LIFE naar Californië. De filamenteuze bacterie Streptomyces. Vingers om het genoom te spelen. Illustreren voor Botanisch Onderzoek.

Transcriptie

1 Jaargang 4 april 2009 Nummer 3 Farmaceutische Wetenschappen Biologie LS&T MST Universiteit Leiden De filamenteuze bacterie Streptomyces Vingers om het genoom te spelen Illustreren voor Botanisch Onderzoek LIFE naar Californië

2 Redactioneel Inhoud Studeren of werken aan de universiteit betekent je bevinden in een internationale context. Veel van onze wetenschappelijke medewerkers komen uit het buitenland en ook de exchange students mogen niet vergeten worden. Een leuke manier om tijdens je studie kennis te maken met buitenlandse universiteiten en bedrijven, is de studiereis. Met name cultuurverschillen kunnen interessant zijn, zo worden er aan een fabriek op het platteland van Hongarije compleet andere eisen gesteld dan aan een high-tech laboratorium in hartje Londen. Een stapje verder dan de studiereis, gaat het doen van een stage in het buitenland. Dit betekent niet slechts snuffelen aan een andere cultuur, maar een ware onderdompeling. In dit nummer van de Origin komen zowel een studiereis als een stage in het buitenland aan het bod. Waar ook je voorkeur ligt, een internationale ervaring zal zeker je horizon verbreden! Nieuws 3 De filamenteuze bacterie Streptomyces 4 Vingers om met het genoom te spelen 8 Central role of the stress hormone in type 1 diabetes neuropathology 12 Illustreren voor Botanisch Onderzoek 16 Stage aan Mount Sinai School of Medicine 18 LIFE naar Californië 21 LBC Biologen op Ameland 24 De week van Wouter Roorda e Dies Natalis der L.P.S.V. Aesculapius 29 Agenda & promoties 31 Chantal Stoffelsma Colofon , jaargang 4, nummer 3, april 2009 Oplage: Redactieadres: Origin Magazine Einsteinweg CC Leiden info@originmagazine.nl Aan Origin werkten mee: Erik Danen, John Meerman, Bob van de Water, Leo Price, Janneke van der Niet, Sanne de Ridder, Mart van Meurs, Shashini Munshi, Christiaan van Gorkum, Thijs Groenewegen, Evelien de Vries, Freek Vonk en Johan Postema Drukkerij: Drukkerij Groen, Leiden Opmaak: teambart Redactie: Hoofdredactie: Gert Jan van Helden Eindredactie: Chantal Stoffelsma Johan Detollenaere Origin en al haar inhoud Faculteit der Wiskunde en Natuurwetenschappen, Universiteit Leiden. Alle rechten voorbehouden. 2 Origin - Universiteit Leiden

3 Nieuws Facultaire Onderwijsprijs voor Harald van Mil De Onderwijsprijs van de Faculteit Wiskunde en Natuurwetenschappen werd gewonnen door dr. Harald van Mil. Van Mil is werkzaam bij de onderzoeksgroep Fungal Genetics & Genomics, onderdeel van de sectie Moleculaire Microbiologie. Hij verzorgt cursussen voor verschillende jaargangen van de opleiding biologie, waarbij altijd het vakoverschrijdende centraal staat. Van Mil weet zijn enthousiasme voor de biologische, bio-informatische en mathematische wetenschappen over te brengen op zijn studenten. Door veel discussies met studenten aan te gaan, inspireert hij studenten en maakt ze bewust van hun positie in de maatschappij. Daarnaast heeft hij een breed interessegebied dat ook andere bètagebieden en filosofie omvat en dat zijn eigen disciplines verre overstijgt. Hij laat zijn studenten hierin delen. Kortom, Van Mil is een betrokken, gedreven en veelzijdige docent. Vreugdenhil heeft gevonden dat er een microrna bestaat dat specifiek is voor de hersenen, en dat dit microrna de hoeveelheid glucocorticoid-receptor reguleert. Klinisch gezien is de ontdekking erg interessant. Chronisch gebruik van medicijnen kan soms leiden tot bijwerkingen als depressie. Chronische stress, waarbij continu stresshormonen worden aangemaakt, is ook een belangrijke factor bij het ontstaan van depressie. Het bestaan van microrna s die specifiek zijn voor hersencellen biedt dus de mogelijkheid de glucocorticoid-receptor in de hersenen specifiek te reguleren. In andere cellen, zoals die van het afweersysteem, wordt de receptor dan ongemoeid gelaten. Op het moment dat je de invloed van stress op de hersenen kunt reguleren door een specifieke microrna-therapie te ontwikkelen, heb je iets heel effectiefs in handen. Het zal niet lang meer duren voordat er op microrna gerichte medicijnen op de markt zijn. Bron: Ontdekkers van het Jaar Nieuwe leerstoel industriële biotechnologie Dr. Kai Ye heeft op 5 januari de C.J. Kokprijs van de Dr. Peter J. Punt, werkzaam bij TNO, is benoemd tot Faculteit Wiskunde en Natuurwetenschappen toegekend bijzonder hoogleraar Industriële Biotechnologie. Punt gekregen voor zijn werk aan algoritmen voor het opsporen van regelmaat en functionaliteit in eiwitvolgorden. menteuze schimmels. De bijzondere leerstoel is ingesteld gaat zich richten op de moleculaire genetica van fila- Dr. Ignas Snellen en drie bachelorstudenten wonnen de door het Lorentz-van Iterson Fonds van TNO Read More Publieksprijs. Zij ontdekten een zogenoemde exoplaneet, Schimmels zijn in staat om efficiënt een groot scala aan dat is een planeet die om een andere ster dan de zon heen eiwitten en chemicaliën te produceren. Zij zijn eenvoudig cirkelt. Het onderzoek van de studenten betrof niet in fermentoren te kweken en worden daarom al vele tientallen jaren toegepast op industriële schaal. Volgens Punt, zozeer het vinden van een planeet, als wel het ontwikkelen van een methode daartoe. De vijf winnaars mogen werkzaam bij TNO als senior scientist schimmel biotechnologie, kan het productie potentieel van schimmels nog zich tooien met de titel Ontdekker van het Jaar verder verbeterd worden door een aantal generieke problemen, zoals proteolytische activiteit en hoge viscositeit MicroRNA: klein, maar o zo belangrijk De ontdekking van het belang van microrna s in 2001 van schimmelcultures, beter te begrijpen. heeft de wereld van de moleculaire biologie op zijn kop Bron: : biology.leidenuniv.nl gezet. De kleine stukjes RNA trokken ook de aandacht van universitair hoofddocent Erno Vreugdenhil. Nieuws MicroRNA s zijn heel kleine stukjes RNA, die een behoorlijke macht hebben in de cel. MicroRNA s zijn betrokken bij verschillende ziekteprocessen. Zo speelt microrna een belangrijke rol in verschillende soorten kanker. Deze regulerende rol maakt microrna erg interessant als drugtarget. Origin - Universiteit Leiden 3

