Fragmentocyten - betekenis en standaardisatie. ASO Annelies Fraeyman 02/03/2010

Transcriptie

1 Fragmentocyten - betekenis en standaardisatie ASO Annelies Fraeyman 02/03/2010

2 Overzicht Aanleiding CAT Fragmentatie hemolyse Definitie fragmentocyt & bruikbaarheid Studie OLV Detectieprincipes (celteller/flagging, microscopie, ) Telling Studie OLV Betekenis fragmentocyten: casussen Rondvraag Vlaamse labo s Conclusie

3 Aanleiding CAT onderzoek 1. Geen consensus over de definitie voor schistocyten- Geen standaardisatie v/d identificatie 2. Geen consensus over telling & rapportering intra- en interindividuele variatie 3. FRC vaak in kleine aantallen aanwezig belangrijke statistische variatie i/d telling 4. Moeilijke standaardisatie v/h beoordelingsgebied in het uitstrijkje 5. Betekenis schistocyten?

4 Fragmentatie hemolyse Hemolytische anemie, Microangiopathische vorm

5 Fragmentatie van RBC - mechanismen Hitte 49 C in vitro, soms 46 C bij erfelijke vormen van hemolytische anemie brandwonden Mechanisch Mars hemoglobinurie, trombectomie, cardiopulmonaire bypass, extra-corporele hemodialyse, kunstkleppen, DIC, TTP-HUS, Osmotisch

6 Mechanische destructie van RBC 1. Vaatwandruptuur schuifspanning 2. Inflammatie vaatwand fibrinevorming

7 Mechanisme fragmentatie Hoofdzakelijk via afsnijden door fibrinedraden (TMA) Micro-sfero-schistocyten aan uiteinden vh uitstrijkje

8 Fragmentatie hemolyse = vorm van intravasculaire hemolyse Toename vrij Hb in plasma Vrij Hb in urine (hemoglobinurie) Hemosiderine in urine (hemosiderinurie)

9 Micro/Macroangiopathische hemolytische anemie Mechanische beschadiging van RBC i/d circulatie intravasculaire hemolyse & fragmentocyten TTP HUS DIC urgenties Fu BM-Tx TTP (Pre)eclampsie maligne hypertensie scleroderma renal crisis intravasculaire voorwerpen (bv. kunstkleppen, )

10 Definitie fragmentocyt Not clear cut!

11 Definitie? Schistocyt shistos (Gr.) = verdeeld, deelbaar, afgescheiden" schizein (Gr.) = knippen, klieven, scheiden gefragmenteerde RBC Vaak samen met andere poikylocyten zoals acantocyten, keratocyten, sferocyten en echinocyten (ook geassocieerd met fragmentatie)

12 Definities Dacie & Lewis Fragmentatie = conditie met 3 typen cellen 1. Kleine fragmenten in verschillende vormen soms met scherpe uiteinden of hoeken, soms met ronde contour, meestal diep gekleurd, maar soms bleek (tgv Hb verlies) 2. Grotere cellen: onregelmatige of ronde contour waarvan fragmenten afgesplitst zijn. Hieronder vallen helmcellen. 3. Normale ongefragmenteerde volw RBC en reticulocyten B.Bain Fragmenten van RBC gevormd door fragmentatie van abnormale cellen. Bij mechanische schade vaak coëxistentie met keratocyten. Veel schistocyten zijn puntig. Wintrobe RBC in de vorm van een sikkel, helm, driehoek en/of microsferocyten Hoffbrand Geen definitie!

