Downloaded from UvA-DARE, the institutional repository of the University of Amsterdam (UvA)

Transcriptie

1 Downloaded from UvA-DARE, the institutional repository of the University of Amsterdam (UvA) File ID Filename Version uvapub:63195 Chapter 9: Samenvatting final SOURCE (OR PART OF THE FOLLOWING SOURCE): Type PhD thesis Title The molecular mechanism of Atp8b1-deficiency Author(s) A. Groen Faculty AMC-UvA Year 2009 FULL BIBLIOGRAPHIC DETAILS: Copyright It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content licence (like Creative Commons). UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( (pagedate: )

2 Chapter 9 Chapter 9 Samenvatting 147

3 Samenvatting Samenvatting Progressieve familiaire intrahepatische cholestase (PFIC) is een ernstige vorm van cholestase die zich voordoet bij jonge kinderen. Er zijn drie typen PFIC bekend, PFIC1-3, die worden veroorzaakt door mutaties in respectievelijk ATP8B1, ABCB11, and ABCB4. Al deze genen coderen voor transporteiwitten die nodig zijn voor een juiste galvorming. Een defect in één van deze eiwitten resulteert in verminderd galzout transport van de lever naar de gal (hepatobiliair) en daarmee in cholestase. Deze ziekten zijn progressief en kunnen uiteindelijk leiden tot leverfalen als de patiënten niet getransplanteerd worden. Dit proefschrift is gericht op het mechanisme van de ATP8B1-geassociëerde ziekte. PFIC1 en BRIC1 (een milde vorm van PFIC1) worden veroorzaakt door mutaties in het gen ATP8B1. 1,2 Het doel van het onderzoek dat in dit proefschrift gepresenteerd wordt was om de pathofysiologische mechanismen die bij de ATP8B1-geassociëerde ziekte horen te onderzoeken. In dit onderzoek hebben we gebruik gemaakt van een muismodel voor PFIC1, de Atp8b1 G308V/G308V muis. In Hoofdstuk Eén wordt een overzicht gegeven van galzout synthese, het mechanisme van galvorming en de eiwitten die daarin een rol spelen. Ook wordt er een algemeen overzicht gegeven over erfelijke vormen van intrahepatische cholestase. Hoofdstuk Twee beschrijft de karakterisering van de Atp8b1 G308V/G308V muizen (129/SvImJ achtergrond). De muizen zijn homozygoot voor de meest voorkomende PFIC1 mutatie die in de Amish populatie is gevonden, een puntmutatie die de glycine op aminozuur 308 vervangt door een valine. Patiënten die homozygoot zijn voor deze mutatie hebben een verlaagde galzout uitscheiding en leiden aan ernstige cholestase en progressieve leverziekte. Hoewel de dieren verhoogde serum galzout waarden hadden, hebben ze geen verlaagde hepatobiliaire galzout uitscheiding. Deze muizen hebben juist een verhoogde galzout uitscheiding naar de gal in vergelijking met wildtype muizen: Terwijl wildtype muizen cholestase ontwikkelden tijdens een infuus met het hydrofobe galzout taurodeoxycholaat (TDC), behielden Atp8b1 deficiënte muizen een hoge galzout uitscheiding. In deze experimenten observeerden we in Atp8b1 deficiënte muizen een verhoogde hydroxylering van TDC naar taurocholaat (TC), wat de bescherming tegen de TDC-geïnduceerde cholestase in deze muizen verklaart. Het voeren met een cholaat dieet leidde tot een dramatische, maar variabele, toename in de serum galzout waarden in de mutante muizen, terwijl er geen effect was in de wildtype muizen. De conclusie op dat moment was dat Atp8b1 deficiëntie de galzout homeostase aantast zonder een defect in de galvorming, en dat het fenotype waarschijnlijk veroorzaakt wordt door een hogere galzout opname in de darmen. 148

