Handleiding RespiFinder RG Panel

Transcriptie

1 Maart 2013 Handleiding RespiFinder RG Panel 25 Versie 1 Kwalitatieve in-vitrodiagnostiek Voor gebruik met Rotor-Gene Q-apparaten PathoFinder B.V., Randwycksingel 45, 6229 EG Maastricht, NEDERLAND Gedistribueerd door QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, Hilden, DUITSLAND R NL Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample & Assay Technologies QIAGEN is marktleider in het bieden van innovatieve sample- en assaytechnologieën, waarmee bestanddelen van elk biologisch sample kunnen worden geïsoleerd en gedetecteerd. Onze geavanceerde, kwalitatief hoogwaardige producten en diensten verzekeren succes van sample tot resultaat. QIAGEN zet de standaard voor: Opzuivering van DNA, RNA en eiwitten Nucleïnezuur- en eiwit-assays microrna-onderzoek en RNAi Automatisering van sample- en assaytechnologieën Het is onze missie om ervoor te zorgen dat u uitstekende resultaten en doorbraken kunt bereiken. Kijk voor meer informatie op

3 Inhoud Beoogd gebruik 4 Samenvatting en uitleg 4 Principe van de procedure 5 Targetgenen 7 Meegeleverde materialen 10 Inhoud van de kit 10 Benodigde maar niet meegeleverde materialen 10 Waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen 11 Algemene voorzorgsmaatregelen 12 Bewaren en hanteren van reagentia 13 Bewaren en hanteren van monsters 13 Procedure 14 Extractie en bereiding van nucleïnezuren 14 Gebruik van een negatieve controle 15 Gebruik van een interne controle en carrier-rna 15 Protocol PCR-amplificatie en smeltanalyse 17 Interpretatie van de resultaten 34 Normalisatie 34 Analyse 34 Threshold 34 Oplossen van problemen 36 Kwaliteitscontrole 39 Beperkingen 40 Werkingseigenschappen 40 Referenties 40 Symbolen 41 Contactgegevens 41 Bestelinformatie 42 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015 3

4 Beoogd gebruik Het RespiFinder RG Panel is een kwalitatieve multiplex-pcr-test voor het detecteren van en differentiëren tussen 16 RNA-virussen,* 2 DNA-virussen en 3 bacteriën die allemaal luchtweginfecties bij mensen kunnen veroorzaken: adenovirus, bocavirus, corona NL63, corona OC43, corona 229E, corona HKU1, hmpv, influenza A, influenza B, influenza A H1N1v, parainfluenza 1, para-influenza 2, para-influenza 3, para-influenza 4, rinovirus/enterovirus, RSV-A, RSV-B, Bordetella pertussis, Legionella pneumophila en Mycoplasma pneumoniae. Het RespiFinder RG Panel is een hulpmiddel bij de diagnose van luchtweginfectie, wanneer het in samenhang met andere klinische bevindingen en laboratoriumuitslagen wordt gebruikt. Negatieve resultaten duiden niet noodzakelijkerwijs op afwezigheid van een virale of bacteriële luchtweginfectie; negatieve resultaten mogen niet worden gebruikt als enige basis voor diagnose, therapie of andere beslissingen met betrekking tot behandeling. Positieve resultaten sluiten gelijktijdige infectie met andere pathogenen niet uit. Het gedetecteerde pathogeen of de gedetecteerde pathogenen zijn mogelijk niet de uiteindelijke oorzaak van de ziekte. Bij het stellen van de uiteindelijke diagnose moet ook rekening worden gehouden met andere laboratoriumonderzoeken en met de beoordeling van het klinische beeld. Het product is uitsluitend bedoeld voor gebruik door hiertoe bevoegd laboratoriumpersoneel. Samenvatting en uitleg Acute luchtweginfectie is het meest voorkomende type acute infectie bij volwassenen en kinderen en is een belangrijke oorzaak van ziekte bij patiënten met een verzwakt immuunsysteem. Luchtweginfecties (LWI's) worden vaak onderverdeeld in bovensteluchtweginfecties (BLWI's) en ondersteluchtweginfecties (OLWI's). Rinorroe, conjunctivitis, faryngitis, otitis media en sinusitis zijn BLWI's. Pneumonie, bronchiolitis en bronchitis zijn OLWI's. Zowel virussen als bacteriën kunnen acute LWI's veroorzaken. Het aantal causale agentia is groot en de agentia zijn uiteenlopend van aard, hetgeen een grote uitdaging vormt voor de diagnostiek. * Het RespiFinder RG Panel detecteert 16 RNA-virussen, maar kan geen onderscheid maken tussen rinovirus en enterovirus. 4 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

5 Nucleïnezuur-amplificatietests hebben zich bewezen als snelle en gevoelige tests, en als specifieke alternatieven in singleplex- of multiplexvorm. In multiplexassays kan tegelijkertijd meer dan één target worden geamplificeerd, waardoor inzicht wordt verkregen in de betekenis van gemengde infecties en de prognose en verergering van de respiratoire ziekte. Principe van de procedure Het RespiFinder RG Panel is gebaseerd op de SmartFinder-techniek, een techniek waarmee een zeer complexe analyse kan worden uitgevoerd van maximaal 13 targets in één enkele real-time PCR-reactie Het RespiFinder RG Panel bevat verschillende MultiFinder-probe-sets, gecombineerd met 12 fluorescerend gelabelde SMART-probes (SMART: single-tube multiplex amplification in real time), waarmee 21 verschillende pathogenen plus een interne controle kunnen worden gedetecteerd. De reactie start met een preamplificatie waarin een reverse-transcriptasestap wordt gecombineerd met een PCR-stap om het target-cdna te amplificeren. Vervolgens wordt een deel van de preamplificatiereactie overgebracht in 2 PCR-buisjes. Er worden twee afzonderlijke SmartFinder-reacties uitgevoerd, bestaande uit een probehybridisatiestap en een probe-ligatie- en amplificatiestap. De detectie wordt uitgevoerd met behulp van smeltcurve-analyse. In afbeelding 1 wordt de totale workflow schematisch weergegeven. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015 5

6 Afbeelding 1. Overzicht workflow met het RespiFinder RG Panel Met het RespiFinder RG Panel wordt het Rotor-Gene Q MDx-apparaat of het Rotor-Gene Q-apparaat gebruikt voor de detectie van nucleïnezuren van de pathogenen. Er is een interne controle (IC) in de assay opgenomen om onderscheid te kunnen maken tussen werkelijk negatieve samples en fout-negatieve samples als gevolg van afbraak van nucleïnezuren, remming van de PCR of mislukken van de test. Het uitgangssample bestaat uit totale nucleïnezuren die zijn geëxtraheerd en opgezuiverd uit nasofaryngeale swabs. Het bereiden van de samples is een 6 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

