Microbiologische kwaliteit en veiligheid van maaltijdsalades

Transcriptie

1 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar Microbiologische kwaliteit en veiligheid van maaltijdsalades Michel Verhaegen Promotor: Prof. dr. ir. M. Uyttendaele Promotor: Prof. dr. ir. F. Devlieghere Tutor: MSc. E. Lahou Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Levenmiddelenwetenschappen en voeding 1

2 2

3 De auteur en de promotor geven de toelating deze thesis voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de thesis te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze thesis. The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is in subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis. Auteur/Author: Michel Verhaegen Promotoren: Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele en Prof. dr. ir. Frank Devlieghere Begeleider/tutor: MSc. Evy Lahou 3

4 4

5 Woord vooraf Het is bijna zover na die Fantastische vijf jaren (studie)plezier aan de faculteit bioingenieurswetenschappen te Gent, finale versie van mijn thesis. Het laatste jaar was best druk en intensief. Maar een jaar waar ik veel heb bijgeleerd, niet enkel op wetenschappelijk gebied, maar des te meer op persoonlijk vlak. Thesissen is meer dan enkel een wetenschappelijke rapportering van de uitgevoerde onderzoeken. Het is jezelf leren kennen, limieten verleggen, doorzetten Graag wil ik mijn beide promotoren, Mieke en Frank, bedanken voor de fijne samenwerking, de vele kansen die ik op dit labo heb gekregen, de interessante discussiemomenten en het vele geduld tijdens het schrijven van mijn thesis. In het bijzonder wil ik ook mijn tutor, Evy, bedanken voor alle hulp, steun en geduld tijdens het vervolledigen van mijn thesis maar ook zeker voor de gezellige babbeltjes, ondermeer over Zweedse pralines die ik ongetwijfeld vroeg of laat eens zal proeven, tijdens het labowerk! Verder wil ik ook graag Ann bedanken die mij in den beginne alle tips and tricks op de labovloer heeft aangeleerd en mij het reilen en zeilen van het labo op een geweldige manier heeft leren kennen. Zonder jullie hulp waren wellicht deze proeven nu nog bezig? Ook wil ik al de toffe collega s die ik hier niet bij naam heb vermeld bedanken voor de leuke sfeer op het labo. Voor jullie was nooit iets teveel! Dank je LFMFP! Bedankt aan al mijn vrienden, in bijzonder Jonas, Rens, Stijn en Thomas, en vriendinnen die mij bijstonden met een hartverwarmende babbel, een spannend gezelschapsspel, een onvergetelijk feest, een sportieve voetbalmatch, een popcorn-overgoten film, een traktatie op een welverdiende frisse Witkap Dank je! Ook mijn ouders krijgen in deze thesis een speciale plaats. Jullie hebben mij de kans en de vrijheid gegeven om deze opleiding te volgen. Om mij steeds te steunen en met raad en daad bij te staan. Dankje voor er steeds te zijn! Sorry mama, dat ik jouw lievelings maaltijdsalade geregeld bekritiseerde maar hopelijk smaakt ze nog steeds even lekker. Henri en Louis, jullie hebben mij heel wat afgeleid tijdens mijn thesiswerk, maar ik geef toe, zonder jullie geniale interventies was jullie grote broer helemaal niet zo ver gekomen! Thx, Bro s! Nog één iemand wil ik heel speciaal bedanken. Bomma, meter, M-C, dankje dat ik vijf jaar lang bij jou mocht komen studeren in alle rust en stilte. Dat je steeds in mij geloofde, mij telkens opnieuw moed in sprak en mij iedere keer weer verwende met je overheerlijke, marktverse en fait-maison gerechten. Dat ik bij jou mijn thesis mocht schrijven Dank je voor alles! Michel Verhaegen Wieze, augustus

6 6

7 Inhoudsopgave Inhoudsopgave... 7 Lijst van afkortingen... 9 Samenvatting Inleiding Literatuurstudie Gekoelde, kant-en-klare samengestelde maaltijden Definitie en algemene kenmerken Componenten Verpakking Bewaring Microbiologisch bederf Microbiologische veiligheid Bepaling houdbaarheidsperiode Wettelijke microbiologische criteria Microbiologische richtwaarden Ten minste Houdbaar Tot - Te Gebruiken Tot Materiaal en Methoden Karakterisatie van het assortiment beschikbare maaltijdsalades Aankoop van koelverse, kant-en-klare maaltijdsalades Bepaling van de fysicochemische parameters Microbiologische analyses Dataverwerking Transfertesten Opkweek van L. monocytogenes en bereiding van het inoculum Opstellen en bereiden modelmaaltijd Analyses Challengetesten Opkweek van L. monocytogenes en bereiding van het inoculum Bereiden modelmaaltijd Bepaling van de fysicochemische parameters Bepaling van de microbiologische parameters Afdoding L. monocytogenes in maaltijdsoep

8 4. Resultaten Karakterisatie van het assortiment beschikbare maaltijdsalades Producteigenschappen van koelverse, kant-en-klare maaltijdsalades Fysicochemische parameters Microbiologische kwaliteit en veiligheid van koelverse, kant-en-klare maaltijdsalades Correlaties tussen produktkarakteristieken en microbiologische kwaliteit Transfertesten Fysicochemische parameters Microbiologische parameters Challengetesten Fysicochemische parameters Microbiologische parameters Kooktesten Discussie Microbiologische kwaliteit van onderzochte maaltijden Microbiologische veiligheid van maaltijdsalades Transfertesten Challengetesten Conclusie Aanbevelingen voor verder onderzoek Bijlagen Referenties

9 Lijst van afkortingen a w = wateractiviteit ALOA = Agar Listeria acc. to Ottaviani & Agosti CAC = Codex Alimentarius Comission EC = Europese comissie ECDC = European Centre for Disease Prevention and Control EFSA = European Food Safety Authority FAVV = Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FDA = US Food and Drug Administration FAO = Food and agriculture organization GHP = Good hygiene practices HACCP = Hazard analysis critical control point HPA = Health protection agency kve = kolonievormende eenheden LFMFP-UGent = Laboratorium voor. Levensmiddelenmicrobiologie en conservering Ugent LOD = Limit of detection LOQ = Limit of quantification Map = modified atmosphere packaging MPI -NZ= Ministery for Primary Industries New Zealand MRS = de Man, Rogosa and Sharpe NZIFST = New Zealand Institute of Food Safety and Technology NVWA = Nederlandse voedsel- en warenauthoriteit PPS = peptone physiological solution RASFF = Rapid Alert System for Food and Feed REC = RAPID E.coli RTC = Ready-to-cook RTE = Ready-to-eat 9

10 RTS = Ready-to-serve USDA = U.S. department of agriculture WIV = Wetenschappelijk instituut volksgezondheid YOPI = Young, Old, Pregnant, Immunodeficient 10

11 Samenvatting De veiligheid en kwaliteit van kant-en-klare, (RTE) levensmiddelen is van groeiend belang in de hedendaagse maatschappij. De veranderende leefgewoontes doen ook de vraag stijgen naar de gebruiksvriendelijke, gekoelde, samengestelde maaltijdsalades die onderwerp uitmaken van deze Master thesis. Dergelijke maaltijdsalades zijn (meestal) opgebouwd uit een eiwit-, groenten- en zetmeelcomponent. In deze Master thesis werd een prevalentiescreening uitgevoerd op 51 maaltijdsalades die in Belgische supermarkten te Gent werden aangekocht in de periode van september-november Op deze manier werd de microbiologische kwaliteit, de bewaarcondities en de eventueel aanwezigheid van ongewenste aantallen van L. monocytogenes, Salmonella spp., E. coli en B. cereus, bepaald in dergelijke maaltijdsalades zoals aangeboden aan de consument. Op basis van deze resultaten werd een modelmaaltijd ontworpen zodat de transfer van L. monocytogenes tussen de deelcomponenten kon onderzocht worden. Ten slotte werden challengetesten uitgevoerd op alle deelcomponenten van een maaltijd(soep)salade om het groeipotentieel van L. monocytogenes, de meest relevante voedselpathogeen voor dit type van levensmiddelen,te bepalen. De kwaliteit van de 51 onderzochte gekoeldesamengestelde maaltijdsalades kon als ondermaats beschouwd worden aangezien 28 maaltijdsalades de richtwaarde voor het totale kiemgetal van 6.48 log kve/g overschreden. Deze richtwaarden op het einde van de houdbaarheid zijn waarschijnlijk iets te streng omdat slechts 10 van deze 28 maaltijden visuele afwijkingen vertoonden. De positieve invloed van map-verpakking en bewaring bij lagere temperaturen op de kwaliteit van de maaltijdsalades werd aangetoond. Naast de voedselkwaliteit werd ook de voedselveiligheid nagegaan en werden L. monocytogenes en Salmonella spp. in respectievelijk 8 (17%) en 0 (0%) van de 51 onderzochte maaltijdsalades gedetecteerd. Alle maaltijdsalades voldeden echter aan het wettelijke criterium van maximum 100kve/g voor L. monocytogenes op moment van analyse (zelfde dag of dag na aankoop van de maaltijdsalade in de winkel, waarbij verondersteld werd dat consumptie ook dan zou plaatsvinden door een effectieve consument). Ook werd slechts in 4% van de maaltijdsalades telbare E. coli en B. cereus aangetroffen, steeds < 1000 kve/g, zodat kan gesteld worden dat de maaltijdsalades onder goede hygiëne omstandigheden geproduceerd werden en bij correcte temperatuur bewaard werden. In de transfertesten werd aangetoond dat er inderdaad transfer optreedt van L. monocytogenes tussen de deelcomponenten van de maaltijd en dus besmetting van één van de deelcomponenten kan leiden tot dus besmetting van de andere component in de maaltijdsalade, ook als deze deelcomponenten slechts een beperkt aantal raakvlakken hebben en redelijk apart liggen De transferefficiënties bedroegen 2.60 tot procent. Het is dus mogelijk dat de besmetting die mogelijks optreedt bij de rauwe groentencomponent tot gevolg heeft dat de (gekookte) eiwit- of zetmeelcomponent nabesmet wordt ten gevolge van de assemblage van de maaltijdsalade. In de challengetesten werd aangetoond dat L. monocytogenes groeipotentieel vertoont op zowel de eiwit-, groenten- en de zetmeelcomponent wat een verhoogd risico met zich meebrengt tot overschrijden van de limietwaarde van 100 kve/g aan L. monocytogenes, ook al is de beginbesmetting van (één van de) componenten laag (vb. aanwezigheid per 25 gram). De zetmeelcomponent laat het meeste groei toe. Daarom wordt een te gebruiken tot -datum en beperking van de houdbaarheidsperiode tot maximaal 5 à 6 dagen verkozen. Deze resultaten duiden aan dat de gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijdsalades aangeboden op de Belgische markt onder goede omstandigheden geproduceerd en bewaard worden, 11

12 maar desondanks toch een middelmatige kwaliteit hebben. De richtwaarden i.v.m. deze maaltijdsalades zullen mogelijks herbekeken moeten worden om een juiste meerwaarde te betekenen in de realiteit bij de beoordeling van de kwaliteit gezien af en toe discrepantie optreedt tussen aanvaardbare microbiologische kwaliteit en effectief sensorische kwaliteit. Er werd geen inbreuk vastgesteld op basis van de steekproef inzake voedselveiligheid. Toch moet, gezien het vastgestelde groeipotentieel van L. monocytogenes toch verdere inspanningen geleverd worden door (sommige) producenten met betrekking tot het controleren van de besmetting met L. monocytogenes in deze complex samengestelde, kant-en-klare gekoelde levensmiddelen zodat het risico op voedseluitbraken verkleind wordt en de consument deze voedingswaren veilig kan consumeren. 12

13 1. Inleiding De vraag naar gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijden in onze Westerse maatschappij wordt steeds groter. Deze maaltijden zijn snel, lekker, gebruiksvriendelijk en hebben bovendien een gezond imago. Dit zijn niet toevallig belangrijke thema s van deze tijd en ook de drijfveren om deze maaltijdsalades aan te kopen (Panyarjunet al.,2011). De voedingssector speelt graag in op deze vraag van de consument. Een gevolg hiervan is dat het gamma van kant-en-klare maaltijden de laatste decennia enorm uitgebreid is. De klant verwacht bovendien een goede kwaliteit die met de huidige technologie perfect bereikt kan worden maar wat in de praktijk niet zo simpel blijkt. Recentelijke terugroepingen in België (FAVV)en Europa (RASFF) en de grote vraag naar informatie over L. monocytogenes in maaltijdsalades (NZIFST, 2013) staven deze problematiek rond dit thema. Deze maaltijdsalades verdienen de laatste jaren heel wat extra aandacht omdat de snelgroeiende YOPIpopulatie vatbaarder is voor L. monocytogenes die de voornaamste pathogeen is in deze levensmiddelen (Todd et al., 2010). De houdbaarheidstermijn van deze voedingswaren vastleggen is vaak gecompliceerd. Intrinsieke factoren(ph, a w, samenstelling levensmiddel ) en extrinsieke factoren (bewaartemperatuur, gassamenstelling, relatieve vochtigheid ) zijn maar enkele voorbeelden van goed bestuurde beïnvloedingsfactoren die mede de houdbaarheid van levensmiddelen bepalen (Uyttendaele et al., 2009). Wetgeving omtrent de aanwezigheid van ziekteverwekkende micro-organismen in deze producten is opgesteld omdat deze noodzakelijk is om de voedselveiligheid voor de consument te garanderen. Toch zijn kant-en-klare maaltijden een redelijk nieuw fenomeen waardoor er weinig microbiologische richtwaarden van bedervers in deze producten beschikbaar zijn. Deze richtwaarden laten toe om preventiemaatregelen zoals GMP-procedures ten volle te ondersteunen en evalueren omdat niet enkel de voedselveiligheid, maar ook de voedselkwaliteit wordt gemonitord. Dat deze groep van kant-en-klare samengestelde maaltijden niet eenzijdig gedefinieerd is, brengt extra moeilijkheden met zich mee (Luber et al., 2010). Deze thesis wil op een wetenschappelijke onderbouwde wijze de kwaliteit van bestaande kant-enklare, gekoelde, samengestelde maaltijdsalades in kaart brengen en op basis van deze gegevens de meegegeven houdbaarheidstermijn van de producent evalueren. Deze onderbouwing vertrekt uit een steekproef van 51 maaltijdsalades zodat het bestaande gamma in kaart kon gebracht worden. Na het bepalen van fysicochemische en microbiologische parameters, werden verbanden gezocht tussen deze parameters om de veranderingen tijdens het bewaren te belichten. Vervolgens werd een modelmaaltijd geselecteerd waarop transfertesten en challengetesten werden uitgevoerd met L. monocytogenes. Ten slotte werd op basis van de kwaliteit van de maaltijdsalades, het risicoprofiel voor uitgroei van L. monocytogenes en de bestaande criteria en richtwaarden finaal een suggestie van maximale houdbaarheidsperiode geformuleerd. Hierbij werden ook de bestaande richtwaarden en criteria beoordeeld. De onderzochte kant-en-klare producten in deze thesis bestaan steeds uit drie hoofdcomponenten: een eiwit-, een zetmeel- en een groenten/fruitcomponent. De transfer van de initiële besmetting van bacteriën, schimmels en gisten, zorgt voor een bijkomende factor die in rekening wordt gebracht in deze thesis bij deze componenten. Hierbij wordt verondersteld dat de meest besmette component bepalend is voor de houdbaarheid. Producenten zullen namelijk eerder hun houdbaarheidsperiode verkorten om het risico op de mogelijke uitgroei van een pathogeen te reduceren. Echter draagt dit mede bij tot voedselverspilling wat een groot maatschappelijk thema is in de 21 e eeuw (Alliantie Verduurzaming Voedsel, 2014). 13