4 De filamenteuze bacterie Streptomyces In ons onderzoek staat de Streptomyces bacterie centraal, een ongewoon complex organisme dat meer weg heeft van een schimmel dan van een bacterie (Figuur 1). Streptomyceten zijn zogenaamde Gram-positieve bacteriën die behoren tot de familie van actinomyceten, die veel voorkomen in de grond. De typerende zoete grond- cq. boslucht is het resultaat van de productie van de metaboliet geosmine. De grote belangstelling voor actinomyceten binnen de biotechnologie laat zich gemakkelijk verklaren doordat ongeveer 70% van alle antibiotica geproduceerd wordt door deze bacteriën (60% door Streptomyces). Bekende voorbeelden zijn onder meer erythromycine, vancomycine, tetracycline en streptomycine. In een tijd waar multi-drug resistente pathogenen als Mycobacterium tuberculosis (veroorzaakt TB) en MRSA het nieuws beheersen is de aandacht voor actinomyceten wellicht groter dan ooit. Daarnaast produceren actinomyceten een breed scala aan nuttige enzymen, gebruikt in onder meer de wasmiddelen- en voedingsindustrie. Streptomyceten zijn naast voor de biotechnologie ook voor de fundamentele microbiologie van groot belang, omdat ze een belangrijk modelsysteem zijn voor de zogenaamde morfologische differentiatie (groeifase- afhankelijke verandering). Ze ondergaan een complexe levenscyclus die zoals gezegd veel vergelijkenis vertoont met die van filamenteuze schimmels, waaronder bijvoorbeeld Penicillium en Aspergillus vallen. Na de ontkieming van een spore ontstaat een vegetatieve hyfe, die via groei en vertakking uitgroeit tot een complex dradennetwerk, het mycelium. Daarmee is een streptomyces kolonie in feiten één organisme en niet opgebouwd uit individuele cellen. De differentiatie wordt geïnitieerd zodra het voedsel in de bodem begint op te raken, waarbij het vegetatieve mycelium als voedingsbron wordt gebruikt voor het nieuw te vormen luchtmycelium, dat er wit en donzig uitziet. De uiteinden van de luchthyfen vormen uiteindelijk ketens van sporen, op een voedingsbodem duidelijk te onderscheiden aan het donkergrijze pigment, die resistent zijn tegen hitte en uitdroging en verspreid worden om in een meer nutriëntrijke omgeving een nieuwe kolonie te starten. Figuur 1: Stereomicroscopische opname van een volledige ontwikkelde Streptomyces kolonie op een vaste voedingsbodem. Blauwe druppels zijn antibiotica, grijs pigment zijn de sporen. Diameter van de kolonie is in werkelijkheid 6 mm. Cannibalisme en antibiotica De start van de antibioticumproductie valt samen met de overgang van het vegetatieve mycelium naar het luchtmycelium. Deze koppeling is noodzakelijk omdat de bacterie juist in die fase van zijn levens- 4 Origin - Universiteit Leiden

5 Celdeling en morfologie Een tweede voorbeeld van hoe fundamenteel en toegepast werk hand in hand kunnen gaan betreft de bestudering van celdeling, die vervolgens toegepast wordt voor de verbeterde groei in de fermentor (STW VICI project, zie onder). Celdeling is een van de centrale processen van het leven. De vermeerdering en deling van cellen is een bijzonder complex proces, uitgevoerd door het celdelingsapparaat. Een goede timing en controle van celdeling is voor alle orgacyclus, gestart om te ontsnappen aan een voedingsarme bodem, het meest kwetsbaar is. Tijdens de ontwikkeling cannibaliseert de streptomyceet zijn eigen mycelium om aan de nodige bouwstoffen te komen. Dit noemen we ook wel autolyse (zelfafbraak). Omdat op dat moment in de bodem geen voedingsstoffen meer aanwezig zijn trekt deze autolyse andere bacteriën aan en de antibiotica zijn nodig om ongewenste gasten buiten de deur te houden. We hebben recentelijk het mechanisme opgehelderd dat ervoor zorgt dat antibioticumproductie aangezet wordt zodra de autolyse start. N-acetylglucosamine blijkt het cruciale signaalmolecuul. N-acetylglucosamine is de monomeer van chitine, samen met cellulose de meest voorkomende suikerpolymeer in de natuur en tevens een bijzonder belangrijke voedingsbron voor streptomyceten; daarnaast is het een belangrijke component van de bacteriële celwand. Bij de autolyse komt N-acetylglucosamine vrij uit de celwand. Dit wordt opgenomen in de cel, waar het leidt tot de inactivering van het globale regulatie-eiwit DasR, een repressor van de antibioticumproductie. Als DasR niet meer actief is ligt de weg naar antibioticumproductie volledig en irreversibel open. De complexiteit van deze signaalroute is groter dan deze paar regels doen vermoeden en leent zich bij uitstek voor een systeembiologische aanpak. Daarbij worden de meest geavanceerde genomics technologieën gebruikt. De toepassing van deze ontdekking bij de screening van nieuwe antibiotica (en andere metabolieten, waaronder anti-schimmel en anti-kanker middelen) is duidelijk: we kunnen antibioticumproductie middels een moleculaire schakelaar aanzetten door N-acetylglucosamine toe te voegen aan het kweekmedium. Wat met name erg interessant is, is dat ook antibiotica die we normaal niet zien opeens sterk tot expressie komen en dus zichtbaar worden. Dit worden slapende biosynthese clusters genoemd en zijn een mogelijke goudmijn in een tijd waar de behoefte aan nieuwe antibiotica weer net zo actueel is als 60 jaar geleden. Een enorm probleem voor de wereldgezondheid is de sterk dalende trent met betrekking tot de ontdekking van nieuwe antibiotica, waarbij nagenoeg geen nieuwe meer ontdekt worden, terwijl tegelijker- Figuur 2: Verscheidenheid van streptomyceten geïsoleerd uit Franse bosgrond door een bachelorstudent van de opleiding Life Sciences & Technology (Giovanni Sandrini). Alle stammen produceren tenminste 2-3 verschillende antibiotica. tijd het aantal ziekenhuisopnames met multi-drug resistente infecties zoals MRSA en MDR tuberculose explosief toeneemt. In een net toegekend STW project binnen het perspectief programma Genbiotics zullen we actief gaan zoeken naar dit soort verborgen clusters, op zoek dus naar de antibiotica van de toekomst (Figuur 2). De sterke clustering van expertises die voor dit project noodzakelijk is, van onder meer microbiologie en bioinformatica (Erik Vijgenboom en ondergetekende), organische synthese (Hermen Overkleeft en Mark Overhand, LIC), metabolomics (Rob Verpoorte en Young Choi, IBL), MRSA/Tb testing (van Belkum, Rotterdam) en full genome sequencing (ServiceXS) is typerend voor de multidisciplinaire richting waarin ons onderzoek zich beweegt. Tijdens de ontwikkeling cannibaliseert de streptomyceet zijn eigen mycelium om aan de nodige bouwstoffen te komen. Origin - Universiteit Leiden 5

