UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Biochemische en Microbiële Technologie Laboratorium voor Microbiële Ecologie en Technologie Academiejaar FLOW CYTOMETRISCHE FINGERPRINTING VOOR DE ANALYSE VAN PROBIOTISCHE STAMMEN Kathleen Verbrugge Eerste Master Farmaceutische Zorg Promotoren Prof. Dr. Ir. N. Boon Prof. Dr. Ir. T. Van de Wiele Commissarissen Prof. Dr. Apr. H. Nelis Prof. Dr. T. Coenye

2 Auteursrecht De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. 31 mei 2013 Promotor Prof. Dr. Ir. N. Boon & Prof. Dr. Ir. T. Van de Wiele Auteur Kathleen Verbrugge

3 Samenvatting Flow cytometry is met zijn snelle en nauwkeurige analyses een alternatief voor tijdrovende uitplatings- en moleculaire technieken. Door de combinatie van fluorescente kleuringen met SYBR Green en propidium iodide en flow cytometry kan de viabiliteit van micro-organismen gevisualiseerd worden. Het bestuderen van de viabiliteit is belangrijk om de overleving van probiotica tijdens processing en de maag-darm passage te verbeteren. De staalvoorbereiding en het kleuringsproces van de probiotische stammen Lactobacillus rhamnosus GG en Bifidobacterium longum werden geoptimaliseerd. Bacteriële suspensies kunnen voorafgaand aan de flow cytometrische metingen verdund worden om een nauwkeurig resultaat te krijgen. De gemeten celconcentratie bleef tijdens de meting van B. longum en LGG verdund in gebufferde fosfaatoplossing meer constant dan in fysiologische oplossing. Na toevoegen van de kleurstof resulteerde incubatie gedurende 15 minuten bij 37 C in een maximale fluorescentie intensiteit. In de toekomst kan het kleuringsprotocol nog verder geoptimaliseerd worden: het effect van EDTA op de kleuring van Gram negatieve bacteriën en de invloed van verschillende kleurconcentraties kunnen bepaald worden. De zwakke plek van flow cytometry blijft de subjectieve beoordeling van de verschillende data. Flow cytometrische fingerprinting kan gebruikt worden om verschillende microbiële gemeenschappen aan de hand van een statistische methode objectief met elkaar te vergelijken, te differentiëren en eventueel te classificeren. Om 29 verschillende Lactobacillus stammen, behorend tot vijf clusters, met deze methode te kunnen onderscheiden moest minstens gekend zijn tot welke cluster de stam behoort. Door de grote variabiliteit tussen herhaalde metingen is eerst verder onderzoek naar de stabiliteit en reproduceerbaarheid van het systeem nodig. Verder onderzoek kan in de toekomst uitwijzen of het mogelijk is om onbekende stalen te classificeren met flow cytometrische fingerprinting. Vooraleer kan beslist worden of de snelle techniek een alternatief kan zijn voor de dure en tijdrovende moleculaire technieken die vandaag gebruikt worden, is uitgebreid verder onderzoek dus noodzakelijk.

4 Dankwoord Graag wil ik iedereen bedanken die meegeholpen heeft om deze thesis tot een goed eind te brengen. Niet in het allerminst mijn promotors Prof. Dr. N. Boon & Prof. Dr. T. Van de Wiele om mij de kans te geven mijn onderzoeksstage in LabMET uit te voeren. Verder dank ik Ir. Karen De Roy & Ir. Annelies Geirnaert om mij wegwijs te maken in de wereld van probiotica en flow cytometry. Jullie stonden steeds klaar met tips en trics om deze thesis tot een goed einde te brengen. Ook bedankt voor het corrigeer- en naleeswerk. Uiteraard gaat mijn dank ook uit naar alle andere mensen van het LabMET team voor de fijne samenwerking. Een speciaal woordje van dank gaat nog naar Jana De Bodt. Dankjewel Jana voor het opgroeien van alle Lactobacillus stammen tijdens mijn gipsperiode! Deze onderzoeksstage verliep door enkele onvoorziene omstandigheden niet van een leien dakje. Daarom dankjewel aan iedereen voor de extra inspanning om deze thesis toch te doen slagen!!! Als laatste ook een woordje van dank aan mijn ouders & vriend voor de onvoorwaardelijke steun al 4 jaar lang!

5 Inhoudsopgave 1 INLEIDING DARMMICROBIOTA VAN DE MENS Algemeen Opbouw van de darmmicrobiota vanaf de geboorte Belang en functie van de darmmicrobiota HET STUREN VAN DE DARMMICROBIOTA M.B.V. PROBIOTICA Algemeen Oorsprong Werking Klinisch gebruik: een overzicht van de belangrijkste toepassingen OVERLEVING VAN PROBIOTICA DOORHEEN DE MAAG-DARM PASSAGE Conventionele methoden Flow cytometry als alternatieve methoden Fluorescente kleuringen Optimalisatie kleuring en flow cytometrische analyse PHENOTYPING VAN PROBIOTICA OBJECTIEVEN MATERIAAL EN METHODEN GROEI- EN VERDUNNINGSMEDIA OPGROEIEN VAN BACTERIËN FLOW CYTOMETRY Kleuring en meetprotocol FCM meting PBS versus FO Incubatietijd en temperatuur Fingerprinting... 26

6 3.3.3 Statistische analyse van flow cytometrische data RESULTATEN LIVE/DEAD-ASSAY: SYBR GR EN SYBR GR+PI Verdunnen van bacteriële suspensies Incubatietijd en temperatuur FLOWCYTOMETRISCHE FINGERPRINTING VAN LACTOBACILLUS STAMMEN Onderscheid tussen Lactobacillus clusters Onderscheid tussen stammen binnen groep L. rhamnosus en L. paracasei groep Onderscheid tussen de verschillende stammen binnen een cluster L. rhamnosus cluster L. brevis cluster L. salivarius cluster L. farciminis cluster L. acidophilus cluster Onderscheid tussen alle 29 Lactobacillus stammen DISCUSSIE STAALVOORBEREIDING: PBS VS FO BIJ HET VERDUNNEN VAN BACTERIËLE SUSPENSIES KLEURINGSPROTOCOL Suggesties POST PROCESSING CONCLUSIE LITERATUURLIJST... 47

7 Lijst met gebruikte afkortingen AAD AGE CFDA CU DMSO DNA FCM FDA FO FSC IBD IECs KKVZ KVE MRS nm OD ORS PB PBS PCA PI PMT s RAPD RCT SSC SYBR Gr VBNC antibiotica-geassocieerde diarree agarose gel elektroforese carboxyfluorescine diacetaat colitis ulcerosa dimethylsulfoxide desoxyribonucleïnezuur flow cytometry fisher discriminant analyse fysiologische oplossing forward scatter inflammatory bowel disease intestinale epitheliale cellen korte keten vetzuren kolonievormende eenheden Man, Rogosa and Sharpe Agar nanometer optische densiteit oral rehydratation salts probability binning fosfaatgebufferde zoutoplossing principal component analyse propidium iodide photomultiplier tubes random amplified polymorphic DNA assay randomized clinical trial side scatter SYBR Green viable but non culturable

8 1 INLEIDING 1.1 DARMMICROBIOTA VAN DE MENS Algemeen Naar schatting leven triljoen symbiotisch levende microbiële cellen in het menselijk lichaam. De grootste aantallen micro-organismen, voornamelijk bacteriën, komen voor in het maag-darm kanaal, maar ze koloniseren daarnaast ook de huid en de vagina bij de vrouw (Ursell et al. 2012). Gewoonlijk zijn in de maag en het proximale deel van de dunne darm slechts bacteriën per ml aanwezig. De overleving van micro-organismen is er immers erg laag omwille van de aanwezigheid van onder meer maagzuur en gal en een snelle transit (O'Hara and Shanahan 2006, Ramakrishna 2007). Helicobacter pylori is de belangrijkste kolonisator van de maag (Ramakrishna 2007). De bacteriële densiteit stijgt in het distale deel van de dunne darm tot 10 7 kolonievormende eenheden (kve)/ml en is maximaal in het colon waar het aantal bacteriën geschat wordt op per gram darminhoud (O'Hara and Shanahan 2006). Figuur 1.1: De bacteriële gemeenschap aanwezig in de humane gastro-intestinale tractus (O'Hara and Shanahan 2006) Het duodenum, het jejunum en het proximale deel van het ileum zijn voornamelijk gekoloniseerd door Gram positieve stammen zoals Lactobacillus en Streptococcus. Ook gisten kunnen voorkomen. Gewoonlijk zijn in dit deel van het gastro intestinaal kanaal tot 10 3 bacteriën/ml aanwezig. In het distale ileum kunnen daarnaast strikt anaerobe bacteriën zoals Clostridium stammen gevonden worden (Ramakrishna 2007). 1

