NEDERLANDSE SAMENVATTING Inleiding Reumatoïde artritis (RA, reuma) is een chronische ziekte, waarbijvoornamelijk de gewrichten aangetast worden.

Transcriptie

1 APPENDIX

2

3 Inleiding Reumatoïde artritis (RA, reuma) is een chronische ziekte, waarbijvoornamelijk de gewrichten aangetast worden.het is een veelvoorkomende aandoening(ongeveer 1% van de bevolkinglijdt eraan) en de ziekte komt vaker bijvrouwen dan bijmannen voor.de ziekte behoort tot een grotere groepvan aandoeningen die als gemeenschappelijkkenmerk hebben dat het afweersysteem zich tegen het eigen lichaam keert, de zogenoemde autoimmuun ziekten.in het gevalvan RA toont het ziekteproces zichdoor opvlammende ontstekingen van in de regelkleinere gewrichten.om de diagnose RA te ste len dient het ziektebeeld aan een aantalcriteria te voldoen.in een typisch gevalis er sprake van al langer bestaande symmetrische ontstekingen van kleine handgewrichten, maar ookandere gewrichten zijn vaakaangedaan.verder is er vaaksprake van ochtendstijfheid, die langer dan een uur duurt voordat de maximale verbeteringoptreedt.in het bloed zijn sporen te vinden van de zogenaamde Reuma Factor (aanwezigbijveelra patiënten) en opröntgen foto s vindt men vaaktekenen van aantastingvan gewrichtskraakbeen.deze aantastingvan het gewrichtskraakbeen is één van de factoren die eraan bijdragen dat op den duur gewrichtsdeformaties ontstaan en RA patiënten geïnvalideerd raken. Vele van door RA aangedane gewrichten hebben dezelfde structuur. Tussen de botuiteinden bevindt zich gewrichtskraakbeen. Het gewricht is omgeven door het gewrichtskapselen er zijn vaakbindweefselverbindingen aanwezigdie aan de stevigheid van het gewricht bijdragen.het gewrichtskapselis aan de binnenzijde bekleed met zogenaamd synovium een dun laagje ce len, dat onder andere voor de productie van gewrichtsvloeistof(synoviaalvloeistof) verantwoordelijk is.gewrichtsvloeistofis een dikke vloeistofdie ervoor zorgt dat met kraakbeen bedekte botuiteinden moeiteloos langs elkaar heen kunnen schuiven wat de essentie vormt van gewrichtsbewegingen. BijRA patiënten ontstaat door nogonbekende oorzaakeen ontstekingvan het synovium. Er worden ontstekingsce len aangetrokken die niet a leen gewrichtsbestanddelen kapot maken maar er ook voor zorgen dat de ontsteking een chronisch karakter krijgt.w at precies het mechanisme is waarlangs het immuunsysteem aangezet wordt tot het veroorzaken van een chronische ontsteking in juist het synovium is nog onduidelijk. W aarschijnlijkgaat het hier om een samenspelvan erfelijke en omgevingsfactoren.w at welsteeds meer duidelijkwordt is het mechanisme langs welke de verschi lende stoffen die het kraakbeen en het onderliggend bot kunnen afbreken geproduceerd en geactiveerd worden. Het afbreken van kraakbeen gebeurt door verschi lende enzymen, dat zijn eiwitten die de bestanddelen van het kraakbeen kunnen afbreken.deze enzymen zijn ookvoor de normale processen nodigwaarbijweefselvernieuwd wordt (bijvoorbeeld wondheling, groei en het afbreken van slijmvlies in de baarmoeder tijdens menstruatie).in ziekteprocessen zoals RA zijn deze enzymen echter vaker en in grotere hoeveelheden aanwezig.een van de systemen die voor het afbreken van het kraakbeen verantwoordelijkworden gehouden is de groep van meer dan 20enzymen die MatrixMeta loproteinasen (MMPs) genoemd wordt.a le M M Ps kunnen opbasis van substraatspecificiteit (capaciteit om een specifiekbestanddeel van het kraakbeen te kunnen afbreken) onderverdeeld worden in meerdere subklassen 119

