Samenvatting. Samenvatting 207

Transcriptie

1 Samenvatting Op gezette tijden komen er magische middelen in de belangstelling die een heilzame werking zouden hebben bij nagenoeg alle kwalen. Recentelijk is melatonine op deze manier in de belangstelling gekomen. Belangrijk hiervoor was de uitgave van een boek van de onderzoekers Pierpaoli en Regelson met de suggestieve titel Het melatonine mirakel. Zonder gehinderd te worden door enige neiging tot terughoudendheid worden claims gelegd als zou melatonine heilzaam zijn bij hart- en vaatziekten, depressies, slaapstoornissen, kanker, aandoeningen van het immuunsysteem en nog veel meer. Zeer tot de verbeelding spreken de verjongende werking en de verlenging van het leven met wel 25%. Het is jammer dat door dergelijke populistische geschriften een veelbelovend nieuw onderzoeksgebied een beetje het karakter krijgt van een alternatieve geneeswijze en door sommigen enigszins minachtend wordt bekeken. Een ander boek, van de amerikaanse onderzoeker Russell Reiter, heeft eveneens een veelbelovende titel: Melatonine, het wondermiddel van het eigen lichaam. Inderdaad wordt ook hierin een breed scala aan mogelijke therapeutische toepassingen van melatonine beschreven, maar daarbij wordt duidelijk het onderscheid gemaakt tussen feiten en hypotheses. De gedegen kennis van de auteur over het gehele onderzoeksveld draagt bij tot een reëel beeld van de huidige stand van zaken en de vele open plekken die momenteel nog aanwezig zijn in onze kennis van dit veelbelovende hormoon. Melatonine is aan het einde van de jaren vijftig ontdekt, maar pas de laatste vijf tot tien jaar is duidelijk geworden hoe veelzijdig dit hormoon is. Het wordt aangemaakt in de pijnappelklier, een klein orgaantje in de hersenen, ongeveer ter grootte van een erwt. Bijzonder is dat de aanmaak alleen s nachts plaatsvindt; de aanwezigheid van licht leidt onherroepelijk tot een remming van de synthese. Als de stof dan ook in het bloed wordt gemeten, blijkt de concentratie een markant dag-nacht ritme te vertonen, waarbij de concentraties s nachts wel maal zo hoog zijn als overdag. Opvallend is verder dat dit ritme in melatonine produktie gehandhaafd blijft, ook als verder alle dag-nacht ritmes uit de omgeving, zoals het licht-donker, worden geëlimineerd. Het blijkt dan ook dat de melatonine produktie wordt aangestuurd door een klok in de hersenen. Deze klok heet de suprachiasmatische kern en is in staat om uit zichzelf allerlei ritmische processen in het lichaam aan te sturen. Dit kleine uurwerkje in onze hersenen vormt samen met enkele andere gebieden, waaronder de pijnappelklier, de biologische klok. De tijdsinformatie wordt vanuit de suprachiasmatische kern via zenuwbanen electrisch doorgegeven aan andere hersengebieden. Voor het doorgeven van tijdsinformatie aan de rest van het lichaam wordt gebruik gemaakt van een hormonaal signaal, namelijk melatonine. De tijdstippen van stijging en daling van de melatonineconcentratie geven informatie over de tijd van de dag. De duur van verhoogde melatoninespiegels geeft informatie over de tijd van het jaar (lange of korte nachten). Omdat de nachtwaarden van melatonine gedurende het leven continu afnemen, kan zelfs informatie over de ouderdom van het lichaam worden doorgegeven. Een belangrijke waarneming is geweest dat, hoewel de suprachiasmatische kern aan de ene kant de melatonine produktie aanstuurt, melatonine op zijn beurt weer de suprachiasmatische kern kan beïnvloeden. Hierdoor kan melatonine de biologische klok bijstellen. Op deze eigenschap is het effect van melatonine op slaapstoornissen en jet-l ag Samenvatting 207