6 nismen uitermate belangrijk en daarom een centraal levensthema. Vermeerdering van cellen op momenten of plaatsen waar dat niet gewenst is heeft desastreuze gevolgen, zoals bij kanker. Het meest bekende voorbeeld voor celdeling is het proces in de ééncellige darmbacterie Escherichia coli. Na verdubbeling van het enkele chromosoom voor elke dochtercel één - wordt precies in het midden een scheidingswand (septum) gevormd, de chromosomen segregeren naar de nieuwe middelpunten, waarna celdeling volgt en twee dochtercellen ontstaan uit één moedercel. In multicellulaire systemen (zoals mens, dier en plant, maar ook in bijvoorbeeld schimmels) ontstaat een complex netwerk van met elkaar communicerende cellen met diverse gespecialiseerde functies binnen hetzelfde organisme. Streptomyces vertoont beide vormen van celdeling: tijdens de eerste (vegetatieve) groeifase leidt celdeling tot de vorming van verbonden compartimenten, terwijl aan het eind van de levenscyclus individuele cellen (de sporen) worden afgesnoerd. Een tweede fundamentele reden om celdeling te bestuderen in een exotisch organisme als Streptomyces is dat dit het enige organisme is waarin celdeling niet essentieel is (!), zodat hier gemakkelijk mutanten gemaakt en bestudeerd kunnen worden. Figuur 3: Conserveringsmodel van SsgA-achtige eiwitten, gebaseerd op de kristalstruktuur van de SsgB trimeer van de actinomyceet Thermobifida fusca. Aminozuren die volledig geconserveerd zijn in alle SALP eiwitten (SsgA-G) zijn aangegeven in rood. Van fundament naar toepassing: het SsgA eiwit en controle van morfologie Wat is nu het signaal voor de start van de celdeling? De basis voor de celdelingsringen wordt gevormd door polymerisatie van het eiwit FtsZ, een naaste verwant van het in hogere organismen voorkomende tubuline. Rond deze ring wordt nieuw celwandmateriaal aangelegd, resulterend in een fysiek septum. Het door ons bestudeerde SsgA eiwit stimuleert specifiek de aanmaak van septa. Het eiwit behoort niet tot één van de bekende eiwitfamilies, noch kunnen er specifieke functies toegewezen worden aan stukken van het eiwit. Echter, struktuuranalyse in samenwerking met het Joint Center for Structural Genomics (Qingping Xu, Ashley Deacon, Ian Wilson en medewerkers) liet een eiwit zien met drie subunits met homologie aan eukaryote RNa bindende eiwitten (Figuur 3). Alle streptomyceten hebben meerdere SsgA-achtige eiwitten (SALPs of SsgA-like proteins). Recentelijk hebben we stammen gemaakt die de informatie voor één van de eiwitten SsgA-SsgG missen, zogenaamde knock-out mutanten. Uit hun fenotype - de verzameling uiterlijke kenmerken - blijkt dat SALPs zonder uitzondering een rol spelen bij de celdeling of morfogenese, van stimulering van de celdeling tot aan het scheiden van de rijpe sporen. Recent onderzoek in onze groep toonde aan dat SsgA en SsgB samen bepalen waar het septum moet komen; daarbij recruteert SsgB actief FtsZ naar de toekomstige plek van het septum. De wortels van het huidige onderzoek in onze groep liggen feitelijk aan het eind van 1996, toen het verzoek kwam van DSM-Delft (het voormalige Gist-brocades) om te proberen Streptomyces meer gefragmenteerd te laten groeien. In tegenstelling tot op vaste voedingsbodems, waarop we de ontwikkeling bestuderen (zie boven), worden door de meeste streptomyceten geen sporen gemaakt in vloeibare cultures, waaronder biotechnologische fermentaties. In vloeibaar medium zijn de hyfen uitsluitend vegetatief en wordt geen luchtmycelium gemaakt. Het gevolg is dat in vloeibaar medium ook alleen vegetatieve septa worden gevormd, en zoals gezegd leiden die niet tot afsnoering. Dit resulteert dus in schier eindeloos lange hyfen en dichte netwerken van in elkaar verwoven hyfen, zogenaamde pellets. Deze zeer filamenteuze groeivorm is erg ongunstig voor grote productieschaal, omdat de vaak grote 6 Origin - Universiteit Leiden

7 myceliumklonten (tot millimeter schaal) leidt tot trage groei en slechte opname van voedingsstoffen en zuurstof, met als resultaat een te lage opbrengst. Onze benadering om de celdeling te stimuleren resulteerde in de identificatie van SsgA als een cruciaal controleeiwit. Het aantal kopieën van SsgA in de cel heeft een sterke invloed heeft op de morfologie, waarbij een verhoogd niveau leidt tot meer celdeling en dus fragmentatie. Dit maakt het mogelijk om de morfologie genetisch te beïnvloeden en middels een aantal genetische tools als het ware achter de knoppen te zitten. Inmiddels is deze gepatenteerde technologie uitgetest middels fermentaties en aangetoond dat het een significante rendementsverbetering kan sorteren in een aantal productiesystemen, zoals verhoogde groeisnelheid maar vaak ook hogere yield (Figuur 4). Figuur 4: Fermentatie van Streptomyces coelicolor waarin het SsgA eiwit tot overexpressie is gebracht laat zeer sterke productie van het rode antibioticum undecylprodigiosine zien. De recombinante stam maakt 20-50x zoveel van dit antibioticum als de oorspronkelijke stam. VICI project Hoewel we inmiddels een aantal stappen in de goede richting hebben gezet, stuiten we op een nieuw probleem: de relatie tussen morfologie en productie. De antibioticumproductie (het aantal gram product per kilogram biomassa dus) hangt erg sterk af van de morfologie. Veel antibiotica hebben een soort minimum klontgrootte nodig voordat er überhaupt iets wordt gemaakt, terwijl andere antibiotica en veel enzymen juist baat hebben bij heel kleine fragmenten. Aan dit fenomeen is eigenlijk nog nooit onderzoek gedaan, doorgaans prefereert de industrie om productiestammen via een black box benadering te optimaliseren, zeker waar het de groei betreft. Niemand weet dan ook waar in streptomyceten de producten gemaakt en gesecreteerd worden; is dit aan de uiteinden, waar de groei plaatsvindt, of juist in het midden langs de wand van de hyfen? Inzicht hierin is absoluut cruciaal omdat het alleen dan mogelijk wordt om te komen tot gerichte stamverbetering. Het zojuist door STW toegekende VICI project (industrieel ondersteund door DSM en Danisco- Genencor) richt zich op een integrale aanpak voor de verbetering van antibioticum- en enzymproductie. Daarbij staan drie onderzoekslijnen centraal: (1) via geavanceerde imaging analyseren waar productie en secretie plaatsvindt en tevens hoe dit reageert op variabele groeicondities (groeisnelheid, morfologie, suikerbronnen); (2) via genomics bepalen hoe de activiteit van de sleutelgenen qua morfologie en productie afhangt van morfologie en groeisnelheid, met name ook tijdens het fermentatieproces; (3) een voor- spellend computermodel bouwen van Streptomyces waarin alle data worden geintegreerd (in samenwerking met Mark van Loosdrecht en Christian Picioreanu van de TU Delft), zodat je als het ware een digitale testrun van een fermentatie kunt draaien en veel gerichter veranderingen kunt aanbrengen. Tot slot zal innovatieve technologie voor genetische manipulatie van streptomyceten worden ontwikkeld (onder meer in samenwerking met Nora Goosen, LIC). Het feit dat door STW (Stichting Toegepaste Wetenschappen) gesubsidieerde toepassingsgerichte projecten de basis hebben gevormd voor meer fundamenteel georiënteerde KNAW en NWO projecten en vervolgens weer andersom geeft aan dat een sterke wisselwerking tussen deze twee ogenschijnlijk verschillende wetenschappelijke invalshoeken bijzonder stimulerend kan zijn. Juist door deze tweeledigheid is de intensieve samenwerking tussen de faculteiten TNW (TU Delft) en W&N (Leiden) van groot belang voor de continuïteit van dit type onderzoek. Origin - Universiteit Leiden 7

8 Instituut Biologie Leiden (IBL), sectie Moleculaire Ontwikkelingsgenetica Vingers om met het genoom te spelen Erfelijke eigenschappen van een organisme zijn binnen het genoom vastgelegd in de genen. Om die eigenschappen tot expressie te laten komen zijn er een tweetal processen nodig. Allereerst moet het gen worden overgeschreven waarbij er een transcript of messenger RNA wordt gevormd en daarna moet dit transcript nog vertaald worden in een eiwit. Beide processen zijn van nauw gereguleerd en bepalend voor de genexpressie. Tot enkele jaren geleden was het alleen met grove middelen mogelijk om de expressie van specifieke genen te beïnvloeden. Ook was het in meercellige organismen bijzonder lastig om zeer gericht veranderingen in het erfelijk materiaal aan te brengen. Binnen het IBL is ingespeeld op nieuw ontstane mogelijkheden om met behulp van zinkvingereiwitten veranderingen in de expressie en de structuur van genen te bewerkstelligen. Als modelorganisme is daarvoor de plant Arabidopsis thaliana (zandraket) gebruikt. DOOR: Bert van der Zaal: 8 Origin - Universiteit Leiden