4 zoals collagenasen (MMP-1, -8, -13), gelatinasen (MMP-2 en -9) of stromelysinen (MMP- 3, -10, -11). MMPs hebben als gemeenschappelijk kenmerk dat ze meestal in een nietactieve vorm worden aangemaakt (zogenaamde prommps) om vervolgens buiten de cel te worden geactiveerd (actieve MMPs), waarna ze met specifieke remmers (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases, TIMPs) en niet-specifieke remmers ( 2 Macroglobulin, 2 M) complexen kunnen vormen waardoor ze weer geïnactiveerd raken. Om MMPs te detecteren maakt men gebruik van verschillende methoden. Eén ervan is het vangen van MMPs met een specifiek antilichaam dat gebonden is aan het oppervlak van een putje op een reageerplaat. De rest van het bloedmonster wordt weggespoeld, waarna met een tweede specifiek antilichaam de gebonden MMPs aangetoond kunnen worden. Met deze techniek worden voornamelijk de nog niet actieve prommps gemeten. De reden ervoor is dat geactiveerde MMPs vrij snel complexen vormen met remmers en dan niet meer met de hiervoor beschreven techniek te detecteren zijn. Om een indruk te verkrijgen van de hoeveelheden actieve MMPs, kan men ook MMPs in complexen met 2 M meten. MMPs in complexen met 2 M kunnen niet meer hun natuurlijke substraten (zoals diverse kraakbeenbestanddelen) afbreken omdat een MMP/ 2 M complex een kooiconstructie is met MMP als gevangene. MMPs in 2 M komen niet dicht genoeg bij de natuurlijke substraten om deze te kunnen afbreken. Om de hoeveelheid aan MMPs in 2 M te kunnen meten wordt een zeer klein eiwit gebruik dat door 2 M heen de MMP kan bereiken. De gebruikte kleine eiwitten hebben een ingebouwde knipplek voor de MMPs en een fluorescente stof eraan gekoppeld om het door MMPs geknipte eiwit te kunnen detecteren. Vooral deze laatste techniek is veel gebruikt voor het werk beschreven in dit proefschrift. Samenvatting van dit proefschrift Het doel van het promotieonderzoek was het inventariseren van verschillende (vormen) van MMPs in gewrichtsvloeistof en in bloed van RA patienten. Nader onderzoek was gericht op de vraag of (en welke) MMPs gebruikt kunnen worden als ziektemarkers om het ziektebeloop te voorspellen en de effecten van behandelingen te monitoren. Hoofdstuk 1is bedoeld als algemene introductie tot dit proefschrift. Het geeft een beknopt overzicht van het ziektebeeld reumatoïde artritis. Het laat zien dat tot op heden een aanzienlijke hoeveelheid kennis is vergaard over de verschillende processen die bij de ziekte betrokken zijn. Het wetenschappelijk onderzoek van afgelopen decennia maakt het mogelijk om steeds verder te gaan met als uiteindelijk doel dit complexe ziektebeeld te ontrafelen en RA patiënten optimale behandelingsmiddelen en strategieën te kunnen bieden. Een van de belangrijkste aspecten van het ziekteproces is de afbraak van het gewrichtskraakbeen. Het is inmiddels onomstotelijk bewezen dat Matrix Metalloproteinasen hierin een belangrijke rol spelen. MMPs kunnen worden geproduceerd door de cellen van het gewrichtskraakbeen zelf, door de cellen van ontstoken binnenbekleding van het gewrichtskapsel en door de afweersysteemcellen die tijdens de ontsteking in het gewricht aanwezig zijn. 120

