MALDI-TOF massaspectrometrie Click to add title

Transcriptie

1 MALDI-TOF massaspectrometrie Click to add title een revolutie in de microbiologie? Click to add subtitle G. Coppens G. De Sutter 28 september 2010

2 MALDI-TOF massaspectrometrie een revolutie in de microbiologie? Waarom implementatie in ons lab sinds oktober 2009? Veelbelovende techniek voor identificatie in microbiologie Artikel Seng et al. CID 2009:49 (15 august) Ongoing Revolution in Bacteriology: Routine Identification of Bacteria by MALDI-TOF MS Positieve ervaringen met uittesten in België (UZLeuven, VUB, Ulg Luik) Vooral toestel Bruker goed gedocumenteerd Buikgevoel - de identificatiemethode van nabije toekomst Revolutie: met of zonder?

3 Robin Platel, ICAAC 2010

4 MALDI-TOF massaspectrometrie een revolutie in de microbiologie? Inhoud van deze presentatie: Identificatie van micro-organimen met MALDITOF-MS Toepassing van deze technologie in een routine lab microbiologie Microflex Maldibiotyper systeem van Bruker Daltonics

5 MALDI-TOF massaspectrometrie een revolutie in de microbiologie? Principe MALDI-TOF MS Benodigde apparatuur en software Testkwaliteit: - eigen verificatie/validatie - (enkele publicaties) Implementatie MALDI-TOF MS in routine laboratorium microbiologie Kostenraming Besluit

6 MALDI-TOF massaspectrometrie een revolutie in de microbiologie? Wat we NIET behandelen: Vergelijking tussen toestellen (Bruker < > Shimadzu = Vitek MS BioMérieux) Epidemiologische toepassingen van MDT (subtyperen van stammen) Identificaties rechtstreeks op klinische monsters (urine, positieve hemocultuur flessen) Toepassingen MALDI-TOF buiten de microbiologie (onderzoek macromoleculen -> klinische scheikunde)

7 Principe van MALDITOF-MS Een per micro-organsime bekomen spectrum (speciespecifiek) wordt vergeleken met in een databank opgeslagen speciesspecifieke referentiespectra om tot een identificatie te komen.

8 Robin Platel, ICAAC 2010 MALDI-TOF massaspectrometrie Matrix assisted

9 Robin Platel, ICAAC 2010 MALDI-TOF massaspectrometrie Matrix assisted

10 MALDI-TOF massaspectrometrie Laser Desorption/Ionisation Robin Platel, ICAAC 2010 UV 337 nm 60Hz (instelbaar)

11 MALDI-TOF massaspectrometrie Laser Desorption/Ionisation Donna Wolk, ICAAC 2010

12 MALDI-TOF massaspectrometrie Time of flight ,0 KV Vacuum: 5 2 x 10-6 mbar

13 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] MALDI-TOF massaspectrometrie MALDI-TOF-profiling: Breed toepasbaar op (myco)bacteriën, gisten, schimmels 3000 Aspergillus fumigatus Bacillus subtilis Candida albicans ATCC Escherichia coli DH5alpha m/z Bruker Daltonics

14 Intens. [a.u.] MALDI-TOF massaspectrometrie ribosomal Protein m/z RL ,33 RS ,82 RL ,39 RL33meth. 6255,39 RL ,19 RL ,60 RL ,74 RL ,45 RL ,06 RS , Meting ~ 1 u voor 96 identificaties ; Massa range: Da 0 E. coli m/z

15 MALDI-TOF massaspectrometrie IDENTIFICATIE

16

17 Principe opbouw score value Score value = log(0,6 x 0,3 x 0,9 x 1000) = 2.21 [0 3]

18 Donna Wolk, ICAAC 2010 SAMENVATTING PRINCIPE MALDI-TOF MS

19 Benodigde apparatuur en software Microflex LT MALDI-TOF spectrometer 135cm (H) x 51 cm (B) x 68 cm (D) Tafelmodel plug and play

20 Benodigde apparatuur en software Klassieke Target: Gepolijst staal 96 spotzones of cirkels Afwasbaar Herbruikbaar

21 Benodigde apparatuur en software FlexControl v 3.0 : Stuurt de microflex massaspectrometer aan. MALDI Biotyper v 2.0 identificatiesoftware : Vergelijkt de bekomen spectra met de databank van gekende spectra. MALDI Biotyper Automation control v 2.0 : Koppelt de Microflex massaspectrometer Flexcontrol software MALDI Biotyper zodat geheel vlot in routine kan gebruikt worden.

