Woord vooraf. Ine Vansteenkiste 1

Transcriptie

1 Woord vooraf Als laatstejaarsstudente aan de Hogeschool West-Vlaanderen volg ik de opleiding van Farmaceutische en Biologische Laboratoriumtechnologie. Als onderdeel van mijn opleiding heb ik de kans gekregen om drie maanden stage te volgen in een privé-labo. Ik mocht er methoden opzoeken in verband met vloeistofchromatografie en ze uittesten met de aanwezige apparatuur. Ik heb gebruik gemaakt van de infrastructuur, de apparaten en reagentia van het labo. Het personeel van het bedrijf heeft me geholpen bij algemene taken maar ook bij specifiek werk voor mijn onderzoek. De voorbereidingen, het praktisch gedeelte en de resultaten zijn gebundeld in dit eindwerk. Dit alles is tot stand gekomen met de hulp van mijn stagebegeleider en stagementor. Ik wil dan ook dhr. Quartier en mevrouw Van Daele bedanken voor hun medewerking. Ook speciale dank voor het laboratorium Chemiphar N.V. waar ik stage heb mogen lopen. Ine Vansteenkiste 1

2 Samenvatting Osteoarthritis is een aandoening die de gewrichten aantast. Een groot percentage van de bevolking lijdt aan de ziekte of heeft andere degeneratieve gewrichtsproblemen. Meer en meer worden hiervoor voedingssupplementen ingenomen, in plaats van de klassieke ontstekingsremmende middelen en pijnstillers. De supplementen bevatten het natuurlijk aminosuiker glucosamine in combinatie met chondroïtine sulfaat. Deze twee stoffen zouden nieuw kraakbeen opbouwen en de verdere degradatie van de aangetaste gewrichten tegengaan. Omdat deze preparaten tot de voedingssupplementen behoren, zijn de controles minder streng dan bij geneesmiddelen. Dit heeft tot gevolg dat vele van de preparaten mogelijks niet altijd even zuiver, veilig en doeltreffend zijn. Er is dus nood aan een methode om een kwaliteitscontrole uit te oefenen op deze preparaten. Een mogelijkheid is om door middel van vloeistofchromatografie ( High Performance Liquid Chromatography of HPLC ) de identificatie en kwantificering van de actieve bestanddelen uit te voeren. In de literatuur zijn meerdere methoden terug te vinden die de bepaling van glucosamine in samengestelde preparaten, zoals tabletten of siroop, uitvoeren met HPLC. Eén van de problemen hierbij is dat er veelal interferentie is van andere stoffen uit het preparaat waardoor glucosamine minder doeltreffend te bepalen is. Chondroïtine, vulstoffen of toegevoegde vitamines zijn met HPLC moeilijk te scheiden van glucosamine. Er werden negen verschillende methoden getest die afkomstig waren uit meerdere bronnen. Allen gebruikten HPLC en waren bedoeld om glucosamine en/of chondroïtine te bepalen in samengestelde preparaten. Ine Vansteenkiste 2

3 Eén van de conclusies is dat geen van de geteste methoden geschikt is om glucosamine en chondroïtine tegelijkertijd te bepalen. Bij het experiment was er telkens interferentie van één van de twee stoffen met de andere. Er moet dus voor gezorgd worden dat bijvoorbeeld enkel glucosamine detecteerbaar is en chondroïtine niet. Om dan chondroïtine te bepalen moeten de condities terug aangepast worden zodat glucosamine niet kan gedetecteerd worden. Uiteindelijk werden twee methoden aanvaard om mee verder te werken. Eén voor de bepaling van glucosamine en een andere voor chondroïtine. Criteria hierbij waren de resultaten van een eerste test, alsook het beschikbaar materiaal, de kostprijs en mogelijkheid tot routine. De twee methoden werden uitgevoerd op samengestelde preparaten. Hierbij werd de lineariteit en nauwkeurigheid bepaald. De betreffende methoden moeten uiteindelijk bruikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling in opdracht van een klant. Hiervoor moet nog bijkomend onderzoek gebeuren en moet de validatie verder gezet worden. Ine Vansteenkiste 3

4 Lijst met afkortingen en symbolen AU: DAD: FDA: HPLC: mau: mg: µl: µm: nm: MSM: NSAID s: PITC: R.I.: rpm: USP: U.V.: absorption units (foto)diode array detector food and drug administration high performance liquid chromatography mili-absorption units milligram microliter micrometer nanometer methylsulfonylmethaan niet-steroïdale anti-inflammatoire drugs phenylisothiocyanaat refractive index, brekingsindex rounds per minute, toeren per minuut United States pharmacopeia ultraviolet Ine Vansteenkiste 4

5 Verklarende woordenlijst alumina Andere naam voor de chemische stof aluminiumoxide (Al 2 O 3 ). Een harde stof die in de natuur voorkomt, onder andere als robijn. aminosuiker Een suiker met een amino-groep (NH 2 ) aan gebonden. apolair Heeft geen elektrische polen (het zwaartepunt van de negatieve lading valt samen met het zwaartepunt van de positieve lading.) Een apolaire stof is hydrofoob ( houdt niet van water ). bar Eenheid van druk. 1 bar = Pascal (SI-eenheid voor druk). biobeschikbaarheid De fractie onveranderde drug of geneesmiddel van een bepaalde dosis die de algemene circulatie van het lichaam uiteindelijk bereikt. disaccharide Een suiker die samengesteld is uit twee monosacchariden (enkelvoudige suikers). elueren Term uit de vloeistofchromatografie. Een component van de stationaire fase losmaken met behulp van een solvent als loopvloeistof (eluens). emissie Proces waarbij een systeem dat zich in een aangeslagen toestand bevindt zijn overtollige energie kwijtraakt door het uitzenden van elektromagnetische straling (bijvoorbeeld licht). excitatie Het in aangeslagen toestand brengen van een atoom door elektronen naar een andere schil te laten overgaan (door toevoegen van energie zoals licht met een specifiek golflengte). Ine Vansteenkiste 5

6 exoskelet Een uitwendig skelet dat voorkomt bij geleedpotigen. farmacopee Officieel handboek, door de staat uitgegeven, met voorschriften voor de analyse en standaardeisen waaraan farmaca en hun preparaten moeten voldoen. flow rate De snelheid waarmee een pomp de mobiele fase over de kolom brengt bij HPLC. macromolecule Een molecule met een relatief hoge moleculaire massa die algemeen gezien uit meer dan 1000 atomen bestaat. monomeer Een kleine molecule die een chemische binding kan aangaan met andere monomeren om zo een polymeer te vormen. osteofyten Botuitgroeiiingen aan de rand van een gewricht dat aangetast is door osteoarthritis. Dit is een antwoord van het lichaam om de schade aan het gewricht te beperken. paracetamol Chemische stof die pijnstillend en koortsverlagend werkt. polair Heeft elektrische polen (het zwaartepunt van de negatieve lading valt niet samen met het zwaartepunt van de positieve lading.) Een polaire stof is hydrofiel ( houdt van water ). polysaccharide Een koolhydraat die opgebouwd is uit een groot aantal monosacchariden. (1) precursor Een stof die bij een chemische reactie de voorloper is bij het aanmaken van een andere stof. Ine Vansteenkiste 6