9 Het eerste niveau van regulatie van genexpressie, de hoeveelheid transcripten die er van het gen worden overgeschreven, wordt gereguleerd door transcriptiefactoren. Transcriptiefactoren zijn eiwitten die bestaan uit een DNA-bindingsdomein dat ervoor zorgt dat het eiwit op de juiste plek aan het DNA kan binden en een effectordomein dat bijdraagt aan de regulatie van de transcriptie. Afhankelijk van het type effectordomein kan de transcriptie van een gen wat in de buurt van de bindingsplaats voor de transcriptiefactor ligt gestimuleerd of juist geremd worden. Heel vaak zijn het DNA-bindingsdomein en het effectordomein van een transcriptiefactor te beschouwen als los functionerende (modulaire) onderdelen. Dit houdt in dat er in principe tal van nieuwe combinaties tussen verschillende DNA-bindingsdomeinen en effectordomeinen gemaakt kunnen worden. Met behulp van zulke artificiële transcriptiefactoren (afgekort ATFs) kan in principe de expressie van genen op een andere manier worden aangestuurd. De ontwikkeling van ATFs is in een stroomversnelling terecht gekomen met de komst van zinkvingertechnologie. Zinkvingers zijn kleine eiwitdomeinen die in veel natuurlijke transcriptiefactoren voorkomen. Hun naam hebben ze te danken aan hun vorm; door de aanwezigheid van een zink-ion wordt een structuur gestabiliseerd die aan een vinger doet denken. Voor een bepaalde klasse van zinkvingers is gevonden dat ze specifiek kunnen binden aan drie basenparen in het DNA. Inmiddels is er wereldwijd een groot lexicon van zinkvingers beschikbaar waarvan bekend is welke DNA-sequentie bij voorkeur gebonden wordt. De mooie eigenschap van zinkvingers in relatie tot het ontwikkelen van ATFs is dat ze aaneen gekoppeld kunnen worden tot een domein met meerdere zinkvingers (een polydaktiel zinkvingerdomein, oftewel een PZF), waarbij elke vinger verantwoordelijk is voor de binding aan drie basenparen in het DNA. Op deze manier zal een PZF bestaande uit drie zinkvingerdomeinen binden aan een negen basenparen DNA-sequentie. Nog verdere uitbreiding kan leiden tot nog specifiekere interacties, zelfs zo specifiek dat de DNA sequentie die bij voorkeur wordt herkend slechts één keer in een complex genoom voorkomt. De PZFs kunnen op hun beurt gebruikt worden in ATFs (PZF-ATFs) door ze te combineren met een effectordomein naar keuze. Zinkvinger-gestuurde screening voor planten met verhoogde frequentie van homologe recombinatie (HR). Van links naar rechts: 1) PZF activator bank: telkens zijn drie zinkvingers gecombineerd met een activatie domein. 2) De PZF activator bank wordt overgedragen (getransformeerd) naar een plantenlijn die een genconstruct bevat waarmee de frequentie van homologe recombinatie bepaald kan worden. 3) Een PZF-ATF die is geintegreerd verhoogt de expressie van een gen dat betrokken is bij HR. 4) Hierdoor neemt de frequentie van HR binnen het in de plantenlijn aanwezige genconstruct toe. 5) Na kleuring zijn HR gebeurtenissen zichtbaar als blauwe spots. Door de PZF-ATF terug te isoleren kan een HR-inducerende factor in handen worden gekregen. Binnen de sectie moleculaire ontwikkelingsgenetica van het IBL is zes jaar geleden, na toekenning van een NWO-GENOMICS subsidie, gestart met het zinkvingeronderzoek. De voornaamste doelstelling was om te onderzoeken wat de mogelijkheden voor het gebruik van zinkvingers zouden kunnen zijn voor het ophelderen van biologische vraagstellingen in planten. Tijdens dit onderzoek is nagegaan hoe zinkvingers het beste aaneengeschakeld kunnen worden en ook is een efficiënt kloneringsysteem ontwikkeld zodat we tal van PZFs kunnen maken. Daarbij is een methode ontwikkeld om in gistcellen, die gemakkelijk en snel te transformeren zijn, te testen welk type PZFs daadwerkelijk goed functioneren in een ATF. Het is lang niet altijd nodig om erg complexe en specifiek bindende PZFs te maken om interessante toepassingen te kunnen vinden. Ook PZFs die maar uit een paar - bijvoorbeeld drie - zinkvingers bestaan en op heel veel plekken in een complex genoom Origin - Universiteit Leiden 9

10 De ontwikkeling van ATFs is in een stroomversnelling terecht gekomen met de komst van zinkvingertechnologie. kunnen binden, simpelweg omdat de bindingsplaats vele malen voorkomt, zijn bijzonder nuttig. Door zulke minder specifieke PZFs te koppelen aan effectordomeinen ontstaan PZF-ATFs die ieder voor zich de expressie van een groot aantal genen in een genoom kunnen veranderen. Deze vorm van misregulatie biedt mogelijkheden om naar nieuwe gewenste eigenschappen (fenotypes) te zoeken. De procedure houdt in dat er een groot aantal transgene organismen wordt gemaakt waarvan ieder individu een variant van een PZF-ATF bevat. Op die manier kan gekeken worden waartoe het genoom van het organisme in staat zou kunnen zijn als het met zinkvingers wordt bespeeld. Deze methode wordt ook wel genome interrogation genoemd. Wanneer een causaal verband tussen de aanwezigheid van een bepaalde PZF-ATF en een fenotype is gevonden, is dit fenotype oproepbaar zodra de PZF-ATF in het organisme wordt geïntroduceerd. Er is bij allerlei organismen grote interesse om te zien hoe schade aan het DNA zo nauwkeurig mogelijk gerepareerd kan worden. Het ideale DNA-reparatiemechanisme verloopt via homologe recombinatie (HR). Bij dit proces kunnen breuken in het DNA zonder fouten worden hersteld omdat gebruik wordt gemaakt van een identiek stukje DNA dat dient als mal voor reparatie. Hoewel planten en andere complexe organismen tot HR in staat zijn, worden breuken in het DNA meestal zo snel mogelijk aan elkaar geplakt, waarbij vaak fouten optreden. De mogelijkheid om HR door middel van een PZF-ATF te kunnen controleren is ook zeer interessant vanuit een biotechnologisch standpunt. Bij verhoogde HR frequentie zou het ook mogelijk moeten zijn om zeer specifiek genetische aanpassingen in planten te kunnen aanbrengen door een bijna identiek stuk DNA in een gen te laten integreren ( gene targeting ). Dit is tot nu toe eigenlijk niet echt mogelijk omdat een ingebracht stuk DNA normaliter ergens lukraak (op de niet-homologe manier) in het genoom terecht komt. Om te toetsen of mutanten met verhoogde HR frequentie kunnen worden gevonden, is besloten om de modelplant Arabidopsis aan een ondervraging met PZF-ATFs te onderwerpen. Voor dit doel is er een verzameling van PZF-ATFs gecreëerd door een grote collectie van PZF domeinen met drie zink-vingers te fuseren met een sterke transcriptionele 10 Origin - Universiteit Leiden