22 Benodigde apparatuur en software Database: Reference Library 3.0 voor MALDI Biotyper 2.0 Bibliotheek van referentiespectra van micro-organismen 3287 MSP s van stammen (MSP = Main Spectra Projection) 1820 species, 294 genera (juni 2009) Periodieke update: hiaten van minder goed vertegenwoordigde species worden opgevuld databank wordt steeds performanter 2 delen: Basisdatabank (laatste update mei 2010: 3476 MSP s) Security Relevant Database: bevat 13 species die in aanmerking kunnen komen voor bioterrorisme (b.v. Salmonella (Para)typhi, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, ) Mogelijkheid om eigen databank(en) te realiseren (arbeidsintensief, ervaring)

23 Testkwaliteit Aanvaardingscriteria - Diverse aanvaardingscriteria (Bruker, publicaties, SOP s, ) - Aanvaardingscriteria Bruker: (te) streng? Range Identification Symbols Color Highly probable species (+++) green Secure genus, probable species (++) green Probable genus (+) yellow Not reliable (-) red -Voor de eigen validatie aanvaardingscriteria van Seng et al. CID 2009:49 gebruikt: score value > 1.9 is indicatief voor de SPECIESidentificatie is indicatief voor GENUSidentificatie. < 1.7 is indicatief voor onbetrouwbare identificatie.

24 Testkwaliteit MALDI-TOF MS Accuraatheid op 50 referentiestammen (vrnl ATCC) Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Streptococcus dysagalactiae Streptococcus species (F, 2) Streptococcus equisimilis (C) Streptococcus agalacatiae Streptococcus pyogenes Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Aerococcus viridans Bacillus cereus Escherichia coli Shigella flexneri (2b) Salmonella Thyphimirium Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus hauseri Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Serratia marcescens Morganella morganii Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas malthophilia Lactobacillus gasseri Prevotella melaninogenica Bacteroides fragilis Trichophyton mentagrophytes Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Concordant: 94% (47/50) - Discordant: 6% (3/50) Verificatie laboratorium microbiologie ZOL 2009 Met dank aan Dr. A. Van de Abeele, AZSL GENT voor levering aantal stammen

25 Testkwaliteit MALDI-TOF MS Accuraatheid op 50 referentiestammen (vrnl ATCC) 3/50 discordanties : ATCC Shigella flexneri * Haemophilus parainfluenzae** Trichophyton mentagrophytes*** MDT Escherichia coli (2.15) Aggregatibacter aphrophilus (1.90) Trichophyton tonsurans (1.76) * Geen identificatie van Shigella species mogelijk met MDT ** Slechts 2 MSP in databank *** Slechts 1 MSP in databank Verificatie laboratorium microbiologie ZOL

26 Testkwaliteit MALDI-TOF MS Accuraatheid : vergelijking 2 methodes in klinische routine Gedurende november - december 2009 Representatieve stammen uit klinische monsters routine Prospectief Vergelijking klassieke geaccrediteerde identificatiemethode (KI) Met identificatie door middel van MALDI-TOF MS Stammen in groepen onderverdeeld Aanvaardingscriterium nieuwe methode: per groep > 90% concordantie (Verification and Validation of Procedures in the Clinical Microbiology Laboratory, Cumitech 31A, 2009, R. B. Clarck et al, ASM press) Verificatie laboratorium microbiologie ZOL

27 Testkwaliteit MALDI-TOF MS Accuraatheid in klinische routine Routine ZOL N Concordant Concordant % Opmerkingen ATCC e.a S. aureus CNS Validatie species volgt Streptokokken Indien optochine:98.2% Enterokokken Enterobacteriën Restricties Niet vergisters Restricties GPS aëroob Validatie species volgt Anaëroben Verder te valideren H, M, N Restricties Gisten Schimmels TOTAAL % Validatie volgt Verificatie laboratorium microbiologie ZOL