7 referentiestandaard Een bepaalde stof met zeer grote zuiverheid (rond de 99 %). De stof bevat dus geen of zo weinig mogelijk andere chemische stoffen. silica Siliciumdioxide (SiO 2 ), een harde stof die in de natuur voorkomt als zand of kwarts. U.V. licht Elektromagnetische straling met een golfengte korter dan die van het zichtbare licht, maar langer dan die van X-stralen (400 nm nm). U.V. spectrum Een weergave van de hoeveelheid geabsorbeerd U.V. licht (absorbantie) in functie van de ingestelde golflengte. Een U.V. spectrum is specifiek voor een bepaalde chemische stof of verbinding. vortex Een apparaat met een bewegende (trillende) functie die dient om bijvoorbeeld de inhoud van proefbuizen te mengen. Ine Vansteenkiste 7

8 Lijst van tabellen en figuren Afbeelding 2.1: Verschil tussen nauwkeurigheid en precisie Afbeelding 2.2: Chemische structuur van glucosamine Afbeelding 2.3: Chemische structuur van chondroïtine Afbeelding 2.4: Proteoglycanen in de kraakbeenstructuur Afbeelding 2.5: Aantasting van het gewrichtsweefsel door osteoarthritis Afbeelding 2.6: Voorbeeld van voedingssupplementen met glucosamine Afbeelding 2.7: Onderdelen van een HPLC-toestel Afbeelding 2.8: Voorbeeld van een vial en autosampler Afbeelding 2.9: Voorbeeld van een HPLC-kolom Afbeelding 2.10: Detectoren Afbeelding 2.11: Stationaire fase Afbeelding 2.12: Invloed van de polariteit Afbeelding 4.1: Methode 1 met derivatisatie, referentiestandaarden Afbeelding 4.2: Tailing factor Afbeelding 4.3: Methode 1 met derivatisatie, chromatogram ijklijn Afbeelding 4.4: Methode 1 met derivatisatie, grafiek ijklijn Afbeelding 4.5: Methode 1 met derivatisatie, chromatogram monsters Afbeelding 4.6: Methode 1 met derivatisatie, chromatogram stabiliteit Afbeelding 4.7: Methode 1 met derivatisatie, grafiek ijklijn Afbeelding 4.8: Methode 1 met derivatisatie, grafiek ijklijn Afbeelding 4.9: Methode 1 met derivatisatie, grafiek ijklijn Afbeelding 4.10: Methode 3, chromatogram referentiestandaarden Afbeelding 4.11: Methode 3, chromatogram ijklijn Afbeelding 4.12: Methode 3, grafiek ijklijn Afbeelding 4.13: Methode 3, chromatogram monsters Afbeelding 4.14: Methode 8, chromatogram referentiestandaarden Ine Vansteenkiste 8

9 Afbeelding 4.15: Methode 9, chromatogram referentiestandaarden Afbeelding 4.16: Methode 9, chromatogram ijklijn Afbeelding 4.17: Methode 9, grafiek ijklijn Afbeelding 4.18: Methode 9, chromatogram monsters Ine Vansteenkiste 9

10 Inhoudsopgave WOORD VOORAF... 1 SAMENVATTING... 2 LIJST MET AFKORTINGEN EN SYMBOLEN... 4 VERKLARENDE WOORDENLIJST... 5 LIJST VAN TABELLEN EN FIGUREN... 8 INHOUDSOPGAVE INLEIDING, SITUATIESCHETS EN PROBLEEMSTELLING LITERATUURSTUDIE Identificatie van stoffen in farmaceutische preparaten Belang van identificatie en kwaliteitscontrole De farmacopee Validatie Glucosamine en chondroïtine Structuur en eigenschappen van glucosamine Structuur en eigenschappen van chondroïtine Biochemisch Verband met osteoarthritis Identificatie en kwantificering met HPLC...20 Ine Vansteenkiste 10

11 2.3 HPLC Principe Algemene opstelling Soorten detectoren Derivatisatie Stationaire fase Mobiele fase MATERIALEN EN METHODEN Materialen HPLC toestel Referentiestandaarden IJklijn Monsteroplossingen Algemene reagentia Methoden Methode 1: Glucosamine and Chondroïtin Sulfate Sodium Tablets (4) Methode 2: Glucosamine Tablets (4) Methode 3: Determination of Chondroitin Sulfate in Raw Materials by Liquid Chromatography. (9) Methode 4: Lactulose (Lactulosum) (3) Methode 5: Development of a simple and sensitive HPLC method for determination of glucosamine in pharmaceutical formulations. (7) Methode 6: Determination of glucosamine in mushrooms, Agaricus bisporus. () Methode 7: A stability-indicating HPLC method for the determination of glucosamine in pharmaceutical formulations. (13) Methode 8: Precolumn Derivatization Liquid Chromatography Method for Analysis of Dietary Supplements for Glucosamine: Single Laboratory Validation Study. () Methode 9: Determination of the nutraceutical, glucosamine hydrochloride, in raw materials, dosage forms and plasma using pre-column derivatization with ultraviolet HPLC. (29)...39 Ine Vansteenkiste 11

12 4 RESULTATEN EN DISCUSSIE Methode 1 zonder derivatisatie Referentiestandaarden Methode 1 met derivatisatie Referentiestandaarden Tailing factor (symmetrie factor) (3) IJklijn Monsteroplossingen Stabiliteit van de oplossingen Derivatisatie Methode Referentiestandaarden Methode Referentiestandaarden IJklijn Monsteroplossingen Overige methoden Methode Methode 5 en Methode Methode Methode CONCLUSIE LITERATUURLIJST BIJLAGEN VOOR AKKOORD VERKLARING Ine Vansteenkiste 12

13 Experimenteel vergelijkende studie van analysemethoden voor de kwantitatieve Inleiding, situatieschets en probleemstelling 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling De stage en het eindwerk zijn een belangrijk onderdeel van de opleiding farmaceutische en biologische laboratoriumtechnieken. De stage gaat door in een universitair onderzoekslabo of in een labo uit de privé-sector. Het eindwerk behandelt het onderzoek of de analyses die in de stageperiode uitgevoerd werden. In dit geval werd in het privé-labo Chemiphar N.V. een vergelijkende studie uitgevoerd. Dit labo werkt voor klanten die bepaalde uit te voeren analyses aanvragen op hun monsters. De vraag naar kwantitatieve analyses op voedingssupplementen die glucosamine bevatten wordt alsmaar groter. Deze analyse wordt het best uitgevoerd met de HPLC scheidingstechniek. Een probleem is dat de meeste van deze supplementen ook chondroïtine bevatten. Met de apparatuur en methoden die beschikbaar waren in het labo was het tot nu toe nog niet gelukt om glucosamine en chondroïtine te scheiden met HPLC. De chondroïtine interfereerde met de glucosamine waardoor ze niet kwantitatief konden bepaald worden. Het doel was om in de stageperiode een manier te vinden om glucosamine en eventueel chondroïtine te kwantificeren in samengestelde preparaten zoals voedingssupplementen. Dit door opzoeken van methoden in de literatuur en deze te vergelijken en eventueel aan te passen. De ultieme doelstelling was om een methode te vinden die de gelijktijdige kwantitatieve bepaling van glucosamine en chondroïtine met HPLC in preparaten mogelijk zou maken. Als alternatief werd gezocht naar twee aparte methoden voor glucosamine en chondroïtine. De gevonden methoden werden getest op referentiestandaarden en op samengestelde preparaten. Ine Vansteenkiste 13