11 PZF-GFP eiwitten in de buurt van elkaar aan het DNA moeten binden. Om dit voor elkaar te krijgen, werd gekozen voor een bindingsplaats die zich in een kort, repeterend, stukje DNA bevindt. Ons lab had de primeur met dit principe. Zo is aangetoond dat PZFs, opgebouwd uit drie zinkvingers en voorzien van een GFP-lamp, in levende cellen de repeterende sequenties rond de centromeren in Arabidopsis chromosomen zichtbaar kunnen maken. Ook in muizencellen konden we de centromeren via een PZF van drie zinkvingers visualiseren. Labeling van centromeerrepeats in kernen van een levende Arabidopsis wortel. activator. Deze PZF-ATF verzameling werd vervolgens gebruikt voor transformatie van speciale Arabidopsis planten die een genconstruct bevatten waardoor de HR frequentie in elke PZF-ATF bevattende plant door middel van een kleuring kan worden bepaald. Op deze manier is het gelukt om een PZF- ATF te selecteren die kan leiden tot een extreem verhoogde HR frequentie, wel 200- tot 1000-maal hoger dan normaal. Een uitdaging voor de toekomst waar nu aan wordt gewerkt is er in gelegen om te begrijpen hoe deze specifieke PZF-ATF het genoom aanstuurt. Dit zal kunnen leiden tot het identificeren van nog onbekende sleutelgenen voor het HR proces in hogere planten en daar is een octrooi op aangevraagd. Samenvattend vormen zinkvingers de bouwstenen om nieuwe DNA-bindingsdomeinen te maken die vervolgens in combinatie met andere eiwitdomeinen in allerlei moleculaire gereedschappen kunnen worden toegepast. Zowel vanuit een fundamenteel wetenschappelijk standpunt als vanuit een meer toegepast biotechnologisch perspectief zijn zinkvingers onmisbare vingers in de pap! Tot slot nog een toepassing voor zinkvingers: ze kunnen namelijk ook nog gebruikt worden om specifieke stukken van chromosomen in levende cellen zichtbaar te maken. De mogelijkheden hiertoe waren zeer beperkt doordat er meestal geen eiwitdomeinen bekend waren die erg specifiek aan DNA sequenties binden en die ook nog eens voorzien konden worden van een fluorescent label. Ook hier bieden zinkvingers uitkomst omdat in principe voor allerlei DNA sequenties PZF domeinen kunnen worden geconstrueerd. Het enige wat nog rest is dat de PZF gefuseerd moet worden met een fluorescent eiwit zoals het Green Fluorescent Protein (GFP) - zodat de binding aan het DNA met een fluorescentiemicroscoop zichtbaar gemaakt kan worden. Om het specifieke signaal daadwerkelijk te kunnen zien, zullen er veel Origin - Universiteit Leiden 11

12 Central role of the stress hormone in type 1 diabetes neuropathology Diabetes dates from 1552 B.C; however, it was not until the last century, in 1959, that the two major types of diabetes were recognized: type 1 (insulin-dependent) and type 2 (non-insulin-dependent) diabetes. Type 2 diabetes constitutes 90% of diabetes cases; it is a metabolic disorder that is primarily characterized by insulin resistance, relative insulin deficiency, and hyperglycemia and is presently of unknown etiology. Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease that results in the permanent destruction or damage of insulin producing beta cells of the pancreas, leading to insulin deficiency. The exact cause(s) of T1D are not yet fully understood. So far, research on diabetes has focused on the peripheral endocrinology and nervous system. Nowadays, the impact of diabetes on the central nervous system (CNS) is well acknowledged. However, the reason why T1D affects the CNS integrity remains unclear. DOOR: Yanina Revsin)* Division of Medical Pharmacology, LACDR/LUMC, Leiden, The Netherlands. Animal models for diabetes To study disease initiation, progression and treatments without exposing humans to unnecessary and potentially unethical risks animal models have been developed. The physiology of mice, rats and other animals is remarkably conserved in comparison to the human condition. They comprise spontaneous models, in which disease develops unprovoked, and experimental models induced by various types of intervention. In order to investigate effects of T1D on the brain, we used two animal models in our studies: 1) a genetic model, the NOD mouse, which spontaneously develops the disease and 2) a pharmacological model, the streptozotocin (STZ)-treated mouse, in which the drug destroys the beta cells of the pancreas. Like type 1 diabetic patients, these animal models show hyperglycemia, high circulating levels of the stress hormone (i.e. corticosterone), increased sensitivity to stress and morphological alterations in various brain areas (1-3). For sake of clarity, only the results from the STZ model will be described in this article. When T1D develops, the insulin producing beta cells in the islets of Langerhans from the pancreas are destroyed (figure 1A). Hence, hyperglycemia develops; however, since insulin controls glucose intake, lack of insulin creates a state of cellular starvation. Both hyperglycemia and cellular starvation coexist and, under certain conditions such as T1D, can generate metabolic stress. Metabolic stress, like any other kind of stress, will activate the hypothalamus-pituitaryadrenal (HPA) axis with the aim of restoring the homeostasis and recovering from the metabolic disturbance. The HPA axis activation will ultimately raise plasma corticosterone (CORT) levels (Figure 1B) which will be followed by the shut down of the HPA axis via CORT negative feedback. Stress hormones: a new window towards understanding diabetes-induced brain damage CORT exerts a hyperglycemic effect, inhibiting cellular glucose uptake in the periphery and also in neurons and astrocytes of brain regions such as the hippocampus, a brain structure that belongs to the limbic circuitry, which plays a major role in spatial memory.as a result of this CORT function, the preexisting hyperglycemia caused as a result of the insulin deficiency in T1D, will become a chronic state. In this way, the continuous metabolic alterations will contribute to a defective shut-off of the stress response (Figure 1C). When HPA axis activity is chronically elevated, as evidenced by chronic hypercorticism, or managed inefficiently, various pathophysiologies are promoted, such as dysfunction of the hippocampus (4, 5). Thus, in order to adapt to the metabolic imbalance different processes will occur in T1D such as poor glucose homeostasis, hypercorticism, HPA axis reactivity and metabolic adjustments. Extreme 12 Origin - Universiteit Leiden

