!"#$#%&'#()##*+&,-"#(./0-1&233(4#(5678$#."9&

Transcriptie

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`#"&*-%&567%&4-"&-8.&7#&##%&%6#E>#&"#/0%6#*&6%5#"&3;&##%&)#1--84#&$(--=&"#& )#-%">33(4#%+&4-"&7#&4-%&%3=&."##4.&-%4#(#&"#/0%6#*#%&;3#"&6%5#U#%&3;&4#&3$#(6=#& $(-=#%&"#&)#-%">33(4#%9&a#$38=&6.&4-"&#(&4-%&#b"(-&*3."#%&=#;--*"&;3#"#%&>3(4#%9&,-"&)#"(#P&>#U#867*#&#6.#%?&46#&;3=#%&)#."&"#(&46./E..6#&=#."#84&>3(4#%9&`#"&=--"& "#%&.83U#&%6#"&3;&4#&;3%6"3(6%=&5#8H+&;--(&3;&0#"&43#8;-G=&)#-%">33(4#%&$-%&##%& )#1--84#&$(--=9&C-"&=#84"&4E.&33*&$33(&4#&>#"=#$#(9&N#8#64.)#c%$83#46%=& %3345-*#867*9& _& f&

3 )#33(4#86%=d&$#(.1(#646%=&$-%&$6..#%+&;--(&33*&-%4#(#&=(3#1#%&-8.&-;^)6#h%&#%& #b3"#%&q)67$33()##84&(6$6#(*(##p#%rd&999&& V3("3;?&.8E6"&--%&)67&3%5#&6%H3(;-G#)#03#P#9& 1(3"3/388#%&#%&53&*3;#%&"3"&."-%4--(46.-G#9&V#%%6.E6">6..#86%=&"E..#%&6%."-%G#.&46#& %E&;#"&#C2D&>#(*#%+&867*"&Q"#R&)#1#(*"9&C##8&7#&*#%%6.+&534-"&0#"&#6%41(34E/"&."#(*#(& >3(4"&#%&.%#88#(&6%5#")--(9& DH>67*#%&$-%&0E646=#&."-%4--(4#%&;-=d&;3=#867*&*-%&#C2D&53%4#(&4#&*>-%G^/#(6%=& $-%&)#."-%4./0-i%=#%&##%&)#"#(+&$388#46=#(&)##84&$-%&4#&$6.."-%4&=#$#%9&C-%& ;3#"#%&>#&4--(&$33(&31#%&."--%&#%&53&%346=&;--"8-U#%&$33(&--%1-..#%9&L%6=#& *>-%G^/#(6%=+&#$#%"E##8&-8.&$#(03E46%=&"E..#%&.33("#%&6.&#/0"#(&>#8&=#>#%."9& j&

4 !"#$%#%!$&' RAVON Environmental DNA RAVON & SPYGEN Vlinderstichting, Zoogdiervereniging en FLORON Jelger Herder Amersfoort, 27 november 2013 Reptielen Amfibieën Vissen Onderzoek Nederland!! 28 professionals!! 2000 vrijwilligers!! Non profit Alle inkomsten op projectbasis Doel: het duurzaam behouden van onze reptielen, amfibieën en vissen. 2/17 Sinds 2011 samenwerking met SPYGEN Samenwerking op edna gebied SEH Congres 2009 in Turkije ontmoet. Samenwerking in Nederland!! Toonaangevend lab op gebied edna!! Uitvinders edna!! Jarenlange ervaring!! Speciaal lab!! Speciale protocollen!! Wetenschappelijke insteek!! Kennis ecologie en verspreiding!! Pilot studies!! Ontwikkeling monstermethodiek!! DNA voor referentiedatabases (ook voor Naturalis!)!! Ervaring met grote projecten Samenwerking Internationaal Waterschappen 3/17 4/17 Ficetola - Taberlet Phillip Francis Thomsen Kennis delen Kwaliteit! eerst pilot studie dan toepassen!! Publicaties (10+)!! Primerontwikkeling Dejean et al., 2011 Herder et al., 2012 Dejean et al., 2012 Herder et al., 2013 In silico (bioinformatisch) In vitro (op weefsel in lab) In situ (in het veld)!! Presentaties (15+)!! College edna -! Nationaal: STOWA, Waterschappen, VOFF, RAVON, RWS, TAUW, Symposium Ecologica etc. -! Internationaal: Symposium edna Brussel en SEH Hongarije!! Testen in het veld: 8 locaties waar de soort zeker voorkomt (verschillende habitats) 4 locaties waar de soort zeker niet voorkomt (controle!)!! Website -! 5/17 6/17 $'