7 proces dat los staat van het kader van het panel. Gebruik geschikte methoden of producten om de monsters te behandelen en nucleïnezuren te extraheren en op te zuiveren (zie Bewaren en hanteren van monsters, blz. 13, en Extractie en bereiding van nucleïnezuren, blz. 14). Targetgenen Targetgenen die zijn gebruikt voor het ontwerpen van probes en primers worden weergegeven in tabel 1. Tabel 1. Targetgenen voor het RespiFinder RG Panel Target Controle Gen Code pathogeen Interne controle (IC) Faag MS2-lysiseiwit-gen IC Virussen Adenovirus Hexon-gen (H) Adeno Bocavirus Noncapsid-gen (NP1) Boca Corona 229E Corona HKU1 Corona NL63 Corona OC43 hmpv Nucleocapside-eiwit-gen ('Nucleocapsid protein'-gen, NP) Nucleocapside-fosfo-eiwit-gen ('Nucleocapsid phosphoprotein'-gen, N) Nucleocapside-eiwit-gen ('Nucleocapsid protein'-gen, NP) Nucleocapside-eiwit-gen ('Nucleocapsid protein'-gen, NP) Nucleocapside-eiwit-gen ('Nucleocapsid protein'-gen, NP) 229E HKU1 NL63 OC43 hmpv Influenza A Matrixeiwit-gen (M1) InfA Influenza B Matrixeiwit-gen (M1) InfB Influenza A H1N1v Neuraminidase-gen H1N1 Vervolg tabel op de volgende bladzijde Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015 7

8 Tabel 1. Vervolg Target Virussen (vervolg) Para-influenza 1 Para-influenza 2 Para-influenza 3 Para-influenza 4 Rinovirus/ Enterovirus RSV-A RSV-B Bacteriën Gen Haemagglutinine-neuraminidase-gen (HN) Haemagglutinine-neuraminidase-gen (HN) Haemagglutinine-neuraminidase-gen (HN) Nucleocapside-eiwit-gen ('Major nucleocapsid protein'-gen, N) Polyproteïne-gen (PP), niet-vertaald 5'-gebied Nucleocapside-eiwit-gen ('Major nucleocapsid protein'-gen, N) Nucleocapside-eiwit-gen ('Major nucleocapsid protein'-gen, N) Code pathogeen PIV1 PIV2 PIV3 PIV4 Rhino/ Entero RSVA RSVB Bordetella pertussis Insertiesequentie 481 (IS481) B. pert Chlamydophila pneumoniae* Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae Buitenmembraan-gen ('Major outer membrane'-gen, OmpA) Macrofaag-remmer-activator-gen ('Macrophage inhibitor potentiator'- gen, Mip) Cytadhesine-eiwit-gen ('Cytadhesin protein'-gen, P1) C. pneu L. pneu M. pneu * Opmerking: De detectie van Chlamydophila pneumoniae met het RespiFinder RG Panel is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden. Niet voor gebruik in diagnostische procedures. Wij beogen geen claims of bedenkingen om informatie te leveren voor de diagnose, preventie of behandeling van een ziekte. 8 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

9 Voor elk sample worden één preamplificatie en 2 SmartFinder-reacties uitgevoerd. De pathogenen, de labels en de aangegeven Tm van de corresponderende Smart-hybridisatieprobes in de 2 SmartFinder-reacties worden weergegeven in tabel 2. Tabel 2. Targets en corresponderende Tm-waarden van Smart-probes Label SMART-probe Aanvaard b aarheidsber eik Tm ( C) Code pathogeen (mix 1) Code pathogeen (mix 2) Cy5 probe 1 50,5-53,5 L. pneu OC43 Cy5 probe 2 54,5-57,5 B. pert NL63 Cy 5 Cy5 probe 3 60,0-63,0 Rhino/Entero 229E Cy5 probe 4 66,0-69,0 C. pneu* HKU1 Cy5 probe 5 70,5-73,5 M. pneu Cy5 probe 6 76,5-79,5 H1N1 ROX probe 1 52,5-55,5 RSVA PIV1 ROX probe 2 57,5-60,5 Adeno PIV2 ROX ROX probe 3 62,5-65,5 hmpv PIV3 ROX probe 4 66,5-69,5 RSVB PIV4 ROX probe 5 72,5-75,5 InfA Boca ROX probe 6 76,5-79,5 InfB BHQ 1 BHQ1 probe 1 70,5-73,5 IC IC * Opmerking: De detectie van Chlamydophila pneumoniae met het RespiFinder RG Panel is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden. Niet voor gebruik in diagnostische procedures. Wij beogen geen claims of bedenkingen om informatie te leveren voor de diagnose, preventie of behandeling van een ziekte. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015 9

10 Meegeleverde materialen Inhoud van de kit RespiFinder RG Panel (25) Catalogusnr Aantal reacties 25 Inhoud Kleur dop Volume Pre-amplification Master Mix (mastermix preamplificatie) Paars 180 µl Interne controle (IC) Zwart 300 µl Pre-amplification Primermix (primermix preamplificatie) Wit 65 µl Hybridization Buffer (Hybridisatiebuffer) Geel 80 µl Probemix 1 (Probemix 1) Rood 40 µl Probemix 2 (Probemix 2) Blauw 40 µl TwoStep Buffer (TwoStep-buffer) Groen (in amberkleuri ge buis) 1600 µl Ligase Enzyme (Ligase) Bruin 50 µl Taq Polymerase (Taq-polymerase) Oranje 20 µl Dilution Buffer (Verdunningsbuffer) Transparant 1700 µl RespiFinder RG Panel Handbook (Handleiding RespiFinder RG Panel) (Engels) 1 Benodigde maar niet meegeleverde materialen Draag wanneer u met chemicaliën werkt altijd een geschikte laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en een veiligheidsbril. Raadpleeg voor meer informatie de desbetreffende veiligheidsinformatiebladen (VIB of SDS) die bij de leveranciers van de producten verkrijgbaar zijn. 10 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

11 Reagentia RNA/DNA-extractiekit (zie Extractie en bereiding van nucleïnezuren, blz. 14) RNase-/DNase-vrij water Verbruiksartikelen Wegwerptips met hydrofobe filters Wegwerptips met aanduiding low retention met hydrofobe filters RNase-/DNase-vrije 1,5 ml-buisjes RNase-/DNase-vrije 0,2 ml-pcr-buisjes (losse buisjes met dop of buisjesstrips met afzonderlijke doppen) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (Buisjesstrips en doppen 0,1 ml) (cat. nr of ) voor gebruik met Rotor-Gene Q-apparaten Uitrusting Instelbare pipetten:* 0,1 2 µl, 2 20 µl, µl Instelbare meerkanaalspipet:* 1 10 µl (optioneel) Vortexmixer* Tafelcentrifuge* met een rotor voor 2 ml-buisjes Centrifuge* voor 0,2 ml-buisjes Koelblok of ijs Thermocycler* voor 0,2 ml-pcr-buisjes, met een verwarmde deksel en ramping rates van 1 5 C/seconde (voor pre-amplificatie en hybridisatie; bijv. de blok-gebaseerde thermocycler GeneAmp PCR System 9700). Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM* of Rotor-Gene Q 5plex HRM*, met accessoires Waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen Voor in-vitrodiagnostiek Draag wanneer u met chemicaliën werkt altijd een geschikte laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en een veiligheidsbril. Raadpleeg voor meer informatie de betreffende veiligheidsinformatiebladen (VIB of MSDS). Deze zijn on-line * Verzeker u ervan dat de apparaten zijn gecontroleerd en gekalibreerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