5 In een normale situatie wordt de werking van MMPs gereguleerd onder andere door de natuurlijke remmers, Tissue Inhibitors (TIMPs). In RA is het evenwicht tussen de MMPs en TIMPs verstoord:de productie van MMPs neemt meer toe dan de productie van TIMPs. Om de betrokkenheid van MMPs in het proces van kraakbeendestructie in RA nader te bestuderen werd gekeken naar een andere manier dan de TIMPs om geactiveerde MMPs in gewrichtsvloeistof en bloed te remmen. In hoofdstuk 2 van dit proefschrift wordt aangetoond dat geactiveerde MMPs complexen vormen met een algemene remmer van enzymen: 2 Macroglobulin ( 2 M). 2 M kan gezien worden als stortplaats voor niet alleen MMPs maar voor alle mogelijke actieve enzymen. Hoofdstuk 2 laat resultaten zien van een aantal verschillende experimenten waaruit blijkt dat ook in bloed van RA patiënten 2 M/MMP complexen gevormd kunnen worden. Het betreft experimenten met gebruik van verschillende scheidingsmethoden (om vrije MMPs en 2 M/MMP complexen van elkaar te kunnen scheiden) en experimenten waarbij grote en kleine MMP substraten en remmers worden gebruikt. Omdat de grote MMP substraten en remmers niet in staat zijn de 2 M/MMP complexen te penetreren terwijl kleinere substraten en remmers dat wel doen, concluderen we dat omzetting van kleinere substraten in bloedmonster van RA patiënten grotendeels afkomstig is uit 2 M/MMP complexen. De resultaten laten ook zien dat op dezelfde manier gemeten MMPs niveaus in bloed van RA patiënten hoger zijn dan in monsters afkomstig van artrose patiënten (gewrichtsslijtage zonder ontsteking) of gezonde mensen. Bovendien laten we zien dat de concentratie van MMPs in het bloed hoger is naarmate ook niveaus van andere ontstekingsparameters, zoals bloedbezinking, toenemen. Hoofdstuk 3laat de resultaten zien van een serie experimenten bedoeld om de gebruikte methode van MMP metingen in 2 M/MMP complexen te meten nader te karakteriseren. Zoals uit de resultaten blijkt valt de variatie bij het meten van hetzelfde bloedmonster binnen één meting en tussen de metingen op verschillende dagen binnen de grenzen die algemeen geaccepteerd zijn (< 15%). Verder is aangetoond dat noch leeftijd noch geslacht het gevonden MMP niveau beïnvloeden. Er blijkt ook geen verschil in gemeten MMPs te zijn in bloedmonsters die op verschillende tijdstippen op een dag bij dezelfde patiënt zijn verzameld. Deze uitkomsten zijn belangrijk om degelijke studies te kunnen uitvoeren. Men wil immers weten dat de gevonden resultaten niet een gevolg zijn van verschillen in samenstelling van bestudeerde groepen (leeftijd/geslacht/tijd van sampling) maar veroorzaakt worden door de verschillende aandoeningen waaraan patiënten lijden. In hoofdstuk 4 van dit proefschrift zijn niveaus van verschillende MMPs in gewrichtsvloeistoffen of bloed vergeleken tussen gezonde mensen en patiënten bij wie de diagnose reuma of gewrichtsslijtage (artrose) vastgesteld is. Uit de resultaten blijkt dat het niveau van een aantal MMPs alleen bij reuma patiënten verhoogd is en dat deze MMPs als potentiële markers van het reumatische ziekteproces gezien zouden kunnen worden. Van sommige MMPs is gebleken dat het enzymgehalte gecorreleerd is aan de hoeveelheid kraakbeenafbraakproducten of aan de concentratie van algemeen geaccepteerde ontstekingsmarkers, zoals bloedbezinking. Deze bevindingen leveren indirect bewijs voor de betrokkenheid van verschillende MMPs in RA. Ook is gebleken dat er een correlatie bestaat tussen het niveau van MMPs gevonden in gewrichtsvloeistoffen en in het bloed van 121