5 !"#$%#%!$&' Kwaliteit! eerst pilot studie dan toepassen Kwaliteit! eerst pilot studie dan toepassen!! Trefkans grote modderkruiper (in pilot studie 87,5%)!! Vervolgonderzoeken bevestigden deze trefkans (honderden locaties bemonsterd inmiddels)!! Trefkans veel hoger dan met electrovissen!! Habitatkennis cruciaal voor succes edna!! 2.5 x meer positieven bij inschatting geschikt vs matig geschikt. Herder et al., Visionair 7/17 8/17 Ervaring RAVON! soortgerichte aanpak Ervaring RAVON! soortgerichte aanpak Vissen: Grote modderkruiper Zoogdieren: Noordse woelmuis Waterspitsmuis Vissen: Grote modderkruiper Nog veel meer Zoogdieren: Noordse woelmuis Waterspitsmuis Amfibieën: Libellen: Invasieve kreeften Amfibieën: Drijvende waterweegbree Libellen: Kamsalamander Knoflookpad Amerikaanse brulkikker Italiaanse kamsalamander Groene glazenmaker Gevlekte witsnuitlibel Kamsalamander Knoflookpad Amerikaanse brulkikker Italiaanse kamsalamander Zwemmersjeuk Groene glazenmaker Gevlekte witsnuitlibel (Trichobilharzia) 9/17 10/17 Ervaring! Soortgroepgerichte aanpak Ervaring! Soortgroepgerichte aanpak!! Universele primer voor soortgroep!! Al het DNA van 1 soortgroep vermeerdert in de PCR!! Reeds succesvol getest door SPYGEN in Frankrijk Amfibieën in poelen: met edna zelfde of meer soorten dan traditioneel. Vissen in de Rhône: met edna 23 soorten tegen 19 soorten met elektrovissen.!! Al het vermeerderde DNA uitlezen met Next Generation Sequencing!! Op de computer een match maken met database 11/17 12/17 %'

6 !"#$%#%!$&' Pilot studie in Nederland edna KRW Ervaring!! Vergelijking edna (Next Generation Sequencing) met KRW bemonsteringen 20 locaties verspreid over NL!! Vergelijking uitkomsten: Hoofddoel: soorten Subdoel: verkenning relatie edna - dichtheid!! Sinds 2011 in Nederland rond 1000 locaties onderzocht met edna!!! SPYGEN en LECA langer bezig en nog veel meer locaties onderzocht 13/17 14/17 Conclusie uit rapport Bijkerk et al Voorstellen uit rapport Bijkerk et al !! De betrouwbaarheid van de methode is nog onvoldoende bekend!! Niet bekend hoe bemonstering op te zetten om detectiekans te realiseren. Deze conclusie delen wij niet!!! Onderzoek optimale bemonsterinspanning! Modelonderzoek In onze ogen te complex / ambitieus voor vissen Beter om te kiezen voor praktische aanpak: testen in het veld edna scoort reeds aantoonbaar beter dan conventioneel! Onderzoek doen naar invloed van losse factoren 15/17 16/17 Voorstellen uit rapport Bijkerk et al !! Ontwikkeling primers! genereren soortenlijsten Niet: voor 70 vissoorten primers te ontwikkelen en los Niet praktisch:! 70 losse analyses " arbeidsintensief + duur! Multiplexing (meerdere primers samen) te complex!! Primerontwikkeling onderschat! Selectief (dus onverwachte soorten mis je!) Zijn er nog vragen?????? Wel: Universele primer en Next Generation Sequencing Benut al het DNA uit het monster Werkt blind " dus ook onverwachte soorten Informatie over aantallen DNA kopieën " relatie naar dichtheden Rapport zegt te duur (2375 euro) " werkelijk kosten ~ 350 euro! 17/17 18/17 &'