2 gebaseerd. Dit zijn met name de indicaties waarvoor melatonine-achtige stoffen op dit moment in ontwikkeling zijn als een nieuwe klasse geneesmiddelen. Naast dit effect op de klok, is gebleken dat ook vele andere processen in het lichaam onder invloed staan van melatonine. Zo zou het een stimulatie geven van het immuunsysteem en zou melatonine in staat zijn om radicalen te neutraliseren. Radicalen zijn zeer reactieve stoffen die DNA-schade kunnen veroorzaken en kanker kunnen induceren. Veel van dit soort onderzoek bevindt zich echter nog in de dierexperimentele fase, of gebeurt zelfs nog in de reageerbuis. Over de therapeutische toepassingen voor de mens valt hier nog weinig te zeggen. In hoofdstuk 1 worden bovengenoemde zaken uitgebreid aan de orde gesteld. De mechanismen in de pijnappelklier die de melatonine produktie beïnvloeden, de diverse werkingen die melatonine in het lichaam zou hebben, de aangrijpingspunten van melatonine, de huidige stand van zaken in de ontwikkeling van nieuwe melatonine-achtige stoffen, en vooral de mogelijke therapeutische toepassingen bij de mens worden beschreven. Ook wordt een uitleg gegeven over de samenstelling van de biologische klok en specifieke karakteristieken hiervan, het wetenschapsgebied van de chronobiologie. Het onderzoek dat in dit proefschrift beschreven wordt, richt zich op de regulatie van de melatonine produktie, mede in relatie tot de suprachiasmatische kern en het gebrui k van melatonine metingen bij de ontwikkeling van melatonine-achtige stoffen tot mogelijk geneesmiddel. Een uitermate belangrijk onderdeel van het onderzoek betrof de ontwikkeling van een nieuwe techniek waarmee de produktie van melatonine gemeten kon worden in vrij bewegende proefdieren, meestal ratten. De basis voor deze techniek berust op het principe van dialyse en lijkt erg veel op de werking van een kunstnier. Waar in een kunstnier een bundel van duizenden dialyse slangetjes wordt gebruikt, wordt bij de zogenaamde microdialyse slechts één slangetje gebruikt. Om één zo n klein slangetje hanteerbaar te maken (de diameter is slechts een kwart millimeter) wordt het gefixeerd in een zogenaamde canule. Door het inbrengen van een canule in de pijnappelklier, was het mogelijk om continu kleine monsters uit de klier te halen en daarin de concentratie melatonine te meten. Deze monstername en melatonine meting kon on-line worden uitgevoerd en geautomatiseerd, zodat gedurende 24 uur per dag kon worden gevolgd hoeveel melatonine er geproduceerd werd. Hoofdstuk 2 geeft een gedetailleerd overzicht van de ontwikkeling van deze techniek, de gevolgde procedures en de gebruikte materialen. Ook bevat dit hoofdstuk gegevens over de karakterisering van de zeer gevoelige analytisch chemische bepalingen noodzakelijk voor de beoordeling van deze nieuwe onderzoeksmethode. De invoering van een nieuwe experimentele methode dient gepaard te gaan met een serie experimenten die de methode karakteriseren en die de (on)mogelijkheden van zo n methode aangeven. Hoofdstuk 3 geeft zo n karakterisering en exploratie van mogelijke toepassingsgebieden. De gemeten dagen nachtverschillen in melatonine produktie en de gevoeligheid voor TTX, een stof die de zenuw input van de klier tijdelijk stil kan leggen, tonen duidelijk aan dat deze on-line methode van melatonine metingen een betrouwbaar beeld geeft van de daadwerkelijke produktie in de klier. Verder bleek dat, hoewel ook gedurende de dag nog een laag restniveau van melatonine produktie meetbaar was, alleen de hoge nachtspiegels veroorzaakt werden door een actieve nerveuze stimulatie (zie hoofdstuk 4). Een groot voordeel van de gebruikte techniek is dat elke 20 minuten een 208 Samenvatting