14 Literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 Identificatie van stoffen in farmaceutische preparaten Belang van identificatie en kwaliteitscontrole Geneesmiddelen moeten zuiver, veilig en doeltreffend zijn. Niet alleen de productie, maar ook het onderzoek en de ontwikkeling van farmaceutische producten moeten bepaalde regels naleven. Farmaceutische ondernemingen moeten bijvoorbeeld GMP ( Good Manufacturing Practice ) toepassen. Dit zijn een hele reeks eisen opgesteld door de food and drug administration (FDA). (1) Wanneer bijvoorbeeld een pijnstiller verkocht wordt, kan op de verpakking vermeld staan dat deze paracetamol bevat. De bedoeling van identificatietests is om zeker te zijn dat er effectief paracetamol zit in de pijnstiller. (2) Naast de identiteit moeten ook het gehalte en de zuiverheid van het actief bestanddeel in een geneesmiddel gecontroleerd worden. Een mogelijkheid is om via HPLC de aanwezige bestanddelen te vergelijken met gekende referentiestandaarden en zo het gehalte te bepalen. In de farmacopee (3,4) zijn ook tests beschreven die mogelijke onzuiverheden kunnen opsporen en kwantificeren. De te bepalen onzuiverheden en de toegestane hoeveelheid worden vermeld De farmacopee Zowel de Europese (3) als de Amerikaanse (4) farmacopee beschrijven monografieën voor de identificatie en kwantificatie van bepaalde stoffen in afgewerkte producten. Vele van deze methoden zijn echter omslachtig en niet ideaal om uit te voeren in routine. Daarom is er nood aan eenvoudige efficiënte methoden die kunnen uitgevoerd worden in routine. Ine Vansteenkiste 14

15 Literatuurstudie Validatie Wanneer een methode op punt gesteld of uitgetest wordt, is het noodzakelijk om de doeltreffendheid aan te tonen. Verschillende laboratoria moeten eenzelfde resultaat bekomen wanneer die methode gebruikt wordt. Hiervoor kunnen verschillende controles uitgevoerd worden. Enkele van de belangrijkste zijn: lineariteit en range, precisie en nauwkeurigheid (afbeelding 2.1), specificiteit, stabiliteit en robuustheid, detectielimiet en kwantificatielimiet. (5) Lineariteit wordt beoordeeld aan de hand van een grafiek (ijklijn) met een antwoord van de detector in functie van de concentratie aan analyt. Door middel van statistische programma s kan de regressie berekend worden. De range is het gebied waarbinnen lineariteit, nauwkeurigheid en precisie aanvaardbaar zijn. Om de specificiteit aan te tonen kan een identificatie gebeuren, bijvoorbeeld door vergelijking met gekend referentiemateriaal. Bij chromatografische procedures worden representatieve chromatogrammen gebruikt om de specificiteit aan te tonen. De stabiliteit en robuustheid moeten zeker vermeld worden. Als de metingen vatbaar zijn voor omgevingsveranderingen moeten die condities (zoals de temperatuur) goed geregeld worden en moet er ook een waarschuwing komen in de procedure. Er zijn nog enkele controlepunten waaronder de detectielimiet (de laagste concentratie die kan gedetecteerd worden) en kwantificatielimiet (een minimum waarbij de analyt kan gekwantificeerd worden, met een aanvaardbare precisie en nauwkeurigheid). (5) Ine Vansteenkiste 15

16 Literatuurstudie Afbeelding 2.1: Verschil tussen nauwkeurigheid en precisie. Linksboven: nauwkeurig en precies, rechtsboven: nauwkeurig maar niet precies, linksonder: precies maar niet nauwkeurig, rechtsonder: onnauwkeurig maar precies op een slecht punt na. (6) 2.2 Glucosamine en chondroïtine Structuur en eigenschappen van glucosamine Glucosamine (2-amino-2-deoxyglucose) is een aminosuiker (afbeelding 2.2) dat afgeleid is van glucose en een component is van chitine. (7) Chitine is een polysaccharide die chemisch en qua sterkte vergelijkbaar is met cellulose. Het komt voor als bouwstof in de celwand van schimmels en in het exoskelet van geleedpotigen waar het voor stevigheid zorgt. (8) Ook in het menselijk lichaam is het een sleutelcomponent van het kraakbeen. Glucosamine komt voor als een glucosamine-sulfaat zout of als glucosamine HCl. Afbeelding 2.2: Chemische structuur van glucosamine (11) Ine Vansteenkiste 16

17 Literatuurstudie Structuur en eigenschappen van chondroïtine Chondroïtine sulfaat is een glycosaminoglycaan, opgebouwd uit glucuronzuur en galactosamine. Het is een sterk wateroplosbaar polymeer (afbeelding 2.3) met een groot moleculair gewicht (23000 tot dalton) en is veel groter dan glucosamine. Omdat het een groot polysaccharide is kan dit voor problemen zorgen bij de scheiding met vloeistofchromatografie (2.3). Bij omgekeerde fase chromatografie kan een grote molecule namelijk minder goed weerhouden worden door de stationaire fase (2.3.4). Daarom wordt in veel methoden voor chrondroïtinebepaling een enzym gebruikt dat de polysacchariden afbreekt tot disacchariden (de polymeer wordt afgebroken in monomeren). Deze kunnen dan wel met vloeistofchromatografie bepaald worden. (9) Een ander alternatief is het gebruik van size-exclusion chromatografie (2.3.4). Afbeelding 2.3: Chemische structuur van chondroïtine. De dissacharide vormt een monomeer, een n-aantal monomeren vormt de polymeer chondroïtine. (10) Ine Vansteenkiste 17

18 Literatuurstudie Biochemisch Glucosamine en chondroïtine komen van nature voor in het kraakbeen en de gewrichtsvloeistof en voeren daar een belangrijke functie uit. Glucosamine-6- sulfaat is een precursor in de biochemische synthese van glycosaminoglycanen, chondroïtine sulfaat is zelf een glycosaminoglycaan. Deze zijn een onderdeel van de proteoglycanen, belangrijke bouwstenen van het kraakbeen. (afbeelding 2.4) Doordat ze een groot oppervlak innemen en graag water binden, zorgen ze ervoor dat er minder compressie plaatsvindt. (11,12) Afbeelding 2.4: Proteoglycanen in de kraakbeenstructuur. (12) Ine Vansteenkiste 18