28 Concordanties: 97.9% (183/187) Accuraatheid in klinische routine Groep STAPHYLOKOKKEN Onderscheid tussen S. aureus (n=62) en CNS (n= 119): 100% correct Geen identificatie met MALDI-TOF: 4/187 (CNS met KI) Accuraatheid speciesidentificatie CNS : bijkomende troef van de Maldi-tof MS accuraatheid niet te evalueren in routine met KI (tot CNS niveau) Verificatie laboratorium microbiologie ZOL

29 Accuraatheid in klinische routine Groep STREPTOKOKKEN - RESTRICTIES Streptococcus agalactiae (n=12): concordantie 100% Streptococcus pyogenes (n=12): concordantie 91.6% - 1 stam niet geïdentificeerd met MDT Streptococcus pneumoniae (n=16): concordantie 100% - 1 stam met score < 1.9 Streptococcus species (n=18): concordantie 100% op GENUSniveau, MAAR! - 7/18 geven S. pneumoniae met optochine R Besluit: (verwantschap met S. mitis, idem met 16SrRNA) Beta-hemolytische streptokokken betrouwbare identificatie S. pneumoniae betrouwbaar indien optochine S Andere streptokokken voorlopig slechts op genusniveau aanvaard (Streptococcus species), speciesidentificatie verdere te valideren. Verificatie laboratorium microbiologie ZOL

30 Accuraatheid in klinische routine Groep ENTEROBACTERIACEAE EN ENTEROPATHOGENEN Concordantie: 97% (218/225) 7/225 discordanties : KI Salmonella enteritidis Serratia marcescens Aeromonas hydrophila Klebsiella oxytoca (2x) Citrobacter koseri Geen identificatie MDT Salmonella species Serratia ureilytica* Aeromonas caviae Raoultella ornithinolytica (2x) Klebsiella pneumoniae** Helicobacter pullorum *98.3% gelijkenis met S. marcescens met 16S rrna gen seq., 43.7 % gelijkenis met DNA-DNA hybridisatie ** staalverwisseling Verificatie laboratorium microbiologie ZOL

31 Accuraatheid in klinische routine Groep ENTEROBACTERIACEAE EN ENTEROPATHOGENEN RESTRICTIES met MALDI-TOF MS: - Geen onderscheid tussen E. coli en Shigella species - Identificatie Salmonella op speciesniveau - (Nog) geen betrouwbare differentiatie binnen het Enterobacter cloacae complex: - E. asburiae, E. cloacae, E. hormaechei, E. kobei, E. ludwigi, E. nimipressuralis - Sterk verwantschap binnen het Aeromonas genus - Moeilijk onderscheid tussen Klebsiella oxytoca en Raoultella ornithinolytica - (genetisch sterke verwantschap) Restrictions Biotyper identification M. Kostrzewa Bruker

32 Concordantie: 94% (128/136) 8/136 discordanties : Accuraatheid in klinische routine Groep NIET VERGISTERS KI Achromobacter denitrificans Achromobacter xylosoxidans Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas maltophilia Stenotrophomonas maltophilia Stenotrophomonas maltophilia MDT Achromobacter insolitus Achromobacter ruhlandii Pseudomonas monteilii * Geen identificatie Escherichia coli ** Klebsiella pneumoniae ** Achromobacter xylosoxidans ** Haemophilus influenzae ** * Nieuw species uit Pseudomonas putida subcluster IIc (Int. J.Syst. Bact. (47):3:846) ** verschillende kolonies gebruikt uit polymicrobiële flora: menselijke fouten Verificatie laboratorium microbiologie ZOL

33 Accuraatheid in klinische routine Groep NIET VERGISTERS RESTRICTIES met MALDI-TOF MS: Pseudomonas hibiscola, geniculata, beteli : meestal = Stenotrophomonas maltophilia Geen betrouwbare differentiatie binnen het Acinetobacter baumanii-calcoaceticus complex: - A. baumanii, A. calcoaceticus, A. genospecies 3, A. genospecies 13 Geen betrouwbare differentiatie tussen Achromobacter xylosoxidans en Achromobacter ruhlandii Restrictions Biotyper identification M. Kostrzewa Bruker

34 Accuraatheid in klinische routine Groep ANAEROBEN -Restricties Concordantie 95% (18/19) Belang verse kolonies: zeker bij anaëroben Bruker 2009