7 Bridging science to practice edna methodiek voor inventarisatie van aquatische biodiversiteit DNA technieken beschikbaar voor praktische toepassing!! Moleculair biologische methoden voor bewaking drinkwaterkwaliteit Ziekteverwekkers van fecale herkomst Schadelijke micro-organismen die zich in water kunnen vermeerderen!! Source tracking van fecale verontreinigingen!! Monitoren van microbiologische zwemwaterkwaliteit Microbiologische meetmethoden voor beoordeling microbiologische kwaliteit drinkwater Cyanobacteriën of blauwalgen E.coli en enterococcen Source-tracking van fecale verontreinigingen Toepassing zwemwater!! Routinematige kwaliteitscontrole Beheer zwemwater (RWS):!! Onderzoek: risico s beter leren kennen!! Locaties met regelmatig hoge concentraties E. coli/ Ook organismen die met klassieke methoden niet aantoonbaar zijn!! Risico beoordeling!! Optimalisatie zuiveringsprocessen enterococcen!! Verbeteren kwaliteit is noodzakelijk!! Oorzaak? Gerichte maatregelen Kwaliteitsverbetering DNA detectie van potentieel toxische blauwalgen In opdracht van RWS Monitoren van beschermde en invasieve soorten met edna, pilot 2013 Samen met Bureau Waardenburg en Waterschap Rivierenland!! Kwantitatieve detectie van de (meest voorkomende) potentieel toxische blauwalgen Grote Modderkruiper Kamsalamander Exotische zoetwaterkreeften!! qpcr met interne controle (Misgurnus fossilis) (Triturus cristatus) (Astacidae and Cambaridae)!! Routinematige toepassing KWR Watercycle Research Institute 1

8 Bridging science to practice Inventarisatiemethoden op basis van edna!! Specifieke detectiemethoden door kwantitatieve edna detectie Soort, groep, geslacht specifiek Kwantitatief en zeer snel resultaat!! Generieke inventarisatie met behulp van metabarcodinganalyse Groep specifiek Identificatie van soorten op basis van next generation sequencing edna voor aquatische biodiversiteit, TKI Samen met Naturalis, RoyalHaskoningDHV, BaseClear, Koeman & Bijkerk, Hogeschool Leiden!! Verzamelen van barcodes!! Ontwerp edna methoden!! Generieke methoden!! Specifieke methoden!! Metabarcoding sequence analysis!! Vertaalslag naar praktijk Kennishiaten edna voor aquatische biodiversiteit!! Optimalisatie en standaardisatie waterbemonstering Detectiekans Afhankelijk van doelsoort Aantal, poolen, volume!! Stabiliteit en verspreiding edna in het milieu O.a. in vitro studies met verschillende modelorganismen!! Standaardisatie edna analyse Robuuste methode geschikt voor routinematige toepassing inclusief controles Werkvoorschriften en protocollen van doelsoorten!! Relatie DNA kopieën en abundantie (enige analogie met cyanobacteriën) KWR Watercycle Research Institute 2