13 F igure 1: HPA axis alterations in type 1 diabetes. Metabolic stress develops when insulin-producing cells destroy leads to hyperglycemia (A). As a consequence, the activation of the HPA axis triggers an increase in corticosteroids levels (B). The chronic high corticosterone concentration, on one hand exacerbates glucose secretion, and on the other hand acts on the HPA axis in order to shut-off the stress response and restore the homeostasis (C). According to the literature, in type 1 diabetes this response is disrupted. metabolic adjustments can induce and significantly accelerate hippocampal damage and remodeling of the limbic circuitry in a way that increases its vulnerability to develop cognitive disturbance. In STZ-diabetic mice we reported elevated CORT concentration (Figure 2) and HPA axis dysregulation (6). Hippocampal dysfunction indicated by alterations of markers for neurodegeneration is also observed (7). This results in impaired cognitive performance in an exclusively hippocampal-dependent test, the novel object-placement recognition (NOPR) task (8). The results support the concept that uncontrolled diabetes may lead to hippocampal damage, which further aggravates changes in other brain structures such as hypothalamus. A fundamental question in the neuropathology of T1D is, therefore, whether aberrant glucose metabolism and insulin deficiency and/or CORT excess may cause the functional and morphological signs of neurodegeneration and cognitive impairment. Imbalance of glucose metabolism may be of importance in modulating the brain disturbances induced by diabetes. Some studies have described how hyperand hypoglycemic episodes can cause acute cerebral dysfunction in diabetic animals (101, 9). Although a central role of insulin in several animal models of diabetes was described (10-12), it was reported that hippocampal impairments are not determined by changes in insulin production (13). Notably, the role of CORT in the central neuropathophysiology of T1D received little attention in the past. Since hypercorticism per se can evoke a neurodegenerative cascade similar to the one described in T1D, the role of CORT excess in STZ-diabetic mice in relation to morphological indices for neuronal viability and cognitive performance was explored. Therefore, the objective of our studies was to elucidate if excessive circulating CORT in mice suffering from T1D enhances vulnerability to cerebral damage and cognitive impairment. The hypothesis was that the onset of diabetes induces first dysregulation of the HPA axis and subsequently hypersecretion of CORT which then renders the brain more vulnerable to metabolic insults causing damage and concomitant cognitive disturbances. Blocking damaging actions of stress hormones in brain and enhancing their protective function: a new therapeutic opportunity CORT actions are mediated by two types of receptors: the high affinity mineralocorticoid receptors (MR) and the low affinity glucocorticoid receptors (GR). In limbic structures such as the neuronal circuits of F igure 2: Time course of blood glucose and basal plasma corticosterone (CORT). Changes in glucose and CORT levels after STZ-injection in control (closed bars) and diabetic (open bars) mice. Blood samples were collected from tail snips and are repeated measures from the same set of animals. Values are expressed as mean ± SEM, n= 6-8. For glycemia measurement: a p<0.05 vs day -2, b p<0.05 vs day -2 and day -1, c p<0.05 vs day 0. For B measurements: d p<0.05 vs day -2, day -1 and day 0. Origin - Universiteit Leiden 13

14 Moreover, when CORT action is inhibited by mifepristone administration, the cognitive deficits observed at day 11 of diabetes were ameliorated (Figure 4). Surprisingly, the diabetic animals treated with mifepristone performed even better than the untreated controls. A rationale behind this observation is that GR antagonism also allows a more prominent function of the protective MR-mediated action in preserving the integrity and stability of the hippocampus (16). MR is neuroprotective, because the receptor promotes neuronal survival and facilitates hippocampus function (16). Hence this suggests that mifepristone treatment blocks the damaging excessive stimulation of GR in hippocampus, sparing protective MR-mediated actions underlying the observed enhanced cognitive performance (17). Figure 3. Immunocytochemistry for glial fibrillary acidic protein (GFAP). (A) Quantification of GFAP+ cell number in the stratum radiatum of the hippocampus. Values expressed mean ± SEM, n= 6 8, *p<0.05. (B) Microphotographs of the different experimental groups. Py= pyramidal cells of the CA1 area. Control microphotograph correspond to a control + vehicle mouse. hippocampus these receptors are co-localized and largely expressed (14). Because of the difference in affinity high CORT concentrations will progressively activate the GRs. Therefore, in order to clarify the role of continuous GR activation in the hippocampus of STZ-diabetic mice we have used the GR antagonist mifepristone (RU38486). We showed that the continuous blockade of CORT action by treatment with mifepristone for 4 consecutive days (from day 6 to 10 of STZ-diabetes) prevented some of the hippocampal aberrations and reversed others (8). The prevention of hippocampal astrogliosis (Figure 3) and increased neuronal activation, and restoration of cell proliferation showed that mifepristone treatment also can interfere directly with the progression of hippocampal alterations observed in diabetic mice. Whether mifepristone s prevention and/or reversion of these disturbances occur directly on hippocampal astrocytes, neurons and proliferative cells, or by changing their surroundings (i.e. their inputs) requires further investigation. It is worth noting that 4-days mifepristone treatment can affect not only the functioning of these cells (8, 15) but also the innervating projections from other brain regions. It appears from this and previous (13) studies unlikely that hyperglycemia per se accounts for the hippocampal disturbances observed during diabetes. We reached this conclusion because GR antagonist normalized hippocampal functions regardless of the hyperglycemic state, which is not altered in diabetic mice treated with mifepristone. However, the Figure 4 B % Preference for re-located object A Sample trial GR blockade normalizes cognitive decline in diabetes *** control + vehicle * diabetic + vehicle 50 min Test trial 6 * control diabetic + + mifepristone mifepristone Figure 4. Mifepristone (a glucocorticoid receptor antagonist) effect on the novel object-placement recognition (NOPR) task. (A) Photograph of the NOPR task: during the sample trial the two objects (water bottles) are equally explored (data not shown). After 50 minutes, during the test trial, one of the objects is re-located. (B) Percentage of preference for the re-located object during the test trial for control and 11-days diabetic mice vehicle- and mifepristone-treated. Values expressed mean ± SEM, *p< Origin - Universiteit Leiden

15 possibility of an effect of CORT excess on hippocampal glucose metabolism in T1D cannot be ignored. Moreover, although a change in insulin production was reported to have no effect on the hippocampal dysfunction in T1D (13), one cannot ignore that the negative effect of diabetes on hippocampal plasticity may be attributable to an interaction between elevated CORT and insulin receptor signaling. In conclusion, the results described in this article provide evidence that CORT excess and the concomitant continuous activation of the GRs are responsible for molecular changes and hippocampal dysfunction at the behavioral level in the early stages of diabetes. They indicate that in T1D excess CORT has lost its function in restoring homeostasis and has become damaging to the brain. hippocampal integrity and the impairment of cognitive performance. At the same time these receptors appear to be an excellent target for a therapy aimed at normalizing the disturbed hippocampal functions characteristic for diabetes neuropathology. * From the PhD thesis by Yanina Revsin, entitled: Type 1 Diabetes, Glucocorticoids and the Brain: a sweet connection, which was defended on September 17 th, Yanina Revsin was the recipient of an NWO WOTRO grant supporting a collaboration with the Institute of Biology and Experimental Medicine, Buenos Aires (prof dr A.F. De Nicola), a special LUMC Division 5 grant and the Academy professorship of prof dr E.R. de Kloet in the Division of Medical Pharmacology, LACDR. A new concept in diabetes has evolved from the data presented in this study, in which CORT plays a causal role in diabetes neuropathology. Moreover, we revealed that the receptors for CORT are crucial for the mechanism that underlies the disruption of References 1. Biessels GJ, Kappelle AC, Bravenboer B, Erkelens DW, Gispen WH. Cerebral function in diabetes mellitus. Diabetologia 1994; 37: Saravia FE, Revsin Y, Gonzalez Deniselle MC, Gonzalez SL, Roig P, Lima A, Homo- Delarche, F, De Nicola AF. Increased astrocyte reactivity in the hippocampus of murine models of type 1 diabetes: the nonobese diabetic (NOD) and streptozotocin-treated mice. Brain Res 2002; 957: Revsin Y, Saravia F, Roig P, Lima A, de Kloet ER, Homo-Delarche F, De Nicola AF. Neuronal and astroglial alterations in the hippocampus of a mouse model for type 1 diabetes. Brain Res 2005; 1038: Sapolsky RM. Do glucocorticoid concentrations rise with age in the rat? Neurobiol Aging 1992; 13: McEwen BS. Protective and damaging effects of stress mediators. N Engl J Med 1998; 338: Revsin Y, van Wijk D, Saravia FE, Oitzl MS, De Nicola AF, de Kloet ER. Adrenal hypersensitivity precedes chronic hypercorticism in Streptozotocin-induced diabetes mice. Endocrinology 2008; 149: Revsin Y, Saravia F, Roig P, Lima A, de Kloet ER, Homo-Delarche F, De Nicola AF. Neuronal and astroglial alterations in the hippocampus of a mouse model for type 1 diabetes. Brain Res 2005; 1038: Revsin Y, Rekers NV, Louwe MC, Saravia FE, De Nicola AF, de Kloet ER, Oitzl M. Glucocorticoid Receptor Blockade Normalizes Hippocampal Alterations and Cognitive Impairment in Streptozotocin- Induced Type 1 Diabetes Mice. Neuropsychopharmacology 2009, 34: Cryer PE. Banting Lecture. Hypoglycemia: the limiting factor in the management of IDDM. Diabetes 1994; 43: Sima AA, Li ZG. The effect of C-peptide on cognitive dysfunction and hippocampal apoptosis in type 1 diabetic rats. Diabetes 2005; 54: Chan O, Inouye K, Akirav EM Park E, Riddell MC, Matthews SG, Vranic M. Hyperglycemia does not increase basal hypothalamo-pituitaryadrenal activity in diabetes but it does impair the HPA response to insulin-induced hypoglycemia. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol 2005; 289:R235-R McNay EC, Williamson A, McCrimmon RJ, Sherwin RS. Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia. Diabetes 2006; 55: Stranahan AM, Arumugam TV, Cutler RG, Lee K, Egan JM, Mattson MP. Diabetes impairs hippocampal function through glucocorticoid-mediated effects on new and mature neurons. Nat Neurosci, 2008; 11: de Kloet ER, Vreugdenhil E, Oitzl MS, Joels M. Brain corticosteroid receptor balance in health and disease. Endocr Rev 1998; 19: Mayer JL, Klumpers L, Maslam S, de Kloet ER, Joels M, Lucassen PJ. Brief treatment with the glucocorticoid receptor antagonist mifepristone normalises the corticosteroneinduced reduction of adult hippocampal neurogenesis. J Neuroendocrinol 2006; 18: Joëls M, Karst H, DeRijk R, de Kloet ER. The coming out of the brain mineralocorticoid receptor. Trends Neurosci 2008; 31: Oitzl MS, Fluttert M, Sutanto W, de Kloet ER. Continuous blockade of brain glucocorticoid receptors facilitates spatial learning and memory in rats. Eur J Neurosci 1998; 10: Origin - Universiteit Leiden 15