12 beschikbaar in handig en compact pdf-formaat via Hier vindt u de SDS's van alle kits en kit-componenten van QIAGEN, die u kunt bekijken en afdrukken. Zie voor veiligheidsinformatie met betrekking tot de gebruikte opzuiveringskit de handleiding van de desbetreffende kit. Zie voor veiligheidsinformatie met betrekking tot de gebruikte apparaten de gebruikershandleidingen van de desbetreffende apparaten. Gooi afval van de samples en de assay weg in overeenstemming met de plaatselijk geldende veiligheidsvoorschriften. Algemene voorzorgsmaatregelen Let altijd op de volgende punten: Deze moleculaire assay mag uitsluitend door hiertoe bevoegde laboratoriummedewerkers worden uitgevoerd. Positieve materialen (monsters en positieve controles) moeten gescheiden van alle andere reagentia worden bewaard en geëxtraheerd, en ze moeten in een afgescheiden ruimte worden toegevoegd aan de reactiemix. Draag tijdens het uitvoeren van de assay wegwerphandschoenen. Gebruik wegwerptips met hydrofobe filters om kruiscontaminatie te voorkomen. Gebruik voor het werken met de RT-PCR-enzymmix, het ligase en Taqpolymerase wegwerptips met de aanduiding low retention met hydrofobe filters. Gebruik RNase-/DNase-vrije PCR-buisjes. Ontdooi RNA-/DNA-samples altijd op ijs en laat ze op ijs of in een koelblok staan. Bewaar enzymen nadat u ze uit de vriezer hebt genomen altijd op ijs of in een koelblok. Behandel enzymen zorgvuldig en meng ze zeer voorzichtig. Centrifugeer de reagentia na het ontdooien gedurende 5 seconden en meng ze vervolgens door ze enkele malen voorzichtig met een pipet op te zuigen. Alle PCR-programma's moeten in de software van de Rotor-Gene Q worden ingevoerd voordat de assay wordt uitgevoerd. 12 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

13 Centrifugeer PCR-buisjes en platen altijd kort en open ze voorzichtig om vorming van aerosolen te voorkomen. Opmerking: Om contaminatie te voorkomen raden wij met klem aan om de experimentele activiteiten in PCR-kasten uit te voeren, in de volgende 3 van elkaar gescheiden ruimten: Ruimte 1: Bereiden van de mastermixen voor preamplificatie, hybridisatie en ligatie-/smeltanalyse. Ruimte 2: Toevoegen van RNA-/DNA-sample aan de mix. Ruimte 3: Uitvoeren van de preamplificatie, hybridisatie en smeltcurveanalyse in 3 stappen: Preamplificatie uitvoeren. Producten van de preamplificatie toevoegen aan hybridisatiemix (bij voorkeur in een PCR-kast) en hybridisatie uitvoeren. Producten van de hybridisatie toevoegen aan de TwoStep-mix (bij voorkeur in een PCR-kast) en de ligatie, amplificatie en smeltcurveanalyse uitvoeren. Bewaren en hanteren van reagentia De componenten van het RespiFinder RG Panel dienen in het donker bij 30 tot 15 C te worden bewaard en blijven stabiel tot de uiterste houdbaarheidsdatum die op het etiket staat vermeld. Herhaaldelijk ontdooien en weer invriezen (> 5 x) dient te worden vermeden, aangezien dit ertoe kan leiden dat de assay minder goed werkt. Bewaren en hanteren van monsters Respiratoire pathogenen kunnen alleen goed worden gedetecteerd wanneer monsters van goede kwaliteit worden verkregen, deze monsters snel naar het laboratorium worden vervoerd en op de juiste wijze worden bewaard voordat ze in het laboratorium getest worden. Nasofaryngeale swabs zijn geschikt voor de detectie van virale en/of bacteriële infecties van de luchtwegen. Klinische monsters dienen zo snel mogelijk naar het laboratorium te worden vervoerd, in porties te worden verdeeld en te worden verwerkt. De monsters dienen bij 4 C te worden bewaard. Als monsters niet binnen 48 uur kunnen worden verwerkt, dienen ze ingevroren te worden bewaard bij 20 C of kouder, bij voorkeur bij 70 C. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

14 Procedure Extractie en bereiding van nucleïnezuren De QIAamp MinElute Virus Spin-kit van QIAGEN, die in tabel 3 wordt weergegeven, is gevalideerd voor de opzuivering van DNA en RNA uit het aangegeven type humane samples, voor gebruik met het RespiFind RG Panel. Voer de opzuivering van nucleïnezuren uit volgens de aanwijzingen in de handleiding van de kit. Tabel 3. Opzuiveringskit gevalideerd voor gebruik met het RespiFinder RG Panel Sample-type Nasofaryngeale swabs Nucleïnezuurisolatiekit QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) Catalogusnummer (QIAGEN) Gebruik 200 µl samplemateriaal en elueer in 60 µl elutiebuffer. Wij raden met klem aan om niet te proberen om de nucleïnezuren te concentreren, omdat dit de kans op remming van de RT-PCR-enzymen zou kunnen verhogen. Aan het gelyseerde sample wordt een interne controle toegevoegd (zie Gebruik van een interne controle en carrier-rna, blz. 15). Bij gebruik van de QIAamp MinElute Virus Spin-kit raden wij aan om de lysisbuffer in een laminaire flowkast aan het sample toe te voegen. Wanneer het sample eenmaal gelyseerd is, kan de extractieprocedure verder op een labtafel worden uitgevoerd. Het is aan te raden om de laminaire flowkast na gebruik te decontamineren met een ontsmettingsoplossing (bijv. bleekmiddel 1000 ppm)* en de UV-lamp 30 minuten te laten branden. Voorkom zoveel mogelijk dat het geëxtraheerde DNA/RNA wordt bevroren en weer ontdooid, en bewaar nucleïnezuurextracten bij 4 C wanneer ze binnen één dag worden verwerkt. Bewaar het geëxtraheerde RNA/DNA wanneer het langere tijd moet worden bewaard bij 20 C of 70 C. * Draag wanneer u met chemicaliën werkt altijd een geschikte laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en een veiligheidsbril. Raadpleeg voor meer informatie de desbetreffende veiligheidsinformatiebladen (VIB of SDS) die bij de leveranciers van de producten verkrijgbaar zijn. 14 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