9 !"#$%#%!$&' 2,'',289'<,+:)=,'>'%'?/4,6' =,+,BI,D/64',6'0,<)64+, /+,15,' 2,'+),3/44561'7/6',289'56':,+';/+,-0,:,,-' ()*+,-'./+0,-1' #':,+')3;,-D,6'7/6':,+',289'=/+' 56'=,';/+,-<)64+,-4'//6;,E51'54F' +,6,56=,'=),A4))-+,6'//6'+,' D*66,6'+)6,6' G*5=51,')6+;5DD,A561,6'>'S),</6',6'U5ND,-D'07'['YCA3:5*<' J54H' 9<K05,L6H' M;,<<,-4N,*D'!"#$%&'($)&*#+$*,-. G/3A)+C3,'0,3/A561H'' O+)P54B:,'Q'0A/*;/A1,6H' R/B-)?/*6/'' OS(TF'8/+*-/A54'UVF'T)C/A'G/4D)6561F'U/4,BA,/-F'WXYF'G)1,4B:))A' G*5=51,')6+;5DD,A561,6' W\6'289'?-/1<,6+[<)A,B**A'56';/+,-<)64+,-'54'/A'7)A=),6=,')<'56':,+' 2,'D/64')<',,6')-1/654<,'//6'+,'+)6,6'54'=//-<,,'1,A5ND'//6'=,'D/64' )<',,6'4+*DN,'289'56':,+';/+,-<)64+,-'+,'D-5N1,6H'=,'=,+,BI,D/64' 2,'=,+,BI,D/64'D*66,6';,'0,]67A),=,6'#'0,<)64+, /+,15,^' #! J)A*<,' #! T*5<+,A5ND,'7,-=,A561' 2,+,BI,D/64'>'(//-'54'=5,'7/6'/_/6D,A5ND`' 2,',289'<,+:)=,'>',,6'7))-0,,A=' a7,-'=,e,'?/b+)-,6'>',6'=*4'=,+,bi,d/64'#';,+,6';,':,,a';,5651b' G),'D*66,6';,'=/6',,6'0,+-)*;0/-,'0,<)64+, /+,15,' :/6+,-,6`' $'

10 !"#$%#%!$&' %'!"#$%%&'"(")# c,7),a51,-'=/6'b)67,6i)6,a,' <,+:)=,6'O<,+'6/<,'E,A=E/<,',6[ )?'<),5A5ND'+,'567,6+/-54,-,6'4))-+,6QH' 85,+'4,A,BI,?H' 2,',289'<,+:)=,'>',,6'7))-0,,A=' U,<)64+, /+,15,'7/6'1-))+' 0,A/61d' *+,',-"#."/%&./%0,)-")# a67)a=),6=,'d,6654')7,-'?/b+)-,6'=5,'=,+,bi,d/64' 0,3/A,6H' U,+-)*;0//-:,5='7/6'=,' 5"&65"78"$")9## 0::&#"&#0%".#)%-#$""(#%)'"&;%"/# -"'::)#<%&'")=# 2,',289'<,+:)=,'>',,6'7))-0,,A=' 2,'<)65+)-5614=),A,6' >=!?%"6.:)'#")#.&")'#0%),.%&,)-# ca)0/a,'0,))-=,a561',6'a/61,'+,-<5n6'+-,6=',b)a)15,'#'?c+)3a/6d+)6f'?c+)0,6+:)4f'</b-)?c+,6f'</b-)?/*6/',6' 7544,6' A5"&:8%)"("#0%),.%&,)-# R,,-'1,-5B:+,-,'<)65+)-561'6/'+-,f,6'7/6'<//+-,1,A,6'>'65,+'/AA,' 3/-/<,+,-4':),7,6'1,<,+,6'+,';)-=,6' B=! F=! G<"0<:."&#,289',6'=,'<)65+)-5614=),A,6'?%"6.:)'#")#.&")'#0%),.%&,)-# ca)0/a,'0,))-=,a561',6'a/61,'+,-<5n6'+-,6=',b)a)15,'#'?c+)3a/6d+)6f'?c+)0,6+:)4f'</b-)?c+,6f'</b-)?/*6/',6' 7544,6' 4))-+,64/<,64+,AA561F'/0*6=/6I,',6'A,,e5N=' H%-"(,I/3"'")#"!12# Y))-+,64/<,64+,AA561'>'//67*AA,6=,'<)65+)-561'+07'E,A=E/<,',6' 8)6#=,4+-*BI,?'O)-1/654<,',6':/05+/+QH' S/6'5D'/AA,';/+,-,6';)-=,6'+),1,3/4+H' 2,+,BI,D/64')6E,D,-H' 90*6=/6I,'>'56'=,'+),D)<4+H' Z,,e5N=40,3/A561'>'65,+'<)1,A5NDH',289',6'=,'<)65+)-5614=),A,6' A5"&:8%)"("#0%),.%&,)-# R,,-'1,-5B:+,-,'<)65+)-561'6/'+-,f,6'7/6'<//+-,1,A,6'>'65,+'/AA,' H%-"(,I/3"'")#"!12# c,7),a51:,5=h' 85,+#4,A,BI,?H' 8)6#=,4+-*BI,?'O)-1/654<,',6':/05+/+QH' S/6'5D'/AA,';/+,-,6';)-=,6'+),1,3/4+H' 2,+,BI,D/64')6E,D,-H' H%-"(,I/3"'")#"!12# U,3/A,6'//6;,E51:,5='7/6',,6')?'<,,-=,-,'4))-+,6H' c,7),a51:,5=h' 85,+#4,A,BI,?H' 8)6#=,4+-*BI,?'O)-1/654<,',6':/05+/+QH' S/6'5D'/AA,';/+,-,6';)-=,6'+),1,3/4+H' 2,+,BI,D/64')6E,D,-H' T575,-3-5DOA/-7,6Q'>'B)66,BI,'+*44,6'E),+',6'