35 Accuraatheid in klinische routine Groep Haemophilus, Moraxella en Neisseria species Concordantie: 96.1% (25/26) 23 op speciesniveau 2 op genusniveau (niveau KI) 1 DISCORDANTIE* N = 26 Haemophilus influenzae: 9 Haemophilus parainfluenzae: 10 Moraxella catarrhalis: 5 Neisseria species: 2 * KI MDT Haemophilus parainfluenae Haemophilus influenzae Slechts 2 MSP s voor H. parainfluenzae in databank = onvoldoende Verificatie laboratorium microbiologie ZOL

36 Accuraatheid in klinische routine Groep GISTEN Concordantie: 100% (71/71) - 89% met rechtstreekse methode - Concordantie onafhankelijk van score value N = 71 Candida albicans: 59 Candida glabrata: 8 Candida parapsilosis: 1 Candida tropicalis: 1 Clavispora lusitaniae: 1 Rhodoturula species: 1 Verificatie laboratorium microbiologie ZOL 2009 Jeroen Heyligen 2009

37 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] MALDI Biotyper - Product Clinical Application - Fungi * 19652_altM_manu\0_G4\1\1SLin, Smoothed, "Baseline subt." Solid Media m/z Aspergillus versicolor DSM m/z MALDI Biotyper, December 2009, MIX, vers. 1, Slide 38 of 40

38 Intens. [a.u.] MALDI Biotyper - Product Clinical Application - Fungi Liquid Media under Agitation x m/z Aspergillus versicolor DSM 1943 Fungi Sample Preparation Generating Reproducible Mass Spectra MALDI Biotyper, December 2009, MIX, vers. 1, Slide 39 of 40

39 Testkwaliteit MALDI-TOF MS Accuraatheid in klinische routine Routine ZOL N Concordant Concordant % Opmerkingen ATCC e.a S. aureus CNS Validatie species volgt Streptokokken Indien optochine:98.2% Enterokokken Enterobacteriën Restricties Niet vergisters Restricties GPS aëroob Validatie species volgt Anaëroben Verder te valideren H, M, N Restricties Gisten Schimmels TOTAAL % Validatie volgt Verificatie laboratorium microbiologie ZOL

40 Concordantie met VITEK % op species niveau 11.4% op genus niveau 95,5% (1586/1660) concordant met VITEK 2 Donna Wolk, ICAAC 2010

41 Bruker: 93.6% (674/720) biomérieux Vitek MS: 88.2% (635/720) Donna Wolk, ICAAC 2010

42 Testkwaliteit: accuraatheid MALDI-TOF versus 16S rrna gen sequencing - Selectie van stammen: - Moeilijke identificaties met klassieke methode - Onverklaarde discordanties tussen MDT en klassieke identificatie stammen geanalyseerd met 16S: 95% concordantie - Beperkingen MALDI-TOF en 16S DNA lopen vaak gelijk: - E.coli vs. Shigella sp. - Streptococcus mitis vs. Streptococcus pneumoniae -. => Voor deze species: moleculaire technieken op andere genetische regio s aan te wenden Verificatie laboratorium microbiologie ZOL 2010 Kevin Martens

43 Testkwaliteit MALDI-TOF MS REPRODUCEERBAARHEID

44 Testkwaliteit MALDI-TOF MS REPRODUCEERBAARHEID 4 ATCC-stammen Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Enterococcus faecalis ATCC werden gedurende 10 runs telkens 4 x geïdentificeerd 100% reproduceerbaar qua identificatie Spreiding op score value: - eerder groot, vooral voor E. faecalis ATCC daarom 2e run met meer aandacht voor applicatie koloniespot ( less is better )

45 Testkwaliteit MALDI-TOF MS REPRODUCEERBAARHEID Score value ESCO ATCC STAU ATCC PSAE ATCC ENFS ATCC RUN 1: n= 40 Gemiddelde ,023 Standaarddeviatie 0,064 0,152 0,095 0,325 RUN 2: n = 40 Gemiddelde Standaarddeviatie 0,046 0,057 0,052 0,059 Besluit: Kwaliteit van koloniespot belangrijkste factor voor bekomen van goede score value en goede reproduceerbaarheid. Verificatie laboratorium microbiologie ZOL