14 14

15 2. Literatuurstudie 2.1. Gekoelde, kant-en-klare samengestelde maaltijden Definitie en algemene kenmerken Kant-en-klare levensmiddelen worden in de Verordening (EG) Nr. 2073/2005 gedefinieerd als levensmiddelen die door de producent of de fabrikant bedoeld zijn om rechtstreeks door de mens te worden geconsumeerd, zonder dat verhitting of een andere bewerking nodig is om relevante microorganismen te elimineren of tot een aanvaardbaar niveau terug te brengen. Wanneer er dus een verhittingsstap of bereidingsstap is aangegeven op de verpakking, kan de maaltijd niet als kant-enklaar beschouwd worden. Indien kant-en-klare producten samengesteld zijn uit twee of meer verschillende componenten, die al dan niet met elkaar in contact komen, kan worden gesproken van kant-en-klare samengestelde levensmiddelen. Ready-to-eat (RTE) maaltijden of Ready-to-Serve (RTS) maaltijden zijn vaak gebruikte synoniemen voor kant-en-klare maaltijden. Onder deze definitie vallen verschillende soorten voedingswaren zoals sushi, belegde boterhammen, wraps, maaltijdsalades en vaak worden deze kant-en-klare maaltijden terug gevonden in het koelvak waar ze bewaard worden bij de aangegeven temperatuur op het etiket. Gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijden zijn dus een zéér heterogene, omvangrijke categorie levensmiddelen die niet eenzijdig gedefinieerd is. Vooral rond het begrip kant-en-klaar bestaat er veel discussie. In bepaalde Duitse culturen wordt rauw varkensvlees als kant-en-klaar beschouwd waar dit in de Belgische cultuur helemaal niet het geval is (Luber et al., 2010). Een duidelijke rechtlijnige definitie van kant-en-klaar is dus niet mogelijk, maar er wordt wel voorgesteld om het begrip kant-en-klare voeding zo goed als mogelijk te omschrijven door alle bestaande definities te harmoniseren. Dit zou de consument en producent helpen of een voedingsproduct tot de categorie van kant-en-klare producten behoord. Enkel zo kan de beste informatie verschaft worden om uitbraken te vermijden (Luber et al., 2010) Componenten De componenten van gekoelde kant-en-klare maaltijdsalades kunnen opgedeeld worden in vier categorieën: Een eiwitcomponent, groente- en/of fruitcomponent, zetmeelcomponent en saus- en/of dressingcomponent. In deze sectie worden de verschillende intrinsieke factoren van deze componenten besproken als ook de bewaarmiddelen die van toepassing zijn. De typische nutritionele samenstelling, ph en a w van een aantal componenten die voorkomen in kant-en-klare maaltijden worden weergegeven in Tabel 1, Tabel 2, Tabel 3, en Tabel 4. Alle componenten hebben een verschillende initiële startcontaminatie en ondergaan vervolgens verscheidene processtappen alvorens deel uit te maken van de maaltijdsalade Eiwitcomponent De voornaamste eiwitbronnen zijn vlees, vis, ei en kaasproducten. Deze eiwitcomponenten van dierlijke oorsprong zijn een rijke voedingsbron voor bedervers of pathogenen die initieel of door nabesmetting onvermijdelijk aanwezig zijn op deze componenten. Vlees is voornamelijk opgebouwd uit water (70%) en hoogwaardige eiwitten die zich vooral bevinden in het spierweefsel (myosine en actine, 50%), bindweefsel (collageen en elastine, 15%) en zuurstofhoudende pigmenteiwitten (myoglobine, 30%). Deze eiwitfractie houdt water vast wat 15

16 bepalend is voor de malsheid en sappigheid van het vlees. Ook komt er nog vetweefsel (10%-35%) en een hele kleine fractie glycogeen voor (de Jong et al., 2008). Het visvlees daarentegen heeft bijna geen bindweefsel. Ook bijna alle glycogeen is afwezig waardoor geen ph-daling meer volgt zoals wel bij vlees het geval is zodat visvlees sneller bederft (Kerry et al., 2002 ; Devlieghere et al., 2011). Het vetgehalte hangt af van de vissoort, magere vis bevat 3-5% vet/olie, vette vis bevat 5-20% vet/olie. Op het orgaanvlees en oppervlakte van de dierenhuid worden vaak hoge aantallen micro-organismen aangetroffen die tijdens het slachten, villen, wassen, evisceratie-proces of versnijden mogelijks worden overgedragen op de producten die geschikt zijn voor consumptie die vaak niet of slechts laag besmet zijn (Warris et al, 2010). Ook kan besmetting optreden via biofilms die zich gevormd hebben op machines die in rechtstreeks contact komen met het product. De ph en wateractiviteit van deze producten zijn vaak optimaal voor micro-organismen die zich vasthechten aan het oppervlak en biofilms gaan vormen (Chaitiemwong et al., 2014). Deze rauwe producten ondergaan vaak een of meerdere processen zoals roken, grillen, bakken, koken, zouten, fermenteren, drogen die de houdbaarheid aanzienlijk verlengen en gewenste sensorische veranderingen te weeg brengen (Dewettinck et al., 2014). Hard gekookte, gepelde eieren worden ook vaak terug gevonden bij maaltijdsalades. Doordat de natuurlijke barrière afwezig is (de schaal), is de houdbaarheidsperiode beperkt tot enkele dagen (de Jong et al., 2008). Tabel 1: Intrinsieke factoren eiwitcomponenten Eiwit ph a w % Koolhydraten % Vet % Eiwitten Vlees 5,60-6,50 1 0,965-0, , , ,00 4 Vis 5,20-6,80 1 0,965-0, ,00 4 8, ,00 4 Gevogelte 6,20-6,70 1 0,965-0, ,00 4 8, ,00 4 Eieren 7,10-7,90 2 0, , , ,58 4 Harde kaas (Gouda) 5,00-7,00 2 >0, , , ,94 4 Zachte kaas (Mozzarella) 5, , , , , Zetmeelcomponent Gekookte pasta, rijst, aardappelstukjes of griesmeelproducten zoals couscous zijn veel voorkomende zetmeelcomponenten in samengestelde maaltijdsalades. Ze bevatten nagenoeg geen vetten en slechts een kleine fractie eiwitten zoals bij rijst en aardappelen. Gekookte pasta bevat bijvoorbeeld 71.5% water en 25.2 % complexe mix van koolhydraten die de ideale voedingsbodem zijn voor microorganismen (Kulp et al.,2000). Zetmeelcomponenten worden meestal onderworpen aan een kookproces waardoor ze een hoge wateractiviteit hebben. (Tabel 2) In eerste instantie zorgt het kookproces ervoor dat het zetmeel beschikbaar wordt voor de mens, maar ook voor microorganismen, door het barsten van zetmeelgranulen (Dewettinck et al.,2011). Een tweede gevolg van dit kookproces is dat zetmeelcomponenten na het koken zo goed als kiemvrij zijn waardoor nabesmetting de limiterende factor is voor de houdbaarheid die zo n 10 dagen bedraagt voor pasta (Kulp et al.,2000). Al moet ook zeker rekening gehouden worden met sporevormers, bv. B. cereus, die 1 Devlieghere et al., FDA /ucm htm 3 Barbosa-Canovas et al., USDA, 16

17 het intensieve kookproces kunnen overleven, bij temperatuursmisbruik snel uitgroeien en zo een risico vormen voor de consument (Kotiranta et al., 2010). Tabel 2 : Intrinsieke factoren zetmeelcomponenten ph a w % Koolhydraten % Vet % Eiwitten Zetmeel Aardappelen 6,10 5 0,988-0, ,72 7 0,14 7 1,37 7 (gekookt) Pasta 5,10-6,41 5 > 0, ,73 7 (25,2) 8 2,30 7 (0,6) 8 11,31 7 (4,3) 8 Rijst 6,00-6,70 9 > 0, ,73 7 0,19 7 2, Groente- en/of fruitcomponent Groenten en fruit, al dan niet rauw of verwerkt, zijn niet weg te denken bij een maaltijdsalade. Ze hebben een gezond en natuurlijk imago. Groenten en fruit hebben vele gelijkenissen op vlak van compositie, verwerking, opslag en cultivatietechnieken (FAO, 1999). Zoals weergegeven in Tabel 3 hebben de meeste groenten en fruit een hoge wateractiviteit, laag proteïne- en vetgehalte. Er zijn steeds uitzonderingen op deze algemene regels zoals bonen en erwten die bijvoorbeeld wel een hoge proteïnegehalte hebben. De zure ph van fruit is lager dan de licht zureneutrale ph van groenten (Devlieghere et al, 2011). Ook het gehalte aan verteerbare koolhydraten ligt hoger bij fruit dan bij groenten, waar het gehalte aan vezels licht hoger ligt (Nubel, 2015). Tabel 3 : Intrinsieke factoren groente- en fruitcomponenten ph a w % Koolhydraten % Vet % Eiwitten Groenten - Tomaat 4,20-4,90 9 0,995-0, ,89 7 0,20 7 0,88 7 fruit Salade 5,40-6,90 9 0,995-0, ,85 7 0,15 7 1,36 7 Wortel 4,90-5,20 9 0,995-0, ,58 7 0,24 7 0,93 7 Bonen 5,70-6,20 9 0,995-0, ,97 7 0,22 7 1,83 7 Olijf 3,60-6, ,6 3, ,32 7 1,03 7 Appel 3,30-3,90 9 0,995-0, ,81 7 0,17 7 0,26 7 Groenten en fruit die niet verwerkt zijn of waarbij het weefsel niet beschadigd zijn, kunnen bij de juiste temperatuur en atmosfeersamenstelling, een lange tijd bewaard worden (Typeafhankelijk). Ook na het oogsten gaat respiratie verder, wat de belangrijkste limiterende factor is bij bewaring van intacte, rauwe groenten/fruit (Rico et al., 2007). Deze activiteit, waarbij O 2 wordt opgenomen, CO 2 en warmte worden afgegeven, moet worden gereduceerd tot het minimale zodanig dat de houdbaarheid maximaal kan verlengd worden. Een kleine concentratie restzuurstof is steeds nodig omdat anders vergisting zal optreden wat ongewenste effecten met zich meebrengt (Sandhya et al., 2009). Eenmaal het weefsel beschadigd wordt door een verwerkingsproces (verhitting, versnijding ) wordt het rottingsproces enorm versneld. De cellen verliezen hun osmotische druk ( soft-rot ), proteïnen denatureren, barrières vervallen, enzymen lossen eigen weefsel op en micro-organismen krijgen toegang tot een rijke voedingsbron omdat de natuurlijke bescherming weg gevallen is. Deze 5 FDA, 6 Barbosa-Canovas et al., USDA, 8 Kulp et al., FDA /ucm htm 10 Devlieghere et al.,

18 enzymatische, chemische, fysieke en (micro)biologische veranderingen kunnen worden uitgesteld door conserveermiddelen, aangepaste map-verpakking, juiste omgevingstemperatuur toe te passen (FAO, 1995 ; Jacxsens et al., 2002) Saus of dressing Een saus of dressing is vaak aanwezig in kant-en-klare maaltijden al dan niet apart verpakt. Mayonaise is een water in olie emulsie op basis van minstens 50% plantaardige olie en 0.30%-0.50% azijnzuur waardoor een lage ph verkregen wordt. Saladedressings zijn gelijkaardige producten maar met minder plantaardige olie (30%) en meer azijnzuur (0.90%-1.2%). Beide producten bezitten een lage a w rond Door deze ongunstige intrinsieke factoren zal voornamelijk bederf optreden door gisten en schimmels. Scheiding van de emulsie zijn de eerste kenmerken van bederf (Jay et al., 2011). Tabel 4 : Intrinsieke factoren saus- en dressingcomponent ph a w % Koolhydraten % Vet % Eiwitten Saus Mayonaise 4,20-4, ,93-0, , , , Verpakking De verpakking van gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijden is niet altijd even gemakkelijk. De maaltijd is samengesteld uit verschillende componenten die elk hun kenmerkende eigenschappen en bederfflora hebben. Sommige fabrikanten verkiezen een verpakking onder gemodificeerde atmosfeer terwijl andere opteren voor een niet-gewijzigde atmosfeer. Beide methodes hebben hun voor- en nadelen Verpakking onder gemodificeerde atmosfeer Verpakking onder gewijzigde atmosfeer is ook gekend onder de Engelse term Modified Atmosphere Packaging (MAP). Het is algemeen bewezen dat levensmiddelen verpakt onder gemodificeerde atmosfeer een aanzienlijke langere houdbaarheid hebben (Sandhya et al., 2009 ; Mastromatteo et al., 2009 ; Rao et al., 2002). Bij de map-techniek wordt de lucht in de kopruimte rond het levensmiddel vervangen door een mengsel van gassen zoals CO 2, N 2 en O 2. Aangezien elk gas verschillende eigenschappen heeft, wordt naargelang het type levensmiddel de samenstelling van de verpakkingsatmosfeer gewijzigd. Stikstofgas is een inert gas dat wordt aangewend als vulgas om te voorkomen dat gasverpakkingen met voedingsmiddelen die CO 2 absorberen vacuüm worden getrokken. Daarnaast wordt het gebruikt om lucht en zuurstof te verdringen zodat aerobe microorganismen niet kunnen uitgroeien. Stikstof heeft geen gekende antimicrobiële eigenschappen. Koolstofdioxide heeft een remmende werking op de groei van de meeste aerobe bacteriën en schimmels doordat het O 2 verdrijft. Vanaf bepaalde concentraties (>10 %) werkt het gas inhiberend afhankelijk van het micro-organisme, wateractiviteit van het levensmiddel, fase waar het (lagexponentiële fase) micro-organismen zich in bevindt en bewaringstemperatuur. Deze laatste speelt een grote rol in het oplossend vermogen van CO 2 in de waterfase van het levensmiddel. Naarmate de temperatuur zakt, lost meer CO 2 op in het verpakte levensmiddel met een ph-daling tot gevolg. Bovendien interageert het opgeloste en vet-oplosbare CO 2 met de lipiden van de celmembranen zodat de normale werking verstoord wordt. Zuurstof is noodzakelijk voor strikt aerobe organismen die snel 11 FDA /ucm htm 12 Barbosa-Canovas et al., USDA, 18

19 bederf veroorzaken, daarom wordt vaak geopteerd dit gas te vervangen door andere gassen. Oxidatieve verschijnselen worden zo ook geëlimineerd. Echter, de aanwezigheid van zuurstof kan op zijn beurt strikt anaerobe organismen (bv. Clostridium botulinum) inhiberen. Bovendien zorgt de aanwezigheid van zuurstof dat ongewenste anaerobe processen van groenten en fruit worden tegengegaan (Caleb et al., 2012 ; Devlieghere et al, 2011 ; Sanjeev et al, 2006 ). Cruciaal voor de map-techniek is de optimale CO 2-concentratie vinden waarbij bederf-veroorzakende micro-organismen maximale hinder zullen ondervinden bij groei en het levensmiddel sensorisch toch aanvaardbaar blijft voor de consument. De ideale gassamenstelling voor gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijdsalades ligt tussen de 30-50% CO 2 en 50-70% N 2 volgens Coles et al. (2009). Hier is wel niet aangegeven of deze maaltijden rauw(e) groenten/fruit bevatten. Uit onderzoek blijkt ook dat een aangereikte O 2-concentratie (>80%) in de gasverpakking een positief effect heeft op de bewaring van de RTE-groenten en op bepaalde vleeswaren. De hoge concentratie O 2 werkt inhiberend (Doyle et al, 2013 ; Ayhan et al., 2007 ; Jayas et al., 2002). Uit onderzoek naar Salmonella Typhimurium in kant-en-klare salades blijkt dat map-verpakking evenwel ook nadelen kan hebben. Bij een verpakkingsatmosfeer van 10% CO 2, 10% O 2 en 80% N 2 en bewaring bij 8 C worden de natuurlijke antagonisten (bv. Pseudomonas) van S. Typhimurium geremd in hun groei, terwijl S. Typhimurium hier geen hinder van ondervindt (Horev et al, 2011). Dit werd niet waargenomen bij een onderzoek naar RTE-garnalen waarbij L. monocytogenes en alle bedervers niet uitgroeiden gedurende 15 dagen door de ongunstige omstandigheden (100% CO 2 en bij 3 C). Wel groeide L. monocytogenes uit bij 100% CO 2 en 7 C-12 C gedurende 15 dagen wat wel overeenkomt met vorig onderzoek. Map-verpakking kan dus pathogenen bevoordelen maar er moet steeds rekening gehouden worden met andere invloedsfactoren (Rutherford et al., 2007). Uit een recent onderzoek is nogmaals gebleken dat map-verpakking met meer dan 30% CO 2 de lagfase van micro-organismen verlengde en dus de groei van deze organismen significant vertraagde. Ook werd bevestigd dat bij lage temperaturen map-verpakking effectiever was. 100% CO 2 bleek het effectiefste te zijn tegen de groei van micro-organismen maar opgeblazen verpakkingen en kleurveranderingen zijn onaanvaardbare neveneffecten voor de consument (Lee et al.,2008). Ook bij een onderzoek naar kant-en-klare sushi werd bewezen dat 100% CO 2 of 50% CO 2 en 50% N 2 significant de houdbaarheidsperiode verlengde (Mol et al., 2014) Verpakkingsmateriaal Verpakkingsmaterialen zijn nog nooit zo belangrijk geweest daar ze bijdragen tot een algemene kwaliteitsverhoging. Een goede verpakking zorgt namelijk voor een verlenging van de houdbaarheid (bewaring en bescherming), maakt massaproductie mogelijk (economisch), brengt levensmiddelen hygiënisch en op een attractieve manier tot bij de consument (promotie en presentatie), voorziet de consument van informatie i.v.m. energetische waarde, vitaminen, bereidingswijzen, bewaaromstandigheden Verder wordt er ook een enorme druk uitgeoefend op de producenten van verpakkingen om deze zo milieuvriendelijk, gezondheidsveilig (geen diffusie van polymeermoleculen in voedsel), gebruiksvriendelijk (convenience) te ontwerpen. Het is duidelijk dat hier heel wat knowhow aan te pas komt. Er zijn vele verpakkingsmaterialen met elk hun voor- en nadelen beschikbaar voor het bewaren van levensmiddelen en ze kunnen bestaan uit glas, metaal, plastiek of karton (Coles et al., 2009). 19