9 In het colon komen vooral anaerobe bacteriën (90%) voor. Het colon van een individu telt minstens 160 verschillende species en er kunnen wel 400 tot 500 verschillende stammen aanwezig zijn (Ramakrishna 2007, Qin et al. 2010). De complexe samenstelling van de microbiota is het gevolg van een natuurlijk selectiemechanisme waardoor de unieke werking en stabiliteit van dit systeem verzekerd wordt (O'Hara and Shanahan 2006). Het aantal genen aanwezig in de intestinale microbiota is 50 tot 100 maal het aantal in ons eigen genoom, wat nogmaals de immense omvang en potentieel van de microbiota benadrukt (Hart et al. 2002). Toch is het moeilijk om te definiëren wat een normale darmgemeenschap is. Er is immers een zekere verscheidenheid van darmmicrobiota in de populatie. Ook kan de samenstelling van de darmmicrobiota tijdens de levensloop van een individu nog veranderen. Bij het ouder worden neemt de diversiteit van de intestinale microbiota gewoonlijk toe. Daarnaast heeft ook de voeding een invloed (Ramakrishna 2007). Zo wordt bijvoorbeeld bij vegetariërs een andere samenstelling van de darmmicrobiota gezien, waarbij het totaal aantal micro-organismen aanwezig in de intestinale microbiota gelijk blijft (Zimmer et al. 2012). Studies worden vaak uitgevoerd in een bepaalde populatie, waarbij extrapolatie naar gezonde personen wereldwijd niet steeds van toepassing is. Ook worden frequent fecale stalen gebruikt bij het bestuderen van de normale microbiota. De fecale samenstelling is vaak niet representatief voor de samenstelling van de microbiële gemeenschap in het darmlumen. Ten slotte kan het verkeerd bewaren of vervoeren van fecale stalen een verandering in samenstelling als gevolg hebben (Hart et al. 2002) Opbouw van de darmmicrobiota vanaf de geboorte Tijdens de ontwikkeling in de baarmoeder is de darm van een foetus steriel. De microbiota in het colon van de mens wordt pas vanaf de geboorte opgebouwd. De samenstelling is afhankelijk van een groot aantal factoren waaronder de geboorte (natuurlijk of via keizersnede), leefomgeving van de baby (ook hygiëne), dieet (borst- of flessenvoeding), de darmmicrobiota van de moeder en ook genetische factoren kunnen een rol spelen (Kaur et al. 2002). 2

10 Al snel na de geboorte koloniseren facultatieve anaerobe bacteriën, zoals Streptococcus, Enterobacteriaceae en Staphylococcus de gastro-intestinale tractus (Ramakrishna 2007). Initieel zijn weinig anaerobe stammen in de darm aanwezig, daar een hoge oxidatie-reductiepotentiaal de groei van anaeroben remt. Naarmate er door aerobe bacteriën meer zuurstof verbruikt wordt en de oxidatie-reductiepotentiaal daalt, kan een meer anaerobe en diverse intestinale gemeenschap gecreëerd worden (Orrhage and Nord 1999). Zo neemt vanaf de eerste levensweek het aantal Bifidobacterium gestaag toe, vooral bij baby s die borstvoeding krijgen. Over het algemeen zijn bij deze baby s ook meer bacteriën in de darm aanwezig dan bij baby s gevoed met flessenmelk (Ramakrishna 2007). Na de eerste levensweek, maar tijdens de periode waarin enkel borstvoeding of flessenvoeding gegeven wordt, zijn Enterobacteriaceae en Enterococcus nog steeds prominent aanwezig. Toch wordt de bovenhand genomen door Bifidobacterium spp. Ook het aantal Bacteroides en Lactobacillus nemen toe, maar veel trager. Wanneer overgeschakeld wordt op vaste voeding, wordt een toename gezien van Enterococcus en Bacteroides (Orrhage and Nord 1999). Op tweejarige leeftijd bestaat de darmmicrobiota van een kind uit een 150-tal bacterie species en is die vergelijkbaar met de intestinale biota van een volwassene (Ramakrishna 2007, Qin et al. 2010) Belang en functie van de darmmicrobiota Een gezonde intestinale microbiële gemeenschap oefent een metabolische, structurele en protectieve werking uit (O'Hara and Shanahan 2006). Indien gegeven is dat een enkel organisme zoals E. Coli een enorme metabolische capaciteit heeft, spreekt het voor zich dat de metabolische capaciteit van de volledige intestinale microbiële gemeenschap immens is (Hart et al. 2002). De belangrijkste metabolische activiteit van de darmmicrobiota is om niet-geabsorbeerde koolhydraten die in het colon terechtkomen te fermenteren tot korte keten vetzuren (KKVZ) (Ramakrishna 2007). Deze KKVZ worden geabsorbeerd en zorgen zo mede voor energie voor de gastheer, maar anderzijds kunnen KKVZ ook dienen als energiebron voor de andere darmbacteriën (O'Hara and Shanahan 2006). Daarnaast bevorderen de gevormde KKVZ de absorptie van natrium en chloride en 3

11 zorgen ze voor een betere proliferatie, differentiatie en herstel van darmepitheelcellen (Ramakrishna 2007). Bacteriën staan ook in voor de synthese van bepaald essentiële stoffen, zoals vitamine K (Resta 2009). Een andere rol van de darmmicrobiota is zijn protectieve werking en het behoud van de integriteit van de darmwand (Orrhage and Nord 1999). Door interactie van mucosale bacteriën met intestinale epitheliale cellen (IECs) kunnen de immuunrespons en inflammatieprocessen in de darm gereguleerd worden (Ramakrishna 2007). Dit doen IECs door immunologische moleculen (bijvoorbeeld IgA) te produceren die instaan voor de homeostase van de darmmicrobiota. Daarnaast vormen IECs een fysieke barrière voor de invasie van pathogenen en secreteren ze antimicrobiële peptides en mucine (Bermudez- Brito et al. 2012, Goto and Kiyono 2012). Uiteraard zijn de beschikbaarheid van voedingsstoffen en de leefomgeving belangrijke factoren die de samenstelling van de darmmicrobiota mee helpen bepalen (He et al. 2010). De intestinale biota zou ook de groei van schadelijke bacteriën remmen, door bijvoorbeeld competitie met potentiële pathogenen voor nutriënten en receptoren en de productie van antimicrobiële stoffen (O'Hara and Shanahan 2006). 1.2 HET STUREN VAN DE DARMMICROBIOTA M.B.V. PROBIOTICA Bij een verstoring van de biologische processen die instaan voor homeostase van IECs kunnen zich bepaalde ziektebeelden ontwikkelen, bijvoorbeeld inflammatoire darmziekten. De oorzaak van die verstoring kan van genetische aard zijn, maar ook omgevingsfactoren kunnen een rol spelen (Goto and Kiyono 2012). Bij de onderbreking van de intestinale barrière kunnen bacteriën en voedselantigenen de submucosa bereiken en zo inflammatie induceren (Bermudez-Brito et al. 2012). Om deze verstoring van de darmmicrobiota op te vangen of te voorkomen kan de inname van probiotica aanbevolen zijn. Dit is het geval voor patiënten met chronische of acute darmproblemen. Probiotica kunnen daarnaast ook toegepast worden bij nosocomiale infecties of allergieën. Ook oudere personen, van wie de darmmicrobiota gewijzigd is, kunnen baat hebben bij de inname van probiotica (Fooks and Gibson 2002). 4

12 1.2.1 Algemeen Volgens de WHO zijn probiotica levende micro-organismen die indien in voldoende hoeveelheid ingenomen, gunstige gezondheidseffecten voor de gastheer als gevolg hebben (Bermudez-Brito et al. 2012). Deze micro-organismen kunnen de darm koloniseren en zijn bestand tegen chemische (maagzuur en galzouten) en fysische (temperatuur en druk) invloeden (Zuccotti et al. 2008). De geschikte dosis (zowel dosering als doseringsschema) is nog steeds voer voor discussie, maar zou echter wel belangrijk zijn om voldoende effectiviteit te bereiken. In de literatuur varieert de aanbevolen dosering voor orale toediening van 1 x 10 9 tot 1 x KVE per dosis en het doseerschema van 2 maal daags tot een maal wekelijks. Een dagelijkse inname van 10 9 levende cellen zou volstaan voor volwassenen (Zuccotti et al. 2008). Probiotica worden over het algemeen als veilig aanzien, toch is bijvoorbeeld een fungemie of bacteremie mogelijk. Deze bijwerkingen zijn echter zeldzaam en komen eerder voor bij patiënten met ernstige comorbiditeiten (Oudhuis et al. 2011). Alert blijven voor ongewenste bijwerkingen is echter raadzaam Oorsprong Probiotica kunnen geïsoleerd worden uit gefermenteerd voedsel, moedermelk of de darmmicrobiota zelf. Lactobacillus species komen het vaakst voor in gefermenteerd voedsel, maar ook Bifidobacterium species kunnen teruggevonden worden. In moedermelk zijn de melkzuurproducerende bacteriën Bifidobacterium en Lactobacillus aanwezig, alsook Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus en Enterococcus. Probiotica kunnen daarnaast ook uit de intestinale biota geïsoleerd worden. Niet enkel de darmmicrobiota van de mens is daarvoor geschikt, maar ook die van de rat, het varken en pluimvee (Fontana et al. 2013). Andere geschikte probiotische micro-organismen zijn bijvoorbeeld gisten zoals Saccharomyces boulardii (Kaur et al. 2002) Werking 5