19 Literatuurstudie Verband met osteoarthritis Osteoarthritis is een aandoening waarbij het kraakbeen aangetast wordt (afbeelding 2.5). Er is een verandering in de structuur en functie van de synoviale gewrichten. De balans tussen synthese en degradatie van de nodige macromoleculen is uit evenwicht. Het gewricht verliest zijn mechanische en functionele eigenschappen en er ontstaat pijn, stijfheid en beperkte bewegingsmogelijkheid. (2) Meestal worden aan patiënten met deze ziekte nietsteroïdale anti-inflammatoire drugs (NSAID s) voorgeschreven. Deze werken enkel ontstekings- en pijnwerend en kunnen bovendien ernstige problemen veroorzaken zoals maagzweren. Als alternatief wordt verondersteld dat de inname van glucosamine zou helpen bij het herstel van kraakbeen. Glucosamine zou in combinatie met chondroïtinesulfaat nieuw kraakbeen kunnen opbouwen en de degradatie van het aangetaste kraakbeen verminderen. (13) Daardoor zijn tal van producten, voornamelijk voedingssupplementen, op de markt die dit mogelijke wondermiddel bevatten. Afbeelding 2.5: Aantasting van het gewrichtsweefsel door osteoarthritis. (14) Ine Vansteenkiste 19

20 Literatuurstudie Identificatie en kwantificering met HPLC Glucosamine wordt door de FDA als een voedingssupplement beschouwd. (15) Hierdoor zijn niet dezelfde strenge productiemaatregelen en controles vereist die wel gelden voor geneesmiddelen. Ook de biobeschikbaarheid en gelijkmatigheid van inhoud zijn nauwelijks bepaald. Vele van de supplementen die op de markt zijn bevatten mogelijks stoffen van mindere kwaliteit en kwantiteit dan vermeld is op de verpakking. (1) Daarom is de vraag naar identificatie en kwantitatieve analyse van de actieve bestanddelen, hier glucosamine en chondroïtine, groot en is er nood aan een bruikbare methode voor de bepaling van deze stoffen. Er zijn verschillende HPLC methoden gepubliceerd die de directe analyse van glucosamine in farmaceutische producten mogelijk maken (hoofdstuk 3). Weinig daarvan zijn echter efficiënt wanneer ook chondroïtine en vulstoffen in het preparaat aanwezig zijn. De absorbantiewaarden van chondroïtine bekomen met HPLC (2.3.3, detectie) interfereren soms met die van andere stoffen waardoor geen juiste (kwantitatieve) analyse mogelijk is. Afbeelding 2.6: Voorbeeld van voedingssupplementen met glucosamine. (16,17) Ine Vansteenkiste 20

21 Literatuurstudie 2.3 HPLC Principe Het principe bij HPLC is de verdeling van componenten tussen de mobiele fase en de stationaire fase (2.3.5 en 2.3.4). (3) Zowel bij normale als omgekeerde fase chromatografie (2.3.4) heeft polariteit een belangrijke invloed op de scheiding van twee of meerdere componenten. De leidraad hierbij is: soort zoekt soort. Componenten die eerder polair zijn, zullen aangetrokken worden door een polaire stationaire fase terwijl apolaire componenten makkelijker op een apolaire stationaire fase zullen vast blijven. Op dezelfde manier verkiezen polaire componenten een polaire mobiele fase waardoor ze sneller samen met de mobiele fase van de kolom zullen elueren. Doordat de verschillende componenten meer of minder op de stationaire fase weerhouden worden of met het eluens meevloeien, treedt er scheiding op. (18) Algemene opstelling Afbeelding 2.7: Onderdelen van een HPLC-toestel (19) Ine Vansteenkiste 21

22 Literatuurstudie Afbeelding 2.7 geeft de verschillende onderdelen weer van een HPLC-toestel. Het reservoir (a) bevat de mobiele fase. Er kunnen meerdere reservoirs gebruikt worden die elk een onderdeel van de mobiele fase bevatten. Met de software van het toestel kunnen die gemengd worden tot de gewenste samenstelling van de mobiele fase bekomen wordt. Als die samenstelling constant gehouden wordt tijdens het scheidingsproces wordt de mobiele fase isocratisch genoemd. Bij gradiënt -HPLC wordt de samenstelling van de mobiele fase wel veranderd tijdens het scheidingsproces. (20) Een pomp (b) brengt de mobiele fase met een constante flow over de kolom. (3) De vloeistof moet door de vele, dicht op elkaar gepakte beads geraken. Hiervoor is de zwaartekracht niet voldoende. De pomp ontwikkelt een bepaalde druk (meestal tussen 6 en 220 bar). Daarom is de buitenkant van de kolom en het buizensysteem van het hele toestel vervaardigd uit drukbestendig materiaal zoals roestvrij staal of inerte kunststof. (21) De injector (c) brengt de monsteroplossing in het systeem dat onder druk staat. De oplossing wordt aan het begin van de kolom in de mobiele fase gebracht met een injectiepoort. Die bestaat uit een injectieklep en een sample loop (een lus). De monsteroplossing wordt in de mobiele fase opgelost voordat die geïnjecteerd wordt in de lus. Dan wordt ze in de naald opgezogen en in de lus gebracht via de injectieklep. Een rotatiesysteem sluit deze klep en opent de lus zodat de monsteroplossing in het voorbijstromende eluens gebracht wordt. Het volume van de lus (het injectievolume) kan variëren van 10 µl tot 500 µl. (22) Ine Vansteenkiste 22

23 Literatuurstudie Het injecteren van meerdere oplossingen na elkaar kan automatisch en nauwkeuriger gebeuren met behulp van een autosampler (afbeelding 2.8). Dit toestel wordt tussen pomp en injector aangesloten op het HPLC-systeem. De te analyseren oplossing wordt in een vial (een klein flesje) gedaan en daarna op een bepaalde positie in de autosampler geplaatst. Via het besturingssysteem of de autosampler zelf, kan ingesteld worden welke posities van de autosampler door welk monster bezet zijn. Afbeelding 2.8: Voorbeeld van een vial en autosampler. (23,24) De kolom (d) is een cilinder met lengtes van 5 tot 30 cm en een variabele diameter tussen 3 en 5 mm (meestal 4.6 mm). Ze is vervaardigd uit roestvrij staal of drukbestendige kunststof (3) (afbeelding 2.9). De kolom bevat de stationaire fase (2.3.4) en is aan de ene kant verbonden met de pomp, aan de andere kant met de detector. (25) Afbeelding 2.9: Voorbeeld van een HPLC-kolom. (26) Ine Vansteenkiste 23