20 Gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijden worden vaak verpakt in plastieken trays die via thermoforming zijn geproduceerd. Deze verpakking biedt vele voordelen en kan mogelijks gesealed worden zodat de verpakking een gasbarrière bezit indien het verpakkingsmateriaal gasondoorlaatbare eigenschappen heeft. Figuur 1 : 'Clamshell' verpakking (Varietypackaging, 2015) Ook kan er gebruik gemaakt worden van plastieken saladekommen met kliksysteem ( clamshell, Figuur 1) die niet geschikt zijn voor een verpakking onder een gemodificeerde atmosfeer. Al deze verpakkingen zijn enorm gebruiksvriendelijk, wat bijdraagt tot het snelle en gemakkelijke imago van kant-en-klare maaltijden wat tevens ook een hoofdreden is tot aankoop. Een nadeel is dat de plastieken verpakking slechts eenmalig gebruikt kan worden, wat belastend is voor het milieu. Wel is zeker dat plastiek één van de lichtste verpakkingsmaterialen is, zodat energie-transportkosten geminimaliseerd worden terwijl de houdbaarheid optimaal blijft (Panyarjun et al.,2011) Bewaring Bewaartemperatuur Een belangrijke, zoniet de belangrijkste extrinsieke factor voor gekoelde, kant-en-klare samengestelde maaltijdsalades is de bewaartemperatuur. Verlaging van de temperatuur tot 4-7 C tijdens opslag in de groothandel of supermarkt verlengt de houdbaarheid aanzienlijk omdat de lag fase van mesofiele micro-organismen verlengd wordt en ook de groeisnelheid afneemt. Toch zijn er pathogenen en bedervers die desondanks deze ongunstige omstandigheden kunnen overleven en zelfs groeien. Psychotrofen kunnen bij lage temperatuur componenten zoals suiker en aminozuren efficiënt opnemen door een adaptatie van het celmembraan bij koude temperaturen. Daardoor zijn psychotrofe micro-organismen vaak de limiterende factor voor bewaring van levensmiddelen bij koeltemperaturen (NZFSA, 2005). Het is belangrijk dat de temperatuurdaling tijdens productie drastisch gebeurd. De micro-organismen ervaren dan een koudeshock waardoor de metabolische activiteit van de micro-organismen plots verstoord wordt met als gevolg een vertraagde of geen groei. Het spreekt voor zich dat psychotrofe micro-organismen deze snelle verandering beter opvangen dan mesofiele micro-organismen. Ook gram-negatieve bacteriën zijn gevoeliger voor dit fenomeen dan gram-positieve (Devlieghere et al, 2011). Eenmaal de lage temperatuur bereikt is, moet deze constant gehouden worden gedurende de opslag en transport periode. Een korte periode van temperatuurmisbruik door de consument kan ernstige gevolgen hebben. In een studie van Kim et al. (2012) werd aangetoond dat onder realistische omstandigheden gekoelde levensmiddelen in amper 40 minuten temperaturen kunnen halen van 20 C wat het risico op ernstige gevolgen drastisch verhoogd doordat verhoogde microbiële groei in het 20

21 levensmiddel plaatsvindt. Verder toonde een studie van Sae-rom et al. (2008) aan dat de houdbaarheid bij bewaring van verschillende kant-en-klare levensmiddelen bij 5 C significant langer was dan deze bij 10 C. Daarom wordt aangeraden om kant-en-klare voedingsmiddelen te bewaren bij maximaal 7 C waar <5 C de voorkeur krijgt. Een challengestudie op kant-en-klare salade wees uit dat het aantal E. coli O157:H7 en Salmonella spp. afnam bij een bewaringstemperatuur van 5 C, terwijl deze van L. monocytogenes met 1 log steeg. Bij bewaring onder 25 C groeiden alle pathogenen (Oliveira et al,2009). Een andere studie onderzocht in 9 soorten salades de groei van Salmonella spp., L. monocytogenes, melkzuurbacteriën en het totaal aeroob kiemgetal bij 7 C en 15 C gedurende 6 dagen. Bij 15 C groeiden beide pathogenen het meest uit. Bij 7 C groeide over het algemeen enkel L. monocytogenes uit wat te verwachten was. Desondanks deze lage temperatuur groeide Salmonella spp. toch uit bij twee groenten (Sant'Ana et al.,2012). Een andere studie toonde aan dat voedselinfectanten (L. monocytogenes en Y. enterolitica) de limiterende factor zijn voor de houdbaarheidsperiode bij de consument. Korte intervallen met verhoogde temperatuursverhoging, bereiding maaltijd en rest in koelkast, bewezen dat voedselintoxicanten (S. aureus en B. weihenstephanensis) zeer moeilijk op deze korte tijd uitgroeien tot grote aantallen en toxines produceren (Røssvoll et al., 2014 ; Stenfors et al., 2002 ) Conserveermiddelen Ten slotte kunnen ook conserveermiddelen de houdbaarheidsperiode van voedingsmiddelen verlengen. Ze remmen de groei of verhinderen overleving van zowel pathogene als bederfveroorzakende micro-organismen veelal door het verstoren van een stofwisselingsproces. Conserveermiddelen zijn slechts in kleine concentraties nodig. Enkele voorbeelden zijn sorbinezuur en afgeleiden (E ), benzoëzuur en afgeleiden (E ),zouten van sulfiet (E ), zouten van nitriet (E ) Ook dragen antioxidanten en zuurteregelaars bij tot de verlenging van de houdbaarheid. Al deze conventionele additieven worden gereguleerd door Verordening (EG) nr. 1333/2008 en aanvullingen in Europa (de Jong et al., 2008). De laatste jaren wordt er onderzoek verricht naar het reduceren van deze conventionele conserveermiddelen in levensmiddelen omdat de producent verplicht is om dit aan te geven op de verpakking waarop de consument het product minder natuurlijk zal ervaren. Producenten kiezen meer en meer om deze artificiële bewaarmiddelen te vervangen door natuurlijke antimicrobiële componenten, zoals mosterd en kruiden. Een totaal nieuwe benadering is het bestrijden van microorganismen met micro-organismen die moedwillig worden toegevoegd. Deze potentiële nieuwe techniek gebaseerd op biocontrolemechanismen heeft echter ook limitaties (Jordan et al.,2014). Ook worden antimicrobiële componenten geïncorporeerd in de verpakking zodat ze kunnen migreren in de voeding en zo de aanwezige micro-organismen controleren (Vermeiren et al, 1999) Microbiologisch bederf Micro-organismen kunnen ervoor zorgen dat levensmiddelen niet geschikt zijn voor consumptie. Indien ze in grote aantallen aanwezig zijn, kunnen ze namelijk de sensorische eigenschappen van het levensmiddel veranderen. Dit uit zich ondermeer in slijmvorming, geurafwijkingen, kleurveranderingen en dergelijke. Hierdoor zal de consument de kwaliteit van het levensmiddel onvoldoende achten en zal het levensmiddel uit de handel genomen worden wat economische verliezen veroorzaakt. Jaarlijks gaat 25% van de levensmiddelen verloren met bederf als oorzaak (Doyle et al.,2013). 21

22 Bedervers in gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijden Pseudomonas spp., Shewanella, Acinetobacter-Moraxella en Enterobacteriaceae zijn de meest voorkomende gram-negatieve bedervers in gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijden. Ze zijn initieel aanwezig op vele rauwe ingrediënten. Melkzuurbacteriën, Brochothrix thermosphacta, enkele Clostridia spp. en Bacillus spp. zijn de voornaamste gram-positieve bedervers (Devlieghere et al., 2011 ; Blackburn et al., 2006). Zure componenten zullen eerder groei toelaten van gram-positieve bederfveroorzakende micro-organismen die ook hittebehandelingsprocessen beter doorstaan. Schimmels en gisten veroorzaken ook bederf en zijn bijna steeds aanwezig, maar zijn voornamelijk dominant bij levensmiddelen met een lage wateractiviteit en lage ph. Een kort overzicht van bederf-veroorzakende micro-organismen in gekoelde kant-en-klare, samengestelde maaltijden is weergegeven in Tabel 5. Tabel 5 : Overzicht bedervers in voedingsmiddelen Schimmels Gisten Bacteriën (g-) Bacteriën (g+) Soorten Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Geotrichum, Alternaria, Cladosporium, Eurotium en Byssochlamys 14 Fermentatieve: Saccharomyces en Zygosaccharomyces 14 Oxidatieve: Mycoderma, Candida, Pichia en Debaryomyces 14 Pseudomonadaceae: Pseudomonas en Xanthomonas 14 Neissericeae: Acinetobacter en Moraxella 14 Enterobactericeae: Escherichia, Erwinia, Enterobacter, Citrobacter, Serratia en Proteus 14 Micrococcaceae: Micrococcus en Staphylococcus 14 Melkzuurbacteriën: Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus en Pediococcus 14 Corynebacteriën: Corynabacterium en Brevibacterium 14 Sporevormende Bacilli: B. cereus, B. subtilis, B. stearothermophilicus 14 Clostridia : C. sporogenes, C. butyricum en C. thermosaccharolyticum 14 Alicyclobacillus: A. acidoterrestris 14 (An)aeroob? Aeroob 14 (An)aeroob 14 Aeroob 14 Aeroob 14 a w (groei) ph (groei) Temperatuur > (0,61) >0, , Brede range 14 >(0,60) >0,88 15 > 0, ,5-9,0 15 Aeroob 14 >0,95 15 >5,3 15 Fac. aeroob 14 (An)aeroob 14 Microaerofiel en Fac. anaeroob 14 Fac. Aeroob en aeroob 14 Aeroob of Fac. aeroob 14 > 0,95 14 > 0,83 15 > 0,90 14 >0,91 15 >0,91 15 Anaeroob 14 >0,91 15 Vooral mesofiel 14 >5,3 15 Psychrofiel 14 Mogelijks psychrofiel 14 4, Mesofiel 14 Microorganisme 3,3-7,2- (10,6) 15 Microaerofiel 14 >0, , 15 Mesofiel 14 Mesofiel 14 Psychrotroof, mesofiel en thermofiel 14 Mesofiel, enkel laatste thermofiel 14 Obligaat thermofiel 14 In maaltijdsalade aanwezig? Ja, kan zeer lage a w aan, bijna overal aanwezig zolang aerobe atmosfeer. 14 Ja, bij bederf door gisten is product te lang opgeslagen of van slechte kwaliteit. Bijna steeds aanwezig. 14 Ja, maar vooral bij rauwe vlees, vis en kipproducten 14 Ja, bij onvoldoende hygiëne maatregelen. Verse kip, vis vlees, eieren en groenten. 14 Weinig, kan bij vrijwel alles door nabesmetting 15 Ja, vooral bij bederf van vleeswaren en groentesalades. 14 Nee, minder belang, vooral in kazen 14 Nee, vooral in gepasteuriseerde en onvoldoende gesteriliseerde producten 14 Nee, vooral bij ingeblikte producten 14 Nee, gepasteuriseerd fruit of voeding bij zeer hoge temperaturen opgeslagen Sperber et al., Devlieghere et al.,

23 Hoge aantallen van indicatororganismen kunnen een aanwijzing zijn voor onvoldoende hygiëne maatregelen, besmetting met faeces, temperatuursmisbruik, onzorgvuldige procesbereidingsstappen en dergelijke. Indicatororganismen zijn bovendien vaak snel en gemakkelijk te bepalen (MPI NZ, 2012). Ook het totale kiemgetal kan dienen als indicator voor voedselkwaliteit. Een 6 log kve/g is de grens waar een gevarieerde flora overgaat in een flora waar één micro-organisme begint te woekeren. Afhankelijk van dit micro-organisme zal het levensmiddel sensorische afwijkingen vertonen bij een bepaald kiemgetal. Zo kunnen gram-negatieve bacteriën al afwijkingen vertonen bij 7-8 log kve/g en melkzuurbacteriën soms pas bij 9 log kve/g. Kant-en-klare gekoelde samengestelde maaltijden met rauwe ingrediënten hebben vaak een initieel totaal kiemgetal van 6-8 log kve/g waardoor bederf snel optreedt (HPA, 2009). Zo kunnen hoge aantallen Enterobacteriaceae worden vaak gelinkt worden aan slechte hygiëneomstandigheden. In rauwe groentencomponenten van maaltijdsalades kunnen deze organismen van nature uit aanwezig zijn en kunnen ze zo de verhitte eiwit-en zetmeelcomponent in de verpakking contamineren wat dus niet direct een aanwijzing geeft op slechte hygiëneomstandigheden. Naast de pathogene E. coli O157 behoren ook Salmonella spp. tot deze familie wat de Enterobactericeae niet enkel een indicatororganisme maakt voor voedselkwaliteit, maar ook mogelijks gelinkt aan voedselveiligheid (Doyle et al., 2013). Er werd ook een significant verband vastgesteld bij groenten tussen de visuele scores en het totale aerobe kiemgetal, melkzuurbacteriën- en coliformen aantal (Caponigro et al, 2010). Dus bedervers kunnen dienen als indicatororganismen voor de beoordeling van de veiligheid, kwaliteit en hygiëneomstandigheden van voeding (Lues et al., 2007) Bederfprofiel in gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijden In kant-en-klare, gekoelde, samengestelde maaltijden zijn zowel eiwitten als koolhydraten aanwezig. (zie 2.1.2Componenten) Algemeen verkiezen bederversglucose, koolhydraten eerst te metaboliseren. Metabolisme dat gedreven is op koolhydraten zal verzuring als gevolg hebben waardoor grampositieve bedervers bevoordeeld worden. Indien er geen koolhydraten beschikbaar zijn, zullen bedervers groeien op de aanwezige eiwitten. Hierbij worden neven-en afvalproducten geproduceerd die vaak geur- en kleurafwijkingen veroorzaken. De ph stijgt tijdens proteolytische activiteit (Devlieghere et al., 2011). Indien er in de kopruimte van de gekoelde, kant-en-klare maaltijd lucht aanwezig is dan zullen proteolytische psychotrofe gram-negatieve bedervers uitgroeien (Pseudomonas). Dit zorgt voor het snelste bederf dat zichtbaar wordt bij ongeveer 6-7 log kve/g. In een micro-aerofiele omgeving (remming aerobe) en bij een CO 2-concentratie van maximaal 50%, zullen facultatieve psychotrofe anaerobe, zoals B. thermospacta en Enterobacteriaceae, de overheersende bedervers zijn (Cayré et al., 2005 ; Lund et al., 2000 ; Tabel 5). Naarmate de ph daalt en CO 2-concentratie stijgt, zullen psychotrofe melkzuurbacteriën de bovenhand nemen (Jayas et al.,2002). Deze trage groeiers zorgen voor mild en traag bederf. Naast melkzuurbacteriën kunnen ook bedervende sporenvormers aanwezig zijn zoals Bacillus spp. waarvan de sporen kiemen vooral door temperatuursmisbruik. Kaas en groenten zijn vaak een bron van gisten en schimmels. Deze veroorzaken mede soft rot in groenten naast andere pectinolytische organismen zoals Erwinia en Pseudomonas. Zuurstofgebrek remt schimmelgroei en stijgende CO 2-concentraties inhiberen gisten (Roberts et al., 1981 ; Devlieghere et al.,2011). 23

24 Al de beschreven bedervers in voorgaande paragraaf kunnen aanwezig zijn in maaltijdsalades via initiële besmetting van de rauwe of nabesmetting van de verwerkte componenten. De initiële contaminatie van het levensmiddel is bepalend voor de houdbaarheidsperiode. Niet onbelangrijk is de competitie tussen bedervers en pathogenen voor nutriënten. Bedervers kunnen een belangrijke remmende factor zijn in de groei van pathogenen in levensmiddelen. Zo is Listeria een slechte competitor in smeerkaas in vergelijking met andere aanwezige flora aan bedervers waaronder Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Enterococcus, Micrococcus en Microbacterium (Carnio et al., 1999). Zo zal L. monocytogenes ook weg geconcurreerd worden wanneer melkzuurbacteriën in grote aantallen aanwezig zijn. Dit fenomeen wordt het Jameson effect genoemd en kan gemodelleerd worden (Mejlholm et al., 2014) Microbiologische veiligheid De ziekteverwekkende micro-organismen die mogelijks aanwezig zijn in gekoelde, kant-en-klare samengestelde maaltijden kunnen opgedeeld worden in twee groepen: Voedselinfectanten en voedselintoxicanten. (Tabel 6) Pathogenen in kant-en-klare maaltijden en prevalentiedata Voedselinfectanten worden opgenomen via de geconsumeerde voeding, waarna ze de darm koloniseren en eventueel de rest van het lichaam. Personen met een zwakker immuunsysteem, YOPIgroep, zijn vatbaarder voor deze pathogenen omdat opname van slechts kleine aantallen al voor infecties kan zorgen. Symptomen variëren van pathogeen tot pathogeen maar acute maag en darmklachten zijn vaak 8 tot 16 uur na consumptie aanwezig. L. monocytogenes, Salmonella spp., C. jejuni, EHEC (E. coli O157), Y. enterocolitica, V. parahaemolyticus, C. sakazakii en Shigella spp. behoren tot de voedselinfectanten (Riemann et al., 2006 ; Devlieghere et al., 2011). Hiervan zijn enkel L. monocytogenes en Salmonella spp. al meerdere keren in verband gebracht met gekoelde, kant-enklare samengestelde maaltijden baserend op prevalentiescreeningen (Tabel 22, Prevalentiedata) en terugroepingen in België en Europa. (Tabel 8, Recalls België entabel 9, Recalls Europa) Voedselintoxicanten daarentegen staan gekend voor de productie van toxines na het uitgroeien tot grotere aantallen tijdens de bewaring van levensmiddelen. Het zijn de toxines die zich concentreren in het levensmiddel die de consument ziek maken. Een afdodingsproces, vb. verhittingsstap, voor consumptie van het levensmiddel doodt de pathogeen af, maar zijn mogelijks hittestabiel toxine niet waardoor de persoon nog steeds ziek wordt. Bij een voedselintoxicatie treden de symptomen na 2 tot 6 uur op. B.cereus, C. perfringens, C. botulinumen S. aureus zijn de meest voorkomende voedselintoxicanten (Riemann et al., 2006 ; Devlieghere et al.,2011). Van deze is enkel B. cereus is al in verband gebracht met gekoelde, kant-en-klare samengestelde maaltijden baserend op prevalentiescreeningen (Tabel 22, Prevalentiedata) en terugroepingen in Europa. (Tabel 9, Recalls Europa) 24