15 Gebruik van een negatieve controle In elke run moet een negatieve controle worden opgenomen. Een negatieve controle bestaat uit 200 µl water van PCR-kwaliteit plus interne controle (IC). Deze negatieve controle wordt als een gewoon sample behandeld en wordt ook meegenomen in de nucleïnezuurextractieprocedure. In de uiteindelijke analyse dient het signaal van de negatieve controle als referentie voor het achtergrondsignaal in het FAM/ROX- en FAM/Cy5-kanaal en voor het positieve IC-signaal in het Green-kanaal (IC). Gebruik van een interne controle en carrier-rna Bij gebruik van de QIAamp MinElute Virus Spin-kit in combinatie met het RespiFinder RG Panel moet een interne controle (IC) worden opgenomen in de opzuiveringsprocedure, om de efficiëntie van de samplebereiding en de downstream assay te controleren. Daarnaast moet bij gebruik van de QIAamp MinElute Virus Spin-kit carrier-rna worden bereid. De IC is een MS2-faag en wordt geleverd als controle voor de RNA-/DNAextractie en de werking van de RespiFinder RG Panel-assay, en ter controle op eventuele remming van de PCR. De IC wordt samen met het carrier-rna aan de lysisbuffer toegevoegd, voordat deze aan het sample wordt toegevoegd. De hoeveelheid toegevoegde IC is onafhankelijk van het aanvangsvolume van het sample. De hoeveelheid toegevoegde IC is afhankelijk van het elutievolume. Bij gebruik van de QIAamp MinElute Virus Spin-kit wordt het geëxtraheerde RNA/DNA in 60 µl geëlueerd. Het volume IC dat aan buffer AL moet worden toegevoegd, is 5,5 µl per sample (zie tabel 4). In geval van een sterke infectie en/of meerdere infecties is het mogelijk dat de smeltpiek van de IC niet zichtbaar is in de uiteindelijke analyse. Dit kan worden verklaard door het feit dat grote hoeveelheden nucleïnezuren van pathogenen de meeste reagentia in de assay verbruiken. Als gevolg hiervan is de assay nog wel geldig wanneer het IC-signaal afwezig is bij aanwezigheid van één of meer specifieke smeltpieken die duiden op een infectie. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

16 Tabel 4. Volumes van benodigde buffer AL, carrier-rna buffer-ave-mix en IC Aantal samples Volume buffer AL (ml) Volume carrier- RNA AVE (µl) Volume interne controle (µl) 1 0,22 6,2 5,5 2 0,44 12, ,66 18,5 16,5 4 0,88 24, ,1 30,8 27,5 6 1,32 36, ,54 43,1 38,5 8 1,76 49, ,98 55,4 49,5 10 2,2 61, ,42 67,7 60,5 12 2,64 73, Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

17 Protocol: PCR-amplificatie en smeltanalyse Wat u moet doen voordat u begint Ontdooi het template-dna/rna (indien bevroren) en alle reagentia en laat de buisjes op ijs staan. Bereid iets meer dan de benodigde hoeveelheden van de verschillende mixen, om te compenseren voor verlies bij pipetteren. Procedure Preamplificatie 1. Draai de mastermix voor preamplificatie een aantal keer ondersteboven om te verzekeren dat de mastermix volledig ontdooid en homogeen is. Centrifugeer het buisje kort. Bereid de preamplificatie-reactiemix volgens tabel 5 en laat hem op ijs staan. De reactiemix bevat meestal alle componenten die nodig zijn voor de PCR, behalve het sample. Opmerking: De hybridisatiemixen (stap 6) en TwoStep-mixen (stap 12) kunnen tegelijk met de preamplificatiemix worden bereid en dienen tot gebruik in het donker bij 4 C te worden bewaard. De mixen kunnen alleen alle 3 gelijktijdig worden bereid wanneer het volledige protocol zonder vertraging wordt gevolgd; er zijn dan geen pauzes toegestaan tussen de verschillende stappen. De stabiliteit van de mixen is niet gegarandeerd na langdurige bewaring (bijvoorbeeld overnacht). Tabel 5. Bereiding van de preamplificatie-reactiemix Aantal samples (kleur dop reagensbuisje) 1 12 Verdunningsbuffer (transparant) 6,25 µl 75 µl Mastermix preamplificatie (paars) 6,25 µl 75 µl Primermix preamplificatie (wit) 2,5 µl 30 µl Totaal volume 15 µl 180 µl Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

18 2. Meng de preamplificatie-reactiemix voorzichtig maar grondig en pipetteer 15 µl van de mix in elk PCR-buisje. Voeg vervolgens 10 µl van het verdunde sample-dna/rna of negatieve controle toe (zie tabel 6). 3. Sluit de PCR-buisjes. Meng goed. Centrifugeer de buisjes kort en plaats ze vervolgens terug op ijs of in een koelblok. Tabel 6. Bereiding van de preamplificatie-reacties Aantal samples 1 12 Preamplificatie-reactiemix 15 µl 15 µl / buisje Sample of negatieve controle 10 µl 10 µl / buisje Totaal volume 25 µl 25 µl / buisje 4. Programmeer de blok-gebaseerde thermocycler volgens tabel 7. Tabel 7. Thermocyclerprogramma voor preamplificatie Reverse-transcriptasereactie: 20 minuten 50 C Initiële-activatiestap: 2 minuten 95 C 3-stapscyclus: Denaturatie 25 seconden 94 C Annealing 25 seconden 55 C Extensie 40 seconden 72 C Aantal cycli 40 Hold: 20 C 5. Start het preamplificatieprogramma terwijl de PCR-buisjes nog op ijs staan. Wacht tot de thermocycler op 50 C is gekomen. Plaats dan pas de buisjes in het blok van de thermocycler en sluit de verwarmde deksel. 18 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

19 Hybridisatie 6. Bereid hybridisatiemix 1 volgens tabel 8 en hybridisatiemix 2 volgens tabel 9 en meng voorzichtig maar grondig. Als de hybridisatiemixen al bij stap 1 werden bereid, wacht dan tot het preamplificatieprogramma is beëindigd en ga vervolgens verder met stap 7. Tabel 8. Bereiding van hybridisatiemix 1 Aantal samples (kleur dop reagensbuisje) 1 12 Hybridisatiebuffer (geel) 1,5 µl 18 µl Probemix 1 (rood) 1,5 µl 18 µl Verdunningsbuffer (transparant) 3,0 µl 36 µl Totaal volume hybridisatiemix 1 6,0 µl 72 µl Tabel 9. Bereiding van hybridisatiemix 2 Aantal samples (kleur dop reagensbuisje) 1 12 Hybridisatiebuffer (geel) 1,5 µl 18 µl Probemix 2 (blauw) 1,5 µl 18 µl Verdunningsbuffer (transparant) 3,0 µl 36 µl Totaal volume hybridisatiemix 2 6,0 µl 72 µl 7. Pipetteer voor elk sample 6 µl hybridisatiemix 1 in een nieuw PCR-buisje en 6 µl hybridisatiemix 2 in een nieuw PCR-buisje. 8. Neem nadat het preamplificatieprogramma is beëindigd (stap 5) de PCRbuisjes uit de thermocycler en centrifugeer ze kort. Pipetteer van elke preamplificatie-reactie 2 µl in elk van de 2 buisjes één met hybridisatiemix 1 en één met hybridisatiemix 2 (zie tabel 10). Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