11 !"#$%#%!$&',289',6'=,'<)65+)-5614=),A,6' G<"0<:."&# G)1,'D;/A5+,5+4,54,6'57<'7)AD41,E)6=:,5=' H%-"(,I/3"'")#"!12# h),d)<4i1')6=,-e),d' 1::&# X6E5B:+'56'=,+,BI,D/64H#!%"(' S)4+,6,iB5L6+,'0,<)64+, /+,15,'=5,',,6'0,3//A=,'0,+-)*;0//-:,5=' -,/A54,,-+H' Y+/6=//-=54,-,6'>'4))-+F':/05+/gC3,H' W,6'1),=,';,+,64B:/33,A5ND,'0/454'7))-':,+'1,0-*5D'7/6'=,',289'<,+:)=,H' *%"# R)=,A</I1')6=,-E),D'>'=543,-45,<)=,A'>';,AD,'?/B+)-,6'E5N6'7/6'0,A/61`' J))-'7,-4B:5AA,6=,'4))-+,6')-1/654<,6F'4+-)<,6=,',6'4+/16/6+,';/+,-,6' WP3,-5<,6+,,AF'56':,+'7,A=',6'56':,+'A/0' J/A5=,-,6'*5+D)<4+,6'<)=,A)6=,-E),DH' "#$%&'($)&*#+$*' &'

12 Environmental DNA en monitoring Ontwikkelingen IMARES Monitoring!! Internationale ei-surveys om paaibestand te bepalen van makreel/horsmakreel/haring Hilde van Pelt-Heerschap!! Invasieve soorten - Mosseltransport - Ballastwater!! Monitoring programma s - Aanwijzing Natura 2000 gebieden o.g.v. aanwezige soorten - KRW- eisen goede waterkwaliteit Surveys eieren van makreel/horsmakreel en haring - -! Gelijktijdige moleculaire identificatie -! Bepaling relatieve biomassa--- gebaseerd op het aantal kopieen van de moleculaire barcode per cel. Invasieve soorten Mosselzaad transport -! edna (ook vroege ontwikkelings-stadia) - levend/dood Natura 2000 gebieden/ KRW Tot nu toe gebaseerd op taxonomische identificatie van soorten in de sediment fractie > 0.5 mm. Ontwikkeling metabarcoding: 1. Splitsing sediment fractie: groter dan 0.5 mm en kleiner dan 0.5 mm 2. DNA isolatie en amplificatie van de moleculaire barcode 3. Sequencing (25 miljoen sequenties per run) 4. Data analyse Ballast water 1