16 Illustreren voor Botanisch Onderzoek Niemand weet precies hoe oud de kunst van het weergeven van planten is, maar Aristoteles ( v. C.) was de eerste inventarisator van planten en maakte zodoende de plantenwereld toegankelijk voor onderzoek. Kruidenboeken zijn een van de eerste voorbeelden van botanische prenten uit het verleden. Vanaf de 15e eeuw verschenen er steeds realistischer af beeldingen van planten. Deze vroege platen werden meer gebruikt als decoratieve illustraties. Ook zijn de eerste aquarellen vanaf die tijd bekend. De botanische tekeningen werden nog veel gebruikt in kruidenboeken voor medicinale doeleinden. In eerste instantie waren de boeken dus bestemd voor artsen en apothekers. In de 17e en 18e eeuw werd het uitgeven van het florilegium een trend. Een florilegium is een boek waarin verschillende soorten bloemen en planten zijn gerangschikt en afgebeeld. Een andere belangrijke trend in de botanische wereld was het wetenschappelijk correct weergeven van illustraties. Dit ontstond door het ontdekken van nieuwe planten in de nieuw ontdekte delen van de wereld. Op expedities ging een tekenaar mee om de flora en fauna in het nieuw ontdekte gebied te tekenen. In de 18e en 19e eeuw verschenen er van de hand van enkele zeer bekende botanische kunstenaars catalogi en plantenencyclopedieën. De opdrachtgevers, meestal botanici, gebruikten de tekeningen als illustratie van hun wetenschappelijk onderzoek. Trichosanthes beccariana subsp. pusila NHN 16 Met de opkomst van de impressionisten in de 19e eeuw ontstond er een losse vrijere stijl van bloemen schilderen. Een kunstenaar kan op talloze manieren een plant uitbeelden, ook zo dat deze redelijk tot uitstekend te herkennen is. Maar een botanische tekening onderscheidt zich in hoofdzaak op 3 punten van een artistieke afbeelding van een plant. Ten Origin - Universiteit Leiden eerste dat het een wetenschappelijk verantwoorde weergave is en controleerbaar door de botanicus. Ten tweede is in een botanische tekening de analyse, het zorgvuldig weergeven van de aparte onderdelen van de plant, terug te vinden. En als laatste is de tekening geen individuele afbeelding van een plant, maar een ideaalbeeld van de soort. Beschadigingen, dauwdruppels of geknakte stengels worden bijvoorbeeld niet weergegeven. Het botanisch illustreren heeft zich zo door de geschiedenis heen ontwikkeld vanuit een eeuwenoude traditie en innovaties. Vandaag de dag worden nog steeds met veel enthousiasme vele botanische illustraties gemaakt op het Nationaal Herbarium Nederland (NHN). Hierbij wordt altijd uit-

17 Trichosanthes phonsenae NHN Coelogyne verrucosa NHN gegaan van het basisprincipe van botanisch illustreren: De illustratie is een gedetailleerd en wetenschappelijk verantwoorde weergave van een plant en delen van de plant. In zo een illustratie zijn dus de karakteristieke kenmerken van een plant zeer belangrijk. Fotografie en ook microscopische fotografie in het bijzonder is vaak een uitstekende aanvulling, maar alleen met een botanische tekening kunnen details echt pas duidelijk en helder worden weergegeven. Die details, die voor onderzoekers belangrijk zijn, kunnen namelijk naar voren worden gehaald en daarbij kunnen zelfs de beschadigde delen van de plant in een tekening worden gerepareerd. Dit soort illustraties is daarom zeer waardevol voor onderzoekers en zij gebruiken daarom diezelfde tekeningen in hun publicaties. De illustratoren die nu op het NHN werken zijn Anita Walsmit Sachs, hoofd van het atelier en opvolger van Jan van Os (winnaar van het 2006 Jill Smithies award for botanical art) en Esmée Winkel. Anita Walsmit Sachs zelf heeft twee Gouden medailles (in 04 en 05 voor Best Botanical Artist in Show van the Royal Horticultural Society Show Birmingham) ontvangen voor haar werk. Van 13 maart tot en met 29 mei 2009 kunnen een aantal botanische illustraties, die op het Nationaal Herbarium Nederland vervaardigd zijn, bezichtigd worden op de tentoonstelling Illustreren voor Botanisch Onderzoek op het Gorlaeus laboratorium. We hopen u daar te zien. Origin - Universiteit Leiden 17