6 reuma patiënten. Deze bevindingen impliceren dat door het meten van MMP niveau in bloed een redelijk inzicht verkregen kan worden in de situatie in het ontstoken gewricht. Verder bevestigen de resultaten dat een verhoogd gehalte aan 2 M/MMP complexen aanwezig is in de gewrichtsvloeistoffen en het bloed van RA patiënten in vergelijking met een gezonde controlepopulatie en artrose patiënten. Hoofdstuk 5 beschrijft de studie die uitgevoerd is om de potentiële markers beschreven in het vorige hoofdstuk te testen in een grote groep van reuma patiënten. Voor deze studie is gebruik gemaakt van bloedmonsters van 108 RA patiënten bij wie de diagnose reuma vastgesteld is en die daarna nog minimaal 2 jaar gevolgd zijn. De belangrijkste vraag was of de gemeten MMP spiegels in bloed de progressie van de gewrichtsschade voorspellen. Alle patiënten zijn klinisch beoordeeld vlak na het stellen van de diagnose RA, en na 1 en 2 jaar. Daarnaast zijn er zijn bloedmonsters verzameld en röntgenfoto s gemaakt. Door de elkaar opvolgende foto s te vergelijken werd de voortgang van de gewrichtsschade vastgesteld. In het bloed zijn de MMPs concentraties bepaald. In de hele patiëntengroep bleek de gewrichtsschade in 2 jaar toegenomen te zijn. Van alle vlak na het stellen van de diagnose RA gemeten parameters bleek prommp-3 deze progressie van gewrichtsschade het beste te voorspellen. Dat wil zeggen dat een patiënt met een hoog prommp-3 gehalte in bloed bij het stellen van de diagnose RA meer kans loopt om snel veel kraakbeen te verliezen. Naast prommp-3 zijn ook twee andere (bekende) factoren (Shared Epitope en Reuma Factor) getest. ProMMP-3 was echter de sterkste voorspeller van schade en deed het als de enige onafhankelijk van andere voorspellers. Voor verdere analyse is de hele groep verdeeld in langzaam en snel progressieve subgroepen gebaseerd op het gemiddelde van schadeprogressie van de hele groep. Patiënten met een schadeprogressie lager dan het gemiddelde van de hele groep kwamen in de langzaam progressieve subgroep terecht en patiënten met een hoger dan het gemiddelde schadeprogressie hebben de snel progressieve subgroep gevormd. Zoals verwacht werd waren de prommp-3 spiegels in de langzaam progressieve groep op alle drie de meetpunten lager dan in de snel progressieve groep. Andere gemeten MMPs (prommp-8 en -9) daalden in allebei de groepen net zoals de ziekteactiviteit gemeten met behulp van DAS (Disease Activity Score, een klinische maat om de ziekte activiteit te beoordelen). Het overschot aan geactiveerde MMPs dat in 2 M/MMP gevonden werd daalde echter alleen in de subgroep van de langzaam progressieve RA patiënten. Op basis van deze bevindingen hebben we geconcludeerd dat niveaus van de bestudeerde MMPs gevonden in het bloed van RA patiënten geassocieerd zijn met de ziekteactiviteit en dat prommp-3 spiegels aan het begin van het ziekteproces voorspellend zijn voor de mate van gewrichtsschade. In hoofdstuk 6 van dit proefschrift wordt een studie beschreven waarin gekeken wordt naar de disbalans tussen MMP en TIMP productie in gewrichten van mensen na een knietrauma bijvoorbeeld als gevolg van een ongeluk. De resultaten worden vergeleken met de spiegels van MMPs en TIMPs in gewrichtsvloeistoffen afkomstig van patiënten met artrose (OA, gewrichtsslijtage), pseudojicht (een door kristalafzetting geïnduceerde ontsteking in het gewricht) en gezonde proefpersonen. Er werd naar het gehalte van 122