20 Tabel 10. Bereiding van de hybridisatiereacties Aantal samples 1 12 Hybridisatiemix 1 (stap 7) 6,0 µl 6,0 µl / buisje Preamplificatie-reactie (stap 8) 2,0 µl 2,0 µl / buisje Totaal volume 8,0 µl 8,0 µl / buisje Hybridisatiemix 2 (stap 7) 6,0 µl 6,0 µl / buisje Preamplificatie-reactie (stap 8) 2,0 µl 2,0 µl / buisje Totaal volume 8,0 µl 8,0 µl / buisje 9. Sluit de PCR-buisjes en centrifugeer ze kort. 10. Programmeer de blok-gebaseerde thermocycler volgens tabel 11. Tabel 11. Thermocyclerprogramma voor hybridisatie Denaturatie: 10 minuten 98 C Hybridisatie van de probes: 30 minuten 60 C Hold: 60 C 11. Plaats de buisjes met de mengsels van de preamplificatie-reactie en hybridisatiemixen in het blok van de thermocycler en sluit de verwarmde deksel. Start het hybridisatieprogramma. Ligatie en PCR 12. Bereid de TwoStep-mix volgens tabel 12. Meng voorzichtig maar grondig en laat tot gebruik op ijs staan. Opmerking: Omdat de samples in 2 delen zijn gesplitst (hybridisatiemix 1 en hybridisatiemix 2), moet de TwoStep-mix in tweevoud worden bereid. Voor beide hybridisatiemixen is 32 µl TwoStep-mix nodig. Als de TwoStep-mix al bij stap 1 werd bereid, ga dan verder met stap Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

21 Tabel 12. Bereiding van de TwoStep-mix Aantal samples (kleur dop reagensbuisje) 1* 2 x 1 2 x 12 TwoStep-buffer (groen) 30,6 µl 61,2 µl 734,4 µl Ligase (bruin) 1,0 µl 2,0 µl 24,0 µl Taq-polymerase (oranje) 0,4 µl 0,8 µl 9,6 µl Totaal volume 32,0 µl 64,0 µl 768,0 µl * Opmerking: Bereiding van 1x TwoStep-buffer is nooit nodig, omdat voor elk sample 2 x 1 volume TwoStep-mix moet worden bereid. 13. Maak aan de hand van de volgende stappen een temperatuurprofiel aan voor de Rotor-Gene Q. Een overzicht van het thermocyclerprogramma wordt weergegeven in tabel 13, blz. 22. De algemene assayparameters instellen Afbeelding 2, 3 Nieuwe kanalen aanmaken Afbeelding 4-7 De gain bewerken Afbeelding 8, 9 Het temperatuurprofiel programmeren Afbeelding Het smeltprogramma programmeren Afbeelding 17, 18 Samenvatting en template opslaan Afbeelding 19, 20 De run starten Afbeelding 21 Alle specificaties hebben betrekking op softwareversie van de Rotor- Gene Q. Meer informatie over het programmeren van Rotor-Geneapparaten vindt u in de gebruikershandleiding van het apparaaat. In de afbeeldingen staan deze instellingen in een zwart kader met dikke lijnen. De afbeeldingen worden gegeven voor Rotor-Gene Q-apparaten. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

22 Tabel 13. Overzicht van het thermocylerprogramma voor TwoStep-cycling Opmerkingen Ligatie van de probes: 15 minuten 54 C Initiële-denaturatiestap: 2 minuten 95 C PCR 1: 3-stapscyclus: Denaturatie 15 seconden 94 C PCR met hoge specificiteit Annealing 15 seconden 60 C Extensie 15 seconden 72 C Aantal cycli 10 PCR 2: 3-stapscyclus: Denaturatie 15 seconden 94 C Annealing 15 seconden 50 C Acquisitie* Denaturatie 15 seconden 72 C Aantal cycli 23 Denaturatie: 2 minuten 95 C Smeltprogramma: C Acquisitie * Acquisitiekanalen: Green, gain 4; Red, gain 1; FAM /ROX, gain 8; en FAM/Cy5, gain 10. Acquisitiekanalen: Green, Red, FAM/ROX en FAM/Cy5. Gebruik: Optimize gain before melt on all tubes (gain vóór smelten optimaliseren voor alle buizen). The gain giving the highest fluorescence less than 95 will be selected (de gain-instelling die de hoogste fluorescentie onder de 95 geeft, wordt geselecteerd). 22 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

23 14. Open eerst het dialoogvenster New Run Wizard (wizard nieuwe run) (Afbeelding 2). Vink het vakje Locking Ring Attached (vergrendelingsring bevestigd) aan en klik op Next (volgende). 1 2 Afbeelding 2. Het dialoogvenster New Run Wizard. 15. Selecteer 40 voor het reactievolume en klik op Next (Afbeelding 3). 1 2 Afbeelding 3. De algemene assayparameters instellen Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

24 16. Klik in het volgende dialoogvenster van de New Run Wizard op de knop Create New (nieuwe aanmaken) en programmeer 2 extra kanalen, zoals is aangegeven in afbeelding Afbeelding 4. Nieuwe kanalen aanmaken. 1 2 Afbeelding 5. Nieuw kanaal FAM/ROX aanmaken. 24 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

25 1 2 Afbeelding 6. Nieuw kanaal FAM/Cy5 aanmaken. 1 2 Afbeelding 7. Nieuwe kanalen zijn aangemaakt. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

26 17. Bewerk de gain voor elk kanaal zoals is aangegeven in afbeelding 8. De uiteindelijke gain-instellingen voor alle kanalen zijn weergegeven in afbeelding 9. De gain-instellingen voor de Rotor-Gene Q zijn zo geselecteerd dat verzadiging in de detectiekanalen wordt voorkomen. Als er echter in een van de detectiekanalen verzadiging wordt waargenomen, dient de gaininstelling voor dat verzadigde kanaal te worden aangepast en dient een nieuwe smeltcurveanalyse te worden uitgevoerd. 1 2 Afbeelding 8. De gain bewerken. In de afbeelding is een voorbeeld te zien waarbij de gain voor kanaal Green op 4 wordt ingesteld. 26 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