25 Soort Voornaamste pathogenen (mens) Tabel 6 : Overzicht van pathogenen in kant-en-klare maaltijden Gram min. T g min. a w g ph g O 2 behoefte Listeria 16,17 L. monocytogenes C 0,92 4,4-9 Salmonella spp. 16,17 Bacillus spp. 16,17 S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Typhi en vele andere B. cereus, B. weihenstephanensis, Fac. Anaeroob (Microaerofiel) - 7 C 0,94 3,5-9 Fac. Anaeroob + 4 C 0,93 4,5-9,5 Fac. Anaeroob Voornaamste besmettingsbronnen Rauwe visserij, vlees, groenten producten. Kruis contaminatie gekookte producten! Rauwe producten (eieren, vlees...) Zetmeel houdende producten en vele eiwitproducten Kans op aanwezigheid in kant-en-klare gekoelde samengestelde maaltijd Staphylococcus 16,17 S. aureus + 6 C 0, Fac. Anaeroob Allerlei Soms Escherichia 16 E. coli O157, VTEC, E. coli O104-8 C 0,95 4,4-9 Fac. Anaeroob Yersinia 16,17 Y. enterocolitica - -1,3 C 0,96 4,2-9,6 Fac. Anaeroob rauw (runds)vlees, rauwe groenten rauw varkensvlees, groenten, salades Groot Soms Soms soms-sporadisch sporadisch Vibrio 16,17 V. parahaemolyticus 5 C 0,94 4,8-11 Fac. Anaeroob Mariene producten sporadisch Campylobacter 16,17 C.jejuni, C. coli - 30,5 C 0,987 4,9-9 Microaerofiel Shigella 16 S. sonnei - 6 C 0,96 4,8-9,3 Fac. Anaeroob Clostridium 16,17 C. botulinum (Niet-proteolytisch en wel proteolytisch) + 3 C en 10 C 0,97 en 0, en 4,6-9 Clostridium 16,17 C. perfringens + 10 C 0,93 5,1-9,7 Anaeroob rauwe (kip)vleesproducten deli-salads, rauwe groenten, sandwiches Vacuüm LM, Conserven (Vlees) Rauw vlees of kip of afgeleide producten sporadisch sporadisch Vrijwel nooit Vrijwel nooit Cronobacter 16,17 C. sakazakii - 5,5 C 0,94 3,89-9 Fac. Anaeroob Babyvoeding Nooit 16 Ministry of Health NZ, NVWA-fiches,

26 L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus en in mindere mate S. aureus zijn de belangrijkste pathogenen die gezondheidsrisico s veroorzaken na het consumeren van een gekoelde, kant-en-klare samengestelde maaltijd. L. monocytogenes is de meest voorkomende in deze producten (Jamali et al., 2013), omdat hij erg koudetolerant is (Gandhi en Chikindas et al., 2007 ; Tabel 6). Dit komt grotendeels door aanwezigheid van een dikke peptidoglycaanlaag die er mede voor zorgt dat L. monocytogenes zeer hitteresistent is. Een micro-aerofiele omgeving is optimaal maar bij afwezigheid van O 2, wordt de groei van L. monocytogenes vertraagd door CO 2 (Farber et al.,1991 ; Devlieghere et al.,2011). Enkel inname van levende L. monocytogenes veroorzaken een voedselinfectie die invasief of nietinvasief kan verlopen. 30% van de invasieve voorvallen kent een dodelijke afloop, waarbij vooral de YOPI-groep kwetsbaar is. Slechts cellen zijn mogelijks genoeg om in deze YOPI-groep de darm-bloed barrière over te steken en zo ontstekingen van het ruggenmerg en hersenen, koorts, hoofdpijn te veroorzaken. Niet-invasieve listeriose is hierin tegen minder ernstig, wordt veroorzaakt door opname van hogere aantallen cellen (>10 5 ) en komt veel meer voor ook bij alle bevolkingsgroepen. Hier zijn koorts, diarree en spierpijn veelvoorkomende symptomen en is de mortaliteitsgraad veel lager. Vaak wordt dit type van infectie zelfs niet gerapporteerd door het niet weten dat L. monocytogenes de veroorzaker is (NZFSA, ). L. monocytogenes komt vrijwel overal voor in de omgeving (bodem, water, planten ) en dus bijgevolg ook mogelijks in de omgeving waar dagelijks levensmiddelen worden verpakt (Doyle et al, 2013). Producten die rauwe ingrediënten bevatten en geen voldoende verhittingsstap hebben ondergaan, gekoeld bewaard worden en langer dan 5-6 (Luber et al., 2010) / 10 dagen (Doyle et al.,2013) houdbaar zijn, houden een risico in omdat deze pathogeen kan uitgroeien. Ook gekookte producten vormen een probleem omdat deze frequent gehercontamineerd worden tijdens het versnijdings- en verpakkingsproces (Lin et al.,2006 ;Kusunmaningrum et al., 2003). Maaltijdsalades zijn een mooi voorbeeld waar deze twee problemen van L. monocytogenes nabesmetting kan voorkomen (Rauwe groenten, gekookte kip). Verder kunnen Listeria spp. gebruikt worden als indicatororganismen om een correcte hittebehandeling. Twee minuten bij 70 C is in veel gevallen voldoende voor afdoding. Detectie kan ook aanzien worden als een indicatie van nabesmetting wat wijst op slechte hygiëne omstandigheden of incorrect gereinigde productielijnen (HPA, 2009). Salmonella spp. komen onder ongeveer 2500 verschillende, mogelijks pathogene, serotypen voor. Inname van voedsel besmet met Salmonella spp. kan salmonellose teweeg brengen. Buikkrampen, koorts diarree zijn de voornaamste symptomen. Meestal is een hoge infectiedosis nodig om de ziekte op te wekken maar er zijn gevallen bekend waar lage aantallen de ziekte toch kunnen ontwikkelen, vooral bij vetrijk voedsel of voedsel met lage a w zoals chocolade en melkpoeder. S. Enteritidis en S. Typhimurmium zorgen voor de meeste Salmonella infecties. De minder voorkomende S.typhi heeft ernstigere gevolgen. Salmonella spp. vertonen geen groei onder de 7 Cmaar bij temperatuursmisbruik groeien ze uit op zeer breed assortiment van voedingsproducten. Aangezien Salmonella gemakkelijk kan afgedood worden door een korte verhittingsstap, vormen vooral rauwe ingrediënten (eieren, vers vlees) of producten waarin rauwe ingrediënten verwerkt zitten die verder geen verhittingsstap ondergaan zijn een risico. Ook onvoldoend verhit gevogelte of varkensvlees is vaak een bron van Salmonella-infecties (NZFSA, ; Devlieghere et al, 2011). B. cereus is een wijdverspreide (bijna alle grondstoffen) en sporevormende pathogeen die in grote aantallen ziekte of de dood tot gevolg kan hebben. De sporen overleven kookprocessen of andere 26

27 bereidingsstappen waardoor dit een zeer resistente pathogeen is. B. cereus kan via opname van cellen die het diarree toxine produceren een voedselintoxicatie veroorzaken. Dit is voornamelijk bij eiwitproducten. Maar ook kan B. cereus emetische toxines produceren in vooral zetmeelhoudende producten verpakt onder zuurstofatmosfeer wat een voedselintoxicatie tot gevolg kan hebben. Een sterke verhittingsstap alvorens consumptie van het product zal het aantal B. cereus reduceren maar nauwelijks het hittebestendige emetische toxine waardoor de ziekte dus niet vermeden wordt. Toxine productie vindt plaats bij 10 C tot 40 C. (NZFSA, 2010 ; Devlieghere et al, 2011) De andere vermelde pathogenen kunnen theoretisch gezien groeien in kant-en-klare levensmiddelen maar worden hier niet vaak in aangetroffen. De weinige prevalentiescreeningen op deze pathogenen in kant-en-klare maaltijden geven ook aan dat deze zelden als prioriteit worden gezien bij het beoordelen van voedselveiligheid. Bij alle beschreven pathogenen is het van enorm belang dat de koude keten doorheen het traject producent-consument continu wordt gerespecteerd zodat groei door temperatuursmisbruik kan vermeden worden. Hygiëne bij het fabriceren van kant-en-klare maaltijden via het HACCP-systeem, lage initiële besmettingsgraad van de ingrediënten, optimale afdodingsprocessen en optimale bewaaromstandigheden zijn van primair belang bij het bestrijden van deze pathogenen (CAC,2007). Prevalentiedata In verschillende Europese landen worden de aanwezigheid van ziekteverwekkende kiemen in diverse levensmiddelen gemonitord. Een jaarlijkse samenvatting van deze controles wordt teruggevonden in The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Foodborne Outbreaks. De meest recente versie is deze van Ook voor Belgiëapart is zo n samenvatting beschikbaar. In 2012 en 2013 hebben respectievelijk 533, 1159 staalnames plaats gevonden in België onder de categorie other RTE-products and prepared dishes, waarvan er respectievelijk 0 en 1 keer (>2 log kve/g) L. monocytogenes gedetecteerd werd. Dit zijn de enige uitgevoerde onderzoeken in deze rapporten die betrekking hebben op kant-en-klare, gekoelde, samengestelde maaltijden in België. Ook werden in 2011 kant-en-klare salades onderzocht waaruit bleek dat 15 op 223 (6.7%) positief werd bevonden op L. monocytogenes, steeds < 2 log kve/g (EFSAb, 2011; EFSAb, 2012 ; EFSAb, 2013). In Europa werden L. monocytogenes zelden gedetecteerd boven de 2 log kve/g in de distributie in de periode In de categorie kant-en-klare levensmiddelen werd L. monocytogenes het meeste aangetroffen in visserijproducten, (semi)zachte kaas en vleeswaren (Figuur 2) Vooral gerookte vis bleek een probleem te zijn in Een sterke toename van 2012 naar 2013 bleek in de categorieën unspecified cheeses en Other RTE-products. Tot deze laatste behoren de maaltijdsalades (EFSAe, 2013). 27

28 Figuur 2 : Overzicht aantal RTE-stalen die niet voldeden aan EU-criteria voor L. monocytogenes In 2011 en 2012 voldeed respectievelijk 99.8% en 100% van alle onderzochte producten onder de categorie other processed food products and prepared dishes aan de bestaande criteria van L. monocytogenes. In 2013 werd er L. monocytogenes gedetecteerd in sandwiches en sushi. Niets werd gedetecteerd bij de rijst/pasta salades zoals ook in 2012 het geval was. In 2010, werd in Tsjechië en Denemarken, respectievelijk 48 en 112 stalen genomen van Pasta/rice salad and unspecified, hiervan bevatte respectievelijk 4.2 % en 3.6% L. monocytogenes. (steeds < 2 log kve/g) Deze screenings duiden aan dat kant-en-klare maaltijden toch een risicofactor zijn voor besmetting met L. monocytogenes, al wordt de norm van 100kve/g zeer weinig overschreden. Tabel 7 : Overzicht van prevalentiescreeningsresultaten van RTE salads-other food preparations in de Eu Jaar Product Pathogeen Aanwezig >2 log kve/g 2013 RTE-salade retail L. monocytogenes 5.96% (n=2468) 0.05% (n=1847) 2013 Other RTE food and prepared dishes retail L. monocytogenes 0.56% (n=1068) 0.16% (n=622) 2012 RTE-salade L. monocytogenes 1% (n=1922) 1/2285 (n=2285) 2012 Other RTE food and prepared dishes L. monocytogenes 1.1% (n=1037) 0% (n=699) 2011 Other RTE food and prepared dishes L. monocytogenes 1.3% (n=400) 0.2% (n=936) 2010 Other RTE food and prepared dishes L. monocytogenes 0.6% (n=5999) >0.1% (n=3107) 2010 RTE-salads L. monocytogenes / 0.7% (/) Salmonella spp. werden ook zelden aangetroffen in kant-en-klare levensmiddelen volgens de onderzoeken, maar als deze werd aangetroffen was dit voornamelijk in kant-en-klare vleeswaren (EFSAe, 2011 ; EFSAe, 2012 ; EFSAe, 2013). Doordat kant-en-klare gekoelde samengestelde maaltijden behoren tot de grotere categorie Other RTE foods, geven de prevalenties van deze categorie niet helemaal de realiteit weer van 28

29 maaltijdsalades. Hiertoe behoren ook bakkerijproducten, sandwiches, fruit en groenten, bereide maaltijden en salades. Prevalentiescreeningen specifiek voor kant-en-klare gekoelde samengestelde maaltijdsalades zijn dus nodig. Verder zijn in de wetenschappelijke literatuur ook prevalentiescreeningen te vinden waarvan een kort overzicht wordt gegeven in Tabel 22 in bijlage. Hierbij analoge resultaten zoals uit de EU monitoring. L. monocytogenes is de meest gezochte pathogeen en occasioneel aanwezig maar in aantallen < 2 log kve/g. Ook werd B. cereus aangetroffen in gekookte pasta die vaak deel uitmaakt van kant-en-klare gekoelde samengestelde maaltijdsalades (Samapundo et al., 2011). Zarei et al. (2012) detecteerde in RTEvisserijproducten hoge aantallen S. aureus die niet van nature uit aanwezig zijn op deze levensmiddelen wat wijst op kruis contaminatie. Algemene conclusies zijn dat hygiëne (Oliveira et al., 2011 ; Kotzekidou, 2013) en het behoud van de koude keten de belangrijkste kritische punten zijn bij het produceren en bewaren van kant-en-klare levensmiddelen (Gonzalez et al., 2013). De initiële besmettingsgraadvan een levensmiddel met pathogenen speelt ook een grote rol bij het vermijden van grote aantallen pathogenen. Vooral bij de screening van rauwe kant-en-klare visserij (Kovacevic et al., 2012 ; Gonzalez et al., 2013) en vlees producten die langer houdbaar zijn dan 5 dagen (Vitas et al., 2004 ; Meyer et al., 2012), wordt geregeld L. monocytogenes en Salmonella spp. aangetroffen in hoge aantallen. Op eiwitproducten en groenten die niet onderworpen zijn aan een proces waarbij micro-organismen afgedood zijn, worden meer pathogenen gedetecteerd (Inoue et al., 2000 ; Vitas et al., 2004) Voedselgebonden uitbraken en recalls Recalls België Indien een producent, retailer of consument het mogelijk acht of bewijzen heeft dat een levensmiddel na consumptie ernstige gezondheidsproblemen kan oplopen dan zullen zij dit verplicht moeten melden aan het Federaal agentschap voor veiligheid van de voedselketen (FAVV). Het FAVV contacteert dan de producent van het desbetreffende product waarop deze verdere acties onderneemt zoals: blokkeren, uit de handel nemen en/of een recall van het product naargelang waar het product zich bevindt in de keten. Het FAVV heeft een publieke databank waar alle terugroepingen opgelijst zijn. Er werd vier keer een gekoelde, kant-en-klare samengestelde maaltijdsalade teruggeroepen in de periode In twee gevallen gaat het om mogelijke aanwezigheid van L. monocytogenes telkens afkomstig van dezelfde producent en beiden in het jaar In 2012 waren er ook twee productterugroepingen op hetzelfde moment, dit door mogelijke aanwezigheid van Salmonella spp. in maaltijdsalades op basis van hamblokjes. Dit is niet veel in vergelijking met andere levensmiddelen maar toch duidelijk een probleem dat vooral de laatste jaren voorkomt (FAVV-site,2015). Tabel 8 : Terugroepingen gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijdsalades in België Product Pathogeen Datum Verantwoordelijke Bereide salades L. monocytogenes 17/10/2014 Dessaint Bereide salades op basis van pasta L. monocytogenes 30/08/2014 Dessaint Saladebowl, Verse salade snack Ham Salmonella spp. 14/12/2012 Univeg Belgium en Spar Saladebowl, craq-craq Salmonella spp. 14/12/2012 Carrefour 29

30 Uitbraken België In België staat het FAVV in voor de veiligheid van het voedselketen. Het FAVV wordt bij een voedseluitbraak bijgestaan door het WIV (Wetenschappelijk instituut volksgezondheid). Deze verzamelt voedselstalen en data inzake voedseluitbraken en analyseert deze stalen. Een voedseluitbraak is het vóórkomen, onder bepaalde omstandigheden, van twee of meer gevallen van dezelfde ziekte en/of besmetting bij de mens, of een situatie waarbij meer ziektegevallen worden geconstateerd dan normaal zou mogen worden verwacht, waarbij er een (waarschijnlijk) oorzakelijk verband bestaat met eenzelfde voedselbron (Directive 2003/99/EC, Article 2(d)). In België is er maar één uitbraak tijdens de periode in verband te brengen met een vermoedelijk zelfgemaakte kant-en-klare maaltijd. In 2012 raakten 20 kinderen ziek na het eten van een rijst-komkommer salade. B. cereus kon vermoedelijk uitgroeien door temperatuursmisbruik. Er werden emetische toxine niveau s aangetroffen van µg/g. Er werd ook vastgesteld dat in % van de voedingsuitbraken in België veroorzaakt werd door consumptie van samengestelde levensmiddelen waartoe kant-en-klare samengestelde maaltijden ook behoren. Vaak zijn dit warme gerechten die thuis of op restaurant geconsumeerd worden (EFSAb, 2008 ; EFSAb, 2009 ; EFSAb, 2010 ; EFSAb, 2011 ; EFSAb, 2012). Recalls Europa Op Europees niveau wordt het RASFF-systeem gebruikt. (Rapid Alert System for Food and Feed) Dit systeem verzamelt informatie over de (mogelijke) gevaren die kunnen optreden door het consumeren van levensmiddelen en wordt bijgestaan door het EFSA met wetenschappelijke onderbouwde raad. Het RASSF staat in nauw contact met de lidstaten en andere landen buiten de EU zodat snel informatie kan verspreid worden om uitbraken te vermijden, internationale terugroepingen te coördineren en een Europees invoerverbod voor bepaalde risicovolle levensmiddelen te suggereren. Verder heeft het RASFF een publieke databank die werkt via alerts en informatives. Op deze alerts en informatives kunnen terugroepingen volgen. Elf alerts en elf informatives zijn via het RASFF van 2001 tot en met 2014 opgetekend i.v.m. kant-enklare gekoelde samengestelde maaltijden.(tabel 9) Dit is geen sluitende lijst want bij enkele voorvallen is het niet geheel duidelijk of deze maaltijden kant-en-klaar zijn. 30