7 prommp-1 en prommp-3, actieve MMP-1 en -3 in complexen met 2 M en TIMP-1 (een van de natuurlijke MMP remmers) gekeken. De rationale achter deze studie was de gedachte dat na een gewrichtstrauma meer prommp-1 en -3 en TIMP geproduceerd wordt, maar dat de productie van de remmers onvoldoende is om alle MMPs tijdig te elimineren. De resultaten laten zien dat er meer MMPs in 2 M terecht komen na een knietrauma dan in de gewrichtsvloeistof van gezonde proefpersonen. Deze bevindingen impliceren dat er inderdaad een overschot aan geactiveerde MMPs aanwezig is in gewrichtsvloeistoffen na een knietrauma. Om de gegevens verder te analyseren werd de groep van patiënten met knietrauma onderverdeeld in subgroepen gebaseerd op tijdstip na het ongeluk. Het verloop van prommp, TIMP en geactiveerde MMPs in 2 M/MMP complexen laat zien dat verhoging in 2 M/MMP spiegels samenvalt met het moment van afname van TIMP-1 concentratie. Deze bevinding versterkt de hypothese dat er te weinig remmers aanwezig zijn om alle geactiveerde MMPs te kunnen elimineren wat op zich zou kunnen bijdragen aan verhoogde afbraak van het gewrichtskraakbeen na een ongeluk en het ontstaan van gewrichtsslijtage zou kunnen vergemakkelijken. In het laatste experimentele hoofdstuk van dit proefschrift (hoofdstuk 7) wordt gekeken naar de mogelijkheden om de behandelingsresultaten te kunnen beoordelen door het niveau van geactiveerde MMPs in 2 M/MMP complexen gedurende de behandeling te volgen. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een patiëntengroep (N = 102) afkomstig uit een grotere prospectieve, gerandomiseerde, dubbel blinde studie die opgezet was om de effecten van leflunomide en methotrexaat op RA activiteit te kunnen beoordelen. Leflunomide en methotrexaat zijn zogenaamde Disease Modifying Antirheumatic Drugs (DMARDs). Beide zijn goedgekeurd voor het behandelen van RA patiënten en worden al geruime tijd gebruikt. Van leflunomide is inmiddels bekend dat het het gestoorde evenwicht tussen de MMPs en de specifieke remmers (TIMPs) kan herstellen. Patiënten werden klinisch beoordeeld (Disease Activity Score, DAS) aan het begin van de studie, na vier maanden en na één jaar. Op dezelfde tijdstippen werden bloedmonsters afgenomen waarin de algemene ontstekingsmarker (C-reactieve proteïne, CRP) en de hoeveelheid geactiveerde MMPs in 2 M/MMP complexen werden bepaald. De resultaten van deze studie laten zien dat de hoge ziekte activiteit zoals aan de hand van DAS gemeten is aan het begin van de studie, met 30% afgenomen was na één jaar in beide groepen. Dat betekent dat de toegepaste geneesmiddelen effectief zijn en in vergelijkbare mate de ziekteactiviteit onderdrukken. Dat werd ook bevestigd door de metingen van de algemeen geaccepteerde ontstekingsparameter, CRP, die in beide groepen na een jaar gedaald was. Nieuwe bevindingen in deze studie waren echter een gedaalde hoeveelheid aan 2 M/MMP complexen in bloed. In de leflunomide groep waren de gevolgen van de behandeling al na vier maanden zichtbaar en na één jaar waren de bloedspiegels van de met methotrexaat behandelde patiënten ook gedaald. Deze resultaten laten zien dat MMP activiteitsmetingen als ziektemarker gebruikt kunnen worden. 123