13 Definitie? Consensus? Vaak discrepantie tss theorie en praktijk intra- en interlabo variatie

14 Consensus report French Group of Cellular Haematology (= ref. orgaan v/d French Society of Haematology) fragmenten in de vorm van een driehoek, sikkel, helm met een recht snijvlak (dus kleinere RBC dan initieel) minstens 2 hoeken = gevolg van in vivo fragmentatie door fibrine draden

15

16 Referentiebeelden

17 Voorbeelden schistocyten driehoek helm sikkel kattekop chapeau de gendarme

18 Géén schistocyten - vbn RBC met stekels RBC met gat Twijfelachtige schistocyten - vbn Bite cell staafvormig

19 Bruikbaarheid definitie? Korte enquête

20 Definitie schistocyt (French Group of Cellular Hematology) = RBC fragmenten in de vorm van een driehoek, sikkel, helm met een recht snijvlak

21 Welke afgebeelde RBC afwijkingen voldoen volgens u aan de definitie?

22 Oplossing: consensus >75% Biologen (n=24) Groupe français d hématologie cellulaire (Delphi methode)

23 Rondvraag definitie Aantal deelnemers n=18 Experts: 4 hematologen Assistenten: 4 MLT s: 10 Resultaten Totaal: gemidd 17 op 38; range 6-29 Experts: gemidd 21 ; range Assistenten: gemidd 20.7 ; range MLT s: gemidd 14.3 ; range van de 38 FRC door >50% deelnemers herkend (37%) 12 van de 38 FRC door 1/3 niet herkend (31.6%) Veel gemaakte opmerking: volgens buikgevoel zou men meer FRC tellen dan obv definitie

24 Oplossing: score +/- antwoorden Door meer dan 50% herkend Door 1/3 niet herkend

25 Detectie fragmentocyt

26 Detectiemogelijkheden Microscopie Sysmex RET channel ADVIA 120 Grootte BPL Brekingsindex BPL Celtellers: review nodig owv veel VP

27 Sysmex Roche XE-2100 Kleine RBC zonder RNA in RET kanaal

28 MVR

29 MVR Discriminator celteller: 100

30

31 Relatie tss FRC% (Celteller) en andere parameters

32 Advia 120 analyser - Bayer Partikels met grootte BPL Kleiner dan 30fL, laserhoek 2-3 Andere brekingsindex dan BPL, nl. > 1,4 densiteit, laser 5-15 Treshold: /µL Bevat niet alleen FRC: VP 0,2-0,3%

33 Speciale software voor digitale beelden Daling inter-morfologist variatie Criteria: opp, circulariteit, verhouding l/b, diameter equivalent Correctie achteraf

34 Detectie - besluit Blijft gelinkt aan de morfologie! Dus microscopie = noodzakelijk Klinische context = gewenst Neonati, prematuren: FRC = fysiologisch

35 Telling FRC

36 Telling Stabiliteit FRC% op Tk toename van 14% /24h

37 Enquête FGH: vb. van rondgestuurd beeld Aantal FRC?

38 Antwoorden enquête FGH: #getelde schistocyten

39 Studie fragmentocyten

40 Studie opzet 165 stalen Controlegroep: 20 NL Pathologische groep 8 TTP-HUS 29 kunstkleppen, waarbinnen 24 metalen kleppen & 5 bioprothesen 22 dialyse 10 neonati 29 IZ 47 ziek (patiënten van oncologie, algemene heelkunde, nefrologie, patiënten met ferriprive anemie, myelofibrose, myelodysplasie, HbS trait, VKF, MVP, )

41 Studie opzet Celteller Sysmex CBC + RET channel Flag? FRC 10*6/µL, FRC%, RBC fragm Automatische microscoop Cellavision DM96 9 velden omzetten in een volume Correlatie met bloedplaatjestelling Visuele telling schistocyten op 9 velden door 1 persoon (daling variatie): echte FRC (recht snijvlak) en TW FRC Cut-off? Wanneer rapporteren? oa rondvraag Betekenis schistocyten Significant verschil tss groepen?