46 Melman et al., JCM, 2009 Testkwaliteit MALDI-TOF MS REPRODUCEERBAARHEID

47 Testkwaliteit MALDI-TOF MS REPRODUCEERBAARHEID Is identificeren in duplo noodzakelijk? Besluit uit 1039 in duplo uitgevoerde identificaties tijdens de validatiefase: In duplo applicatie van de kolonies is niet noodzakelijk, wat een besparing in tijd en kosten betekent In ongeveer 3 tot 4 % van de identificaties een probleem opduiken waarbij een herhaling van de MDT identificatie zal dienen te gebeuren. Mogelijk kan dit percentage verminderen bij toename van de ervaring bij het aanbrengen van kolonies op de target. Bij éénmalige applicatie is het zeer belangrijk dat bij het technisch valideren vergeleken wordt met het originele kolonietype op de gebruikte kweekbodem.

48 MALDI-TOF massaspectrometrie Click to add title een revolutie in de microbiologie? Click to add subtitle 28 september 2010

49 Situatieschets voor Maldi-biotyper - Conventionele fenotypische testen - Aanmaak van voedingsbodems voor de conventionele fenotypische testen - Beperkt gebruik van commerciële kits - Geen automatisatie identificaties of gevoeligheidsbepalingen ZOL = klassieke microbiologie

50

51 Maldi-biotyper in de praktijk

52

53

54

55

56

57 Technische validatie - Controle (ATCC stam) - Kolonie versus resultaat

58 Onderhoud - Calibratie - Reiniging target - Reiniging kamer - Gepland onderhoud firma 1. Reiniging ionenbron frequentie afhankelijk van het gebruik toestel blijft bruikbaar 2. Jaarlijks groot onderhoud toestel niet bruikbaar (2 à 3 dagen) zorgen voor backup - Opnieuw klassieke microbiologie? - 2 de toestel? - Ander labo? - Niet gepland onderhoud firma

59

60 Technicus gerelateerde fouten - Te veel / weinig materiaal - Staalverwisseling - Memory phenomenon: resten vorige analyse

61 Practische implementatie - Implementatie niet vanzelfsprekend - Doorbreken van de klassieke workflow - Stress

62 Marleen Cindy Marleentje Inge Ilse Myriam Erna Kim Nicole Daisy Marie-Jeanne Ellen Els Vera Hilde Betty Frank

63 Kostprijs - Aankoop: ± euro - Update database: ± euro per jaar - Onderhoudscontract: ± euro per jaar - Consumables: ± 10 cent per test Prijs daalt naarmate het aantal analyses toeneemt Interne studie Jeroen Heyligen: - Afschrijfperiode van 5 jaar: klassiek systeem iets goedkoper

64 Toekomst voor microbiologie ZOL - Malditof: - Koppeling internet - Koppeling LIS (paperless?) - Verder automatiseren? - MalditofA? - Entautomaat? - Automaat gevoeligheidsbepalingen? - Kiestra Lab automatisation? - Nieuwbouw

65 Zullen wij als mlt s onze expertise verliezen??

66 MALDI-TOF massaspectrometrie een revolutie in de microbiologie? Besluit Breed toepasbaar op alle (gegroeide) micro-organismen Eenvoudige handeling, weinig materiaal vereist Snelste TAT voor identificatie micro-organismen Goede performantie: vergelijkbaar met 16S rrna gen sequencing! Goedkoper dan conventionele identificaties (manuele en automaten) Afhankelijk van aantal identificaties/dag! Kennis van taxonomie vereist (interpretatie resultaten) Kennis van beperkingen van de identificatietechniek Op te vangen met klassieke testen of 16S

67 MALDI-TOF massaspectrometrie een revolutie in de microbiologie? Besluit - Geschikt als methode voor identificaties microbiologie in routine - Inpasbaar in labautomatisatie microbiologie - Momenteel nog arbeidsintensief: stand alone - Veelbelovend: - Verdere uitbreiding van (eigen/commerciële) DATABANK - Identificatie rechtstreeks op HC en URINE - Toepassingen in EPIDEMIOLOGIE typeren stammen - Toepassingen opzoeken RESISTENTIE mechanismen in onderzoek REVOLUTIONAIR!

68 MALDI-TOF massaspectrometrie Click to add title een revolutie in de microbiologie! Click to add subtitle G. Coppens G. De Sutter 28 september 2010