3 meetpunt genomen wordt. Vergeleken met alternatieve technieken, waarbij vaak slechts om de paar uur gemonsterd wordt, betekent dit dat snel veranderende processen op de voet gevolgd kunnen worden. Deze dynamiek is benut in een tweetal experimenten waarin een korte stimulatie en remming van de innervatie werden aangebracht. Het bleek dat melatonine produktie slechts reageerde op de kortdurende inhibitie, een effect wat verklaard wordt uit het mechanisme achter de melatoninesynthese. Tot slot wordt in dit hoofdstuk aandacht besteed aan de invloed van de suprachiasmatische kern en een aanverwant hersengebied (dorsomediale hypothalamus, DMH) op de melatonine produktie. Na weghalen van de suprachiasmatische kern bleek dat deze absoluut noodzakelij k was voor de ritmiek in melatonine produktie, maar niet direct voor de amplitude. Verder bewees de zogenaamde dubbele canule methode, dat de verbindingen van de pijnappelklier met de hersenen tot in detail bestudeerd kunnen worden. Bij deze dubbele canule methode werd naast één canule in de pijnappelklier een tweede canule in de DMH geplaatst. De markante effecten die stoffen, ingebracht in de DMH, kunnen hebben op de melatonine produktie in de pijnappelklier, maken deze methode bij uitstek geschikt om als functioneel model gebruikt te worden bij de studie naar onderlinge verbindingen tussen hersengebieden. De belangrijkste intermediair tussen de suprachiasmatische kern en de pijnappelklier is het sympatische zenuwstelsel. Zenuwuiteinden in de pijnappelklier geven s nachts de neurotransmitter noradrenaline af, die via de activatie van β-adrenerge receptoren op de pijnappelklier de melatonine produktie initiëert en onderhoudt. In hoofdstuk 4 is de aandacht met name gericht op deze sympathische innervatie. Verschillende adrenerge stoffen zijn gebruikt om de relatie tussen β-adrenerge stimulatie en melatonine produktie te bestuderen. Tevens werd de regulerende rol van α-adrenerge receptoren op β-adrenerge stimulatie getoond. Een belangrijk vervolg was de directe meting van de noradrenaline afgifte zelf. Hiervoor was het noodzakelijk om een recent ontwikkelde zeer gevoelige analyse methode te introduceren, welke in hoofdstuk 2 uitgebreid beschreven wordt. Het bleek dat noradrenaline nog markantere dag-nacht variaties vertoonde dan melatonine zelf en min of meer aan en uit ging, in plaats van steeg en daalde. Het aanen uitgaan was tevens symmetrisch gelegen ten opzichte van het begin en einde van de nacht. Deze opvallende karakteristieken kunnen geïnterpreteerd worden als een directe meting van de klok-activiteit zelf. De sympathische innervatie werd verder gekarakter i- seerd met TTX, een remmer van zenuwactiviteit, yohimbine, die de presynaptische regulatie beïnvloedt, en cocaïne, die de heropname van noradrenaline in het zenuwuiteinde vermindert. Naast de sympathische innervatie staan vrijwel alle organen in het lichaam ook onder invloed van het parasympathische zenuwstelsel, met als belangrijkste neurotransmitter acetylcholine. Voor de pijnappelklier waren de gegevens over de rol van deze parasympathische input tot dusver tamelijk tegenstrijdig. In hoofdstuk 5 wordt de invloed van cholinerge stoffen op de melatonine produktie beschreven. Het bleek dat vooral s nacht s deze cholinerge invloed zeer markant inhiberend was en gemediëerd werd door muscarine receptoren. Ook wordt in hoofdstuk 5 duidelijk waarom er zoveel tegenstrijdigheid op dit punt is gemeten. Het bleek dat de parasympathische invloed niet direct op de melatonine produktie gericht was, maar indirect, via het sympathische zenuwstelsel. Dergelijke presynaptische effecten zijn in in vitro modellen, waarin de innervatie door- Samenvatting 209