31 Tabel 9 : Overzicht van terugroepingen van gekoelde, kant-en-klare, samengestelde maaltijdsalades over de periode van aan de hand van het RASSF-systeem Classificatie Datum Herkomst Land (notificatie) Pathogeen Product Actie? Besmettingsniveau Alert 20/10/2014 Frankrijk Frankrijk Salmonella spp. Komkommer salade Terugroeping consumenten Aanwezigheid in 25 g Alert 16/10/2014 Frankrijk Frankrijk L. monocytogenes Gekoelde salades Terugroeping consumenten > 1500 ; < 240 ; < 40 ; < 10 kve/g Alert 29/08/2014 Frankrijk Frankrijk L. monocytogenes Salades met pasta Terugroeping consumenten 1500kve/g Info attention 22/05/2014 België Frankrijk Salmonella spp. Kip en noten tabbouleh / Aanwezigheid 25 g Info attention 19/09/2013 België Frankrijk L. monocytogenes Salades met tonijn, gerookte zalm en zee-producten Terugroeping winkels <10kve/g Info attention 28/08/2013 Duitsland Nederland L. monocytogenes Sushi Informeren autoriteiten 100kve/g Info attention 2/08/2013 België Luxemburg Bacillus cereus Salade met tonijn Terugroeping winkels >150000kve/g Info attention 1/07/2013 Frankrijk Luxemburg Bacillus cereus Salade met pasta Terugroeping winkels kve/g Info attention 23/05/2013 Duitsland Nederland L. monocytogenes Gekoelde Sushi / <100 kve/g Alert 24/04/2013 Frankrijk Frankrijk L. monocytogenes Paprika gevuld met tonijn Terugroeping consumenten 100 kve/g Alert 18/12/2012 België België Salmonella spp. Salades met ham en kip Terugroeping consumenten Aanwezigheid in 25 g Alert 5/11/2012 Frankrijk Frankrijk L. monocytogenes RTE-pasta met kip Terugroeping winkels <10 kve/g Info attention 30/10/2012 Gekoelde gemixte salade met Zweden en Informeren autoriteiten, Zweden Salmonella szentes rauwe ingrediënten van Denemarken voorbij THT datum Denemarken Aanwezigheid in 25 g Alert 15/10/2012 Denemarken Denemarken L. monocytogenes Gekoelde RTE-salade en 'side dish' Terugroeping consumenten Aanwezigheid in 25 g Alert 23/09/2011 Duitsland Duitsland L. monocytogenes Mini-paprika gevuld met een crème kaas Terugroeping consumenten 1200 kve/g Info 10/08/2010 Italië Frankrijk L. monocytogenes Gegrilde groenten en gedroogde ham Terugroeping consumenten <10 kve/g Alert 31/07/2007 Zweden Denemarken Salmonella spp. Bereide salades Terugroeping consumenten Aanwezigheid in 25 g Alert 26/07/2007 Italië Frankrijk L. monocytogenes Bereide maaltijd met kaas en zalm Terugroeping consumenten Aanwezigheid in 4 op 5 /25 g Alert 10/07/2007 Italië Frankrijk L. monocytogenes Bereide maaltijd met kaas en zalm Terugroeping consumenten 120 kve/g Info 28/09/2005 Slovakije Hongarije L. monocytogenes Gemixte salades Product voorbij TGT-datum Aanwezigheid in 25 g Info 7/09/2004 Duitsland Duitsland L. monocytogenes Eiersalade met ham / kve/g Info 27/07/2001 België Luxemburg Salmonella spp. Sandwich met spek / Aanwezigheid in 25 g 31

32 Van deze 22 voorvallen zijn 19 gevallen kant-en-klare gekoelde samengestelde maaltijdsalades, 1 is een kant-en-klare sandwich en 2 voorvallen met sushi. Dit leidde 15 maal tot een terugroeping bij de winkels of consument. L. monocytogenes (14), Salmonella spp.(6) en B. cereus (2) waren de oorzaak van deze meldingen. Van de 14 positieve detecties voor L. monocytogenes voldeed de helft niet aan het wettelijke criterium op einde houdbaarheid (max 2 log kve/g). Opvallend is ook dat de helft van deze meldingen niet afkomstig waren van het land waar de maaltijdsalade werd geproduceerd. Van de 22 meldingen die zijn opgetekend in de periode zijn er 14 in de periode wat wijst op een licht toenemend aantal meldingen de laatste jaren (EC, ). Uitbraken Europa Uitbraken gerelateerd aan consumptie van rauwe en licht verwerkte groenten en fruit zijn de laatste jaren sterk gestegen. Internationale handel, meer consumptie van deze levensmiddelen en de toename van de immunodeficiënte bevolking zorgen voor deze stijging. Studies van Beuchat et al. (2002) en Taban et al. (2011) geven een kort overzicht van al deze uitbraken. Opmerkelijk is dat bijna elke pathogeen in deze overzichten terug te vinden is, zodat kan worden besloten dat op groenten en fruit bijna elke pathogeen kan uitgroeien, afhankelijk van omgevingsfactoren. Ook zijn er uitbraken gekend op kant-en-klare groenten van minder voorkomende pathogenen zoals Yersinia enterocolitica (MacDonald et al.,2011). Deze zijn zeer sporadisch maar ze komen toch voor. Verder maakt EFSA in samenwerking met ECDC een jaarlijks rapport over voedsel-gebonden uitbraken waar ook voorgaande Europese prevalentiescreeningen toe behoren (EFSAe,2013). Dertien listeriose-uitbraken werden genoteerd in de periode , allemaal niet gerelateerd met kant-en-klare gekoelde samengestelde maaltijdsalades. Belegde sandwiches, een bakkerij product en 3 kant en-klare vleesproducten lagen aan de oorsprong in In 2013 waren het voornamelijk RTEvisserijproducten en RTE-vleesproducten dat de oorzaak waren (EFSAe, 2012 ; EFSAe, 2013) Bepaling houdbaarheidsperiode Wettelijke microbiologische criteria Levensmiddelen in de EU moeten verplicht voldoen aan voedselveiligheidscriteria opgesteld door de EC (Europese commissie). De General Food Law Regulation vormt de basis voor deze geharmoniseerde en onderbouwde wetgeving inzake de kwaliteit en veiligheid van voedingswaren in de EU. Hierop nauw aansluitend werden later nieuwe wetteksten toegevoegd i.v.m. hygiëne (Regulatie inzake de hygiëne voor levensmiddelen) en microbiologische criteria (Regulatie inzake de microbiologische criteria voor levensmiddelen) van voedingswaren. Deze laatste bevat voedselveiligheidscriteria en proceshygiëne criteria. In deze thesis werd gesteund op de voedselveiligheidscritaria omdat deze gelden voor producten die in de handel gebracht zijn (EC, VERORDENING (EG) Nr. 2073/2005). De Belgische wetten i.v.m. voedingswaren zijn gebaseerd op deze van de EU. Indien een voedselveiligheidscriterium overschreden wordt, zal het levensmiddel volgens artikel 19 van verordening (EG) Nr. 178/2002 uit de handel worden genomen of een terugroepingsactie ondernomen worden. Een criterium bevat ook een gespecifieerde analysemethode voor kwantificatie en detectie, een monsternameplan voor het aantal te nemen deelmonsters (n) en hun grootte (g of andere eenheid) (FAVV,2010). 32

33 Enkel voor Salmonella spp. en L. monocytogenes zijn er criteria ontworpen voor gekoelde, kant-enklare, samengestelde maaltijden. Volgens de voedselveiligheidscriteria in Verordening (EC) No. 2073/2005 moet Salmonella afwezig zijn bij 25g staalname in bereide salades op basis van rauwe eieren, weinig gekoelde kant-en-klare samengestelde maaltijden vallen onder deze categorie. Voor L. monocytogenes berusten de criteria niet enkel op detectie en worden de kant-en-klare levensmiddelen opgedeeld in drie categorieën. Kant-en-klare levensmiddelen die bestemd zijn voor kinderen of voor speciale medische doeleinden mogen geen L. monocytogenes bevatten per 25g. Kanten-klare levensmiddelen die aan voorgaande beschrijving niet voldoen en die groei van L. monocytogenes toelaten, mogen bij het verlaten van de producent geen L. monocytogenes bevatten per 25g en mogen maximum 2 log kve/g bevatten binnen de vooropgestelde houdbaarheidsdatum in de distributiesector en bij de consument. Indien de groei van L. monocytogenes niet ondersteund wordt, moet enkel voldaan worden aan de vooropgestelde limiet van minder dan 2 log kve/g in de distributiesector. Het is duidelijk dat de EC ervan uitgaat dat L. monocytogenes de meest risicovolle pathogeen is in deze categorie van levensmiddelen omdat enkel voor deze pathogeen voedselveiligheidscriteria bestaan voor alle gekoelde, kant-en-klare samengestelde maaltijden Microbiologische richtwaarden Naast de opgelegde voedselveiligheidscriteria heeft het FAVV ook voedselveiligheidsrichtwaarden, proceshygiënerichtwaarden en distributierichtwaarden. Bij overschrijding van de voedselveiligheidsrichtwaarden zullen dezelfde maatregelen getroffen worden dan bij voedselveiligheidscriteria. Indien een distributie- of proceshygiënerichtwaarde wordt overschreden zal het FAVV dit melden aan de producent die in samenspraak met het FAVV al dan niet maatregelen zal treffen. Wanneer het risico groot is dat een bepaalde pathogeen in een bepaald levensmiddel kan uitgroeien of toxines kan produceren, dan worden criteria opgesteld. Criteria bevatten ook enkele grenswaarden voor indicatororganismen bij bepaalde levensmiddelen. Grote aantallen van deze indicatororganismen duiden op onvoldoende hygiënemaatregelen en vergroten dus ook aanzienlijk de kans op pathogenen. In Tabel 10 zijn de microbiologische criteria en richtwaarden weergegeven die van toepassing zijn op kant-en-klare, samengestelde (gekoelde) maaltijden (FAVV, 2014). Voor L. monocytogenes zijn er steeds voedingsveiligheidcriteria, voor Salmonella spp. Voedingsveiligheidsrichtwaarden (omvatten niet enkel kant-en-klare gekoelde samengestelde maaltijden o.b.v. rauwe eieren) en voor de overige pathogenen en bedervers distributierichtwaarden (FAVV,2014). Voor richtwaarden inzake melkzuurbacteriën wordt terug gevallen op de richtwaarden die aan de vakgroep Labo voor levensmiddelenmicrobiologie en conservering zijn ontworpen (LFMFP- UGent,2010). 33

34 Tabel 10 : Criteria en richtwaarden van het FAVV i.v.m. kant-en-klare, gekoelde en samengestelde maaltijden Matrix niveau 4 RTE Parameters Bereide salades op basis van rijst, pasta, gries (op basis van gekookte ingrediënten) Bereide salades op basis van rijst, pasta, gries (op basis van gekookte ingrediënten) Bereide salades op basis van rijst, pasta, gries (op basis van gekookte ingrediënten) Bereide salades op basis van rijst, pasta, gries (op basis van gekookte ingrediënten) Bereide salades op basis van rijst, pasta, gries (op basis van gekookte ingrediënten) Bereide salades op basis van rijst, pasta, gries (op basis van gekookte ingrediënten) Bereide salades op basis van rijst, pasta, gries (op basis van gekookte ingrediënten) Bereide salades op basis van rijst, pasta, gries (op basis van gekookte ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met gekookte ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met gekookte ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met gekookte ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met gekookte ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met gekookte ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met gekookte ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met gekookte ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met rauwe ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met rauwe ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met rauwe ingrediënten) Kant-en-klare koude gerechten (met rauwe ingrediënten) Stadium waar criterium geldt n c m M Afwezi g Eenh eid Referentie Reg/J -N Indeling RTE Bacillus cereus Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde RTE Clostridium perfringens Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde RTE Escherichia coli Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde RTE Gisten/schimmels Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde RTE Listeria monocytogenes Sector Distributie kve/g Verordening nr 2073/2005 RTE Salmonella spp. Overal 5 0 Afwezig 25 g Richtwaarde N RTE RTE Staphylococcus coagulase + Totaal kiemgetal (mesofiele aerobe) J Voedselveiligheidscriteriu m Voedselveiligheidsrichtwa arde Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde RTE Bacillus cereus Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde RTE Enterobacteriaceae Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde RTE Escherichia coli Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde RTE Listeria monocytogenes Sector Distributie kve/g Verordening nr 2073/2005 RTE Salmonella spp. Overal 5 0 Afwezig 25 g Richtwaarde N RTE RTE Staphylococcus coagulase + Totaal kiemgetal (mesofiele aerobe) J Voedselveiligheidscriteriu m Voedselveiligheidsrichtwa arde Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde of proceshygiënerichtwaarde RTE Escherichia coli Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde RTE Listeria monocytogenes Sector Distributie kve/g Verordening nr 2073/2005 RTE Salmonella spp Overal 5 0 Afwezig 25 g Richtwaarde N RTE Staphylococcus coagulase + J Voedselveiligheidscriteriu m Voedselveiligheidsrichtwa arde Sector Distributie kve/g Richtwaarde N Distributierichtwaarde Opmerkingen Indien > 10 5 kve/g, toxines opsporen (in 25g) bij WIV Geldt gedurende de hele houdbaarheidstermijn. Indien > 10 5 kve/g, toxines opsporen (in 25g) bij WIV Indien > 10 5 kve/g, toxines opsporen (in 25g) bij WIV Geldt gedurende de hele houdbaarheidstermijn. Indien > 10 5 kve/g, toxines opsporen (in 25g) bij WIV Geldt gedurende de hele houdbaarheidstermijn. Indien > 10 5 kve/g, toxines opsporen (in 25g) bij WIV 34

35 Richtwaarden zijn een positieve aanvulling op de criteria. Naast pathogenen komen bedervers hier uitgebreid aan bod zodat richtwaarden een vollediger beeld geven van het levensmiddel. Ze worden meer gebruikt in procesoperaties om HACCP en GHP grondiger te controleren en evalueren. Indicatororganismen zijn ook vaak opgenomen in deze richtwaarden. Overschrijding van een richtwaarde duidt op een probleem dat vaak snel kan verholpen worden zonder dat de eerder geproduceerde levensmiddelen een gevaar vormen voor de consument (Cordier et al, 2004). Zowel criteria als richtwaarden dragen dus bij tot veilige levensmiddelen Ten minste Houdbaar Tot - Te Gebruiken Tot Houdbaarheid is een zeer breed begrip. De EU omschrijft de houdbaarheidstermijn als : De periode die loopt tot hetzij de datum van minimale houdbaarheid, hetzij de uiterste consumptiedatum van de producten, zoals gedefinieerd in artikel 9, respectievelijk artikel 10 van Richtlijn 2000/13/EG. De houdbaarheid van een voedingsmiddel is de periode waarin het voedingsmiddel helemaal veilig is en sensorisch voldoetaan de verwachtingen van de consument. Tijdens de houdbaarheidsperiode mag het voedingsmiddel in geen geval de microbiologische criteria overschreiden. Ook moet de nutritionele waarde op het einde van de houdbaarheid zo goed mogelijk overeen komen met de waarden op het etiket. Levensmiddelen die geconsumeerd worden na de gegeven houdbaarheidsperiode en hierbij een groot risico vormen voor de gezondheid van de consument, krijgen een te gebruiken tot datum. Eenmaal deze TGT is overschreden mag het niet meer verkocht worden. Levensmiddelen die geen risico vormen voor de gezondheid van de consument indien consumptie na de gegeven datum, krijgen een ten minste houdbaar tot datum. Wanneer deze THT is overschreden mag het levensmiddel nog verkocht worden omdat het risico op gezondheidsproblemen na consumptie zeer klein is. Figuur 20 in bijlage is een keuzeboom om te helpen bepalen of een levensmiddel een TGT of een THT krijgt toegewezen (MPI-NZ, 2012). Volgens deze handleiding behoren kant-en-klare gekoelde samengestelde maaltijdsalades tot categorie met een TGT-datum (MPI-NZ, 2012). 35