24 Literatuurstudie Het datasysteem (f) is meestal een computer met aangepaste software die alle resultaten bijhoudt en de gegevens van de detector omzet naar een chromatogram. Het systeem kan ook software bevatten die zorgt voor het besturen en instellen van pomp, injector en autosampler. Verwerking van de resultaten, zoals het berekenen van piekoppervlaktes, gebeurt ook door het datasysteem. De detector (e) detecteert de eluerende componenten wanneer die loskomen van de stationaire fase en samen met de mobiele fase de meetcel passeren. Het systeem meet een verschil in absorbantie tussen het eluens en de eluerende component, wat weergegeven wordt als een piek. (27) Soorten detectoren Bij HPLC wordt meestal een U.V.- detector (25) gebruikt, dat in zijn meest simpele vorm bestaat uit een lichtbron, een meetcel en een lichtsensor (afbeelding 2.10 a). De detector meet het verschil in absorbantie tussen zuiver eluens en eluens waarin de geïnjecteerde oplossing zich bevindt. Het is dus belangrijk om een eluens te kiezen dat bij de ingestelde golflengte het U.V.- licht niet of zo weinig mogelijk absorbeert. Anderzijds wordt de golflengte het best ingesteld op een waarde waarbij de te analyseren component het meest absorbeert. U.V.- detectoren met een variabele golflengte, ook spectrofotometrische detectoren genoemd, worden als standaarddetector gebruikt voor kwantitatieve en routineanalyses. Ine Vansteenkiste 24

25 Literatuurstudie Foto diode array detectoren of diode array detectoren (DAD) (25) (afbeelding 2.10 b) zijn meer veelzijdig omdat zowel het chromatogram als een U.V.- spectrum opgenomen wordt. Zo wordt de identiteit van een component niet enkel bepaald op basis van retentietijd maar ook op basis van zijn U.V.- spectrum. Afbeelding 2.10 (25) a): Bij de klassieke detector wordt het licht opgesplitst in zijn verschillende golflengtes m.b.v. een diffractierooster (grating), waarna één golflengte geselecteerd wordt, door de flow cell gestuurd en gedetecteerd wordt. b): Bij de DAD-detector wordt het licht pas na de flow cell opgesplitst en worden alle golflengtes tegelijkertijd gedetecteerd door een rij kleine diode detectoren Derivatisatie Glucosamine op zich heeft geen chromofoor. Dit wil zeggen dat er geen specifieke delen van de molecule zijn, zoals een aromatische binding, die absorberen in het U.V.- golflengtegebied dat bruikbaar is voor HPLC. (28) Om dit probleem op te lossen wordt een chromofore groep gekoppeld aan glucosamine. Op die manier ontstaat er een derivaat die wel licht absorbeert in het U.V.-gebied. Derivatisatie kan door bijvoorbeeld phenylisothiocyanaat (PITC) of o-phtaldialdehyde toe te voegen aan de te injecteren oplossing. (29) Ine Vansteenkiste 25

26 Literatuurstudie Fluorescentiedetectoren (25) zijn nóg specifieker dan U.V.- detectoren. Ze steunen op een bijzondere eigenschap van de analyt, namelijk de mogelijkheid om fluorescent licht uit te zenden na excitatie. De selectiviteit wordt nog versterkt door het gebruik van twee golflengtes, de excitatie-golflengte en de emissie-golflengte. Via derivatisatie kunnen fluorescente groepen gebonden worden aan nietfluorescente componenten. Fluorescentie-detectie meet het emissielicht (in tegenstelling tot transmissie-licht bij U.V.- detectie) waardoor veel gevoeliger kan gemeten worden. Het is immers makkelijker om een absolute hoeveelheid te meten dan een klein verschil tussen twee grotere waarden. Omdat niet alle componenten fluorescent zijn, is deze manier van detectie veel selectiever maar ook beperkter dan U.V.- detectie. De kostprijs ligt ook hoger dan die van een U.V.- detector. Met een brekingsindex-detector (25) worden alle substanties met een verschillende brekingsindex ( refractive index of RI ) dan die van de mobiele fase, geregistreerd. Deze manier van detectie is dus niet-selectief. De detector is erg gevoelig voor veranderingen in temperatuur, druk en flow rate. Om die redenen kan een RI-detector niet gebruikt worden bij gradiënt-elutie HPLC. Detectie op basis van brekingsindex kan wel zeer nuttig zijn voor het bepalen van componenten die niet absorberen in het U.V.- gebied of niet fluorescent zijn, zoals bijvoorbeeld suikers. Ine Vansteenkiste 26

27 Literatuurstudie Stationaire fase Deze bestaat uit minuscule bolvormige partikels ( beads ) waarop al dan niet chemische groepen gebonden zijn. (30) Voor analytische scheidingen varieert de meest gebruikte deeltjesgrootte tussen drie en tien µm. De stationaire fase kan vervaardigd zijn uit silica, alumina of poreuze grafiet zoals bij normale-fase chromatografie. De stationaire fase is dan polair terwijl de mobiele fase minder polair is. Bij omgekeerde-fase chromatografie worden chemisch aangepaste polymeren, silica of poreuze grafiet gebruikt. Deze vorm van chromatografie gebruikt een niet-polaire stationaire fase en een polaire mobiele fase. (3) Het verschil met normale fase chromatografie is dus letterlijk dat de mobiele en stationaire fase omgekeerd zijn. Het oppervlak van silicabeads (de silanolgroepen) laat men reageren met verschillende silaan-reagentia. Zo ontstaan covalent gebonden silylderivaten die een groot aantal actieve chemische groepen vormen aan het oppervlak van de stationaire fase partikels. (afbeelding 2.11) Twee veel gebruikte niet-polaire stationaire fasen zijn de silylderivaten octyl (C 8 ) en octadecyl (C 18 ) die respectievelijk acht en achttien koolstofatomen bezitten. (3) Size exclusion chromatografie gebruikt een stationaire fase met een bepaalde gecontroleerde poriëngrootte. Scheiding is gebaseerd op de mogelijkheid van bepaalde moleculen om in een netwerk van poriën binnen te dringen. (3) Afbeelding 2.11: a) Een enkele silica-bead met zijn poriën. b) Uitvergroting van de porie van een silica-bead waaraan stationaire fase-groepen gebonden zijn. (30) Ine Vansteenkiste 27

28 Literatuurstudie Mobiele fase Net zoals bij de stationaire fase speelt de polariteit hier een belangrijke rol. Omgekeerde-fase chromatografie gebruikt een overwegend polaire mobiele fase en een apolaire stationaire fase. Polaire componenten verkiezen het polaire eluens en blijven dus niet lang op de apolaire stationaire fase vast. Afbeelding 2.12 a) toont dat de onderzochte componenten minder weerhouden worden naarmate ze meer polair zijn (soort zoekt soort principe). Nitrobenzeen is het meest polair, dan 2-nitrobenzeen en dan 2-nitro-1,3-xyleen. Anderzijds kan door aanpassen van de polariteit van het eluens een verschillende retentietijd bekomen worden. Op afbeelding 2.12 b) is te zien dat een vermindering van het percentage aan water (een polair solvent) in dit geval voor twee tot drie maal kortere retentietijden zorgt. Door het aandeel aan water in de mobiele fase te verminderen, kunnen dus kortere retentietijden verkregen worden. Een probleem hierbij is dat de pieken dichter bij elkaar zullen liggen en de scheiding dus minder goed zal zijn. (31) Afbeelding 2.12: Invloed van de polariteit op de retentietijd bij omgekeerde fase chromatografie. a): mobiele fase bevat meer water dan b). (31) Ine Vansteenkiste 28