4 Chapter 9 Dit aspect werd daarna gedetailleerd onderzocht. In Hoofdstuk Drie werd de galzout absorptie in de darmen bestudeerd in de context van coprofagie. Coprofagie betekent dat dieren hun uitwerpselen eten. Wildtype en Atp8b1 G308V/G308V muizen werden gehuisvest in metabole kooien (waardoor coprofagie wordt uitgesloten) en kregen een controle of cholaat dieet. In portaal en systemisch bloed werden de galzout species geanalyseerd. In het geval van het controle dieet had coprofagie weinig effect op de perifere galzout samenstelling. In het geval van een cholaat dieet was de hoeveelheid secundaire galzouten in perifeer en in portaal bloed aanzienlijk verhoogd door coprofagie. Coprofagie is dus een belangrijke factor in studies waarin het voeren van galzout bestudeerd wordt. Tussen Atp8b1 G308V/G308V en wildtype dieren waren geen duidelijke verschillen in portale en perifere galzout species en concentraties. Deze data suggereerden dat er geen verhoogde galzout resorptie in de darmen is in Atp8b1 G308V/G308V muizen. Hoofdstuk Vier geeft data weer die bewijzen dat de verhoogde serum galzout waarden in Atp8b1 G308V/G308V muizen niet worden veroorzaakt door verhoogde galzout resorptie in de darmen. We onderzochten galzout transport in de darmen door middel van Ussing kamer experimenten en intestinale galzout perfusies in situ. We vonden geen veranderde intestinale galzout opname in Atp8b1 G308V/G308V muizen in vergelijking met wildtype muizen. Galzout voeren resulteerde in verhoogde serum galzout waarden in Atp8b1 G308V/G308V muizen. Echter, de intestinale galzout opname was verlaagd in plaats van verhoogd. Dit onderzoek laat zien dat de darmen van Atp8b1 G308V/G308V muizen op een vergelijkbare manier omgaan met galzouten als de darmen van wildtype muizen. De voornaamste conclusie van Hoofdstuk Vijf is dat de afwezigheid van Atp8b1 leidt tot een instabiel canaliculair membraan in de hepatocyt. In Atp8b1 G308V/G308V muizen resulteerde infusie van TC in een verhoogde biliaire uitscheiding van cholesterol en canaliculaire ectoenzymen vergeleken met wildtype muizen. Een belangrijk gegeven is dat gal van de Atp8b1 G308V/G308V muizen phosphatidylserine (PS) bevatte, een aminofosfolipide dat voornamelijk in de binnenste laag van het canaliculaire membraan hoort te zitten. Dit fenotype was afhankelijk van de hydrofobiciteit van het galzout, want infusie met tauroursodeoxycholaat (TUDC) veroorzaakte deze effecten niet. Single-pass perfusie van de geïsoleerde lever met TDC resulteerde in een significant verlaagde biliaire uitscheiding en daarmee samenhangende ophoping van TDC in de lever. Uit deze observaties kwam de hypothese dat Atp8b1 van belang is voor het verlagen van de hoeveelheid PS in de buitenste laag van het canaliculair membraan zodat de relatieve sphingolipide hoeveelheid toeneemt. Sphingolipiden en cholesterol vormen een rigide, liquidordered membraan dat resistent is tegen detergente galzouten. Atp8b1-deficiëntie leidt dus tot het verlies van de normale phospholipide asymmetrie van het canaliculaire membraan. Het 149

5 Samenvatting gevolg is dat het canaliculaire membraan gevoeliger wordt voor extractie van cholesterol door hydrofobe galzouten. Op grond van onze data stellen we voor dat hierdoor de activiteit van de galzout transporter ABCB11 aangedaan zal zijn, met als gevolg cholestase. In Hoofdstuk Zes demonstreren we dat de verhoogde biliaire cholesterol uitscheiding in Atp8b1 G308V/G308V muizen niet afhankelijk is van de aanwezigheid van de sterol transporter Abcg5/g8. Om dit te bewijzen genereerden we dubbel transgene Atp8b1 G308V/G308V /Abcg8 -/- (GF) muizen. Infusie van TC in deze GF muizen liet eenzelfde fenotype zien als in Atp8b1 G308V/G308V muizen, wat aangaf dat de verhoogde biliaire cholesterol uitscheiding werd veroorzaakt door aspecifieke extractie en niet door verhoogde Abcg5/g8 activiteit. 1 Deze data ondersteunen onze theorie dat afwezigheid van Atp8b1 er voor zorgt dat het canaliculaire membraan in een meer liquid-disordered toestand komt waardoor aspecifieke extractie van cholesterol mogelijk is. In Hoofdstuk Zeven werden muizen zonder zowel Abcb4 als Atp8b1 bestudeerd. De aanwezigheid van Atp8b1 is niet belangrijk als Abcb4 ook ontbreekt, omdat het fenotype van de dubbel mutante (MF) muizen minder ernstig is dan dat van de Atp8b1 G308V/G308V muizen: de extractie van ectoenzymen is verminderd in de MF dieren in vergelijking met de Atp8b1 G308V/G308V muizen, evenals de fibrose in vergelijking met de Abcb4 -/- muizen. 2 Uit deze data volgde de hypothese dat de buitenste laag van het canaliculaire membraan redelijk galzout resistent is ondanks de afwezigheid van Atp8b1. We stellen een model voor waarin PC flopping door Abcb4 het canaliculaire membraan in een meer liquid-disordered toestand brengt. Onder normale omstandigheden wordt dit tegengegaan door compensatoire PS flipping door Atp8b1. In de afwezigheid van PC flopping, is de werking van Atp8b1 minder cruciaal. Referenties 1. Bull LN, van Eijk MJ, et al. A gene encoding a P-type ATPase mutated in two forms of hereditary cholestasis. Nat Genet 1998;18: Klomp LW, Vargas JC, et al. Characterization of mutations in ATP8B1 associated with hereditary cholestasis. Hepatology 2004;40: Omdat Abcg8 -/- muizen een C57Bl/6J achtergrond hebben, zijn al deze experimenten gedaan met muizen van deze achtergrond. De C57Bl/6J achtergrond veroorzaakt andere parameters in galvorming (zie Perspectives). 2 Omdat Abcb4 -/- muizen een FVB achtergrond hebben, zijn al deze experimenten gedaan met muizen van deze achtergrond. De FVB achtergrond veroorzaakt andere parameters in galvorming (see Perspectives). 150