd afhankelijk geweest van het toedienen van (peg-)interferon. De activatie van het zien dat bij aanvang van de tweede behandelperiode de viruspopulatie bij 3 patiënten voor immuunsysteem door (peg-)interferon resulteert in ongeveer de helft van de patiënten in <2% bestond uit resistente virusvarianten. Slechts een van deze patiënten had initieel een een adequate antivirale immuunrespons. De antivirale activiteit wordt voor een belangrijk langzamere virusdaling vergeleken met de eerste behandelperiode. Uiteindelijk resulteerde de deel bepaald door het adaptieve (specifieke) immuunsysteem. Verschillende soorten witte standaardbehandeling in deze patiënt in een virologische doorbraak welke was geassocieerd bloedcellen (leucocyten), zoals B- en T-cellen, spelen ieder hun eigen rol in deze specifieke met de zelfde resistente virusvariant vastgesteld, voorafgaande aan de tweede behandeling. respons. T-cellen rijpen in de thymus en kunnen onderverdeeld worden in CD4+ en CD8+ T Een andere patiënt moest vervroegd stoppen in verband met laboratoriumafwijkingen met cellen. CD8+ T cellen, ook wel cytotoxische T cellen genoemd, kunnen met hun T cel receptor een onduidelijke oorzaak. In totaal bereikten drie van de vijf patiënten een blijvende virale virus geïnfecteerde cellen herkennen en beschikken over een aantal methoden om deze dan respons. Deze studie toont aan dat patiënten succesvol kunnen worden herbehandeld met op te ruimen. CD4+ T cellen worden ook wel helper cellen genoemd omdat ze belangrijk zijn TMC435, peg-interferon en ribavirine, ondanks de laag frequente aanwezigheid van resistentie voor de ondersteuning van de B en CD8+ T cel respons. Het uiterlijke kenmerk van een cel in 3 patiënten na anderhalf jaar follow-up. (fenotype) kan aan de hand van verschillende moleculen op het celoppervlak bepaald worden. Het fenotype van een cel vertelt iets over de differentiatie en activatie status van de T cellen en Het monitoren en behandelen van bijwerkingen, het vaststellen van eventuele virale resistentie over de mogelijke functionele eigenschappen. en het goed uitvoeren van de ingewikkelde behandelschema s zullen in de nabije toekomst Hoofdstuk 12 beschrijft de verschillen in het fenotype en functie van CD4+ en CD8+ T cellen van een uitdaging vormen voor de behandeling van HCV-geïnfecteerde patiënten. De effectiviteit chronische hepatitis B of C patiënten met een blijvende respons en non-respons na antivirale van de eerste generatie proteaseremmers (telaprevir en boceprevir) bij chronische hepatitis therapie. T cellen van gezonde vrijwilligers en patiënten met chronische hepatitis B of C werden

8 zowel voorafgaand als na afloop van de antivirale therapie gekarakteriseerd. Het fenotype van CONCLUSIES T cellen was niet verschillend tussen patiënten met een blijvende respons of non-respons, ongeacht het type virus infectie. Echter het fenotype van de algehele T cel populatie, met Door de studies beschreven in dit proefschrift hebben we meer inzicht gekregen in de name de expressie van CXCR3 (een chemokine receptor), was verhoogd bij patiënten met een veiligheid, toepasbaarheid en het werkingsmechanisme van verscheidene nieuwe antivirale chronische HBV of HCV infectie in vergelijking met gezonde vrijwilligers. CXCR3 is een chemokine geneesmiddelen. We kunnen concluderen dat deze nieuwe generatie geneesmiddelen een receptor die mogelijk verantwoordelijk is voor migratie van leucocyten naar de lever. Onze sterke antivirale activiteit bezitten waardoor meer chronische hepatitis C patiënten een bevindingen duiden erop dat de constante aanwezigheid van virale antigenen heeft geleid tot blijvende virale respons bereiken ten opzichte van de behandeling met peg-interferon en een T cel populatie met andere eigenschappen dan witte