8 Conclusies Een belangrijke vraag uit de leeropdracht die tot het schrijven van dit proefschrift leidde was: welke Matrix Metalloproteinasen en in welke vorm zijn aanwezig in gewrichtsvloeistof en bloed van patiënten met gewrichtsziekten?het antwoord op deze vraag kan in het bijzonder gevonden worden in hoofdstuk 4 waarin een overzicht van verschillende MMP-subklassen in RA en OA patiënten gegeven wordt wat de identificatie van MMPs als potentiële markers van het RA ziekteproces mogelijk maakt. Het feit dat meerdere MMPs simultaan gemeten zijn in gepaarde bloed/gewrichtsvloeistoffen monsters maakt het ook mogelijk om te beoordelen hoe de situatie in het ontstoken gewricht weerspiegeld wordt in het bloed. Verder laat dit proefschrift zien dat tijdens gewrichtsontsteking niet alleen verhoogde hoeveelheden van nog niet actieve vorm van MMPs (prommps) maar ook verhoogde MMP activiteit in 2 M/MMP complexen gevonden wordt. Deze bevindingen impliceren dat de verhoogde productie van de pro vorm van MMPs daadwerkelijk tot aanwezigheid van actieve MMPs leidt. Bovendien versterken deze bevindingen de hypothese dat de MMP/TIMP disbalans een belangrijke rol speelt in ontstekingsprocessen. Het is bij herhaling aangetoond dat er meer moleculen van prommps dan TIMPs zijn in RA wat ook uit onze studies blijkt. Het feit dat er ook meer geactiveerde MMPs in 2 M terecht komen tijdens gewrichtsontsteking wijst wederom in de richting van de MMP/TIMP disbalans. Een van de belangrijkste aanwijzingen vormt het feit dat MMP activiteit in 2 M/MMP complexen toeneemt in dezelfde periode na een knietrauma waarin de spiegels van TIMP-1 in gewrichtsvloeistof afnemen, zoals hoofdstuk 6dat laat zien. Verder is veel aandacht besteed aan de bruikbaarheid van MMP metingen als ziektemarkers. In meerdere hoofdstukken is aangetoond dat MMP activiteit metingen in 2 M/MMP complexen gebruikt kunnen worden om het RA proces verder te bestuderen. Gebleken is dat MMP activiteit verhoogd is in gewrichtsvloeistoffen en in de circulatie van RA patiënten en gecorreleerd is aan het niveau van ontstekingsmarkers. Bovendien laat hoofdstuk 7van dit proefschrift zien dat na behandeling met geneesmiddelen die de MMP productie kunnen verlagen inderdaad minder 2 M/MMP complexen in het bloed gevonden worden. De studie naar de voorspellende waarde van MMPs voor het verloop van het ziekteproces met betrekking tot gewrichtsdestructie (hoofdstuk 4) laat immers zien dat MMP activiteit deels andere, additionele, informatie levert dan ontstekingsmarkers. In dezelfde studie is aangetoond dat bloedspiegels van prommp-3 (een Metalloproteinase waarvan duidelijk is dat het een cruciale rol in het RA proces speelt) ook indicatief zijn voor het optreden van gewrichtsschade in de periode van 2 jaar na het stellen van de diagnose RA, oftewel het lange termijn verloop van de ziekte. Van andere MMPs (-8 en -9) kan geconcludeerd worden dat ze meer indicatief zijn voor de ziekteactiviteit op het moment van bloedafname. Dit gezien het feit dat de bloedspiegels van deze enzymen geassocieerd zijn met andere ziekteparameters en een dalende trend tijdens de follow up periode hebben laten zien. 124

9 Verder onderzoek op het gebied van Matrix Metalloproteinases zou veel kunnen opleveren voor het ontrafelen van het RA ziekteproces. De verworven kennis zou bovendien op den duur vertaald kunnen worden in een direct voordeel voor RA patiënten. Daarbij kan men denken aan het specifieker maken van gebruikte methodes om de activiteit van afzonderlijke MMPs te kunnen meten of aan het ontwikkelen van nieuwe methoden om bijvoorbeeld MMPs in complexen met hun specifieke remmers (TIMPs) te kunnen meten. Wanneer meer kennis beschikbaar komt over weefselafhankelijke productie van verschillende MMPs zal ook duidelijk worden welke MMPs een interessant therapeutisch doel vormen en welke manieren het beste zijn om het uiteindelijke doel van remming van het kraakbeenafbraak in RA te bewerkstelligen. 125

10