13 Het gunstig effect van probiotica voor de gastheer is onder meer het gevolg van competitie met pathogenen voor nutriënten en adhesie aan epitheliale cellen, de productie van antimicrobiële metabolieten zoals ammoniak (NH 3 ) en vrije vetzuren, verandering van het intestinale leefmilieu en stimuleren van de aangeboren immuniteit van de gastheer (Saad et al. 2013). Figuur 1.2: Werkingsmechanismen probiotica (Saad et al. 2013) Ook het behoud van de darmwand integriteit heeft een positief effect. Dit door de genexpressie van genen betrokken bij tight junction signaling te sturen en mucussecretie te bevorderen. Probiotica kunnen beschadigingen van de darmwand herstellen. Daarnaast draagt de regulatie van de immuunrespons via het inhiberen van de productie van proinflammatoire cytokines bij tot het gezondheidbevorderend effect (Alvarez-Olmos and Oberhelman 2001, Bermudez-Brito et al. 2012, Saad et al. 2013). Boterzuur-producerende probiotische stammen zorgen voor een versnelde turnover van enterocyten en zijn in staat om de schadelijke invloed van carcinogene stoffen te beperken (Kaur et al. 2002) Klinisch gebruik: een overzicht van de belangrijkste toepassingen Een eerste vaak voorkomende toepassing is infectieuze diarree. Deze kent meestal een virale oorsprong en is zeer vaak zelflimiterend. De primaire behandeling bestaat eruit goed te hydrateren met ORS ter preventie van dehydratatie (Wolvers et al. 2010, BCFI folia 6

14 augustus 2005). Er zijn echter voldoende overtuigende argumenten dat vroege inname van een probioticum, zoals LGG, een meerwaarde voor de behandeling kan zijn. Er bestaat evidentie dat de duur van symptomen, alsook de frequentie van het ongemak verminderd wordt, voornamelijk bij waterige (virale) diarree (Zuccotti et al. 2008, Wolvers et al. 2010). Bij bacteriële, invasieve infecties is echter geen gunstig effect merkbaar (Kaur et al. 2002, Zuccotti et al. 2008). De inname van probiotica kan ook zijn nut hebben bij antibiotica-geassocieerde diarree (AAD). Dit is een vaak voorkomende ongewenste nevenwerking van een antibioticakuur waarbij niet enkel pathogenen, maar ook de nuttige microbiële gemeenschap van het colon wordt aangetast. AAD komt voor bij 5-35% van de patiënten en dit percentage is nog hoger in hospitaalmilieu, waar infecties met Clostridium difficile vaak voorkomen (McFarland 2008, Zuccotti et al. 2008, Saad et al. 2013). AAD is meestal zelflimiterend, toch tonen verschillende studies aan dat voor bepaalde risicogroepen de inname van probiotica tijdens een antibioticakuur het risico op AAD doet afnemen. Voornamelijk S. boulardii lijkt zeer effectief. Ook de inname van LGG vermindert de frequentie en duur van de diarree. Lactobacillus en Bifidobacterium stammen worden gebruikt om de incidentie van AAD ten gevolge van een Clostridium difficile infectie te verminderen (Zuccotti et al. 2008, Saad et al. 2013). Ook patiënten met inflammatoire darmziekten kunnen baat hebben bij de inname van probiotica. Inflammatory bowel disease (IBD) is een verzamelnaam voor inflammatoire darmziekten, zoals colitis ulcerosa (CU) en de ziekte van Crohn (CD). Bij analyse van een fecesstaal van IBD patiënten, worden afwijkingen gezien in de samenstelling van de microbiële gemeenschap. CD-patiënten hebben bijvoorbeeld significant meer Enterobacteriaceae en minder Bifidobacterium dan personen zonder darmproblemen (Seksik et al. 2001, Zuccotti et al. 2008). Het lijkt dus dat probiotica nuttig zouden kunnen zijn bij de behandeling van de ziekte. Waarschijnlijk kunnen ze de immuunrespons beïnvloeden door competitie met commensalen en pathogene bacteriën (Butterworth et al. 2008). De behandeling bij CD, alsook bij CU, bestaat uit het induceren van remissie van de ziekte, gevolgd door een onderhoudsbehandeling. De ziekte zelf is niet te genezen, maar er zijn geneesmiddelen, en dus ook probiotica, beschikbaar teneinde de aandoening onder controle te houden (Zuccotti et al. 2008, Saad et al. 2013). 7

15 In de darmmicrobiota van CU patiënten zijn minder Lactobacillus bacteriën aanwezig. Verschillende soorten probiotica zoals LGG, E. Coli en Bifidobacterium species werden getest op hun effectiviteit. In een studie werd aangetoond dat E. Coli Nissle 1917 effectief is in de onderhoudsbehandeling van colitis ulcerosa (Zuccotti et al. 2008, Saad et al. 2013). Voor de genoemde indicaties zoals infectieuze (reizigers)diarree en AAD zijn er voldoende studies waaruit voor bepaalde probiotica kan besloten worden dat ze uitkomst kunnen bieden (Wolvers et al. 2010). Het positief effect mag niet veralgemeend worden, want het is vaak species- en individu-afhankelijk (Fooks and Gibson 2002). Er kan gesteld worden dat er probiotica zijn die in bepaalde omstandigheden een gunstige invloed hebben bij sommige patiënten (Wolvers et al. 2010). Voor vele indicaties, zoals lactose intolerantie, irritable bowel syndroom, urineweginfecties, kankerpreventie, cardiovasculaire aandoeningen, IBD en allergieën, suggereren de data die op dit moment voorhanden zijn een gunstig effect. De resultaten zijn echter niet steeds consistent en goede RCT s zijn vrij zeldzaam. Vaak worden onvoldoende personen in de trials geïncludeerd en er is een grote variatie in leeftijd, dosis en hoe lang probiotica toegediend worden. Om een goed onderbouwd besluit te kunnen nemen zijn daarom meer (en betere) welomlijnde studies noodzakelijk (Wolvers et al. 2010, Friedman 2012). 1.3 OVERLEVING VAN PROBIOTICA DOORHEEN DE MAAG-DARM PASSAGE Om effectief te zijn, moeten probiotica processing, transport, stockage en ook de maag-darm passage in voldoende mate overleven. Probiotica kunnen tijdens processing aan oxidatieve en osmotische stress, extreme temperaturen en verhoogde druk blootgesteld worden. Tijdens de maag-darm passage, komen bacteriën terecht in het zuur milieu van de maag en in het duodenum komen ze in contact met galzouten. Deze stresstoestanden kunnen dodelijk zijn voor micro-organismen. Bacteriën hebben echter een aantal verdedigingsmechanismen waardoor ze hun weerstand tegen dergelijke extreme leefomstandigheden kunnen verhogen (Mills et al. 2011). De bacterie kan enerzijds een verhoogde productie van verschillende enzymen vertonen. Zo kan bijvoorbeeld de synthese van lipasen en proteasen voor het opruimen van 8

16 beschadigd celmateriaal verhoogd zijn. Ook superoxide dismutase en katalase voor het neutraliseren van reactieve zuurstofdeeltjes kunnen in hogere concentraties voorkomen. Protonpompen en decarboxylasen kunnen ph dalingen (deels) opvangen (Mills et al. 2011). Anderzijds zullen bacteriën blootgesteld aan stress vaak voorkomen in een niet- of toch zeer traag groeiende toestand met lage metabolische activiteit, waardoor ze viable but nonculturable (VBNC) worden. Sommige bacteriën, zoals Bacillus ssp., zullen zelfs endosporen vormen (Matin 1992). Bij gunstigere condities zoals in het colon, kunnen VBNC cellen opnieuw metabool actief en cultiveerbaar worden (Oliver 2005). Bovendien kunnen VBNC cellen, ondanks hun lage metabole activiteit, toch invloed hebben op industriële fermentatie en andere bioprocessen (Diaz et al. 2010). Bepaalde technieken kunnen helpen om de overleving van probiotica te verhogen. Voorbeelden hiervan zijn zuurstof ondoorlaatbare verpakkingen, micro-encapsulatie, toevoegen van anti-oxidantia, selectie van zuurresistente stammen (Sarkar 2010). Omdat het aantal levende bacteriën die het colon bereiken van essentieel belang is voor de effectiviteit van probiotica zijn geschikte, efficiënte viabiliteitstesten nodig om de overleving van probiotica te bestuderen en te verbeteren (Doherty et al. 2010) Conventionele methoden Traditioneel wordt de viabiliteit van micro-organismen nagegaan met uitplatingstechnieken. Hierbij worden dode bacteriën echter niet gedetecteerd, maar ook inactieve, beschadigde, rustende of levende niet-cultiveerbare cellen worden niet gezien. Het aandeel VBNC cellen kan een belangrijke fractie van de totale celpopulatie uitmaken (Breeuwer and Abee 2000). Daarnaast kunnen met de traditionele uitplatingen geen realtime metingen uitgevoerd worden (Doherty et al. 2010). Daarom zijn tijdrovende uitplatingen niet echt geschikt om op een efficiënte wijze de viabiliteit te bepalen. Het geeft eerder een indicatie over hoeveel cellen in de gegeven omstandigheden kunnen vermenigvuldigen (Ben Amor et al. 2002). Om dezelfde reden kan de telling van het totaal aantal microbiële cellen aanwezig in een waterig staal niet gebeuren met de conventionele uitplatingstechnieken. Toch kan het voor een bioloog belangrijk zijn om te weten hoeveel micro-organismen er in een bepaalde 9