29 Materialen en methoden 3 Materialen en methoden 3.1 Materialen HPLC toestel Er werden twee verschillende toestellen gebruikt. toestel 1: - detector: Varian 9050 Variable wavelength UV-VIS detector. - pomp: Varian 9012 Solvent delivery system. - autosampler: Varian 9100 AutoSampler. toestel 2: - detector: Varian ProStar, DAD-UV detector. - pomp: Varian ProStar - autosampler: Varian ProStar model 410, tray-cooling installed. - kolomoven: Varian ProStar model Referentiestandaarden De referentiestandaarden oplossen in water tenzij anders voorgeschreven, met een concentratie van +/- 1 mg/ml. De stockstandaard en verdunningen voor een ijklijn apart aanmaken zodat een concentratie van +/- 1 mg/ml referentiestandaard binnen de range van de ijklijn valt. - Glucosamine HCl: D (+) - glucosamine, Sigma. lot: 41K Glucosamine sulfaat 2 KCl: (monster van klant) lot: Chondroïtine-6-sulfaat sodium salt: Sigma. lot: 027K methylsulfonylmethaan (MSM): (monster van klant) lot: Vitamine C (ascorbinezuur): L (+) - ascorbic acid, Sigma. lot: Ine Vansteenkiste 29

30 Materialen en methoden IJklijn Volgens de normen van het betreffende labo is de correlatie van een ijklijn aanvaardbaar vanaf een waarde van en kan de ijklijn gebruikt worden voor kwantificering. De bekomen piekoppervlakte wordt ingevuld in de vergelijking van de ijklijn en de berekende concentratie wordt uitgedrukt in percent. De gekende concentratie (theoretische concentratie) wordt gelijkgesteld aan 100 percent. In de USP (4) worden twee grenzen vermeld in verband met de hoeveelheid van een bepaald actief bestanddeel in een preparaat. De ene gaat van 95 tot 105 percent, de andere van 90 tot 110 percent. Welke van deze grenzen gehanteerd wordt is afhankelijk van het registratiedossier van de firma waarvoor de kwantitatieve analyse gebeurt Monsteroplossingen Er waren twee monsters van een klant ter beschikking die glucosamine en chondroïtine bevatten en waarop uiteindelijk een kwantitatieve bepaling moet gebeuren. - Tabletten Weeg minimum 20 tabletten afzonderlijk en bereken de gemiddelde massa van een tablet. Verpulver de gewogen tabletten met stamper en mortier. Los de juiste hoeveelheid op in water en meng met een vortex of magnetische roerder zodat het poeder in oplossing gaat. Zet 20 minuten in een sonificatiebad en roer daarna nog 5 minuten. Centrifugeer en filtreer de oplossing. (*): de tabletten bevatten theoretisch: 500 mg glucosamine sulfaat per 2 gram tablet. De gemiddelde massa van een tablet bedroeg g, deze bevat ( /4 =) g glucosamine sulfaat. De concentratie glucosamine sulfaat van de uiteindelijke oplossing moet binnen de range van de bijhorende ijklijn vallen. Ine Vansteenkiste 30

31 Materialen en methoden - Siroop Neem de siroop op met een pipet en maak de nodige verdunning aan in water. Gebruikte siroop: GlucoMotion, bevat 1992 mg per dagdosering (= 20 ml) of (1992/20) = 99.6 mg/ml glucosamine sulfaat 2 KCl (tabel 3.1). De siroop bevat tevens chondroïtine sulfaat, vitamine C en MSM. De concentratie glucosamine sulfaat van de verdunde oplossing moet binnen de range van de bijhorende ijklijn vallen Algemene reagentia - Water: HPLC-grade (gezuiverd door omgekeerde osmose). - Solventen: Scharlau, Multisolvent, HPLC-grade, ACS, ISO, UV-VIS, K.F. - Andere reagentia: farmacopee-kwaliteit. (3,4) Ine Vansteenkiste 31

32 Materialen en methoden 3.2 Methoden Methode 1: Glucosamine and Chondroïtin Sulfate Sodium Tablets (4) Content of glucosamine Reagentia Oplosmiddel (voor monsteroplossingen) Voeg 29 µl azijnzuur ( % CH 3 COOH) samen met acetonitril. Leng aan met water tot 50 ml. 5 ml Verdund azijnzuur Leng 60 ml ijsazijn ( % CH 3 COOH) aan met water tot 1000 ml. 0.2 M Boraatbuffer ph 9.5 Los 7.63 g natriumtetraboraat (Na 2 B 4 O 7.10 H 2 O) op in +/- 80 ml water. Breng op juiste ph met HCl en leng aan met water tot 100 ml. (opmerking: bewaar op kamertemperatuur en warm op wanneer kristallisatie voorkomt.) Derivatisatiereagens In een polypropyleen cultuurbuisje (14 ml): Los 50 mg o-phtalaldehyde op in 1.25 ml methanol. Voeg 50 µl 3-mercaptopropionic acid en 11.2 ml 0.2 M boraatbuffer toe. Meng zachtjes en laat 30 minuten in het donker staan vóór gebruik. (opmerking: sterkte van het reagens wordt behouden door om de 2 dagen 10 µl 3-mercaptopropionic acid toe te voegen. Bewaar in het donker en op kamertemperatuur). Ine Vansteenkiste 32

33 Materialen en methoden Acetaatbuffer ph g natriumacetaat trihydraat (NaC 2 H 3 O 2.3H 2 O) oplossen in +/- 700 ml water. Op juiste ph brengen met verdund azijnzuur en aanlengen met water tot 1000 ml. Mobiele fase 900 ml acetaatbuffer ph ml methanol mengen en ontgassen voor gebruik Chromatografisch systeem Zie bijlage 2, tabel Werkwijze Breng 100 µl van het derivatisatiereagens en 100 µl van de standaardoplossing of testoplossing in een vial die 400 µl 0.2 M boraatbuffer bevat. Meng, laat 1 minuut reageren en injecteer de oplossing. Ine Vansteenkiste 33