27 1 Afbeelding 9. Uiteindelijke gain-instellingen voor alle kanalen. De benodigde kanalen zijn: Green, gain 4; Red, gain 1; FAM/ROX, gain 8; en FAM/Cy5, gain Klik in het volgende dialoogvenster van de New Run Wizard op de knop Edit Profile (profiel bewerken) (afbeelding 10) en programmeer het temperatuurprofiel zoals is aangegeven in afbeelding Afbeelding 10. Het profiel bewerken. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

28 1 2 Afbeelding 11. Ligatie van de probes Afbeelding 12. Initiële-denaturatiestap Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

29 1 2 5a Afbeelding 13. Amplificatie van de geligeerde probes a Afbeelding 14. Amplificatie van de geligeerde probes, met signaalacquisitie bij 50 C. De benodigde kanalen voor acquisitie worden weergegeven in afbeelding 15. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

30 1 2 Afbeelding 15. Selecteren van alle kanalen die nodig zijn voor acquisitie. 1 2 Afbeelding 16. Denaturatie van PCR-producten en probes Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

31 1 2 Afbeelding 17. Smeltprogramma Afbeelding 18. Acquisitie tijdens het smeltprogramma. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

32 1 Afbeelding 19. Samenvatting van het temperatuurprofiel. 19. Template opslaan voor later gebruik (Afbeelding 20). 1 Afbeelding 20. Template opslaan voor later gebruik. 20. Laat de TwoStep-mix (van stap 12) op kamertemperatuur komen (15 25 C) en pipetteer 32,0 µl van de TwoStep-mix in elk buisje van de buisjesstrip voor de Rotor-Gene Q. Opmerking: Pipetteer voor elk sample telkens 32,0 µl TwoStep-mix in twee nieuwe buisjes. 32 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

33 21. Pipetteer elke hybridisatiereactie (8 µl) in de buisjes van de buisjesstrip met de TwoStep-mix. Het eindvolume is 40 µl per sample. Opmerking: Laat de hybridisatiereacties bij 60 C staan totdat ze aan de TwoStep-mix worden toegevoegd. 22. Sluit de buisjes van de buisjesstrips met de juiste doppen en plaats ze onmiddellijk in de rotor van de Rotor-Gene Q. 23. Plaats de rotor in de Rotor-Gene Q. Controleer of de vergrendelingsring (hulpstuk van de Rotor-Gene Q) op de rotor is geplaatst om te voorkomen dat de buisjes per ongeluk tijdens de run opengaan. 24. Start the run (afbeelding 21) met behulp van de opgeslagen template (stap 19). 1 Afbeelding 21. De run starten. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

34 Interpretatie van de resultaten Normalisatie Op Rotor-Gene Q-apparaten moeten de onbewerkte gegevens van kanaal FAM/Cy5 eerst worden genormaliseerd om te compenseren voor crosstalk tussen de verschillende kanalen. Voor normalisering van de Cy5-signalen opent u het kanaal met onbewerkte gegevens Melt FAM/Cy5 (filterinstelling nm). Klik op de knop Option (optie) en kies Normalise to Melt FAM/ROX (normaliseren naar Melt FAM/ROX). Het nieuw aangemaakte gegevensbestand Melt FAM/Cy5/Melt FAM/ROX moet ook nog genormaliseerd worden voor kanaal Red (filterinstelling 625/660 nm). Dit doet u door het nieuwe bestand met onbewerkte gegevens Melt FAM/Cy5/Melt FAM/ROX te openen, te klikken op de knop Option en Normalize to Melt Red (normaliseren naar Melt Red) te kiezen. Door deze normalisatie wordt de temperatuurafhankelijke fluorescentie van Cy5 gecorrigeerd, hetgeen resulteert in een symmetrischer smeltpiek. Analyse Om het bestand met onbewerkte gegevens te analyseren opent u het venster Analysis (analyse) en selecteert u onder het tabblad Melt (smelten) het juiste genormaliseerde bestand met onbewerkte gegevens voor FAM/Cy5. Het signaal in kanaal Green (IC) (filterinstelling nm) en kanaal FAM/ROX (filterinstelling nm) hoeft niet genormaliseerd te worden; de corresponderende bestanden met onbewerkte gegevens voor de kanalen FAM/ROX en Green worden ook geselecteerd. De verschillende smelttemperaturen van de SMART-probes worden weergegeven in tabel 14, blz. 35. Threshold Bij gebruik van de gain-optimalisatie in de software van de Rotor-Gene Q, in het smeltprogramma van de TwoStep-reactie zoals is beschreven in tabel 13 (blz. 22) en afbeelding 17 (blz. 31), dienen in de plots van de smeltcurveanalyse de volgende tresholdwaarden te worden ingesteld om de resultaten van de samples te analyseren. Kanaal FAM/ROX: Threshold = 1 Kanaal FAM/Cy5 (genormaliseerd): Threshold = 0 34 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

35 Kanaal Green (IC) Draai het teken van df/dt om en selecteer alle samples die voor beide mixen geen positieve smeltpiek vertoonden in de kanalen FAM/ROX en FAM/Cy5. Stel de treshold handmatig in op het hoogste fluorescentieniveau bij 50 C dat met deze negatieve samples werd verkregen. Samples die voor beide mixen smeltpieken vertonen binnen het Tm-aanvaardbaarheidsbereik van de interne controle (70,5 73,5 C) kunnen nu worden benoemd als werkelijk negatieve samples. Samples die slechts één of geen positief resultaat voor de interne controle vertonen, moeten ongeldig worden verklaard. Ongeldige samples moeten opnieuw worden gemeten. Tabel 14. Targets en corresponderende Tm-waarden van SMART-probes Label SMART-probe Aanvaard b aarheidsber eik Tm ( C) Code pathogeen (mix 1) Code pathogeen (mix 2) Cy5 probe 1 50,5-53,5 L. pneu OC43 Cy5 probe 2 54,5-57,5 B. pert NL63 Cy5 Cy5 probe 3 60,0-63,0 Rhino/Entero 229E Cy5 probe 4 66,0-69,0 C. pneu* HKU1 Cy5 probe 5 70,5-73,5 M. pneu Cy5 probe 6 76,5-79,5 H1N1 ROX probe 1 52,5-55,5 RSVA PIV1 ROX probe 2 57,5-60,5 Adeno PIV2 ROX ROX probe 3 62,5-65,5 hmpv PIV3 ROX probe 4 66,5-69,5 RSVB PIV4 ROX probe 5 72,5-75,5 InfA Boca ROX probe 6 76,5-79,5 InfB BHQ1 BHQ1 probe 1 70,5-73,5 IC IC * Opmerking: De detectie van Chlamydophila pneumoniae met het RespiFinder RG Panel is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden. Niet voor gebruik in diagnostische procedures. Wij beogen geen claims of bedenkingen om informatie te leveren voor de diagnose, preventie of behandeling van een ziekte. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