13 Verdere ontwikkelingen 1.! Uitbreiding moleculaire databases 2.! Bepaling abundantie o.g.v. biomassa 3.! Bepaling levend versus dood 4.! Ontwikkeling primers voor bepaalde groepen 5.! VALIDATIE 2

14 Huidige en toekomstige activiteiten Alterra edna en monitoring door waterschappen Huidige activiteiten en toekomstvisie van Alterra Aanvullende validatie voor reeds beschikbare edna-merkers: Arjen de Groot - Knoflookpad Dierecologie, Alterra Wageningen UR - Grote modderkruiper Ontwikkeling van edna-merkers voor relevante soorten: 2013: invasieve en inheemse rivierkreeften 2014: kenmerkende libellen, kokerjuffers Methodologie op basis van qpcr-reactie Optimalisatie van bemonsteringsprotocollen STOWA, 27 november 2013 edna onderzoek bij Alterra - WUR Rivierkreeften in Nederland Moleculaire en ecologische expertise onder één dak: Vroegtijdige opsporing invasieve rivierkreeften voorkomt: Moleculair laboratorium, gespecialiseerd in analyse van DNA met matige kwaliteit en kwantiteit Schade aan ecosystemen (verlaagde KRW-scores) - keutels, haren, eischalen ł Schade aan oever- / aquatische vegetatie - edna in bodem- en watermonsters ł Vertroebeling ł Predatie en concurrentie Praktijkgerichte ecologische expertise voor aquatische flora en fauna - ecologische doelen en monitoringseisen voor de KRW Mogelijke schade aan infrastructuur ł Ondergraven van oevers en slootkanten - beleidsplannen voor bedreigde en invasieve soorten Bemonstering en inventarisatie door ervaren veldmedewerkers Eigen proefsloten, kunstbeken, etc. Roessink et al. 2009, Alterra-rapport 1923 Roessink et al. 2010, Alterra-rapport 2052 Foto s: Fabrice Ottburg edna onderzoek bij Alterra: praktijkgericht Ontwikkeling edna-technieken gericht op ondersteuning van de monitoringstaken van waterbeheerders en natuurbeheerders Focus op detectie van beleidsrelevante soorten / soortsgroepen: ł Verkenning aanwezigheid van kwetsbare soorten voorafgaand aan werkzaamheden ł (Prestatie)monitoring voor terugkeer kenmerkende soorten KRW na herstelwerkzaamheden ł Vroegtijdige opsporing van soorten die KRW-doelstellingen negatief kunnen beïnvloeden (invasieve exoten) Methodeontwikkeling voor rivierkreeften Ontwikkeling van twee early-warning tools: A) B) Een soort-specifieke test voor de Rode Amerikaanse rivierkreeft Een brede test voor de in Nederland voorkomende rivierkreeften Doorlopen stappen: Rode Am. rivierkreeft (Procambarus clarkii) specifieke Gestreeptemerker Am. rivierkreeft 1. Ontwerpen van voldoende Marmerkreeft 2. Optimalisatie qpcr-reactie Geknobbelde Am. rivierkreeft 3. Tests op andere kreeftachtigen Æ vals-positieven uitsluiten(orconectes virilis) Gevlekte Am. rivierkreeft 4. Tests op veldmonsters met bekende aan/afwezigheid (Orconectes limosus) Californische rivierkreeft Aandacht voor praktische inzetbaarheid methode (Procambarus acutus) (Procambarus fallax) Turkse rivierkreeft (Pacifastacus leniusculus) (Astacus leptodactylus) Europese rivierkreeft (Astacus astacus)