42 aantal plaatjes Celteller (x10*3/µl) BPL telling Lineair verband tss #BPL in 9 velden (Cellavision) met #BPL 10*3/µL (Celteller) correlatie plaatjestelling Celteller - Cellavision 700 Lineair (BPL celteller vs # in 9 velden Cellavision) 600 y = x R 2 = aantal plaatjes 9 velden Cellavision

43 Histogram - som alle FRC controlegroep

44 Box Whisker plot - som alle FRC 50.5 rr Neo Z Kl TTP D IZ NL Neo Zi Kl TTP Di IZ NL Significantieniveau 0,05/7= 0,

45 Histogram - som alle FRC Cut-off = 7 FRC

46 ROC curve - som alle FRC Cut-off = 7 FRC

47 Cut-off Hoeveel schistocyten zijn aanwezig bij fragmentatie hemolyse? Literatuur NL (n=20) Mean 0,05% PV 58%, cut off < 0,5% Studie OLV Mean *3/µL (=0,053%); SD 2 (range 0-7, median 2) TTP-HUS (n=6) Mean 8,4% (range 1-18%) Mean *3/µL (= 2,6%); SD 112 (range , median 50) Dialyse (n=22) Mean 0,05%, PV % Mean 9 10*3/µL (= 0,2%); SD 6 (range 1-24, median 7) Kleppt (n=9) Mean 0,18% (range 0,2-0,3%), PV %, Mean 12 10*3/µL (= 0,26%); SD 19 (range 1-105, median 9) IZ (n=29) Mean 30 10*3/µL (= 0,66%); SD 32.5 (range 3-146, median 17) ziek (n=47) Neonati (n=10) Mean 27 10*3/µL (= 0,6%); SD 34 (range 2-189, median 13) Mean 24 10*3/µL (= 0,53%); SD 40.8 (range 1-137, median 14.5)

48 Controle populatie Literatuur bovengrens = 0,2% = 9.10*3/µL OLV studie 7 FRC in 9 velden = 7.10*3/µL

49 TTP populatie TTP Literatuur: > 1% of 2 schistocyten/veld (100x) is suggestief voor TTP-HUS = 45.10*3/µL OLV studie: mediaan = 50,5.10*3/µL

50 Histogram - som echte FRC controlegroep

51 Box Whisker plot - som echte FRC per groep rr Neo Z Kl TTP D IZ NL Neo Zi Kle TTP Di IZ NL Significantieniveau 0,05/7= 0,007

52 Histogram - som echte FRC Cut-off = 4.5 FRC

53 ROC curve - som echte FRC Cut-off = 4.5 FRC

54 Histogram - ratio FRC/BPL controlegroep TTP-HUS groep

55 Box Whisker plot - Ratio FRC/BPL

56 Frag Celteller #FRC Celteller (10*6/µL) % FRC Celteller Correlatie microscopie waarden celteller? DM96 vs SYS %FRC 6 DM96 vs SYS #FRC 10*6/µL 5 0, DM96 vs SYS 0,2 0,15 DM96 vs SYS #FRC 2 1 0,1 0, aantal FRC in 9 velden (DM96) aantal FRC in 9 velden (DM96) DM96 vs SYS Frag DM96 vs SYS aantal FRC in 9 velden (DM96)

57 Flagging? FRC>7 FRC =of<7 totaal flag ,0 geen flag ,0 totaal ,0 Sensitiviteit flagging 35% Specificiteit flagging 89% PPV 85% NPV 44% False positive rate 11% False negative rate 65% LR - 1 LR + 3

58 FRC op rapport in Glims? FRC>7 FRC =of<7 totaal FRC op rapport geen FRC op rapport totaal Sensitiviteit rapportering 59% Specificiteit rapportering 95% PPV 97% NPV 44% False positive rate 5% False negative rate 41% LR - 0 LR + 12 Power 1

59 Betekenis Fragmentocyt

60 Casus 1 Dame, 1961 VG: ethylproblematiek + levercirrose Bij opname: algemene achteruitgang, BWZ daling, respiratoire achteruitgang Trombopenie met diffuse bloedingen ovv epistaxis, melena, Ac. nierinsufficiëntie IZ: sepsis met E. coli, koorts, neurologische symptomen, verdere plaatjesdaling RDW-CV *14.2 % Wbc *12730 /µl Rbc * e6/µl HGB *9.1 g/dl Hct *25.5 % MCV *92.4 fl Trombocyt *75 10e3/µl Kr 5.06 mg/dl MDRD *9 ml/min/1.73m2 Haptogl 2.91 g/l Bilto 1.1 mg/dl Bildi 0.5 mg/dl LDH 603 U/l CRP mg/l