34 Materialen en methoden Methode 2: Glucosamine Tablets (4) Reagentia Fosfaatbuffer ph 3 Los 1.0 ml fosforzuur op in water en breng op juiste ph met kaliumhydroxide - oplossing. Leng aan met water tot 2000 ml. Mobiele fase 600 ml fosfaatbuffer ph ml acetonitril Meng en ontgas voor gebruik Chromatografisch systeem Zie bijlage 2, tabel Methode 3: Determination of Chondroitin Sulfate in Raw Materials by Liquid Chromatography. (9) Reagentia Buffer concentraat Verdun 100 ml triëthylamine met water tot +/- 900 ml. Voeg 80 ml fosforzuur 85 % toe en meng voorzichtig. Laat afkoelen tot kamertemperatuur. Leng aan met water tot 1000 ml. Mobiele fase Weeg 0.50 g octanesulfonic acid sodium salt af in een klein bekertje en breng kwantitatief over in een maatkolf van 1000 ml. Voeg 5.0 ml LC buffer concentraat en 40 ml acetonitril toe. Leng aan met water tot 1000 ml en meng goed. Meng en ontgas voor gebruik. Ine Vansteenkiste 34

35 Materialen en methoden Chromatografisch systeem Zie bijlage 2, tabel Werkwijze Bereid oplossingen uit de standaardstock voor de standaardcurve. Injecteer de stockoplossing en de oplossingen voor de standaardcurve. De correlatie moet groter zijn dan (3.1.3). Als een goede standaardcurve bekomen is, injecteer dan de monsteroplossingen Methode 4: Lactulose (Lactulosum) (3) System suitability: reference solution (c) Reagentia Mobiele fase Los g natrium diwaterstoffosfaat R (NaH 2 PO 4 ) op in 220 ml water. Voeg 780 ml acetonitril toe. Meng en ontgas voor gebruik Chromatografisch systeem Zie bijlage 2, tabel Werkwijze Injecteer de stockstandaard om na te gaan als pieken te zien zijn. Zo ja, bereid oplossingen uit de standaardstock voor de standaardcurve. Injecteer de stockoplossing en de oplossingen voor de standaardcurve. De correlatie moet groter zijn dan (3.1.3). Als een goede standaardcurve bekomen is, injecteer dan de monsteroplossingen. Ine Vansteenkiste 35

36 Materialen en methoden Methode 5: Development of a simple and sensitive HPLC method for determination of glucosamine in pharmaceutical formulations. (7) Reagentia Boraatbuffer ph 9.5 Los 2.85 g natriumtetraboraat (watervrij) op in 100 ml water. Laat de oplossing vijf minuten koken, pas de ph aan tot 9.5 +/ met natriumhydroxide oplossing. Derivatisatiereagens Los 5 mg o-phtaldialdehyde (OPA) op in 900 µl methanol, voeg 100 µl boraatbuffer ph 9.5 en 10 µl 3-mercaptopropionic acid (MPA) toe. Mobiele fase Oplossing 1: Meng natriumfosfaat 12.5 mm ph 6.5 met methanol in de verhouding 10:90. Oplossing 2: Meng methanol en tetrahydrofuraan in een verhouding 97:3. Meng oplossing 1 met oplossing 2 in een verhouding 85:15. Meng goed en ontgas voor gebruik Chromatografisch systeem Zie bijlage 2, tabel 1. Ine Vansteenkiste 36

37 Materialen en methoden Methode 6: Determination of glucosamine in mushrooms, Agaricus bisporus. (32) Reagentia Extractiesolvent: verdunde HCl (6 N) Leng g HCl aan met water tot 1000 ml. (3) Mobiele fase Meng 0.15 % mierenzuur in water met acetonitril in een verhouding 80:20. Meng goed en ontgas voor gebruik Chromatografisch systeem Zie bijlage 2, tabel Werkwijze Maak de oplossingen voor de standaardcurve aan in water. Voeg extractiesolvent toe en kook de oplossing onder reflux gedurende een zekere tijd (minimum 1 uur) Methode 7: A stability-indicating HPLC method for the determination of glucosamine in pharmaceutical formulations. (13) Reagentia M fosfaatbuffer ph 7.50 Los 7.0 +/- 0.1 g KH 2 PO 4 op in 2 L water. Voeg 0.5 ml 28 % NH 4 OH toe en pas de ph aan tot / met fosforzuur. Solvent voor staalbereiding Meng acetonitril met HPLC-water in de verhouding 50:50. Ine Vansteenkiste 37

38 Materialen en methoden Mobiele fase Meng M fosfaatbuffer ph 7.50 met acetonitril in de verhouding 25: Chromatografisch systeem Zie bijlage 2, tabel Methode 8: Precolumn Derivatization Liquid Chromatography Method for Analysis of Dietary Supplements for Glucosamine: Single Laboratory Validation Study. (33) Reagentia Trisbuffer ph Los 3 g tris(hydroxymethyl)aminomethaan R op in 1000 ml water. Breng op juiste ph met 1 M HCl. Derivatisatiereagens Maak een 5 % phenylisothiocyanaatoplossing in methanol. Mobiele fase Lineaire gradiënt die bestaat uit: % fosforzuur in methanol % fosforzuur in water Chromatografisch systeem Zie bijlage 2, tabel Werkwijze Meng 1 ml oplossing met 1 ml buffer ph 8,3; 1 ml 5 % PITC in methanol. Derivatiseer bij 80 C in een warmwaterbad voor 30 minuten. Laat afkoelen in een koudwaterbad, centrifugeer bij rpm en injecteer de heldere bovenlaag. Ine Vansteenkiste 38

39 Materialen en methoden Methode 9: Determination of the nutraceutical, glucosamine hydrochloride, in raw materials, dosage forms and plasma using precolumn derivatization with ultraviolet HPLC. (29) Reagentia 0.3 M fosfaatbuffer ph 8.0 (Opmerking: in de Europese farmacopee 2 staat een 0.1 M fosfaatbuffer ph 8.0 beschreven. Alle hoeveelheden werden vermenigvuldigd met drie.) - (3 x g/l) = g/l kaliumdiwaterstoffosfaat R. - (3 x g/l) = g/l dikaliumwaterstoffosftaat R. Los op in water, breng op juiste ph met geconcentreerd fosforzuur en leng aan met water tot 2000 ml. Derivatisatiereagens 5 % phenylisothiocyanaat (PITC) in methanol. Mobiele fase Methanol, water en azijnzuur mengen in een verhouding van 10:89.96: Chromatografisch systeem Zie bijlage 2, tabel Werkwijze Voeg 250 µl 0.3 M fosfaatbuffer ph 8.0 en 250 µl 5 % PITC bij de oplossing. Vortex, laat reageren op kamertemperatuur gedurende 10 minuten en laat droogdampen bij +/- 50 C onder stikstof. Voeg na derivatisatie 200 µl mobiele fase toe en injecteer de bekomen oplossing. Indien pieken bekomen werden van de referentieoplossing, bereid en injecteer een standaardstock en oplossingen voor de standaardcurve. De correlatie moet groter zijn dan (zie 3.1.2). Als een goede standaardcurve bekomen is, injecteer dan de monsteroplossingen. Ine Vansteenkiste 39