17 natuurlijke leefomgeving aanwezig zijn. Als alternatief kan de telling van het totaal aantal microbiële cellen aanwezig in een waterig staal gebeuren met een microscoop. Deze werkwijze is echter eveneens tijdrovend en is bovendien weinig accuraat (Wang et al. 2010). Andere mogelijke technieken zoals het meten van de verandering van optische densiteit (OD) of geleidbaarheid zijn niet steeds toepasbaar. Bijvoorbeeld in het geval van een zeer lage densiteit, de aanwezigheid van veel abiotische partikels of gekleurde oplossing moet naar alternatieven gezocht worden (Muller and Nebe-von-Caron 2010) Flow cytometry als alternatieve methoden Cultuuronafhankelijke technieken waarbij een beter beeld van de dode, beschadigde en levende niet-cultiveerbare populatie wordt geschetst, zijn dus uiteraard gewenst. Alternatieven zijn gevoelige fluorescente technieken met een hoge resolutie. Bacteriën kunnen, voornamelijk na kleuring, geanalyseerd worden met flow cytometry (FCM). Flow cytometry is een krachtige techniek gebruikt voor de analyse van bacteriën op celniveau (Wang et al. 2010). FCM ontstond in de jaren zestig van de vorige eeuw. Meteen werd de techniek toegepast in het onderzoek van zoogdiercellen. Toch liet het gebruik ervan door microbiologen nog een tiental jaar op zich wachten, want zij waren er toen niet meteen van bewust welke enorme mogelijkheden FCM bood (Steen 2000). Gaandeweg evolueerde de techniek naar een zeer precieze en snelle methode voor het analyseren van verschillende intrinsieke en extrinsieke celparameters. Het is een populaire techniek voor onder andere het bestuderen van de celcycli en eigenschappen zoals grootte, complexiteit, viabiliteit en activiteit van bacteriën op celniveau, het opvolgen van micro-organismen in waterig milieu en het sorteren van cellen (Steen 2000). Mede door de grote beschikbaarheid van kleurstoffen, zijn de mogelijke toepassingen zeer uitgebreid. Toch zijn er nog beperkingen omwille van de vereiste uitgebreide data-analyse en de beperking tot de analyse van vloeibare stalen (Wang et al. 2010). 10

18 Figuur 1.3: De opbouw van de flow cytometer (Diaz et al. 2010) Algemeen bestaat een flow cytometer uit een krachtige lichtbron, een vloeistofsysteem, verschillende filters (bandpass, shortpass of longpass filters), photodiode en photomultiplier tube (PMT) detectoren, en tenslotte een systeem voor data processing. Een sample wordt in de flow cell geïnjecteerd in een vloeistofstroom, de sheath fluid. Door middel van hydrodynamische focusing worden cellen afzonderlijk doorheen de lichtbron (vaak een laser, maar een kwiklamp of xenonlamp zijn ook mogelijk) geleid. Welke lichtbron gebruikt wordt, is afhankelijk van welke golflengten nodig zijn voor de excitatie van de gebruikte fluorescente markers (Diaz et al. 2010). De intensiteit van de gegenereerde signalen (lichtverstrooiing of fluorescentie) is gerelateerd met functionele en structurele celparameters. Lichtverstrooiing geeft een idee over de intrinsieke eigenschappen van een cel. Het licht verstrooid in dezelfde richting van het laserlicht, wordt Forward Scatter (FSC) genoemd en is een indicatie voor de grootte van de cel. Side Scatter (SSC) en fluorescentie worden opgevangen in een hoek van 90 tegenover de laser. SSC is een maat voor de complexiteit van de cel (Diaz et al. 2010). Stofdeeltjes en andere abiotische partikels kunnen echter ook zorgen voor lichtverstrooiing. Daarom kunnen targetcellen best fluorescent gelabeld worden om specifieke detectie mogelijk te maken (Wang et al. 2010). Bovendien kunnen ook extrinsieke parameters bestudeerd worden na fluorescente kleuring (Diaz et al. 2010). De digitale data verkregen na meting met FCM kunnen gevisualiseerd worden in een histogram of scatter plot. Voorbeelden van scatter plots zijn het uitzetten van de FSC tegenover SSC of het plotten van twee fluorescente parameters. Uit deze laatste kunnen de fluorescente eigenschappen van de (bacteriële) cellen bepaald worden. Door gating kunnen 11

19 subpopulaties binnen een sample onderscheiden worden bij multiparameter analyse met verschillende fluorochromen (Diaz et al. 2010) Fluorescente kleuringen Cellen kunnen gekarakteriseerd worden aan de hand van hun celstructuur en functionaliteit, wat bestudeerd kan worden met behulp van fluorescente kleuringen. Er zijn veel verschillende fluorescente kleurstoffen voorhanden die elk bepaalde karakteristieken hebben. Hiermee kunnen verschillende fysiologische parameters van de cel, bijvoorbeeld membraanintegriteit en enzymactiviteit, weergeven worden (Diaz et al. 2010, Zotta et al. 2012). Ethidium bromide efflux pump activity EB is pumped from active cells SYBR Green total cell count proteins DNA/RNA DiBac 4 membrane potential Excluded from polarised cells esterase enzymes RedoxSensor TM reductase activity PI is excluded from intact cells Propidium iodide membrane integrity CFDA esterase substrate Figuur 1.4: Een overzicht van verschillende fluorochromen die kunnen gebruikt worden bij het bestuderen van cellen (Overgenomen uit een presentatie van Frederik Hammes) Totale kleuringen In het verleden werd aangetoond dat flow cytometry gecombineerd met kleuringen een waardig alternatief is voor de telling van het aantal microbiële cellen in een waterig staal (Hammes et al. 2008). Met deze techniek kan in enkele minuten het totaal aantal microbiële cellen in een staal bepaald worden. Het is belangrijk dat kleurstoffen voor deze toepassing alle cellen kleuren, ongeacht hun fysiologische toestand. Voorbeelden van geschikte kleurstoffen zijn SYTO9 en SYBR Green (Wang et al. 2010). SYBR Green is een groenfluorescerende kleurstof die een zeer grote affiniteit voor dubbelstrengig DNA vertoont, maar ook met een lagere affiniteit kan binden met enkelstrengig DNA of RNA (Marie et al. 1997). De binding van SYBR Green aan DNA 12

20 resulteert in een exponentiële toename van zijn fluorescentie. Niet gebonden aan DNA is de achtergrondfluorescentie van SYBR Gr verwaarloosbaar. De excitatie en emissie maxima van SYBR Green gebonden aan DNA zijn respectievelijk 497 nm en 520 nm (Invitrogen.com). Figuur 1.5: De excitatie en emissie maxima van SYBR Green zijn respectievelijk 497 nm en 520 nm. ( Het kleuren van cellen met SYBR Green is ph-afhankelijk. Om een optimale sensitiviteit te bereiken, ligt de ph van de kleurstofoplossing ideaal tussen 7,5 en 8. Daarom is een verdunning van SYBR Green in buffer vaak stabieler dan in een niet-gebufferde oplossing (Invitrogen.com). SYTO 9 is eveneens een groenfluorescerende stof en kleurt levende en dode Gram positieve en Gram negatieve bacteriën. De excitatie en emissie maxima van deze fluorochroom zijn respectievelijk 485 nm en 498 nm (Invitrogen.com). In vroegere studies werd gezien dat Gram negatieve cellen, die een cytoplasmatisch membraan hebben, minder efficiënt gekleurd worden door SYTO9. Door dit membraan te permeabiliseren met EDTA kan de kleuring verbeterd worden (Berney et al. 2007). Viabiliteitskleuring Voor vele wetenschappelijke toepassingen is het interessant om een onderscheid te kunnen maken tussen dode en levende cellen, hoewel intact en beschadigd correctere benamingen zijn. Met FCM in combinatie met fluorescente kleuringen is het mogelijk om de viabiliteit van micro-organismen te bestuderen (Wang et al. 2010). Traditionele uitplatingsmethoden zijn minder geschikt om de viabiliteit te bestuderen, zeker van bacteriën blootgesteld aan stress. Deze bacteriën zijn vaak beschadigd waardoor ze niet meer groeien op vaste bodems, maar later toch terug functioneel kunnen zijn. Daarom geven uitplatingen vaak een onderschatting van de viabiliteit (Shen et al. 2010). Welk 13