36 36

37 3. Materiaal en Methoden Producenten van maaltijdsalades zijn verplicht om een houdbaarheidsdatum weer te geven op hun verpakkingen. Door gebrek aan concrete microbiologische richtwaarden voor samengestelde maaltijden, wordt voor de juiste keuze van de houdbaarheid van deze maaltijden beroep gedaan op microbiologische richtwaarden voor de beoordeling van enkelvoudige levensmiddelen. (Componenten) Om na te gaan in hoeverre deze microbiologische richtwaarden van enkelvoudige levensmiddelen ook van toepassing zijn in geval van samengestelde maaltijden, werd vooreerst het assortiment beschikbare maaltijdsalades grondig gekarakteriseerd. Vervolgens werd vooral onderzocht in hoeverre L. monocytogenes, indien aanwezig, zich kan verspreiden over de verschillende componenten van de maaltijdsalade en hierop kan uitgroeien tijdens de bewaring in de koeling Karakterisatie van het assortiment beschikbare maaltijdsalades In een eerste fase worden 51 maaltijdsalades onderworpen aan een grondige analyse om zo de fysicochemische parameters (ph en gassamenstelling) en de microbiologische kwaliteit hiervan nauwgezet in kaart te brengen Aankoop van koelverse, kant-en-klare maaltijdsalades Er werd besloten om de maaltijdsalades als gewone klant aan te kopen in verschillende supermarkten in Gent. In totaal werden er 51 verschillende maaltijdsalades van elf verschillende producenten aangekocht in zeven verschillende supermarktketens en dit in de periode september-november Zowel maaltijdsalades met of zonder zetmeelcomponent werden aangekocht. De maaltijdsalades werden telkens per twee aangekocht, met aandacht voor hetzelfde lotnummer, waarbij één maaltijdsalade gebruikt werd voor microbiologische analyses en de andere voor fysicochemische analyses. Naast deze analyses werden ook visuele kenmerken genoteerd (aantrekkelijkheid, versheid, beschadiging aan de verpakking, enz.). Deze 51 verschillende salades zijn geheel op toevallige basis gekocht om zo dicht mogelijk bij de realiteit van het dagelijkse leven aan te leunen. Direct na aankoop of na maximaal 1 dag bewaring bij de maximale bewaringstemperatuur aangegeven op het etiket (4 C of 7 C), werden de analyses uitgevoerd. Aangezien dit een hele dag in beslag nam, werden de ph s gemeten 1 of 2 dagen na aankoop. Niet alle maaltijdsalades van het beschikbare gamma werden onderzocht omdat ze op moment van bezoek aan de supermarkt niet voorradig waren of omdat er maar één pakje van aanwezig was Bepaling van de fysicochemische parameters ph-bepaling Om de zuurtegraad van de maaltijdsalade te bepalen, werd een ph-meting uitgevoerd met behulp van een ph-meter (Mettler Toledo SevenEasy ph meter, Schwerzenbach, Zwitserland). Hiervoor diende 25 à 30g levensmiddel in een grote, droge plastic beker vermalen te worden m.b.v. een mixer. Om de phmeting te kunnen uitvoeren diende deze brei te worden overgebracht in een klein plastic potje dat een kwartiertje in de frigo werd gezet. De ph-electrode werd vervolgens aangebracht in de brei om zo de zuurtegraad te bepalen. De ph werd zowel van iedere component apart gemeten, alsook van de gehele maaltijdsalade waarbij de verschillende componenten in dezelfde verhouding aanwezig waren als in de originele maaltijd Bepaling van de gassamenstelling De gassamenstelling in de verpakking is een belangrijke invloedsfactor tijdens het bewaarproces. Daarom werd de gassamenstelling in de kopruimte bepaald m.b.v. een gassamenstellingsmeter (PBI 37

38 Dansensor check mate 9000, Ringsted, Denemarken), indien de verpakking zich leende tot mapverpakking. Met behulp van een holle naald wordt het gas in de kopruimte opgezogen en zo het procentuele gehalte aan zuurstof en koolstofdioxide bepaald. Het septum voorkomt tijdens het doorprikken van de verpakking dat de plastic folie scheurt en dat er ongewenste uitwisseling van lucht in de kopruimte met de omgeving kan optreden. Enkel de gassamenstelling van maaltijdsalades verpakt onder gemodificeerde atmosfeer werd onderzocht Microbiologische analyses In dit onderzoek werden zowel kwantitatieve als kwalitatieve testen op de maaltijdsalades verricht. De microbiologische kwaliteit werd zowel van iedere component apart bepaald, als van de gehele maaltijdsalade (i.e. de mix) waarbij de verschillende componenten in dezelfde verhouding aanwezig waren als in de originele maaltijd. De kwantitatieve bepalingen, i.e. de tellingen, vinden plaats op gieten strijkplaten. Op deze manier werd het totaal psychotroof aeroob kiemgetal nagegaan alsook het aantal melkzuurbacteriën, gisten en schimmels, E.coli, Enterobacteriaceae (enkel voor eiwitcomponent), B. cereus (enkel voor zetmeelcomponent)en telling L. monocytogenes (in geval van aanwezigheid in het levensmiddel).de kwalitatieve bepaling, i.e. detectie per 25 g levensmiddel, werd toegepast voor Salmonella spp. en L. monocytogenes Kwantitatieve bepalingen Aanmaak verdunningsreeks Omdat de kiemgetallen vaak erg hoog zijn in koelverse kant-en-klare maaltijdsalades werd een verdunningsreeks aangemaakt voor iedere component in de maaltijdsalade en de mix volgens ISO :1999 (ISOa, 1999). De primaire verdunning (i.e verdunning) bestaat uit 10g (component) of 25g (mix) levensmiddel waaraan PPS (8,5 g zout/l en 1 g pepton/l, OXOID) werd toegevoegd. Na het homogeniseren werd een tienvoudige verdunningsreeks aangemaakt door telkens 1 ml van de voorgaande verdunning over te brengen in 9ml PPS. Microbiologische parameters De concentratie van de verschillende micro-organismen werd bepaald aan de hand van de bestaande standaard analysemethoden. Een overzicht wordt gegeven in Tabel 11. Het totaal psychrotroof aeroob kiemgetal werd bepaald op PCA. Op deze gietplaten worden alle bacteriën, schimmels en gisten geteld. De samenstelling van de agar heeft geen enkele inhiberende component waardoor groei van alle micro-organismen mogelijk is. Voor het bepalen van de concentratie melkzuurbacteriën diende een ph-correctie van het medium te worden uitgevoerd door toevoeging van 0,9ml 37% zoutzuur (Sigma-Aldrich) per 1l. De ph moet steeds rond de 5,7 liggen met een maximale afwijking van 0,2. Dit werd steeds nagegaan met de ph-meter. Aangezien melkzuurbacteriën het beste groeien bij micro-aerofiele condities werd bij dit medium een deklaag aangebracht. Melkzuurbacteriën zijn te herkennen aan hun langwerpige ovale en witte koloniegroei. Gisten worden soms ook aangetroffen op deze agar. Bij twijfel worden de betwiste kolonies opgepikt en bekeken onder de microscoop (Variant Jenamed, Oberkochen, Duitsland) waar duidelijk het verschil tussen gisten en melkzuurbacteriën zichtbaar is. 38

39 Tabel 11: Overzicht van microbiologische parameters en de gebruikte analysemethoden voor de bepaling van de kwaliteit en de veiligheid van kant-en-klare levensmiddelen. Micro-organisme Standaardmethode Cultuurmedium Supplementen Producent Incubatie Totaal psychotroof aeroob kiemgetal ISO 4833 Melkzuurbacteriën ISO Gisten en schimmels ISO 7954 (08/1988) E. coli AFNOR, NF ISO Enterobacteriaceae ISO :2004 B. cereus ISO :2001 L. monocytogenes ISO /2 AMD1 Plate Count Agar (PCA) Gietplaat Man Rogosa Sharpe agar (MRS) Gietplaat met deklaag Yeast extract Glucose Chloramphenicol agar (YGC) Strijkplaat RAPIDE. Coli (REC) Gietplaat Violet Red Bile Glucose agar (VRBG) Gietplaat met deklaag Mannitol egg Yolk Polymyxin agar (MYP) Strijkplaat Agar Listeria Ottaviani Agosti (ALOA) Strijkplaat ml37% HCl/l (Merck) Difco antimicrobial vial A ( Becton, Dickinson and company) - - Polymyxin B Supplement + egg yolk ALOA Enrichment Selective Supplements Oxoïd, CM0325 Oxoïd, CM0361 Bio-rad Bio-rad, Oxoïd, CM0485 Oxoïd, CM SR0099 en SR0047 Biolife, Incubatie 4-6 dagen bij 22 C Incubatie 4-6 dagen bij 22 C Incubatie 3 dagen bij 25 C Incubatie 1 dag bij 44 C Incubatie 1 dag bij 37 C Incubatie 1 dag bij 30 C Incubatie 2 dagen bij 37 C Gisten vertonen vaak ronde, witte of rode kolonies. Schimmels daarentegen vallen op door hun harig uiterlijk. Ze zijn ook vaak filamentueus. De gisten en schimmels werden apart geteld. YGC-agar is de ideale voedingsbodem waar enkel gisten en schimmels kunnen overleven. Difco antimicrobial vial A werd toegevoegd om bacteriële groei zeker onmogelijk te maken omdat de onderzochte producten groenten bevatten of in contact zijn geweest met groenten waar een grote nevenflora aanwezig is. Chloortetracycline is het actieve bestanddeel en maakt bacteriële groei onmogelijk. Het aantal E. coli werd bepaald op REC-agar, een selectieve en chromogene voedingsbodem voor het isoleren van E. coli en coliformen. In dit medium zijn 2 chromogene substraten aanwezig, nl. GLUC en GAL. Bij aanwezigheid van het enzym glucoronidase in het organisme en GLUC (medium) zullen de kolonies paars kleuren. Bij aanwezigheid van het enzym galactosidase in het organisme en GAL(medium) zullen de kolonies blauw kleuren. Coliformen bezitten galactosidase en geen glucoronidase waardoor deze blauw kleuren op REC-agar. E. coli bezit integendeel wel glucoronidase maar geen galactosidase waardoor deze kolonies paars kleuren zodat vlug een onderscheid kan gemaakt worden tussen deze organismen. Enterobacteriaceae werden bepaald op VRBG-agar, een selectieve en chromogene voedingsbodem. Bij het uitplaten werd net zoals bij MRS een deklaag aangebracht omdat micro-aerofiele condities de groei van enterobactericeae bevorden. Enterobacteriaceae zijn een grote groep gram-negatieve bacteriën. VRBG-agar bevat onder andere glucose, neutraal rood, crystal violet en galzouten. Deze laatste twee inhiberen de groei van grampositieve bacteriën. Glucose wordt snel omgezet door de enterobacteriaceae waardoor de ph in het medium gereduceerd wordt. Doordat de kolonies neutraal rood en crystal violet hebben opgenomen zullen de kolonies door een ph-reductie roos-paars gaan kleuren. Soms wordt er ook een roze halo waargenomen rond de kolonies door precipitatie van de galzouten. 39

40 MYP agar is een differentieel en selectief medium voor B. cereus doordat deze in vergelijking tot andere bacteriën geen mannitol kan gebruiken als energiebron, bestand is tegen polymyxin B en de mogelijkheid heeft om lecithinase aan te maken. Bacteriën die mannitol gebruiken als energiebron brengen een ph-daling teweeg die de kolonies geel kleurt. B. cereus kan dit niet en kleurt roze. Verder reageert lecithine in de eidooier m.b.v. het lecithinase aanwezig in B. cereus waardoor een witte neerslag in de vorm van een halo bekomen wordt. Polymyxin B inhibeert gram-negatieve bacteriën en dus niet B. cereus. De kolonies van B. cereus zijn typisch grillig en droog met een opvallende roze achtergrond en worden omgeven door een neerslaghof. Verdachte kolonies dienen bevestigd te worden op schapenbloed-agar. Als de verdachte kolonies een heldere halo vertonen na incubatie dan gaat het om B. cereus. Dit principe is gebaseerd op haemolyse. Wanneer L. monocytogenes aanwezig is in 25g levensmiddel, dient een kwantificatie te worden uitgevoerd op ALOA-agar. Dit cultuurmedium is een differentiële en selectieve voedingsbodem voor het isoleren van L. monocytogenes. Door het toevoegen van LiCl en een selectieve mix van antimicrobiële middelen waaronder ook polymyxin B, is dit medium selectief. Het differentiële aspect van het medium wordt bekomen door de chromogene stof X-glucoside, een substraat voor de detectie van het ß-glucosidase enzyme, dat aanwezig in alle Listeria species. De speciale differentiële activiteit wordt bekomen door middel van een substraat L-fosfatidylinositol. Dit substraat wordt door een reactie m.b.v. fosfolipase C enzym omgezet. Dit laatsgenoemde enzym wordt enkel aangemaakt door L. monocytogenes en in enkele L. ivanovii stammen. Door deze combinatie van differentiële technieken kan L. monocytogenes gemakkelijk herkend worden aan zijn blauw-groene kleur omgeven door een opake halo. Deze halo is niet aanwezig bij de andere Listeria spp.. Aantal kolonievormende eenheden berekenen Om het aantal micro-organismen in het levensmiddel te kunnen berekenen, dienen drie parameters gekend te zijn, namelijk het aantal getelde kolonies (A), de verdunningsfactor (V) en het inoculumgrootte (I). M.b.v. de onderstaande formule kan dan het aantal kolonie vormende eenheden in 1g levensmiddel berekend worden: X= A*V/I Kwalitatieve bepalingen Indien L. monocytogenes en Salmonella spp. aanwezig zijn in het levensmiddel dan ligt hun concentratie vaak onder de detectielimiet van kwantitatieve methoden, i.e. <1 log kve/g. Om toch na te gaan of er al dan niet één van deze pathogenen aanwezig was, werd er gebruik gemaakt van gevoeligere kwalitatieve testen. Deze kunnen in theorie 1 bacterie aantonen in 25 g levensmiddel. De detectielimiet van deze kwalitatieve testen ligt dus heel wat lager doordat deze methoden gebruik maken van een aanrijking waarbij de cellen kunnen vermeerderen tot hogere aantallen. In deze studie werd geopteerd om gebruik te maken van de AFNOR-gevalideerde VIDAS-methode voor L. monocytogenes (BIO 12/11-03/04) en Salmonella spp. (BIO 12/16-09/05) ontworpen door BioMérieux). Beide testen bestaan uit een vooraanrijking in respectievelijk demi-fraser (Biomérieux, ) en BPW (Oxoïd, CM0509), een aanrijking in respectievelijk fraser (Biomérieux, ) en SX2 (Biomérieux, ) en detectie met behulp van de VIDAS-essay. Indien één van de uitgevoerde analyses positief bleek te zijn, werden er verdachte kolonies geïsoleerd door het aanrijkingsmedium fraser of SX2 uit te strijken op respectievelijk ALOA (Biolife, ) voor L. monocytogenes of XLD (Oxoïd, CM0469) voor of Salmonella spp.. 40

41 De VIDAS-essay steunt op het ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) principe. De kant-en-klare Vidasstrip bestaat uit verschillende cupjes. Het eerste cupje dient gevuld te worden met het aangereikte monster. Wanneer het gezochte organisme aanwezig is, zullen de antigenen van het micro-organisme interageren met de specieke anti-lichamen in de SPR-tips waarmee het monster wordt opgezogen. Na enkele wasstappen, zal de SPR-tip een oplossing met een tweede specifiek antilichaam opzuigen. Dit anti-lichaam is gekoppeld aan een enzyme. Indien het gezochte organisme aanwezig is, ontstaat er dus een antilichaam-antigeen-antilichaam-enzym complex dat zal reageren met het substraat waardoor er fluorescentie wordt uitgezonden. Indien dit signaal boven een drempelwaarde uitkomt, dan is de test positief en volgen er confirmatietesten. Figuur 3 : Werkingsmechanisme VIDAS-essay (BioMérieux, 2015) Dataverwerking De bekomen data (X) werden nauwkeurig in Excel ingegeven. Voedingsbodems waar geen kolonies op aanwezig waren, werden aangegeven als kleiner dan de LOD die afhankelijk is van de gebruikte verdunning en het gebruik van een giet- of strijkplaat. In een volgende stap werden deze resultaten verder statisch verwerkt. Hierbij werden de resultaten van TKG, MZB, Enterobacteriaceae schimmels en gisten die onder de LOQ lagen, gelijkgesteld aan de helft van de LOQ. Voor L. monocytogenes werd enkel voortgegaan op de aanwezigheid of afwezigheid van L. monocytogenes in de statistische testen aangezien geen enkele telling boven de LOQ (1 log kve/g) lag. Elk bekomen resultaat werd op basis van de geldende criteria (EC-FAVV)(Tabel 23 in bijlage) en richtwaarden (LFMP) (Tabel 23 in bijlage) ingedeeld in één van onderstaande categorieën met bijhorende kleurencode: X<Doel Doel< X <Tolerantie Tolerantie< X < Einde Houdbaarheid Einde Houdbaarheid<X X<m m<x<m X=M M<X Er wordt ook een nieuwe factor gecreëerd voor elke component die het aantal overschrijdingen van de (richtwaarden en criteria) voorstelt. Deze factor geeft dus de algemene kwaliteit weer van de geanalyseerde component. Hoe hoger deze waarde hoe slechter de kwaliteit van deze component. Indien een component de richtwaarde voor TKG en MZB overschrijdt en deze van Enterobacteriaceae, gisten, schimmels niet dan zal deze component kwaliteit 2 krijgen. Hoe hoger deze factor, hoe slechter de kwaliteit. 41