40 Resultaten en discussie 4 Resultaten en discussie 4.1 Methode 1 zonder derivatisatie Referentiestandaarden Bij een golflengte van 195 nm en 340 nm waren geen significante pieken afkomstig van glucosamine of chondroïtine te zien. De standaardoplossingen werden een tweede maal geïnjecteerd om een probleem met de injectie of kolom uit te sluiten. In een methode om chondroïtine te bepalen (3.2.3) wordt een golflengte van 207 nm voorgesteld. In het U.V.-spectrum van chondroïtine is te zien dat het absorptiemaximum dicht ligt bij 207 nm (bijlage 1, afbeelding 2). Een piek specifiek voor chondroïtine werd niet gevonden bij de gebruikte werkwijze en ingestelde golflengte van 195 nm en 340 nm. Glucosamine sulfaat bevat geen chromofoor dat absorbeert in het ingestelde golflengte-gebied. Zonder derivatisatie (2.3.4) waren geen pieken afkomstig van glucosamine te zien. Aangezien de referentiestandaarden geen pieken gaven met deze methode, werd ze ook niet geprobeerd op monsters. 4.2 Methode 1 met derivatisatie Referentiestandaarden Afbeelding 4.1 toont chromatogrammen van standaarden glucosamine en chondroïtine. De retentietijd van de pieken werd vergeleken met deze beschreven in de gebruikte methode (relatieve retentietijd van β-anomeer van glucosamine: 1.0, α-anomeer van glucosamine: 1.8 bij de voorgestelde kolom). Ine Vansteenkiste 40

41 Resultaten en discussie In bijlage 1, afbeelding 4 is te zien dat beide pieken afkomstig zijn van dezelfde stof (de U.V.- spectra zijn gelijk). De pieken waren specifiek voor de twee anomeren van glucosamine en er werden geen interfererende pieken van chondroïtine gevonden. Afbeelding 4.1: Methode 1 met derivatisatie, referentiestandaarden. Flow rate: 1.0 ml.min -1, detectie: U.V. 340 nm, concentratie glucosamine HCL: +/- 1 mg/ml. R t glucosamine α: +/ min., glucosamine β: +/ min. (van voor naar achter): glucosamine HCl standaard, chondroïtinestandaard en blanco Tailing factor (symmetrie factor) (3) Omdat de pieken een minder goede vorm hadden (asymmetrie) werd de tailing factor (afbeelding 4.2) berekend aan de hand van volgende formule: A s = w d Ine Vansteenkiste 41

42 Resultaten en discussie met w 0.05 = wijdte van de piek op 1/20 ste van de piekhoogte. d = afstand tussen de loodrechte vanaf het piekmaximum en de rechte op 1/20 ste van de piekhoogte. Een waarde van 1.0 komt overeen met complete (ideale) symmetrie. Afbeelding 4.2: Tailing factor. (34) De tailing factor werd berekend voor de pieken van de referentiestandaarden (afbeelding 4.1). Een waarde van 2.9 werd bekomen, de piek vertoont dus tailing. Door langdurig gebruik van een kolom kunnen de koolstofatomen die op de silanolgroepen gebonden zijn als het ware plat gaan liggen. Dit komt vooral omdat de mobiele fase altijd in dezelfde richting door de kolom vloeit. Om dit te verhelpen werd de kolom omgekeerd gespoeld. De bedoeling was dat de gebonden groepen terug hun oorspronkelijk positie zouden aannemen en dat de tailing zo zou verminderen. De tailing factor van de bekomen pieken (afbeelding 4.3) werd opnieuw berekend en een waarde van 1.3 werd gevonden. De tailing factor is dus gereduceerd door omgekeerd spoelen van de kolom. Ine Vansteenkiste 42

43 Resultaten en discussie IJklijn Een verdunningsreeks met +/- 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 en 2 mg/ml glucosamine HCl werd gederivatiseerd en geïnjecteerd (afbeelding 4.3). Na integreren van de pieken door het computerprogramma werden de piekoppervlaktes vergeleken. Een grafiek werd opgesteld met de piekoppervlaktes in functie van de concentratie glucosamine HCl (afbeelding 4.4). De correlatie van de ijklijn bedroeg (3.1.3). Een controlestandaard met gekende concentratie glucosamine HCl werd apart aangemaakt en geïnjecteerd. De bekomen piekoppervlakte werd ingevuld in de vergelijking van de ijklijn en de concentratie glucosamine HCl werd berekend. Deze bedroeg 108 % van de afgewogen hoeveelheid wat een aanvaardbare waarde is volgens de grenzen van de USP (4) (3.1.3). Afbeelding 4.3: Methode 1 met derivatisatie, ijklijn. Flow rate: 1.0 ml.min -1, detectie: U.V. 340 nm, concentratie glucosamine HCl: (van voor naar achter) +/- 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 en 2 mg/ml. R t glucosamine α: +/ min., glucosamine β: +/ min. Ine Vansteenkiste 43

44 Resultaten en discussie Afbeelding 4.4: Methode 1 met derivatisatie, grafiek ijklijn. Piekoppervlaktes van verdunningsreeks glucosamine in functie van de gekende concentratie glucosamine sulfaat. Vergelijking van de rechte: y = x Correlatie (R 2 ) = Monsteroplossingen Oplossingen van tabletten en siroop die glucosamine en chondroïtine bevatten werden samen met een referentiestandaard glucosamine geïnjecteerd. Een hoeveelheid poeder en siroop werd opgelost zodat de oplossingen een gekende hoeveelheid glucosamine bevatten (3.1.4). Op afbeelding 4.5 zijn pieken specifiek voor glucosamine te zien (zie referentiestandaarden). De resolutie tussen de glucosamine-piek en de aangrenzende piek werd berekend aan de hand van volgende formule: (3) R s = 1.18 (t R2 - t R1 ) met t R2 > t R1 w h1 + w h2 t R2 en t R1 = Retentietijden, w h1 en w h2 = Piekwijdtes op halve hoogte. Ine Vansteenkiste 44

45 Resultaten en discussie Een resolutie groter dan 1.5 komt overeen met een scheiding van de twee pieken ten opzichte van de basislijn. (3) Voor de tablet was de resolutie tussen de β anomeer van glucosamine en de piek afkomstig van een andere stof gelijk aan 2.74, voor de siroop waren enkel glucosamine-pieken te zien. Er werden dus geen interfererende pieken van chondroïtine of vulstoffen gevonden (aan de hand van de resolutie). Na integratie werden de oppervlaktes van de glucosamine-pieken ingevuld in de vergelijking van de ijklijn (afbeelding 4.4). De berekende hoeveelheid glucosamine bedroeg voor de tablet 91 % en voor siroop 75 % van de afgewogen hoeveelheid. De waarde van de tablet is aanvaardbaar, deze van de siroop niet (3.1.3). Afbeelding 4.5: Methode 1 met derivatisatie, monsteroplossingen. Flow rate: 1.0 ml.min -1, detectie: U.V. 340 nm, (van voor naar achter): tablet, siroop, controlestandaard glucosamine HCl (+/- 5 mg/ml). R t glucosamine α: +/ min., glucosamine β: +/-5.01 min. Ine Vansteenkiste 45