61 Vermoeden TTP-HUS dag 3

62 Vermoeden TTP-HUS dag 3

63 # FRC in 9 velden = 50

64 Casus 2 Dame, 1962 Spoedopname wegens Algemene achteruitgang Laatste 2 weken meer vermoeid, dysnpee d effort, malaise, Icterisch, witte sclera Geen medicatie, geen VG Wbc *5420 /µl Trombocyt *70 10e3/µl Rbc * e6/µl RDW-CV *21.6 % SIS_DM_Anis {<++} SIS_DM_Poik {<++} HGB *5.8 g/dl Hct *16.4 % MCV *113.1 fl Retic 29.6 /1000_RBC D-Dimeren Bilto Bildi LDH Haptogl CRP Foliumz VIT B12 >5000 µg/l 2.5 mg/dl 0.5 mg/dl U/l <0.20 g/l 8.94 mg/l 1.4 µg/l 197 ng/l BM: Celrijk beenmerg met zeer celrijke mergbrokjes. Goed vertegenwoordigde myeloïde reeks met reuzenvormen, hypersegmentatie,... Zeer sterke, megaloblastische rode reeks (uitgesproken megaloblastisch, kernbudding, bijkernen, abnormale kernaflijning). Relatief veel mitosefiguren. Enkele hypersegmentaire megakaryocyten. Meerdere gelyseerde cellen.

65 Megaloblastische anemie

66 Megaloblastische anemie

67 # FRC in 9 velden = 55

68 Betekenis FRC op IZ?

69 #FRC in 9 velden Correlatie #dagen op IZ en #FRC? Correlatie #d op IZ en #FRC in 9 velden correlatie #d op IZ en #FRC Lineair (correlatie #d op IZ en #FRC) y = x R 2 = #d op IZ

70 Betekenis FRC = belangrijk urgente therapie Bij micro- en macro-angiopathie Ikv verspreide trombosen tijdens trombotische micro-angiopathie (TMA) Oorzaak van hemolytische anemie tijdens TMA bevestigen diagnose TMA Scoringssysteem voor BMT-TMA gebaseerd op aantal FRC (prognostisch belang)

71

72 Rondvraag FRC

73 Inhoud rondvraag 38 rondvragen verstuurd -18 antwoorden ontvangen (=47%) Definitie Detectie Manuele microscopie aantal velden Automatische microscopie aantal velden Andere methode? Manier van rapporteren: kwalitatief, (semi-) kwantitatief

74 Gebruikte definitie & rapportering in Vlaamse labo s Defnitie Geen consensus Vaak verwijzing naar handboeken Vaak opm dat standaardisatie moeilijk is 7 op 18 labo s (=38%)hanteren een duidelijke definitie die analoog is aan die van FGH Rapportering ook niet gestandaardiseerd Vaak rapportering obv buikgevoel

75 Wijze van opsporen & rapporteren FRC in Vlaamse labo s AANTAL RONDVRAGEN 38 aantal antwoorden 18 duidelijke definitie analoog aan FGH 7 aantal manuele microscopie 18 aantal velden min aantal velden 5 max aantal velden 25 aantal automatische microscoop 1 aantal andere methode (flagging) 11 aantal kwalitatieve rapportering 6+2 aantal (semi)kwantitatieve rapportering Kwantitatieve rapportering indien veel FRC of op aanvraag (anders enkel kwalitatief) 10+2

76 Besluit FRC

77 Besluit CAT Definitie = RBC fragmenten in de vorm van een driehoek, sikkel, helm met een recht snijvlak (dus kleiner dan oorspronkelijke RBC) & minstens 2 hoeken Training in herkennen FRC Telling op aanvraag (aparte analyse): 9 velden automatische microscopie (= # per ± 2000 RBC, #.10*3/µL) Cut-off: 7 FRC.10*3/µL Rapportering: # 10*3/µL Rekening houden met klinische context

78 Bedankt voor uw aandacht! Suggesties, opmerkingen, vragen?