42 Statistische testen werden uitgevoerd in SPSS. Er werd gekozen om al de testen uit te voeren op het 5% significantieniveau. De nulhypothese wordt weerhouden als de p-waarde van de statistische test groter of gelijk is aan Wanneer de p-waarde kleiner is dan 0.05 wordt de nulhypothese weerlegd en wordt de alternatieve hypothese aangenomen. Er werd onderzocht welke factoren significant gecorreleerd zijn met elkaar m.a.w. of beide onderzochte parameters invloeden vertonen op elkaar. Er wordt onderscheid gemaakt tussen 3 types data: nominale, ordinale en geschaalde data. De correlatie tussen twee nominale/ordinale of nominale-ordinale factoren wordt onderzocht a.d.h.v. chi-square-test in SPSS. Hierbij wordt er geen normaliteit of homogeniteit van de varianties verondersteld (crosstabs). De correlatie tussen twee geschaalde factoren wordt onderzocht d.m.v. bivariate correlatie (Pearson) bij veronderstelling van normaliteit dat wordt nagegaan door Kolgomorov-Smirnov test. Indien een van de data niet voldoet aan de normaliteitstest wordt bivariate correlatie (Spearman) toegepast. Ten slotte wordt de correlatie onderzocht tussen een geschaalde factor en een nominale of ordinale factor. Alvorens wordt eerst normaliteit en homogeniteit (modified levene test) nagegaan van de residuelen. Bij normaliteit worden de gemiddeldes vergeleken met oneway anova waarbij een modified levene test wordt uitgevoerd. Indien homogeniteit aanwezig is, zal het resultaat van one way anova (Tuckey) worden gevolgd. Zoniet, zal one way anova (Games Howell) worden gevolgd. In het geval dat de residuelen niet normaal verdeeld zijn, wordt gesteund op nietparametrische testen (Kruskal-Wallis test) Transfertesten Transfertesten werden uitgevoerd om na te gaan of er overdracht is tussen een met L. monocytogenes besmette component en andere componenten vaneen maaltijdsalade. Deze proef werd telkens uitgevoerd op drie batchen van een bepaalde combinatie, die op hun beurt uit drie testunits bestaan (Figuur 4). Figuur 4 : Schematische weergave opbouw tranfsertesten Opkweek van L. monocytogenes en bereiding van het inoculum De stockcultuur werd aangemaakt door 1 à 2 parels van elke referentiestock (LMG 392, LFMFP 394 en LFMFP 491) op steriele wijze in een proefbuis met 10ml Brain-Heart-Infusion (BHI) bouillon over te brengen. Na 24u incubatie bij 37 C werden TSA slants aangemaakt. De werkcultuur werd aangemaakt door met een oognaald de stammen onder steriele condities over te brengen in 10ml BHI. Na 24u incubatie bij 37 C werden ze overgeënt in nieuwe BHI. Deze cultuur werd voor 4 dagen bij 7 C gezet zodat L. monocytogenes een koudestress ondergaat. Voor het inoculum werd eenzelfde hoeveelheid van elke stam in een buisje gebracht en gehomogeniseerd. Deze mix had een gemiddelde concentratie van 10 9 kve/ml waaruit de benodigde hoeveelheid kon berekend worden om een gewenst inoculum van 5*10 3 kve/g te bekomen. Het volume van het inoculum bedroeg nooit meer dan 1% van het volume 42

43 van de component. Deze methode is gebaseerd op EURL Lm TECHNICAL GUIDANCE DOCUMENT for conducting shelf-life studies on Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods Version 3 6 June Opstellen en bereiden modelmaaltijd Er werd gekozen voor een maaltijdsalade die bestaat uit een kip (eiwit), pasta (zetmeel) en slamix (groenten) (Figuur 5). Alles werd aangekocht in de plaatselijke supermarkt en dezelfde dag gebakken, gekookt of gewassen. Rauwe kipfilets (500g) werden versneden in blokjes en gebakken met boter (Bertoli : bakken en braden) totdat de kippenblokjes een kerntemperatuur van 70 C haalden. De zetmeelcomponent werd in droge vorm aangekocht van het merk Delhaize en werd al dente gekookt volgens de instructies van de fabrikant. De slamix werd in dezelfde hoeveelheden samengesteld uit rucola, verschillende slasoorten en andijviesoorten van het merk Delhaize. De sla werd eerst gewassen en gedroogzwierd alvorens in testunits te verpakken. Na bereiding van de componenten en de inoculummix, werden de testunits gemaakt. Na inoculatie van kip/sla werd een combinatie gevormd van 75g kip, 50g sla en/of 100g pasta. Deze werden verpakt onder luchtatmosfeer en bewaard bij 4 C zodat slechts minimale groei kon optreden en specifiek de transfer kon onderzocht worden. Figuur 5 : Eiwit/Zetmeel/Groenten componenten gebruikt in transfertest Analyses Op de niet verpakte restfractie van de componenten werd de a w en ph gemeten. Om de transfer te achterhalen werden de samengestelde maaltijden na 1 dag bewaring bij 4 C geanalyseerd door elke geïnoculeerde en niet geïnoculeerde component van elke testunit afzonderlijk uit te platen op ALOA strijkplaten die 48u geïncubeerd werden Bepaling water-activiteit (a w) Naast de zuurtegraad is de wateractiviteit ook één van de meest bepalende intrinsieke factoren van een levensmiddel inzake microbiologische groei. Om deze wateractiviteit te achterhalen werd gebruik gemaakt van een a w-kryometer, de AWK-20 van NAGY (Gäufelden, Duitsland) die jaarlijks gekeurd wordt door PEDAK. Na een representatieve monstername van ongeveer 25 g werd dit monster gemixt en in een plastic tube overgebracht. Nadat de Pt-probe is aangebracht in de tube met het gemixte levensmiddel kan de meting van start gaan. Het principe van de a w-kryometer is gebaseerd op cryoscopie, vriespuntverlaging. De wateractiviteit van de aangekochte maaltijdsalades en hun 43

44 componenten werden niet bepaald om dat deze toch vermoedelijk hoger liggen dan 0.95 en dit dus geen limiterende factor is voor de groei van micro-organismen (Devlieghere et al., 2011). Ook bij de challengetesten werd op deze manier de a w bepaald Challengetesten Om na te gaan of L. monocytogenes uitgroeit in één of meerdere componenten van een samengestelde koelverse maaltijdsalade, werden challengetesten uitgevoerd op een modelmaaltijd. De challengetesten werden uitgevoerd volgens een bestaand protocol: EURL Lm TECHNICAL GUIDANCE DOCUMENT for conducting shelf-life studies on Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods Version 3 6 June Opkweek van L. monocytogenes en bereiding van het inoculum De opkweek van L. monocytogenes en de bereiding van het inoculum werd uitgevoerd zoals beschreven staat in paragraaf met het oog op het bekomen van een ent van ca. 1.7 log kve/g Bereiden modelmaaltijd De componenten voor de modelmaaltijd werden aangeleverd door een bedrijf gespecialiseerd in kanten-klare koelverse samengestelde maaltijden. De modelmaaltijd (300g) bestond uit 35% gekookte pasta (105g), 55% gewassen groentenmix (165g) en 10% gekookte kippenblokjes (30g). De groentenmix bestonduit geblancheerde wortelschijfjes, erwten, bonen, salademix en kruiden waaronder bieslook. De gekookte kippenblokjes werden beënt met L. monocytogenes in een beoogde concentratie van 50 kve/g. De geïnoculeerde eiwitcomponent werd bovenop de groenten gelegd die op zijn beurt op de zetmeelcomponent lag. Daarnaast werd de groei van L monocytogenes ook nagegaan op de verschillende componenten afzonderlijk. Hiertoe werd de zetmeelcomponent (100g), de groenten (50g) en de eiwitcomponent (120g) afzonderlijk beënt met de L. monocytogenes cocktail met het oog op het bekomen van een ent van ca. 1.7 log kve/g. Alle producten werden MAP-verpakt (68% N 2, 7% O 2 en 25% CO 2) met een traysealer (Deca packaging group, MECA 900, Figuur 6) of Multivac machine (Type 300C, Figuur 6) en werden gedurende de eerste 4 dagen bewaard bij 4 C en de resterende 2 dagen bij 7 C. De testen werden uitgevoerd op drie batchen (batch 1, batch 2 en batch 3) die hun beurt bestonden uit drie testunits (TU 1, TU 2 en TU 3). Als referentie voor deze geïnoculeerde testunits werd voor iedere analyse dag een blanco testunit samengesteld om de nevenflora, ph en a w te analyseren. 44

45 Figuur 6 : A : Traysealer DECA-verpakkingsmachine (componenten apart) B : Multivac-verpakkingsmachine (mix) Bepaling van de fysicochemische parameters Op de eerste analysedag (dag 0) en de laatste analysedag (dag 6) werd de ph en a w van iedere afzonderlijke blanco component bepaald als beschreven in paragraaf Ook werd de gassamenstelling (% O 2/CO 2) voor het openen van de verpakking gemeten ter controle Bepaling van de microbiologische parameters Microbiële analyses werden telkens uitgevoerd op 25g component (zetmeel, groenten of eiwit), de maaltijdsalade werd dus niet in zijn geheel geanalyseerd. Op elke analysedag (dag 0, dag 4 en dag 6) werd het totaal aeroob psychrotroof kiemgetal, melkzuurbacteriën en de concentratie van L. monocytogenes nagegaan volgens de procedures beschreven in paragraaf Op de eerste analysedag (dag 0) en de laatste analysedag (dag 6) werd bijkomend E. coli geanalyseerd. De groei van L. monocytogenes op de geïnoculeerde component werd opgevolgd door uitplating op ALOA. Op de niet-geïnoculeerde componenten van de maaltijdsalade werd naast detectie ook telling uitgevoerd indien L. monocytogenes aanwezig was Afdoding L. monocytogenes in maaltijdsoep Doordat de componenten van de maaltijdsalade ook gebruikt werden als basis voor een maaltijdsoep, werd er tevens nagegaan of eventueel uitgegroeide L. monocytogenes voldoende werd afgedood. Hiervoor werd voor elke batch drie geïnoculeerde testeenheden voorzien. Op dag 6 werd aan de maaltijd 390ml kokend water toegevoegd waarin de groenten, na omroeren, gedurende 1 minuut konden garen. Hierna werd een representatief monster genomen voor detectie en eventuele enumeratie van L. monocytogenes. Het temperatuursprofiel werd voor 1 batch vastgelegd m.b.v. dataloggers. 45

46 46

47 4. Resultaten In deze sectie worden de resultaten besproken met als finaal doel de microbiologische richtwaarden om de kwaliteit en houdbaarheid van samengestelde kant-en-klare maaltijden te beoordelen. Een eerste deel betreft de resultaten van de microbiologische analyses van de aangekochte maaltijdsalades. Hiervan werden productkenmerken zoals intrinsieke en extrinsieke factoren, prijs, gewicht, producent en aantrekkelijkheid genoteerd. Verder werden op deze maaltijden microbiële analyses uitgevoerd zoals beschreven in materiaal en methoden. In een tweede deel werd aan de hand van transfertesten nagegaan of er interactie en mogelijks uitwisseling van micro-organismen is tussen de verschillende componenten die in contact komen met elkaar bij de samenstelling van de maaltijd. Tenslotte werd het groeipotentieel van L. monocytogenes in deze samengestelde maaltijden onderzocht door middel van challengetesten Karakterisatie van het assortiment beschikbare maaltijdsalades Aangezien maaltijdsalades relatief nieuw zijn, is er in de bestaande literatuur niet veel te vinden omtrent dit thema. Om deze categorie toch te kunnen onderzoeken en in kaart te brengen, werd vertrokken vanuit de praktijk en werden 51 maaltijdsalades aangekocht. Deze geven een realistisch en totaal beeld van de maaltijdsalade-markt zoals ter beschikking voor de Belgische consument weer. Van deze producten werden systematisch een aantal producteigenschappen genoteerd. De frequentie van voorkomen van deze producteigenschappen over het gamma van de aangekochte maaltijdsalades wordt behandeld als eerste punt. Vervolgens werd er nagegaan of er verbanden kunnen worden gelegd tussen de resultaten van de microbiologische analyses en de producteigenschappen Producteigenschappen van koelverse, kant-en-klare maaltijdsalades Er werden 51 maaltijdsalades aangekocht die door 12 verschillende producenten gefabriceerd werden. Deze 51 levensmiddelen werden willekeurig aangekocht in 7 supermarktketens in Gent in de periode september tot en met november De eiwitcomponent bestond uit of kaas (n=12), of vlees(waren) (n=20), of vis en visserijproduct(n=15) of een mix van kaas en vlees(waren) (n=4). De kaascomponent bestond vaak uit mozarella (n=4) of geitenkaas van gepasteuriseerde melk (n=5). Gebakken/gekookte/gegrilde blokjes kipfilet (n=13), gekookte ham (n=7) of gebakken spekblokjes (n=4) waren de voornaamste vlees(waren)componenten. Bij de vis en visserijproducten waren gerookte of gekookte zalm (n=5) en gekookte tonijn (n=5) de meest voorkomende eiwitcomponenten. Ook werd 17 keer een hardgekookt eitje aangetroffen. De zetmeelcomponent was in 37 salades aanwezig waarvan in 17 maaltijdsalades de zetmeelcomponent gemengd was met een saus of dressing. De zetmeelcomponent bestond vaak uit gekookte pasta (n=16) of gekookte aardappelblokjes (n=16). De groente- en/of fruitcomponent werd vaak samengesteld door een mix van salade, tomaten, worteltjes, komkommer, bonen, olijven al dan niet versneden. Bij 41 maaltijden werd de dressing of saus apart verpakt. Indien de componenten van een maaltijdsalade slechts enkele raakvlakken hadden met elkaar en duidelijk niet gemengd waren, werden ze ingedeeld onder de groep apart, waartoe 34 maaltijdsalades behoren. In de overige 17 maaltijdsalades werden de componenten als gemengd beschouwd. 47

48 Aantal maaltijdsalades Aantal maaltijdsalades Het gewicht van de maaltijdsalades varieerde tussen 200g en 520g waarbij 450g het courantste gewicht was met 15 maaltijdsalades (Figuur 7). Op 2 maaltijdsalades was het gewicht niet aangegeven. De prijs bedroeg 2.59 euro tot 6.90 euro per maaltijdsalade met een gemiddelde prijs van 3.81 euro (Figuur 8). De kiloprijs varieerde van 6.67 euro/kg tot euro/kg met een mediaan van 10.9 euro/kg. De kiloprijs hangt zeker af van de gebruikte ingrediënten, maar ook van de winkel waar het product aangekocht werd. Bij 1 aangekochte maaltijd was de houdbaarheid al 1 dag overschreden bij aankoop en bij een andere reeds 2 dagen. De resterende 49 maaltijdsalades werden gekocht tot maximaal 6 dagen voor einde houdbaarheid (Figuur 9) Slechts vijf maaltijdsalades (van eenzelfde producent) hadden een THT-datum meegekregen. De overige 46 maaltijdsalades werden aangeduid op de verpakking met een TGT-datum Gewicht (gram) Figuur 7 : Spreiding van het gewicht van de aangekochte maaltijdsalades Prijs (Euro) Figuur 8 : Spreiding van de prijs van de aangekocht maaltijdsalades 48

49 Aantal maaltijdsalades Resterende houdbaarheid op moment van aankoop (dagen) Figuur 9 : Spreiding van de resterende houdbaarheid op dag van aankoop van de aangekocht maaltijdsalades Fysicochemische parameters De eiwitcomponent heeft een gemiddelde zuurtegraad van 5.65 (Figuur 10). De zuurtegraad van de kaascomponenten (4.98) verschilt significant van deze bij de visserij- (5.85) en vlees(waren)- (5.92) componenten. De hardgekookte eieren hebben een gemiddelde ph van De ph van de zetmeelcomponent bedraagt gemiddeld 5.35 (Figuur 10). Hier werd ook weer een significant verschil opgemerkt. Indien de zetmeelcomponent gemengd werd met een saus of dressing (voornamelijk mayonaise) bedroeg de ph 5.03, wat zuurder is dan een ph van 5.65 voor zetmeelcomponenten zonder dressing of saus. De gemiddelde zuurtegraad van de groenten bedroeg 5.09 en deze verschilt significant van alle andere componenten (Figuur 11). Figuur 10 : Variatie in de zuurtegraad van A) de eiwitcomponent en B) de zetmeelcomponent van maaltijdesalades 49

50 Figuur 11 : Variatie in de zuurtegraad van A ) de groentencomponent en B) het representatief geheel (mix) van de maaltijdsalades De meeste maaltijdsalades (32/51) bevonden zich in een map-verpakking met lucht. In de overige 19 maaltijdsalades werd er een gewone luchtatmosfeer vastgesteld. Maximaal werd 33% CO 2 en minimaal 4% CO 2 gemeten in een map-verpakking. Van de map-verpakte maaltijdsalades hadden acht van de 32 map-verpakkingen een O 2-percentage van minstens 5% Microbiologische kwaliteit en veiligheid van koelverse, kant-en-klare maaltijdsalades Er werden kwantitatieve en kwalitatieve microbiologische analyses uitgevoerd. De samenvattende resultaten voor TKG, MZB, ENTERO, gisten en schimmels is weergegeven in Tabel 12 voor elke component apart alsook voor analyse van een representatief monster van de mix (de maaltijdsalade als geheel). E. coli werd in twee maaltijdsalades aangetroffen, namelijk ineen zetmeelcomponent en een andere maal in zowel de zetmeel- als groentencomponent. De aantallen bedroegen telkens minder dan 1.7 log kve/g. Bij de eiwitcomponenten en de mix stalen werd geen enkele keer E. coli geteld (< 1 log kve/g). B. cereus werd in de zetmeelcomponent van 2 maaltijdsalades geteld met telkens 2 log kve/g (dus net op de detectielimiet van de methode). Kwalitatief werd er gezocht naar L. monocytogenes en Salmonella spp. per 25 gram. Salmonella werd in geen enkel staal gedetecteerd. L. monocytogenes werd wel acht maal gedetecteerd in de mix-stalen en bevestigd door de beschreven conformatietest. De positieve stalen hadden steeds geen telbare aantallen aan L. monocytogenes (dus <1 log kve/g). Van deze acht positieve maaltijdsalades waren er drie afkomstig van één producent terwijl er van die ene producent in totaal maar vijf maaltijdsalades aangekocht werden (5 verschillende batchen product en zelfs 5 verschillende varianten van maaltijdsalade van deze producent). 50