21 fluorochroom gebruikt wordt, is afhankelijk van de bestudeerde celfunctie, bijvoorbeeld membraan integriteit en membraanpotentiaal (Muller and Nebe-von-Caron 2010). Een vaak gebruikte kleuring is de Live/Dead kleuring. Hierbij worden cellen gekleurd met propidium iodide (PI) en membraanpermeabele groene fluorochromen zoals SYTO9 of SYBR Green. PI is een roodfluorescerende kleurstof die kan binden tussen de basenparen van DNA en RNA. Gebonden aan DNA neemt de fluorescentie van PI 20 tot 30 keer toe. PI heeft een excitatie en emissie maximum van respectievelijk 535 nm en 617 nm (Invitrogen.com). PI geeft een indicatie over de integriteit van het cytoplasmatisch celmembraan: terwijl SYBR Green alle cellen in een staal groen kleurt, dringt PI enkel in de cellen binnen waarvan het membraan permeabel is. In de cel bindt PI stoechiometrisch aan het DNA (Wang et al. 2010). Hoe hoger de rode fluorescentie, hoe meer beschadigd het celmembraan en hoe lager de viabiliteit. Bovendien wordt de groene kleuring in de aanwezigheid van PI verminderd: de energie van de geëxciteerde donor (SYBR Green) wordt getransfereerd naar de acceptor molecule (PI) volgens het fluorescentie resonantie energie transfer (FRET) principe (Falcioni et al. 2008). Door overlap van het emissie spectrum van SYBR Green en het excitatie spectrum van PI (Figuur 1.6), wordt het emissielicht van SYBR Green bij dode of beschadigde cellen deels gebruikt als excitatielicht voor PI. Dit resulteert in een verlaagde groene en een verhoogde rode fluorescentie bij dode of beschadigde cellen. Figuur 1.6: De excitatie en emissie maxima van PI zijn respectievelijk 535 nm en 617 nm. Het emissie maximum van SYBR Green ligt rond 520 nm, in dezelfde range als het excitatiemaximum van PI. Het emissielicht van SYBR Gr kan gebruikt worden als excitatielicht voor PI volgens het FRET principe. ( Fluorescence spectra viewer) 14

22 Dergelijke analyses zijn interessant voor slapende of beschadigde cellen die opnieuw gereactiveerd worden (Diaz et al. 2010). Er kan dus niet enkel een dode en levende populatie onderscheiden worden, maar ook tussenliggende toestanden kunnen geobserveerd worden. Toch is de interpretatie hiervan niet makkelijk. Daarom worden best meerdere parameters gebruikt voor de analyse van de viabiliteit (Berney et al. 2007). Activiteitskleuring Verschillende fluorochromen zijn beschikbaar voor analyse van de cellulaire enzymatische activiteit. Een niet-fluorescerende kleurstof die door intracellulaire enzymen van de cel wordt omgezet tot een fluorescerende verbinding is zeer geschikt voor dergelijke toepassingen (Muller and Nebe-von-Caron 2010). Voorbeelden van dergelijke fluorochromen zijn fluoresceïne diacetaat (FDA), carboxyfluoresceine diacetaat (CFDA) en 5- cyano-2,3 ditolyl tetrazolium chloride (CTC) (Diaz et al. 2010). Deze laatste is een indicator voor de respiratoire activiteit van de cel (Wang et al. 2010). Gezonde, levende respireerders nemen de kleurstof op en reduceren CTC intracellulair via de elektronentransportketen tot een rood fluorescerende, onoplosbare component (Gasol and Aristegui 2007). Het lipofiele en op zich niet-fluorescerende CFDA dringt de cel binnen en wordt intracellulair omgezet door niet-specifieke esterasen naar een polaire, fluorescerende, membraan impermeabele component, carboxyfluoresceine. Dit impliceert dat cellen met een intacte esterase-activiteit en intact celmembraan de kleurstof kunnen weerhouden en dat dode cellen, zonder enzymactiviteit, niet zullen gekleurd worden (Ben Amor et al. 2002). Vaak wordt CFDA gebruikt in combinatie met PI om een onderscheid te maken tussen dode en levende cellen (Zotta et al. 2012). De optimale concentratie CFDA voor cel labeling is afhankelijk van het te bestuderen celtype (Wang et al. 2005). Glutaraldehyde kan de efficiëntie van celkleuring met CFDA verhogen (Morono et al. 2004). FDA is minder geschikt dan het meer hydrofobe CFDA omdat FDA een minder sterke fluorescentie oplevert en minder goed vastgehouden wordt door de cel (Diaz et al. 2010). Andere voorbeelden van bruikbare fluorochromen, die een indicatie zijn voor celactiviteit, zijn 2-[N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amion]-2-deoxy-D-glucose (2-NDBG) en ethidium bromide (EB). Deze verbindingen zijn respectievelijk een indicator voor de glucose opname van de cel en de activiteit van effluxpompen (Wang et al. 2010). 15

23 Optimalisatie kleuring en flow cytometrische analyse Om een duidelijke, goed interpreteerbare meting te verkrijgen zijn een goede staalvoorbereiding en een geschikt kleuringsprotocol belangrijk. Daarom moeten waterige stalen vooraf vaak verdund worden. Uiteraard mogen de gebruikte verdunningsmedia geen invloed hebben op de viabiliteit van de micro-organismen. Voorbeelden van oplossingen gebruikt om bacteriële suspensies te verdunnen zijn fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en fysiologische oplossing. Naast de staalvoorbereiding is ook een goede kleuring belangrijk. Het opstellen van een ideaal kleuringsprotocol die een hoge fluorescentie intensiteit oplevert, wordt bemoeilijkt door verschillende factoren (Zotta et al. 2012). Onder andere incubatietijd en temperatuur na kleuring, al dan niet voorbehandelen met EDTA en kleurstofconcentratie kunnen de efficiëntie van fluorescente kleuring verminderen (Miyanaga et al. 2007). Daarnaast kan ook de fysiologische toestand van de bacterie een invloed hebben (Berney et al. 2007). In de literatuur zijn reeds zeer veel verschillende protocols beschreven voor verschillende kleuringen van allerhande soorten bacteriën (Jernaes and Steen 1994, Holm and Jespersen 2003, Miyanaga et al. 2007). Toch werd in het verleden gezien dat een enkel protocol niet geschikt is voor de fluorescente kleuring van alle bacteriestammen (Zotta et al. 2012). Vaak wordt tijdens de meting een 96-well plaat gebruikt, om een snelle en efficiënte flow cytometrische analyse mogelijk te maken. Tussen de eerste en de laatste meting verstrijkt echter een 2-tal uur. De voorwaarde om een correcte meting te krijgen is uiteraard dat de tijd geen invloed heeft op de kleuring en de fysiologische toestand van de bacterie. 1.4 PHENOTYPING VAN PROBIOTICA Het is bij onderzoek naar en productie van probiotica vaak nodig om een authenticiteitscontrole uit te voeren op de isolaten waarmee gewerkt wordt. Voor de identificatie van pure bacterieculturen zijn vandaag de dag fenotypische en moleculaire technieken beschikbaar. Fenotypische methoden worden vaak gebruikt voor een 16

24 preliminaire beschrijving van micro-organismen. De combinatie van morfologische, fysiologische en biochemische eigenschappen van een bacterie kan vaak al duidelijkheid brengen. Onder morfologische eigenschappen wordt bijvoorbeeld de grootte, vorm en kleur van de bacterie verstaan. Fysiologische eigenschappen zijn incubatietemperatuur, gevoeligheid voor ph en zuurstoftolerantie. Enzymactiviteit, gasproductie en metabolisme zijn voorbeelden van biochemische parameters (Donelli et al. 2013). Voor bijkomende informatie worden dikwijls moleculaire technieken gebruikt. Een eerste mogelijkheid is random amplified polymorphic DNA assay (RAPD). Bij deze techniek worden korte niet-specifieke primers gebruikt die met het chromosomale DNA kunnen hybridiseren bij een lage annealing temperatuur. Het visualiseren van de geamplificeerde PCR producten met agarose gel elektroforese (AGE), levert een bandenpatroon op typisch voor een bacteriestam. Een techniek met een hogere resolutie en gevoeligheid dan RAPD is amplified fragment length polymorphism (AFLP). DNA fragmenten verkregen na vertering van genomisch DNA door restrictie-enzymen, worden selectief geamplificeerd. Dit levert opnieuw een typisch bandenpatroon op na visualisatie met AGE. Dit maakt de methode geschikt voor het detecteren van polymorfismen in DNA (Donelli et al. 2013). Ook het verschil tussen rrna van verschillende bacteriële stammen kan helpen met de classificatie. Ribotyping wordt de laatste decennia vaak gebruikt bij de differentiatie van Lactobacilli (Donelli et al. 2013). Daarnaast kan denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE) helpen bij het onderscheiden van bacteriën. DGGE van geamplificeerde fragmenten levert een karakteristiek bandenpatroon op. Deze techniek wordt ook vaak gebruikt voor identificatie van Lactobacillus stammen (Donelli et al. 2013). Toch zijn al deze technieken omwille van hun DNA/RNA extractiestap tijdrovend en duur. Daarom zijn alternatieven voor een snelle identificatie gewenst. Als alternatief wordt flow cytometry in combinatie met een fingerprinting pipeline voorgesteld. In het verleden toonden preliminaire experimenten reeds aan dat het mogelijk is om twee E. coli stammen van elkaar te onderscheiden met deze methode (Figuur 1.7). 17