36 Oplossen van problemen De informatie in dit hoofdstuk kan u helpen bij het oplossen van problemen die zich kunnen voordoen. Raadpleeg voor meer informatie ook de pagina met veelgestelde vragen (Frequently Asked Questions) in ons Technical Support Center: De wetenschappers bij de technische diensten (Technical Services) van QIAGEN beantwoorden altijd graag uw vragen over de informatie en protocollen in deze handleiding of over sample- en assaytechnologieën (zie voor contactgegevens de achterzijde van deze handleiding of ga naar 36 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

37 Opmerkingen en suggesties Er zijn geen specifieke smeltpieken zichtbaar en er is geen smeltpiek van de IC zichtbaar a) Programmeerfout(en) in het programma van de thermocycler Programmeer de thermocycler zoals is beschreven in Protocol: PCR-amplificatie en smeltanalyse, blz. 17 en herhaal de assay. b) Pipetteerfout of er ontbreekt een reagens c) er is geen IC toegevoegd of IC werd toegevoegd voordat lysisbuffer werd toegevoegd aan het sample d) Er zijn PCR-remmers in het sample aanwezig Herhaal de RespiFinder-assay zoals is beschreven in Protocol: PCR-amplificatie en smeltanalyse, blz. 17. Het is belangrijk om IC en carrier-rna aan de lysisbuffer toe te voegen, bij voorkeur nadat deze aan het sample is toegevoegd, ongeacht het gebruikte extractieprotocol (zie Gebruik van een interne controle en carrier-rna, blz. 15). Anders kan de IC worden afgebroken door nucleases in het sample. Herhaal de extractie van nucleïnezuren en de RespiFinder-assay. Herhaal de assay met gebruik van een vijfvoudige verdunning van het geïsoleerde RNA/DNA. Er is geen smeltpiek van de IC zichtbaar in aanwezigheid van pathogeenspecifieke smeltpieken Sterke infectie en/of infectie door meerdere organismen De IC is weggeconcurreerd in de assay. Het resultaat is nog steeds geldig. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

38 Er zijn onechte smeltpieken zichtbaar Kruiscontaminatie Opmerkingen en suggesties Zorg dat de reactiestappen in gescheiden ruimten worden uitgevoerd om kruiscontaminatie te voorkomen. Herhaal de RespiFinder-assay. Controleer het programma van de thermocycler en verzeker u ervan dat alle stappen worden uitgevoerd zoals is beschreven in Protocol: PCRamplificatie en smeltanalyse, blz. 17. Zorg dat u op ijs werkt waar dat in het protocol is aangegeven. Herhaal de RespiFinder-assay. Er zijn verhoogde achtergrond-fluorescentiesignalen zichtbaar terwijl er geen specifieke amplificatie heeft plaatsgevonden in de reactie van een sample a) Remmende factoren in het nucleïnezuurextract van het sample belemmeren efficiënte, specifieke amplificatie. Verhoogde achtergrondsignalen kunnen hoger zijn dan de tresholdwaarden van het RespiFinder RG Panel, maar zijn gemakkelijk herkenbaar als niet-specifieke smeltpieken. Een voorbeeld van verhoogde achtergrond wordt weergegeven in afbeelding 22, blz. 39. b) Interne controle is afwezig in negatieve samples Verhoogde achtergrondsignalen kunnen hoger zijn dan de tresholdwaarden van het RespiFinder RG Panel, maar zijn gemakkelijk herkenbaar als niet-specifieke smeltpieken. Herhaal de RespiFinder-assay. Een voorbeeld van verhoogde achtergrond wordt weergegeven in afbeelding 22, blz Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

39 Kanaal FAM/ROX Mix 1 Mix 2 Werkelijk positief Negatieve controle Geen IC Geen IC Negatieve controle Kanaal FAM/Cy5 Mix 1 Mix 2 Geen IC Negatieve controle Werkelijk positief Negatieve controle Geen IC Kanaal Green (IC) Mix 1 Mix 2 Negatieve controle Geen IC Geen IC Negatieve controle Afbeelding 22. Voorbeeld van een verhoogde achtergrond. Negatieve controle: De lijnen corresponderen met de negatieve controle die geen signaal geeft in kanaal FAM/ROX en in kanaal FAM/Cy5, maar een specifieke piek van de interne controle geeft in kanaal Green (IC). Werkelijk positief: De aangegeven lijnen voor FAM/ROX mix 1 en FAM/Cy5 mix 2 corresponderen met samples die werkelijk positieve smeltpieken vertonen. Geen IC: De lijnen corresponderen met een sample waaraan geen interne controle was toegevoegd. Voor dit sample heeft geen specifieke amplificatie plaatsgevonden, hetgeen heeft geleid tot een verhoogde achtergrondfluorescentie in kanaal FAM/ROX, dat geen duidelijke smeltpieken vertoont maar wel fluorescentieniveaus die hoger zijn dan de tresholdwaarde. Kwaliteitscontrole Het RespiFinder RG Panel wordt gefabriceerd door PathoFinder BV in Maastricht, Nederland, binnen kwaliteitssystemen waaraan de normen ISO13485:2003 en EN ISO 13485:2012 zijn verleend. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

40 Beperkingen Het RespiFinder RG Panel is een hulpmiddel bij de diagnose van luchtweginfectie, wanneer het in samenhang met andere klinische bevindingen en laboratoriumuitslagen wordt gebruikt. Negatieve resultaten duiden niet noodzakelijkerwijs op afwezigheid van een virale of bacteriële luchtweginfectie. Negatieve resultaten mogen niet worden gebruikt als enige basis voor diagnose, therapie of andere beslissingen met betrekking tot behandeling. Positieve resultaten sluiten gelijktijdige infectie met andere pathogenen niet uit. Het gedetecteerde pathogeen of de gedetecteerde pathogenen zijn mogelijk niet de uiteindelijke oorzaak van de ziekte. Bij het stellen van de uiteindelijke diagnose moet ook rekening worden gehouden met andere laboratoriumonderzoeken en met de beoordeling van het klinische beeld. De werkingseigenschappen zijn vastgesteld met gevalideerde EKE-panels (Externe Kwaliteits Evaluatie [External Quality Assessment, EQA]) van QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics, Kwaliteitscontrole voor moleculaire diagnostiek). Het product is uitsluitend bedoeld voor gebruik door laboratoriumpersoneel. De detectie van Chlamydophila pneumoniae met het RespiFinder RG Panel is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden. Niet voor gebruik in diagnostische procedures. Wij beogen geen claims of bedenkingen om informatie te leveren voor de diagnose, preventie of behandeling van een ziekte. Werkingseigenschappen Zie voor de werkingseigenschappen van het RepliFinder RG Panel. Referenties QIAGEN onderhoudt een grote, regelmatig bijgewerkte on-line database van wetenschappelijke publicaties waarin producten van QIAGEN zijn gebruikt. Uitgebreide zoekopties stellen u in staat om de artikelen die u nodig hebt te vinden, door eenvoudig te zoeken op trefwoord of door de toepassing, het onderzoeksgebied,een titel, enz. op te geven. Kijk voor een lijst referenties in de on-line QIAGEN Reference Database op of neem contact op met de technische diensten (Technical Services) van QIAGEN of met uw plaatselijke leverancier. 40 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