15 Rivierkreeften aangetoond in veldmonsters Rode Amerikaanse rivierkreeft Nu: verificatie via DNA sequencing Naardermeer (ven) Richting een breder toepasbare methode Speerpunten voor grotere toepasbaarheid door waterschappen: 1. Detectiekans: wat vertelt een positief of negatief resultaat? - over welk watervolume kunnen uitspraken worden gedaan? - invloed van verschillen in hydrologie en waterchemie? Loosdrecht (meer) Maarsseveen (sloot) Waddinxveen (sloot) Europese rivierkreeft Sinderhoeve (proefsloot) 2. Gestandaardiseerde protocollen voor bemonstering en analyse - Replicatie, volume en spreiding van monsters - Wijze van bemonstering en DNA extractie - Replicatie van PCR-reacties, en definitie positieve score Geknobbelde Am. rivierkreeft Kamerik (sloot) Gestreepte Am. rivierkreeft Alblasserwaard (sloot) 3. Meer zicht op mogelijkheden voor kwantitatieve analyse 4. Meer zicht op mogelijkheden voor diversiteitscreening (metabarcoding) Turkse rivierkreeft Kerkrade (meer) Onderzoeksbehoefte A. Effect van studiesoort en condities op hoeveelheid DNA in monster Vele parameters m.b.t. hydrologie, DNA-specificaties en dierecologie Modelstudie waardevol, mits gericht op kwalitatieve uitspraken: ł relatieve belang van parameters ł optimale monsterstrategie Parameters staven met experimenten in lab, proefsloten en veld B. Effect van watercondities op DNA-detectie in het monster Inhiberende stoffen en DNA-verzadiging kunnen de gemeten edna-concentratie beïnvloeden Dit heeft gevolgen voor de optimale monsterstrategie (wel of niet monsters samenvoegen?) Foto: Fabrice Ottburg Knoflookpad als onderzoeksmodel Met dank aan: Ivo Laros In samenwerking met adviesbureau Natuurbalans Kweek van larven en herintroductie in verlaten poelen Jan Bovenschen Experimenteel onderzoek in 2013/2014 aan: ł edna-afgifte door verschillende levenstadia (ei, larve, adult) ł Opbouw en afbraak edna-concentratie in water ł Ruimtelijke verspreiding Ivo Roessink Fabrice Ottburg Ben Crombaghs Jouke van der Zee Vragen: g.a.degroot@wur.nl /

16 3"41#/*5%16#/)* 7#89"*3%88%%/1*!"#$%&%'()*+,,)-&./&0,1('2()&.345& A(&-9((&'((*-&2(6,1(0?(&(AB%&-(D<0,6,>8(O0&P8K0F&& 5QR&S&4T5U&9(66&VWXY& A(&-9((&'((*-&2(6,1(0?(&(AB%&-(D<0,6,>8(O0&P8K0F&& 5QR&S&4T5U&9(66&VWXY& N,>(68K7<(?(0&(0&2(;()780>(0& :;<*/ =>:? C#1%6%/9"D'()* C,,)?(6(0F& G!&Z(()&*;(D8H(7& & && G!&[8-()*-&>(1,(68>& G!&!0(6& G!&],(?7,,;& C,,)?(6(0F& G!&Z(()&*;(D8H(7& G!&N80?()&>(1,(68>&& G!&%66((0&>(*(6(D-(()?(&*,,)-(0&9,)?(0& G!&#0?()*0((=9&(`(D-&& G!&A==)& 1

17 N,>(68K7<(?(0&(0&2(;()780>(0& :;<*S&=>:? C,,)?(6(0F& G!&Z(()&*;(D8H(7& & && G!&[8-()*-&>(1,(68>& G!&!0(6& G!&],(?7,,;& G!&%66((0&>(*(6(D-(()?(&*,,)-(0&9,)?(0& C#1%6%/9"D'()* C,,)?(6(0F& G!&Z(()&*;(D8H(7& G!&N80?()&>(1,(68>&& G!&#0?()*0((=9&(`(D-&& G!&A==)&& G!&WXY&?(-(DE(&'(-<,?(&1,,)&'()*+",)&+$(-)$% b&_0&,0-9877(680>& Kostenefficiënte technologieën ontwikkelen voor afzonderlijke soorten organismen &!% & & &!& &"& & & &"& Standaardisaties ontwikkelen voor de methode(s) zodat de resultaten onderling vergelijkbaar zijn Kwantitatieve bepalingen ontwikkelen van middels qpcr JN(- 2