25 Figuur 1.7: Preliminaire experimenten toonden aan dat 2 E. coli stammen konden onderscheiden worden met behulp van flow cytometric fingerprinting. De Roy et al. ontwikkelden een FCM methode die het mogelijk maakt om microbiële gemeenschappen objectief te vergelijken. Ze slaagden erin om verschillende watermerken van elkaar te onderscheiden, onbekende stalen te classificeren en verschuivingen in de microbiële samenstelling waar te nemen (De Roy et al. 2012). De subjectieve manier waarop een histogram of een dot plot gewoonlijk wordt geïnterpreteerd (bijvoorbeeld door visuele interpretatie), blijft een zwakke plek van flow cytometry. Ook de visuele beoordeling van FCM data is vaak niet eenvoudig. Met de genoemde, nieuw ontwikkelde methode wordt een subjectieve beoordeling van de FCM data overbodig: de data werden via een statistische methode vergeleken en geanalyseerd. De betrouwbaarheid van deze nieuwe werkwijze werd geconfirmeerd door de resultaten te vergelijken met die van PCR-DGGE. Uiteraard moet steeds volgens een gestandaardiseerd protocol gewerkt worden om vergelijkingen tussen verschillende metingen mogelijk te maken. Om de genoemde methode te kunnen gebruiken bij het classificeren van onbekende stalen dient het systeem eerst getraind te worden. Dit wil zeggen dat alle micro-organismen die onderscheiden moeten worden, vooraf geanalyseerd worden. Van die micro-organismen wordt een databank aangelegd van FCM metingen. Daarna kunnen data van nieuwe, onbekende stalen vergeleken worden met de data uit de database (De Roy et al. 2012). 18

26 2 OBJECTIEVEN Probiotica zijn een veelbelovende therapeutische behandeling bij vele ziektebeelden. Om hun overleving tijdens onder meer processing en de maag-darm passage te verbeteren, is een snelle en nauwkeurige techniek nodig om de viabiliteit van micro-organismen te bestuderen. Fluorescente kleuringen in combinatie met flow cytometry wordt daarom gebruikt om de viabiliteit van micro-organismen te analyseren. Er is echter geen eenduidig protocol voorhanden voor het kleuren en meten van veel gebruikte probiotische genera zoals Bifidobacterium en Lactobacillus. Daarom is het doel om in dit onderzoek de staalvoorbereiding en kleuring voor de veelgebruikte probiotische stammen Bifidobacterium longum en Lactobacillus rhamnosus GG te optimaliseren. Tijdens staalvoorbereiding worden bacteriële suspensies vaak verdund. Welk verdunningsmedium het meest geschikt is, fysiologische oplossing of fosfaatgebufferde zoutoplossing, wordt onderzocht aan de hand van de evolutie van de gemeten celconcentratie (events/µl) in de tijd. Na verdunnen kan de kleurstof aan het staal toegevoegd worden. Het staal moet vervolgens gedurende enige tijd geïncubeerd worden om de bacterie de kans te geven de kleurstof op te nemen. Een optimale incubatietijd bij een correcte incubatietemperatuur resulteert in de gewenste, maximale fluorescentie-intensiteit. Een continue meting bij constante temperatuur wordt aangewend om de ideale incubatietijd en temperatuur te bepalen. Bij het onderzoek naar en productie van probiotica is het nodig om de isolaten waarmee gewerkt wordt regelmatig ter controle te identificeren. De hiervoor beschikbare technieken zijn tijdsrovend en duur. Preliminaire experimenten toonden aan dat flow cytometrische fingerprinting mogelijk een alternatief is om verschillende stammen van elkaar te onderscheiden. Daarom bestaat het tweede deel van deze scriptie enerzijds uit het opbouwen van een databank van flow cytometrische data van 29 verschillende Lactobacillus stammen, die behoren tot 5 clusters. Anderzijds wordt met een statistische pipeline nagegaan of flow cytometrische fingerprinting inderdaad geschikt is om Lactobacillus stammen te differentiëren. Er wordt bijvoorbeeld verwacht dat de verschillende clusters van elkaar kunnen onderscheiden worden. Daarnaast wordt nagegaan of het mogelijk is om binnen een 19

27 cluster verschillende groepen, of misschien zelfs binnen een groep stammen te onderscheiden. 20

28 3 MATERIAAL EN METHODEN 3.1 GROEI- EN VERDUNNINGSMEDIA LGG werd opgegroeid op MRS Agar (Oxoid, Basingstoke, UK) of in MRS Broth (Oxoid, Basingstoke, UK). De samenstelling van het Bifidobacterium medium wordt weergegeven in Tabel 3.1. Tabel 3.1: GROEIMEDIA BIFIDOBACTERIUM ( Speciaal pepton (Oxoid, Basingstoke, UK) Oplosbaar zetmeel (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) NaCl (Analar Normapur VWR, Leuven, België) Cysteïne hydrochloride (Calbiochem EMD Millipore, San Diego, USA) Glucose (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Duitsland) Agar (indien vast medium) (Oxoid, Basingstoke, UK) Gedestilleerd water 23 g 1,0 g 5,0 g 0,30 g 5,0 g 15 g ad 1,0 L Voor het verdunnen van bacteriële suspensies wordt fosfaat gebufferde zoutoplossing (Tabel 3.2) en fysiologische oplossing (0,9% NaCl) gebruikt. Tabel 3.2: SAMENSTELLING VAN FOSFAATGEBUFFERDE ZOUTOPLOSSING Kaliumdiwaterstoffosfaat (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Duitsland) Dikaliumwaterstoffosfaat (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Duitsland) NaCl (Analar Normapur VWR, Leuven, België) Gedestilleerd water 6,8 g 8,8 g 8,5 g ad 1,0 L 3.2 OPGROEIEN VAN BACTERIËN Bifidobacterium longum en Lactobacillus rhamnosus GG (LMG 18243) werden uit de glycerolstock bij -80 C overgeënt op vaste (steriele) agarbodems. De Bifidobacterium agarplaten werden geïncubeerd in een candle jar bij 37 C. De zuurstof initieel aanwezig in de candle jar werd tijdens de anaerobic cycle vervangen door een zuurstofvrij gasmengsel (90% N 2, 10% CO 2 ) met het Anoxomat toestel (Mart Microbiology B.V., Drachten, Nederland). 21

29 Van de agarplaten werden vervolgens kolonies overgeënt naar 10 ml vloeibaar medium. Voor B. longum gebeurde de overenting naar vloeibaar medium in Hungate tubes die nadien geflushed werden met N 2 /CO 2 -mengsel. Na nogmaals overenten van vloeibaar naar vloeibaar medium was de cultuur geschikt voor staalname voor FCM meting. Dagelijks werd 1 ml cultuur overgeënt naar 10 ml (1/10 v/v) zuiver vloeibaar medium. Bij staalname, steeds na 20 uur opgroeien, werd de optische densiteit (OD) gemeten. Na 20 uur Optische densiteit Figuur 3.1: Het opgroeien en staalvoorbereiding van B. longum en L. rhamnosus GG. Wekelijks werd een PCR uitgevoerd op enkele zuivere kolonies (Tabel 3.3). Tabel 3.3: DETAILS PCR Bacterie Primers Temperatuurprogramma Bifidobacteria BIF164F, BIF662R 7 95 C; [1 94 C, 1 62 C, 2 72 C] x 35; C Lactobacilli SBMAB0159F, SBLAB667R 7 95 C; [1 94 C, 1 56 C, 2 72 C] x 35; C De Lactobacillus stammen (Figuur 3.2), afkomstig uit de BCCM/LMG collectie, werden uit de glycerolstock bij -80 C overgeënt op vaste MRS agarbodems. Na drie dagen werden kolonies opgepikt en overgeënt naar vloeibaar MRS medium (in viervoud). Dagelijks werd overgeënt naar zuiver vloeibaar MRS medium in een verhouding van 1/10 v/v. Staalname 22