18 Stage aan Mount Sinai School of Medicine Mijn naam is Sascha Hoogendoorn en ik heb de masteropleiding Scheikunde afgelopen jaar afgerond. Als laatste onderdeel van deze master heb ik van april tot november 2008 een bijvakstage gedaan aan Mount Sinai School of Medicine, New York, USA. Wolkenkrabbers, gele taxi s en een stad die nooit slaapt. Het contrast tussen Leiden en New York is groot en dat maakte het des te uitdagender om een zes maanden durende onderzoeksstage te doen aan Mount Sinai School of Medicine in New York. Mount Sinai is een zeer gerenommeerd ziekenhuis, met bijbehorend medisch instituut. Wellicht op het eerste gezicht niet de meest voor de hand liggende keuze voor een organisch chemicus. Tijdens mijn studie scheikunde werd al snel duidelijk dat ik de kant van de organische synthese op wilde gaan: in het lab nieuwe moleculen in elkaar knutselen. De vakgroep Bio-organische Synthese waar ik mijn hoofdvakstage heb gedaan, richt zich op het maken van stoffen die biologisch actief zijn. In 2004 heb ik er voor gekozen om naast de studie scheikunde, de bachelor Bio-Farmaceutische Wetenschappen te gaan doen. Ik vind medische vraagstukken erg interessant en dan vooral de moleculaire achtergrond ervan. Opgeteld bij mijn belangstelling voor de chemie kom je dan al snel uit bij de medicinale chemie: het proces van het ontwerpen, synthetiseren en testen van nieuwe medicijnen. De opleiding moedigt studenten aan om hun bijvakstage te gebruiken voor een stukje verbreding, het liefst in het buitenland. Voor mij was de keuze wat te doen niet moeilijk, ik wilde graag deze stage gebruiken om mijzelf te bekwamen in de farmacologie (het test gedeelte van nieuwe medicijnen). Dit is totaal anders dan de organische synthese en het leek mij dan ook een goede uitdaging om in een heel nieuw vakgebied te duiken. Toen bleek dat prof. dr. IJzerman, de begeleider van mijn bachelorstage in Leiden, goede contacten had in New York was de stage in de onderzoeksgroep van prof. dr. Devi (in het Department of pharmacology and biochemistry ) snel geregeld. Zo kon ik niet alleen de farmacologie ontdekken, maar ook the Big Apple, de stad die ik tot dan toe alleen kende uit de vele films en series die zich daar afspelen. De voorbereiding vergde vervolgens nog wel enige tijd, met beursaanvragen, een zeer langdurige visumaanvraag en een heel aantal 18 Origin - Universiteit Leiden

19 in Nederland niet zo snel meemaken. Met op iedere hoek een Starbucks was de koffie altijd bij de hand en nooit hoefde ik na te denken over een laatste trein of bus: deze gaan immers 24/7! Het dagelijks leven bleek duurder dan ik van tevoren had ingeschat, in New York loont het niet om zelf eten te koken, afhalen is veelal goedkoper. Maar na een aantal keren kebab, pizza of Chinees, is het toch een stuk fijner (en gezonder) om dit wel te doen. inentingen (zelfs al werk je niet met patiënten, dan is dat nog verplicht in een ziekenhuis). Eind april 2008 was het dan eindelijk zo ver: ik vertrok voor ruim 6 maanden naar New York. Leven in New York Ik heb huisvesting kunnen regelen via Mount Sinai, en mijn huis bleek slechts 5 minuten lopen vanaf het lab. Dit kwam goed uit, aangezien mijn cellen meestal niet het hele weekend zonder eten konden en ik dus eigenlijk ieder weekend wel even naar het lab moest. Daarnaast was mijn huis ongeveer 100 meter verwijderd van Central Park, een oase van groen in een overwegend betonnen stad. In New York is altijd wel wat te doen en ontzettend veel te zien. Mijn weekenden waren dus al snel gevuld met allerhande uitstapjes. Zo stonden onder andere een fietstocht over Manhattan, de New York Botanical Garden, de Bronx Zoo, de finale van de US Open en een gratis concert van Bon Jovi in Central Park op het programma. Ook weekendjes Boston en Washington mochten niet ontbreken. Hoewel het voor New York niet ongebruikelijk is dat de luchtvochtigheid en de temperatuur in de zomer tot grote hoogten stijgen, was volgens de echte New Yorkers bij mij op het lab augustus in jaren niet zo aangenaam geweest. Een zomer lang wakker worden met strakblauwe luchten en zon, dat zal je Het onderzoek Hoewel de dagen in New York gemakkelijk gevuld kunnen worden met ontspannende activiteiten, was dat uiteraard niet het doel van mijn reis. Ik heb dan ook het grootste deel van de tijd doorgebracht op het lab van prof. Devi. Recentelijk is in dit lab ontdekt dat hemopressin, een peptide van 9 aminozuren lang, kan binden aan de cannabinoid type 1 (CB 1 ) receptor. Deze receptor bevind zich voornamelijk in de hersenen en speelt daar een belangrijke rol bij vele (patho) fysiologische processen. De voornaamste liganden voor de CB 1 receptor zijn zeer lipofiel, in tegenstelling tot hemopressin, dat hydrofiel is. Het is daarom opmerkelijk dat dit peptide ook aan de receptor kan binden en veel van de onderliggende farmacologie is onbekend. Mijn onderzoek heeft zich gericht op hemopressin en biologische en synthetische hemopressin analoga om erachter te komen hoe deze aan Binding van een ligand aan de CB 1 receptor zet allerlei intracellulaire signaaltransductie cascades in werking, wat onder andere leidt tot de phosphorylatie van het eiwit ERK1/2. Origin - Universiteit Leiden 19

20 de receptor binden en tot welke respons dit leidt. Door mutante CB 1 receptoren te gebruiken, wilden we erachter komen welke aminozuren in het bindingsdomein essentieel zijn voor hemopressin binding. Helaas gaf het bindingsassay dat we hiervoor wilden gebruiken de nodige problemen. De gebruikte liganden zijn door hun hoge lipofiliciteit nogal plakkerig, wat leidt tot een grote mate van aspecifieke binding. Na veel optimalisatie is het gelukt om dit sterk te verminderen, maar het assay bleek niet geschikt voor het bepalen van de binding van de peptiden. Naast de bindingsstudies heb ik me veel beziggehouden met functionele assays, zoals MAP kinase assays. Dit assay is gebaseerd op het principe dat als een agonist bindt aan de CB 1 receptor dit leidt tot phosphorylatie van de ERK1/2 eiwitten, wat zichtbaar gemaakt kan worden met behulp van een Western Blot. Daaruit kwam naar voren dat de synthetische hemopressin analoga de werking van een bekende CB 1 agonist kunnen versterken. Deze vinding is erg interessant omdat het erop kan duiden dat deze stoffen werken als allostere modulatoren. Allostere modulatoren zijn stoffen die op een andere plek aan de receptor binden dan het normale (orthostere) ligand. Door de binding van de allostere modulator wordt het effect van de orthostere ligand versterkt dan wel geremd, terwijl binding van de allostere modulator alleen niet tot een effect leidt. De komende tijd zullen er meer experimenten gedaan worden om verder uit te zoeken of synthetische hemopressin analoga inderdaad als allostere modulatoren Hemopressin, een peptide van 9 aminozuren, is een afbraakproduct van de alpha keten van hemoglobine. beschouwd kunnen worden. Daarnaast zijn de endogene varianten van hemopressin geïdentificeerd en het is gebleken dat de farmacologie van deze liganden anders is dan die van normale cannabinoiden. Dit biedt mogelijkheden om deze peptiden te gebruiken voor therapeutische doeleinden. Het lab waar ik werkte bestond slechts uit 10 mensen en was zeer internationaal. Dit maakte dat ik me al snel thuis voelde en niet alleen iets over de Amerikaanse, maar ook over de Indiase, Franse, Georgische en Puerto Ricaanse cultuur heb opgestoken. De meeste werknemers waren postdocs, die door hun ervaring me erg veel hebben kunnen leren. Daarnaast waren er vele interessante lezingen en symposia. Een absoluut pluspunt aan het lab was het fenomenale uitzicht (ik zat op de 19 e etage) over Central Park en Manhattan! Tot slot Het leven in New York is een onvergetelijke ervaring geweest en mijn stage heeft alles geboden wat ik ervan wilde leren. Inmiddels ben ik weer goed en wel terug in Leiden en in januari ben ik begonnen als AIO bij de onderzoeksgroep Bio-organische Synthese. Ik hoop in mijn project organische synthese te combineren met de farmacologische kennis die ik heb opgedaan. Ik kijk met groot plezier terug op mijn tijd in New York en ik zou iedereen aan willen raden om, als de kans zich voordoet, een stage te doen in het buitenland! 20 Origin - Universiteit Leiden