4 gaans afwezig is, moeilijk te meten. Uit deze gegevens blijkt dus dat er wel degelijk een markante parasympathische inhibitie van melatonine produktie mogelijk is. In hoeverre deze inhibitie onder normale fysiologische omstandigheden actief is, is nog onduidelijk, omdat pogingen om de parasympathische innervatie direct te meten tot dusver niet geslaagd zijn. Zoals gezegd is melatonine een belangrijk onderdeel van de biologische klok. De afgif te vindt ritmisch plaats, met piekwaarden gedurende de nacht. Ritmes met een dergelijke periode van ongeveer een dag worden ook wel circadiane ritmes genoemd. Vanaf hoofdstuk 6 staat de circadiane ritmiek in de belangstelling. Omdat in de proefopzet er een operatie plaats vindt (implanteren van de canule in de pijnappelklier) op de dag voor de melatoninemetingen, is het interessant te weten of een dergelijke operatie de circadiane ritmiek verstoort. Daartoe zijn in hoofdstuk 6 een aantal experimenten beschreven, waarbij de circadiane ritmes van activiteit en lichaamstemperatuur zijn gemeten vooren na operatie. Deze metingen konden plaatsvinden dankzij van tevoren geïmplanteerde sensoren met ingebouwde zendertjes in de buikholte van de ratten. De zendertjes zenden continu de gegevens over bewegingsactiviteit en lichaamstemperatuur naar een onder de kooi geplaatste ontvanger. Om een goed beeld te krijgen van de specifieke effecten van implantatie van een canule in de pijnappelklier, werd deze operatie vergeleken met een standaard microdialyse operatie. Verder werden de effecten van verschillende soorten anaesthetica gemeten. Het bleek dat inderdaad de ritmiek drastisch verstoord werd, vooral na operaties. Dit kwam echter met name tot uiting in de hoogte van de activiteitsen temperatuursritmes. De achterliggende klok leek niet te worden beïnvloed. De effecten van operaties duurden aanmerkelijk langer dan die van anaesthetica. Onderlinge verschillen tussen twee soorten operaties, of tussen twee soorten anaesthetica waren miniem. Vooral het feit dat het onderliggende klokmechanisme niet aangetast werd was belangrijk voor vervolgstudies. Zoals in latere hoofdstukken zal blijken, heeft het melatonineritme niet te lijden onder de operatie. Een belangrijke eigenschap van melatonine, die ten grondslag ligt aan de positieve werking op slaap-waak ritmes en jet-lag, is het zogenaamde entraineren. Wanneer organismen verstoken zijn van enige afwisseling tussen licht en donker in de omgeving, de zogenaamde vrij-loop omstandigheden, zal hun eigen klok (suprachiasmatische kern) het dag-nacht ritme op gaan leggen. Een nadeel hiervan is dat de biologische klok dan gaat afwijken van de normale klok. De biologische klok heeft namelijk een periode die niet helemaal 24 uur is. Bij de mens bedraagt één dag van de biologische klok ongeveer 25 uur. Normaal gesproken is dit niet zo erg, omdat licht-donker wisselingen in de omgeving in staat zijn elke dag de biologische klok een klein beetje bij te stellen, zodat hij toch weer op tijd loopt. In vrij-loop omstandigheden is dat niet het geval en zal na enige dagen de biologische klok geheel verschillen van de normale tijd. In zo n situat ie kan melatonine, elke dag op een specifiek tijdstip gegeven, de bijstellende rol van het licht overnemen. Dit verschijnsel wordt entraineren genoemd. Kortom, een biologische klok die niet gelijk loopt, kan gelijk gezet worden met melatonine. Van dit bijstellende effect wordt in hoofdstuk 7 gebruik gemaakt. In dit hoofdstuk wordt de ontwikkeling van een model beschreven waarmee melatonine-achtige stoffen, die mogelijkerwijs geneesmiddel zouden kunnen worden, getest kunnen worden op hun vermogen om net als melatonine de biologische klok bij te stellen. Daartoe werden ratten 210 Samenvatting