30 gebeurde steeds na 20 uur opgroeien. Anaerobe stammen (LMG 8151, LMG 9433, LMG 11428, LMG 11430, LMG 6400, LMG 10775, LMG 12166, LMG 18030) werden geïncubeerd bij 37 C in anaerobe jars met Anaerogen (Oxoid, Basingstoke, UK). De andere stammen werden allen aeroob geïncubeerd bij 28 C, met uitzondering van R32689 die geïncubeerd werd bij 37 C. L. rhamnosus LMG 6400 LMG LMG LMG R L. rhamnosus cluster L. casei LMG 6904 L. zeae LMG LMG LMG Lactobacillus L. brevis L. salivarius L. paracasei LMG 6906 LMG 7761 LMG LMG LMG LMG 9477 LMG 9476 LMG LMG LMG LMG LMG 9191 R LMG 9200 L. farciminis R R LMG 9433 L. acidophilus LMG 8151 LMG LMG Figuur 3.2: Alle 29 Lactobacillus stammen gebruikt voor flow cytometrische fingerprinting 3.3 FLOW CYTOMETRY Kleuring en meetprotocol De bacteriën werden gemeten met flow cytometry na kleuring met (i) SYBR Gr of (ii) SYBR Gr en PI. De werkoplossing van SYBR Gr en PI werd gemaakt door PI (20 mm in 23

31 dimethyl sulfoxide (DMSO), LIVE/DEAD BacLight Kit, Invitrogen) 50 keer te verdunnen en SYBR Gr (10.000x geconcentreerd in DMSO, Invitrogen) 100 keer te verdunnen in 0,22 µm gefilterd DMSO. Stalen, 1/1000 v/v verdund in 0,22 µm gefilterd PBS of FO oplossing (afhankelijk van het experiment), werden gekleurd met 10 µl/ml werkoplossing en vervolgens in het donker geïncubeerd bij 37 C gedurende 15 minuten. De metingen werden uitgevoerd met een BD Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Erembodegem, België). Groene en rode fluorescentie werden respectievelijk in fluorescentie kanaal FL1 (533/30 nm) en FL3 (670 nm LP ) gemeten. Als sheath fluid werd Milli-Q water gebruikt. De stalen werden, tenzij anders vermeld, gedurende 30 seconden gemeten op medium snelheid, bij een threshold van FL1- H<500 en FSC-H< FCM meting PBS versus FO De metingen uitgevoerd voor zowel LGG als B. longum, worden weergegeven in Figuur 3.3. Er werd steeds een niet afgedood en afgedood staal (12 minuten op 75 C) gemeten. Elke meting werd 8 keer herhaald. Na de horizontale meting van elke rij werd gedurende 1 minuut gespoeld aan hoge snelheid (flow rate 66 µl/min) met 5% hypochlorietoplossing en gefilterd Evian. De 5% hypochlorietoplossing werd gemaakt door hypochloriet stockoplossing (Sodium hypochlorite solution (purum, 10%), Sigma-Aldrich, Schnelldorf) 20 keer te verdunnen in 0,22 µm gefiltreerd Evian. 24

32 5% hypochlorietoplossing Gefiltreerd Evian Gefiltreerd Evian LGG/B. longum Niet afgedood Afgedood PBS FO PBS FO SYBR Gr SYBR Gr+PI SYBR Gr SYBR Gr+PI SYBR Gr SYBR Gr+PI SYBR Gr SYBR Gr+PI Figuur 3.3: Proefopzet bij de keuze tussen PBS en FO Incubatietijd en temperatuur LGG en B. longum, gekleurd met SYBR Gr of SYBR Gr+PI, werden gedurende 1 uur continu gemeten op medium snelheid met een threshold van FL1-H<500 en FSC-H<5000. Zowel een levend als afgedood (12 minuten op 75 C) staal werd gemeten in het donker (m.b.v. zilverpapier) bij kamertemperatuur, 37 C of 50 C. De temperatuur werd constant gehouden met behulp van een warmwaterbad verwarmd door een magnetische roerder met verwarmingsplaat. 25

33 Figuur 3.4:Opstelling voor een continue meting met FCM. Het staal werd gemeten in het donker (zilverpapier) bij een constante temperatuur. De temperatuur werd constant gehouden met behulp van een warmwaterbad verwarmd door een magnetische roerder met verwarmingsplaat Fingerprinting Na staalname werden de stammen 1/1000 verdund in PBS en gekleurd met (i) SYBR Gr of (ii) SYBR Gr en PI (10 µl/ml werkoplossing). Vervolgens werden de stalen 12 minuten geïncubeerd in het donker bij 37 C. De stalen werden gemeten met de BD Accuri C6 flow cytometer. De groene en rode fluorescentie werden opnieuw in fluorescentie kanaal FL1 en FL3 gemeten en als sheath fluid werd terug Milli-Q water gebruikt. Alle stalen werden gedurende 30 seconden gemeten op medium snelheid bij een treshold van FL1-H<500 en FSC-H< Statistische analyse van flow cytometrische data De statistische analyse van de flow cytometrische data werd uitgevoerd zoals beschreven door De Roy et al. (2012). De flow cytometrische data van K verschillende groepen (K=29 Lactobacillus stammen) worden vergeleken. Eerst wordt een kwantitatieve multi-dimensionele fingerprint gecreëerd en vervolgens worden hieruit de eigenschappen gehaald die representatief zijn voor de verschillen tussen de Lactobacillus stammen. 26

34 Uit de FCM distributie wordt een kwantitatieve fingerprint afgeleid met behulp van het recursief probability binning (PB) algoritme voor FCM data behorend tot de Bioconductor package FlowFP. Alle FCM data (pool van alle cellen van de verschillende stalen gemeten met FCM) wordt samengenomen en verdeeld in twee bins die elke evenveel cellen bezitten. Deze twee bins worden elk opnieuw onderverdeeld in twee bins met evenveel cellen. De stap wordt steeds herhaald zodat er na l onderverdelingen 2 l bins zijn met variabele grootte maar telkens met eenzelfde aantal cellen. Op deze manier wordt de FCM data weergegeven aan de hand van rechthoekige bins met een verschillende vorm en grootte. Deze bins fungeren als model voor het maken van de fingerprint van de individuele stalen. Hiervoor wordt voor elke Lactobacillus stam afzonderlijk het aantal cellen per bin bepaald en weergegeven, dit wordt ook de fingerprint genoemd. In de tweede stap wordt een dimensiereductie van de fingerprint doorgevoerd met behulp van principal component analyse (PCA) en nadien Fisher discriminant analyse (FDA). Dit heeft als doel om uit te maken hoe de K verschillende groepen van elkaar verschillen. PCA geeft de meest nauwkeurige voorstelling van de data weer in een lagere dimensie, zodat de variatie tussen de K groepen maximaal is. FDA drukt de verschillen tussen de K groepen uit door de input variabelen te projecteren op discriminanten en wel op die manier dat ze bruikbaar zijn voor data classificatie. De discriminanten zijn die lineaire projecties van de input variabelen die de variatie tussen de K groepen maximaal uitdrukt tegenover de variatie binnen de K groepen. In 1 dimensie kan een goed onderscheid gemaakt worden indien de variatie tussen de K groepen groot is tegenover de variatie binnen de K groepen. Hoe sterk de discriminant in staat is om de variatie binnen de K groepen weer te geven kan kwantitatief uitgedrukt worden. 27

35 4 RESULTATEN 4.1 LIVE/DEAD-ASSAY: SYBR GR EN SYBR GR+PI Verdunnen van bacteriële suspensies Om een ideale, niet te hoge event rate (events/s) te bekomen tijdens FCM metingen, is het nodig om bacteriële suspensies te verdunnen. De event rate ligt bij voorkeur rond 1000 events/s, maar mag zeker niet groter zijn dan 5000 events/s. Dit zou er voor zorgen dat er te veel cellen tegelijk de laser passeren, wat een minder nauwkeurig meetresultaat als gevolg heeft. De verdunningsoplossing mag geen invloed hebben op de bacteriële cellen. De gemeten celconcentratie in de tijd is hier een weerspiegeling van en is bij voorkeur constant. Er werd nagegaan welke oplossing, PBS of FO, het meest geschikt is door de totale celconcentratie (cellen/µl) en de celconcentratie van levende en dode cellen (bij SYBR Gr+PI) uit te zetten in functie van de tijd. Zowel LGG als B. longum werden verdund in PBS en FO. Alle stalen werden gekleurd met SYBR Gr of SYBR Gr+PI. Elke meting werd acht keer herhaald, zodat het effect van PBS en FO op de celconcentratie in de tijd kon gevolgd worden. Er werd eveneens een afgedood staal (12 min op 75 C) gemeten, om een goed onderscheid te kunnen maken tussen dode en levende cellen. Tijdens de meting van B. longum in PBS oplossing (Figuur 4.1), fluctueerde de celconcentratie wel, maar globaal bekeken bleef deze vrij constant in functie van de tijd. Dit wordt weerspiegeld door de rico s van de trendlijnen die een kleine absolute waarde hebben: 0, -2, -1, 0 (Tabel 4.1). Een uitzondering was de meting van het niet-afgedood staal gekleurd met SYBR Gr+PI, waar de celconcentratie van de levende cellen daalde in functie van de tijd (rico=-6). Ook tijdens de laatste 20 minuten van de meting van het afgedood staal gekleurd met SYBR Gr, verminderde de celconcentratie sterk. Dit resulteerde in een trendlijn met rico = -7. Tijdens de meting van B. longum in FO (Figuur 4.2) was een dalende trend te zien van de celconcentratie in de tijd (rico -5). Enkel de celconcentratie van de dode cellen bleef meer constant (rico = -2; rico = 0). Zeker tegenover de meting in PBS, daalde de celconcentratie in FO algemeen gezien veel sneller. De celconcentratie van levende en dode 28