41 Symbolen De volgende symbolen kunnen op de verpakking en de etiketten staan: <N> Bevat reagentia in voldoende hoeveelheden voor <N> reacties Houdbaar tot Medisch hulpmiddel voor in-vitrodiagnostiek Catalogusnummer Lotnummer Materiaalnummer Global Trade Item Number (GTIN) Temperatuurlimiet Fabrikant Raadpleeg de gebruiksaanwijzing Voorzichtig Contactgegevens Ga voor technische ondersteuning en voor meer informatie naar ons Technical Support Center op bel of neem contact op met één van de afdelingen Technical Service of plaatselijke leveranciers van QIAGEN (zie de achterzijde van deze handleiding of kijk op Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

42 Bestelinformatie Product Inhoud Cat. nr. RespiFinder RG Panel (25) CE Voor 25 reacties: Mastermix voor preamplificatie, Interne controle, Primermix voor preamplificatie, Probemixen, Ligase, Taq-polymerase en buffers QIAamp MinElute Virus Spin Kit voor simultane opzuivering van viraal DNA en RNA uit nasofaryngeale swabs, voor gebruik met het RespiFinder RG Panel QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) Voor 50 minipreps: 50 QIAamp MinElute-kolommen, QIAGEN Protease, carrier-rna, buffers, afnamebuizen (2 ml) Rotor-Gene Q MDx voor IVD-gevalideerde real-time PCRanalyse in klinische toepassingen Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Real-time PCR-cycler en High Resolution Melt analyzer met 5 kanalen (green, yellow, orange, red, crimson) plus HRM-kanaal, laptopcomputer, software, accessoires: met 1 jaar garantie op onderdelen en arbeidsloon, installatie en training niet inbegrepen Rotor-Gene Q 5plex HRM System Real-time PCR-cycler en High Resolution Melt analyzer met 5 kanalen (green, yellow, orange, red, crimson) plus HRMkanaal, laptopcomputer, software, accessoires: met 1 jaar garantie op onderdelen en arbeidsloon, installatie en training Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

43 Product Inhoud Cat. nr. Rotor-Gene Q voor uitstekende prestaties in real-time PCR Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q 5plex HRM System Real-time PCR-cycler en High Resolution Melt analyzer met 5 kanalen (green, yellow, orange, red, crimson) plus HRM-kanaal, laptopcomputer, software, accessoires: met 1 jaar garantie op onderdelen en arbeidsloon, installatie en training niet inbegrepen Real-time PCR-cycler en High Resolution Melt analyzer met 5 kanalen (green, yellow, orange, red, crimson) plus HRM-kanaal, laptopcomputer, software, accessoires: met 1 jaar garantie op onderdelen en arbeidsloon, installatie en training Accessoires Rotor-Gene Q Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) 250 strips van 4 buisjes en doppen, voor 1000 reacties van µl 10 x 250 strips van 4 buisjes en doppen, voor reacties van µl Raadpleeg voor bijgewerkte licentie-informatie en productspecifieke disclaimers het desbetreffende handboek van de QIAGEN-kit of de gebruikershandleiding. Handboeken van QIAGEN-kits en gebruikershandleidingen zijn beschikbaar op of kunnen worden opgevraagd bij de afdeling QIAGEN Technical Services of uw lokale QIAGEN-vestiging. Handleiding RespiFinder RG Panel 03/

44

45 Deze pagina is met opzet leeg gelaten.

46 Handelsmerken: QIAGEN, QIAamp, MinElute, Rotor-Gene (QIAGEN Group); BHQ (Biosearch Technologies, Inc.); Cy (GE Healthcare); FAM, GeneAmp, ROX (Life Technologies Corporation); RespiFinder (PathoFinder BV). Beperkte licentie-overeenkomst voor RespiFinder RG Panel Gebruik van dit product houdt in dat de koper of gebruiker van het product akkoord gaat met de volgende punten: 1. Het product mag uitsluitend worden gebruikt in overeenstemming met de bij het product en deze handleiding geleverde protocollen en is uitsluitend voor gebruik met componenten uit het panel. QIAGEN verleent geen licentie onder zijn intellectuele eigendommen om de bijgesloten componenten van dit panel te gebruiken of te incorporeren met andere componenten die niet in dit panel zijn opgenomen, met uitzondering van toepassingen die zijn beschreven in de bij het product geleverde protocollen, dit handboek en aanvullende protocollen die beschikbaar zijn via Sommige van deze aanvullende protocollen zijn verstrekt door QIAGEN-gebruikers, voor QIAGEN-gebruikers. Deze protocollen zijn niet uitvoerig door QIAGEN getest of geoptimaliseerd. QIAGEN garandeert deze protocollen niet en verstrekt ook geen waarborg dat deze de rechten van derden niet schenden. 2. Buiten de expliciet vermelde licenties verstrekt QIAGEN geen waarborg dat dit panel en/of het gebruik ervan de rechten van derden niet schendt. 3. Dit panel en de componenten ervan zijn gelicenseerd voor eenmalig gebruik. Ze mogen niet worden hergebruikt, bijgewerkt of doorverkocht. 4. QIAGEN wijst specifiek alle andere dan de uitdrukkelijk vermelde, expliciete of impliciete, licenties af. 5. De koper en gebruiker van het panel gaan ermee akkoord dat zij geen stappen ondernemen, en niemand anders toestaan stappen te ondernemen, die kunnen leiden tot enige handeling die hierboven als verboden is vermeld, of die dergelijke handelingen mogelijk maken. QIAGEN kan naleving van de verboden van deze beperkte licentieovereenkomst bij elke rechtbank afdwingen en zal alle gemaakte kosten van rechtbanken en onderzoeken terugvorderen, met inbegrip van honoraria van advocaten, bij elke handeling om naleving van deze beperkte licentieovereenkomst of intellectuele eigendomsrechten met betrekking tot het panel en/of de componenten ervan af te dwingen. Zie voor bijgewerkte licentievoorwaarden Mededeling aan de koper Dit product is een RespiFinder product dat is vervaardigd door PathoFinder BV in Maastricht, Nederland, binnen kwaliteitssystemen waaraan de norm ISO13485:2003 is verleend. Deze producten worden uitsluitend verkocht voor gebruik door de eindgebruiker en mogen niet worden doorverkocht, gedistribueerd of herverpakt QIAGEN, alle rechten voorbehouden. 46 Handleiding RespiFinder RG Panel 03/2015

47

48 Australia Austria Belgium Brazil Canada China Denmark Finland France Germany Hong Kong India Ireland Italy Japan Korea (South) Luxembourg Mexico The Netherlands Norway Singapore Sweden Switzerland UK NL Sample & Assay Technologies