5 gedurende een periode van 2 of 4 weken in het continu donker geplaatst en werd aan het einde van die periode met microdialyse gedurende een complete cyclus van 24 uur de melatonine produktie gemeten en vergeleken met het ritme van melatonine produkt ie onder normale licht-donker omstandigheden. Wanneer geen stoffen werden toegediend in die periode van 2 tot 4 weken, bleek inderdaad het melatonine profiel geheel verschoven te zijn ten opzichte van de controle situatie. Volgens verwachting was dit niet het geval wanneer dagelijks melatonine zelf werd toegediend. Een aantal melatonine-achti ge stoffen zijn op deze manier getest, en één hiervan werkte inderdaad vergelijkbaar aan melatonine. Een opmerkelijke bevinding bij deze experimenten was, dat de hoogte van de nachtelijke melatoninespiegels na chronische toediening van melatonine, verlaagd was. In tegenstelling hiermee leidde chronische toediening van melatonine-achtige stoffen juist tot een stijging van de nachtelijke melatonine produktie. Het mechanisme wat hierachter zit is helaas nog niet bekend. Een vervolgstudie zou moeten aantonen welk van de mogelijke verklaringen de juiste is. Therapeutisch gezien is dit echter een zeer interessante bevinding. Tot dusver waren nog nooit experimenten beschreven waarin chronische melatonine toediening leidde tot een daling van de lichaamseigen produktie. Omdat algemeen wordt aangenomen dat hogere spiegels gunstiger zijn dan lage, lijkt dus het gebruik van melatonine-achtige stoffen duidelijk de voorkeur te verdienen boven het gebruik van melatonine zelf. Voor een definitieve uitspraak hierover is het echter wel van belang dat deze vinding bevestigd wordt in humane studies. Veel mensen zullen bekend zijn met het fenomeen jet-lag. Een plotselinge verschuiving van het dag-nacht ritme, veroorzaakt door het vliegen door verschillende tijdzones, leidt vaak tot slaapproblemen en een algeheel gevoel van misère. In hoofdstuk 8 wordt een jet-lag kunstmatig nagebootst door plotseling het ritme waarin de lichten aan en uit gaan te verschuiven. Op verschillende dagen na deze kunstmatige jet-lag werd vervolgens gedetailleerd het 24-uurs melatonine patroon gemeten. Gedurende de eerste dagen na de kunstmatige jet-lag, werd er opvallend genoeg helemaal geen melatonine meer geproduceerd. In de daaropvolgende dagen kwam het normale patroon langzaam terug, waarbij het profiel van melatonine produktie in deze overgangssituatie vreemde kenmerken vertoonde. De hoge tijdsresolutie waarmee de melatonine in het gebruikte on-line systeem gemeten werd, maakte het mogelijk om uit deze overgangssituatie een aantal karakteristieken van de suprachiasmatische kern af te leiden. Op basis van deze karakteristieken werd een hypothese opgesteld. In deze hypothese wordt verondersteld dat de suprachiasmatische kern niet één klok is, maar op zijn minst bestaat uit twee klokken, die verschillend reageren op een kunstmatige jet-lag. Dit verschil in respons is mede de oorzaak van de problemen die bij jet-lag ontstaan. Toekomstig onderzoek zal deze hypothese verder moeten onderbouwen. Tot slot wordt in hoofdstuk 9 een slotbeschouwing gegeven. De diverse resultaten van alle onderzoeken, zoals vermeld in dit proefschrift, worden hierin voor zover mogelij k met elkaar in verband gebracht. Om de discussie te stimuleren, hebben sommige delen van deze slotbeschouwing een wat subjectief en speculatief karakter. De vele aanwijzingen in dit hoofdstuk voor vervolgonderzoek dienen als mogelijke uitgangspunten voor toekomstige projecten. Samenvatting 211

6 212 Samenvatting