36 cellen tijdens de meting van het afgedood staal was zeer gelijkaardig als tijdens de meting van het niet-afgedood staal. Figuur 4.1: De celconcentratie in functie van de tijd tijdens de meting van B. longum in PBS. De totale celconcentratie en de celconcentratie van de levende en dode cellen ifv de tijd blijft vrij constant (grafiek B,C). Tijdens de meting van het onbehandeld staal gekleurd met SYBR Gr+PI, daalt de celconcentratie van de levende cellen in de tijd (grafiek A). De celconcentratie daalt ook tijdens de laatste 20 minuten van de meting van het afgedood staal gekleurd met SYBR Green (grafiek D). Figuur 4.2: De celconcentratie in functie van de tijd tijdens de meting van B. longum in FO. Algemeen is duidelijk een dalende trend van de celconcentratie in de tijd te zien. Enkel de celconcentratie van de dode cellen blijft meer constant (C). 29

37 Een gelijkaardige vaststelling kon gedaan worden bij LGG. Tijdens de meting van LGG in PBS (Figuur 4.3) daalde de celconcentratie licht, maar bleef de celconcentratie in de tijd constanter dan tijdens metingen in FO (Figuur 4.4). Dezelfde vaststellingen konden ook gedaan worden op basis van richtingscoëfficiënt (rico) van de trendlijn. Deze worden weergegeven in Tabel 4.1. Figuur 4.3: De celconcentratie in functie van de tijd tijdens de meting van LGG in PBS. De celconcentratie blijft globaal gezien vrij constant in de tijd, toch is ook een lichte daling te zien tijdens de meting van de stalen gekleurd met SYBR Green (grafiek B,D). Figuur 4.4: De celconcentratie tijdens de meting van LGG in FO. De celconcentratie tijdens de metingen van LGG in FO daalt veel sterker in vergelijking met de metingen van LGG in PBS. 30

38 B. longum in PBS B. longum in FO LGG in PBS LGG in FO Tabel 4.1: RICHTINGSCOËFFICIËNTEN VAN DE TRENDLIJN DIE DE EVOLUTIE VAN DE CELCONCENTRATIE IFV DE TIJD BESCHRIJFT Niet afgedood SYBR Gr+PI Celconcentratie levende cellen Niet afgedood SYBR Gr+PI Celconcentratie dode cellen Afgedood SYBR Gr+PI Celconcentratie levende cellen Afgedood SYBR Gr+PI Celconcentratie dode cellen Niet afgedood SYBR Gr Celconcentratie totaal cel aantal Afgedood SYBR Gr Celconcentratie totaal cel aantal Hoe meer de rico afneemt, hoe sterker de gemeten celconcentratie een dalende trend vertoont. Vrijwel overal is de rico van de metingen in FO kleiner tegenover PBS Incubatietijd en temperatuur De volgende stap in de optimalisatie van het kleuringsprotocol, is het bepalen van de ideale incubatietijd en temperatuur. Daarvoor werden stalen gekleurd met SYBR Gr of SYBR Gr+PI en gedurende 1 uur continu gemeten bij een constante temperatuur (kamertemperatuur, 37 C of 50 C). Er werd een continue meting uitgevoerd om de fluorescentie intensiteit in de tijd op te volgen. De ideale incubatietijd en temperatuur is deze waarbij de fluorescentie intensiteit maximaal is. Daarom werd de mediaan van de fluorescentie uitgezet in functie van de tijd. Tijdens de continue meting bij kamertemperatuur van B. longum gekleurd met SYBR Gr nam de intensiteit van de groene fluorescentie langzaam toe. Bij 37 C steeg de fluorescentie intensiteit veel sneller en werd reeds een maximum bereikt na 10 minuten. 31

39 10 Figuur 4.5: De mediaan van de groene fluorescentie intensiteit in functie van de tijd tijdens de meting van B. longum gekleurd met SYBR Gr bij kamertemperatuur en 37 C. De maximale intensiteit bij 37 C (na 10 minuten) wordt sneller bereikt dan bij kamertemperatuur. B. longum gekleurd met SYBR Gr+PI (Figuur 4.6) werd gedurende 1 uur gemeten bij kamertemperatuur, 37 C en 50 C. Opnieuw steeg de fluorescentie intensiteit bij kamertemperatuur langzaam. De maximale intensiteit werd bij 50 C en 37 C nagenoeg tegelijk bereikt en dit na 15 minuten. De fluorescentie-intensiteit bleef bij 50 C vrij constant tot het einde van de meting, terwijl de intensiteit bij 37 C al na 20 minuten afnam Figuur 4.6: De evolutie van de groene en rode fluorescentie in de tijd, tijdens de continue meting van B. longum gekleurd met SYBR Gr+PI bij kamertemperatuur, 37 C en 50 C. De maximale intensiteit wordt bij 37 C en 50 C even snel bereikt en dit na 15 minuten. Bij 50 C blijft zowel de groene als de rode fluorescentie langer constant. In Figuur 4.7 wordt de intensiteit van de groene fluorescentie intensiteit afgebeeld tijdens de meting van LGG gekleurd met SYBR Gr. De groene fluorescentie-intensiteit is in de grafiek maximaal na 15 minuten. Dit punt is vermoedelijk een outlier. Toch wordt verwacht dat de maximale intensiteit wordt bereikt tussen 10 en 20 minuten. Opmerkelijk is wel dat de fluorescentie intensiteit tijdens de meting van LGG tot 3 keer lager is dan tijdens de meting van B. longum. 32

40 15 Figuur 4.7: De mediaan van de groene fluorescentie in functie van de tijd tijdens de meting van LGG gekleurd met SYBR Gr bij 37 C. Het punt waarop de maximale groene fluorescentie-intensiteit bij deze grafiek bereikt wordt (na 15 minuten) is waarschijnlijk een outlier. Toch wordt verwacht dat de maximale intensiteit bereikt wordt tussen 10 en 20 minuten. De intensiteit van de groene en rode fluorescentie, tijdens de continue meting van LGG gekleurd met SYBR Gr+PI (Figuur 4.8), was maximaal na respectievelijk 15 en 20 minuten. Opnieuw was de intensiteit veel lager dan tijdens dezelfde meting van B. longum Figuur 4.8: De evolutie van de groene en rode fluorescentie afgebeeld in functie van de tijd tijdens de meting van LGG gekleurd met SYBR Gr+PI bij 37 C. De maximale fluorescentie wordt bereikt na respectievelijk 15 en 20 minuten. 4.2 FLOWCYTOMETRISCHE FINGERPRINTING VAN LACTOBACILLUS STAMMEN In het tweede deel van deze thesis is het doel om na te gaan of het mogelijk is om Lactobacillus stammen te onderscheiden met behulp van flow cytometrische fingerprinting. Hiervoor werden 4 onafhankelijk stalen van 29 verschillende Lactobacillus stammen na kleuring met SYBR Gr+PI geanalyseerd met flow cytometry. Gedurende een halve minuut werden data geregistreerd in het SS, FL1 (groene fluorescentie) en FL3 (rode fluorescentie) kanaal. 33

41 Met behulp van het probabilistic binning (PB) algoritme werden voor alle stammen kwantitatieve fingerprints gecreëerd. Daarvoor werd de pool van de cellen van alle stalen (4 keer 29 stalen) onderverdeeld in bins, zodat elke bin even veel cellen bevat (Figuur 4.9). Dit resulteerde in een voorstelling van de FCM data aan de hand van rechthoeken met een verschillende vorm en grootte. Figuur 4.9: De onderverdeling van alle data in bins zodat elke bin even veel cellen bevat. Vervolgens werd het aantal cellen van elke stam aanwezig in elke bin uitgezet zodat een fingerprint patroon voor elke stam verkregen werd (Figuur 4.10). Alle 4 de metingen van eenzelfde stam worden weergegeven in eenzelfde grafiek. Als de 4 individuele metingen reproduceerbaar zijn, moet de grafiek van elke meting zo veel mogelijk op elkaar liggen. Figuur 4.10: De fingerprint van LMG 18022, LMG 18030, LMG 6400, LMG Het aantal cellen van elke meting binnen elke bin wordt weergegeven. De 4 individuele metingen van LMG zijn voorbeelden van reproduceerbare metingen. Bij de 4 metingen van de andere stammen is er meer variatie. 34