bloedcellen in gezonde vrijwilligers ribavirine. Verder duiden onze bevindingen erop dat virale resistentie varianten na behandeling zonder persisterend virus. Het moduleren van chemokine expressie om zodoende de antivirale met proteaseremmers ontstaan en kunnen leiden tot falen van de therapie. Ook hebben we immunologische omgeving in de lever te optimaliseren is een potentieel aantrekkelijk doelwit aangetoond dat het merendeel, maar niet alle, resistente virusvarianten verdwijnen na het van toekomstige therapie. staken van de therapie en dat patiënten succesvol kunnen worden herbehandeld met een In hoofdstuk 13 wordt de antivirale activiteit en het werkingsmechanisme van ANA773 vergelijkbare proteaseremmer. beschreven. ANA773 is een molecuul dat Toll-Like Receptor 7 (TLR7) stimuleert. TLR s vormen De indrukwekkende vooruitgang van de laatste jaren op het gebied van chronische hepatitis C een klasse eiwitten die een rol spelen in het aangeboren afweersysteem. Het zijn receptoren op behandeling is hiermee nog niet ten einde. Het combineren van verschillende klassen antivirale de kernmembraan die micro-organismen, waaronder ook virussen, kunnen herkennen. TLR s geneesmiddelen zal het genezingspercentage verder verbeteren. In de nabije toekomst zal die een ziekteverwekker tegenkomen zorgen voor de productie en het vrijkomen van moleculen blijken of een combinatietherapie, zonder peg-interferon en ribavirine, werkzaam tegen alle (cytokines), die antivirale activiteit van onder andere witte bloedcellen bewerkstelligen. HCV genotypes mogelijk wordt. De zoektocht naar een behandeling zonder interferon en Peg-interferon bestaat uit een enkel interferon subtype (2a of 2b) terwijl activatie van TLR7 ribavirine is van groot belang om de bijwerkingen van peg-ifn en ribavirine te voorkomen. meerdere interferon subtypes induceert. Onze hypothese was dat het stimuleren van TLR7 Concluderend kunnen we stellen dat de ontwikkelingen op het gebied van chronische hepatitis 274 met ANA773 leidt tot een grotere antivirale activiteit in vergelijking met het conventionele en C zullen leiden tot meer diversiteit en complexiteit van de behandeling. De verwachting is 275 geregistreerde peg-interferon-2a/b. ANA773 demonstreerde een toename van verschillende dat aanzienlijk meer HCV-geïnfecteerde patiënten door deze nieuwe behandelingen kunnen endogene interferon subtypes in preklinische studies en gezonde vrijwilligers. In deze fase genezen! 1b studie werden de veiligheid, verdraagzaamheid, farmacokinetiek (ANA773 bloedspiegels) en antivirale werkzaamheid van ANA773 onderzocht. In totaal werden 34 patiënten met verschillende HCV genotypes onderzocht. De studie bestond uit 5 patiëntgroepen met verschillende ANA773 doseringen (800, 1200, 1600 en 2000 mg) of placebo. ANA773 werd om de dag oraal gedoseerd gedurende 28 dagen (800, 1200, 1600 mg groepen) of 10 dagen (2000 mg groep). De bijwerkingen waren mild en vooral aanwezig bij de 2000 mg groep. Tijdens ANA773 dosering werd er, net als bij peg-interferon, een afname van trombocyten (bloedplaatjes), leukocyten en lymfocyten (witte bloedcellen) gemeten. Immuun activatie was beter naarmate de ANA773 dosering toenam. In de 800, 1200 en 1600 mg patiëntgroepen werd er geen significante afname van de HCV RNA hoeveelheid waargenomen. In de 2000 mg groep was er een significante virusdaling ten opzichte van placebo behandeld patiënten (p = 0,037), met een maximale HCV RNA daling van 3.10 log 10. Concluderend kunnen we stellen dat de onderzochte ANA773 doseringen veilig, maar matig effectief bleken in de lagere dosis groepen. Het doel van een vervolgstudie was het antivirale effect te verbeteren met hogere ANA773 doseringen voor een langere duur in combinatie met ribavirine (valt buiten dit proefschrift).