51 Tabel 12 : Microbiologische analyseresultaten van de 51 onderzochte maaltijdsalades bemonsterd in grootwarenhuizen in Gent (sept-nov 2014) EIWIT ZETMEEL GROENTEN MIX TKG GIST SCHIMMEL MZB ENTERO TKG GIST SCHIMMEL MZB TKG GIST SCHIMMEL MZB TKG GIST SCHIMMEL MZB Aantal stalen Gemiddelde 19 6,20 3,58 1,86 5,30 2,92 5,30 2,95 2,01 4,64 6,80 4,40 2,22 5,80 6,80 4,31 2,11 5,84 Mediaan 19 6,28 3,26 1,70 5,20 2,81 5,20 2,70 1,70 4,57 6,60 4,30 2,00 5,90 7,00 4,03 1,70 5,86 Minimum 19 2,70 1,70 1,70 2,00 0,70 2,70 1,70 1,70 1,70 4,90 1,70 1,70 3,20 4,20 2,00 1,70 3,08 Maximum 19 9,38 6,72 3,61 8,40 6,11 8,80 5,76 3,40 7,43 8,90 7,40 3,23 8,40 9,10 7,3 3,49 8,43 Percentielen ,13 2,30 1,70 3,70 1,95 4,20 1,70 1,70 3,30 5,90 3,50 1,70 4,90 5,60 3,51 1,70 4, ,28 3,26 1,70 5,20 2,81 5,20 2,70 1,70 4,57 6,60 4,30 2,00 5,90 7,00 4,03 1,70 5, ,31 5,00 1,70 6,70 4,04 6,30 3,67 2,00 6,06 8,00 5,20 2,70 6,80 8,00 5,03 2,48 6,91 18 Aantal stalen met telbare aantallen (minstens 1 kolonie op de agarplaat) 19 log kve/g 51

52 Correlaties tussen produktkarakteristieken en microbiologische kwaliteit De verzamelde data en observaties rond productkarakteristieken en de microbiologische kwaliteit van de 51 aangekochte maaltijdsalades werden onderworpen aan correlatietesten in SPSS. Zo worden de verbanden tussen de belangrijke parameters tijdens het bewaren van de maaltijdsalade en de (microbiologische) resultaten duidelijk (Tabel 25 in bijlage). De correlaties tussen de geschaalde data werden eerst bekeken (Spearman correlatiefactor, Tabel 13). Vervolgens werden de correlaties tussen de nominale/ordinale data onderzocht. (bivariate correlatie pearson, Tabel 14) Als laatste werden de correlaties tussen de geschaalde data enerzijds en de nominale/ordinale data anderzijds toegelicht (Anova, Tuckey, Games-Howell, Tabel 15). Indien er niet voldaan werd aan de voorwaarden, werd gesteund op niet-parametrische testen. Invloed van enkele verpakkingsfactoren op de microbiologische resultaten Enkele voor de hand liggende verbanden werden al gauw gevonden (Tabel 13). Zo bleek de prijs significant gecorreleerd te zijn met het gewicht en de O 2 (%) concentratie met de CO 2 (%) concentratie. Ook bleken de ph s van bijna alle componenten onderling significant gecorreleerd te zijn behalve de ph van de zetmeelcomponent met de ph van de eiwitcomponent. De ph s vertonen geen verbanden met de andere bekomen geschaalde data. Wel is de ph van de zetmeelcomponent significant hoger indien deze niet met een dressing/mayonaise vermengd is of indien de saus apart verpakt is. De ph van de eiwitcomponent is zuurder als deze volledig uit kaas bestaat. De resterende houdbaarheidstermijn op de dag van de analyse vertoont geen verband met de microbiologische graad van besmetting bij de zetmeelcomponent. Dit staat in sterk contrast met de microbiologische data bekomen op de groentencomponent waarbij de microbiologische kwaliteit dus wel significant achteruit gaat bij een kortere resterende houdbaarheidsperiode. Naarmate het gewicht van de maaltijdsalade stijgt, nemen de gemeten aantallen van de microbiologische parameters (TKG, MZB en gisten) af en dus verbetert de microbiologische kwaliteit. Een mogelijke verklaring zou de grotere oppervlakte/volume-verhouding bij de kleinere maaltijdsalades kunnen zijn aangezien bacteriën zich vooral op de oppervlakken bevinden. Hierbij wordt ook opgemerkt dat grotere porties, meer kans hebben op een map-verpakking, met componenten die apart liggen en een aan te raden bewaringstemperatuur van 7 C. Een duurdere maaltijdsalade staat niet direct gelijk aan een kwaliteitsvoller product wat de consument toch zou verwachten. Deze correlatie moet wel genuanceerd worden omdat de duurdere producten vaak een kortere houdbaarheidsperiode over hadden bij aankoop. Wel werd de kans groter dat de maaltijdsalade niet map-verpakt is bij duurdere producten, wat niet verwacht werd. Correlaties tussen microbiologische kwaliteit van de verschillende componenten Indien één van de componenten hoog besmet is met schimmels dan zal dit de kans dat een andere aanwezige component ook hoog besmet is, significant verhogen. Het aantal schimmels vertoont ook verbanden met het aantal aanwezige gisten in de componenten. Deze eerder besproken trend geldt volgens de waarnemingen ook voor het TKG. Zo wordt aangetoond dat er bijna altijd een significante correlatie is tussen het TKG, het aantal MZB en het aantal gisten op eenzelfde component. De correlatiecoëfficiënt bedraagt minstens 75% tussen het TKG en MZB van eenzelfde component. Voor gisten bedraagt dit minstens 60%. Dit werd ook significant aangetoond voor de interacties tussen de componenten onderling maar in mindere mate. 52

53 Tabel 13 : Correlatiematrix van het gewicht, prijs, houdbaarheid en microbiologische analyseresultaten van de 51 onderzochte maaltijdsalades Correlaties Eiwit Zetmeel Groenten Mix Gewicht Prijs Houdbaarheid Spearman 20 TKG GIST SCHI MZB ENTERO TKG GIST SCHI MZB TKG GIST SCHI MZB TKG GIST SCHI MZB Gewicht +X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X Prijs +X -X Houdbaarheid -X -X -X -X -X -X -X EiwitTKG -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X EiwitGIST -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X EiwitSCHIMMEL +X +X -X EiwitMZB -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X EiwitENTERO -X -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X ZetmeelTKG -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X ZetmeelGIST -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X ZetmeelSCHIM -X +X +X +X +X +X +X +X ZetmeelMZB +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X GroentenTKG -X -X +X +X -X +X +X +X +X +X +X +X +X GroentenGIST -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X GroentenSCHIM +X +X +X +X +X +X GroentenMZB -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X MixTKG -X -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X MixGIST -X -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X MixSCHIMMEL +X +X +X +X MixMZB -X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X +X 20 De correlatiematrix is uitgevoerd via Spearman correlatie omdat het TKG van de mix en de ph van de eiwitcomponenten (hier niet vermeld) niet normaal verdeeld bleken te zijn. 53

54 Microbiologische kwaliteit versus veiligheid van de onderzochte maaltijdsalades Indien alle componenten vermengd zijn met een saus of enkel de zetmeelcomponent vermengd is met een saus, dan is de kans groter dat L. monocytogenes aanwezig is. Dit heeft als logisch gevolg dat wanneer de saus apart verpakt zit, de kans op L. monocytognes kleiner wordt. Er werd net niet signficant aangetoond (p= 0.057) dat de aparte ligging van de componenten een hogere kans geeft aan het aanwezig zijn L. monocytogenes. Ook werd eveneens net niet aangetoond dat bij een zuurdere zetmeelcomponent de kans verhoogt op L. monocytogenes. (p = 0.073) Sterk in contrast hiermee is de algemene microbiologische kwaliteit van de componenten (TKG, MZB, G&S) die geen indicator blijkt te zijn omtrent de aanwezigheid van L. monocytogenes. Figuur 12 : A : Onderzochte maaltijdsalade met aparte ligging van de componenten B : Onderzochte maaltijdsalade waarbij de componenten gemengd werden beschouwd Parameters i.v.m. de kwaliteit van de onderzochte maaltijdsalades Wanneer op het etiket vermeld staat om de maaltijdsalade te bewaren bij 4 C dan is de kans groter dat deze maaltijdsalade niet map-verpakt is. Ook als deze maaltijdsalade geen zetmeelcomponent bevat, dan is de kans groter dat deze salade niet map-verpakt is. Het map-verpakken heeft duidelijk een betere microbiologische kwaliteit van elke component en de mix tot gevolg. De maximale bewaringstemperatuur heeft daarentegen blijkbaar enkel een positieve invloed op de kwaliteit van de eiwitcomponent en de mix (met zoals de te verwachten lagere gemeten aantallen bij aanbevolen bewaring bij 4 C). Omdat het TKG van een component significant correleert met het aantal MZB en gisten op diezelfde component, werden enkel de verbanden tussen het TKG van elke component en een aantal mogelijke bewaringsparameters, onderzocht. Te verwachten was dat het TKG van alle componenten correleren met de kwaliteit van deze component en de bijhorende mix. Ook het TKG van de componenten houden verband met de kwaliteit van de andere aanwezige componenten. Enkel de kwaliteit van de groenten houdt geen verband met het TKG van de eiwit- en zetmeel component. Map-verpakking en een lage(re) bewaringstemperatuur verlagen significant het TKG van alle componenten behalve in het geval van de zetmeelcomponent waar dit niet is waar te nemen. Indien de componenten apart beschouwd worden, zal het TKG van de zetmeelcomponent van een samengestelde maaltijdsignificant lager liggen. Het TKG van de groenten en dus ook de kwaliteit van de groenten bleek hoger te liggen als er geen zetmeel component aanwezig was. Wel wordt opgemerkt dat de resterende houdbaarheidstermijn van de maaltijdsalades opmerkelijk korter was indien geen zetmeelcomponent aanwezig was. 54

55 Ook de supermarkt van aankoop heeft duidelijk invloed op de algemene microbiologische kwaliteit en de bewaringswijze van de maaltijdsalades, zoals ook vastgesteld door Ceuppens et al. (2015). Echter er was geen verband te vinden tussen de supermarkt van aankoop enerzijds en de microbiologische kwaliteit van de zetmeelcomponent en de detectie van L. monocytogenes anderzijds alhoewel de p- waarden steeds klein waren maar net niet significant genoeg. Ten slotte zal een korte houdbaarheid een slechtere kwaliteit tot gevolg hebben bij de groenten- en de eiwitcomponent en niet direct bij de zetmeelcomponent. 55

56 Tabel 14 : Correlatiematrix waarbij de kwaliteit van de componenten in verband wordt gebracht met bewaringsparameters Temperatuur Type Zetmeel L. Kwaliteit Kwaliteit Kwaliteit Kwaliteit Saus Producent Supermarkt eiwit dressing mono Eiwit Zetmeel Groenten Mix apart Temperatuur X X X X X Map X X X X X X Apart X X x X Type eiwit X Zetmeel dressing X X Producent X X X X X X X X Supermarkt X X X X X X X X L. monocytogenes x X X Kwaliteit Eiwit X X X X X X X Kwaliteit Zetmeel X X X Kwaliteit Groenten X X X X Kwaliteit Mix X X X X X X Saus apart X X X X X Tabel 15 : Correlatiematrix tussen bewaringsparameters en houdbaarheid, prijs, gewicht en microbiologische analyseresultaten Temperatuur Map Apart Zetmeel Kwaliteit Kwaliteit Kwaliteit Kwaliteit Producent Supermarkt L. mono dressing Eiwit Zetmeel Groenten Mix Houdbaarheid X X X EiwitTKG X X x X X X X X ZetmeelTKG X NT X X X X GroentenTKG X X NT X X X X X MixTKG X X NT X X X X X Gewicht X X X X X X X X Prijs X X 56

57 4.2. Transfertesten Bij deze testen werd nagegaan of er transfer optreedt van L. monocytogenes van een geïnoculeerde component naar een niet-geïnoculeerde component door deze in contact te brengen met elkaar. Bijvoorbeeld werden stukjes (geïnoculeerde) gebakken kip op (niet geïnoculeerde) gekookte pasta gelegd in een plastiek (maaltijdsalade)bakje om na te gaan na bewaring gedurende 24h bij 4 C of en in welke aantallen L. monocytogenes nadien ook terug te vinden was op de gekookte pasta.(figuur 13) Figuur 13 : Testunit van geïnoculeerde kip met pasta in de transfertest Fysicochemische parameters Alvorens de transfertesten uit te voeren werden de fysicochemische parameters van de componenten bepaald, namelijk ph en a w (Tabel 16). Alle ph s van de componenten bevinden zich in het licht zure ph bereik van De groenten en pasta hebben een zeer hoge wateractiviteit van ongeveer 1. De kip bezit een lagere wateractiviteit van ongeveer Beide parameters (ph en a w) laten in principe groei toe van L. monocytogenes waardoor deze niet zal afsterven gedurende 1 dag bij 4 C, maar in 1 dag (24h) en rekening houdend met een lag-fase is de effectief te verwachten uitgroei beperkt en eerder een status-quo in aantal kiemen van L. monocytogenes te verwachten. Tabel 16 : ph s en wateractiviteit van de eiwit-; zetmeel en groentecomponent betrokken bij de L. monocytogenes transfertesten Geïnoculeerd ph a w Niet- geïnoculeerd ph a w Combinatie 1 Kip 6,32 0,972 Sla 6,28 0,991 Combinatie 2 Sla 6,28 0,991 Kip 6,48 0,978 Combinatie 3 Kip 6,32 0,972 Pasta 6,4 0,992 Combinatie 4 Sla 6,28 0,991 Pasta 6,51 0,992 Combinatie 5 Kip 6,48 0,978 Sla 6,28 0,991 Combinatie 6 Sla 6,22 0,991 Kip 6,13 0,975 Combinatie 7 Kip 6,32 0,976 Pasta 6,32 0,992 Combinatie 8 Sla 6,22 0,991 Pasta 6,63 0,993 Combinatie 9 Kip 6,32 0,976 Sla 6,22 0,991 Combinatie 10 Sla 6,22 0,991 Kip 6,13 0,975 Combinatie 11 Kip 6,28 0,976 Pasta 6,2 1,002 Combinatie 12 Sla 6,23 1,002 Pasta 6,41 1,002 57

58 Microbiologische parameters De afwezigheid van L. monocytogenes in de niet-geïnoculeerde componenten werd nagegaan zodat het resultaat van de transfertest correct geïnterpreteerd kan worden. Indien er toch initieel L. monocytogenes aanwezig zou zijn op de niet-geïnoculeerde component, zou er bij aanwezigheid van telbare aantallen (> 10 kve/g) een probleem van interferentie met het testresultaat kunnen stellen en zou niet met zekerheid vast te stellen zijn of er inderdaad transfer optrad. Echter in geen enkel van de deelcomponenten betrokken in deze transfertesten was L. monocytogenes van nature aanwezig (telkens afwezigheid per 25g). Als initieel inoculum van L. monocytogenes op de geïnoculeerde component werd gestreefd naar ca. 4 log kve/g, dit met het oog op het nog steeds behalen van telbare aantallen bij transfer. De resultaten van de transfertest zijn weergegeven in onderstaande (Tabel 17). Tabel 17 : Transfer van L. monocytogenes tussen deelcomponenten van een maaltijdsalade na 1 dag bewaring bij 4 C Geïnoculeerde component Niet-Geïnoculeerd component Transfer TU log kve/g log kve/g TU11 TU12 kip 4,04 4,02 sla 2,89 3,34 7,10% 20,90% TU13 3,91 3,59 47,90% TU51 4,11 2,96 7,10% TU52 kip 3,93 sla 3,07 13,80% TU53 4,26 3,48 16,60% TU91 4,26 3,10 6,90% TU92 kip 4,05 sla 3,15 12,60% TU93 4,28 3,13 7,10% TU21 4,14 2,62 3,00% TU22 sla 4,08 kip 1,48 0,30% TU23 4,15 3,18 10,70% TU61 4,63 2,11 0,30% TU62 sla 4,46 kip 2,69 1,70% TU63 4,52 2,38 0,70% TU101 4,53 2,80 1,90% TU102 sla 4,51 kip 2,85 2,20% TU103 4,36 2,74 2,40% TU31 3,96 2,95 9,80% TU32 kip 4,73 pasta 2,92 1,50% TU33 4,06 2,73 4,70% TU71 4,08 3,40 21,00% TU72 kip 4,12 pasta 3,12 10,00% TU73 4,48 3,45 9,30% TU111 4,17 2,62 2,80% TU112 kip 4,32 pasta 2,80 3,00% TU113 4,11 2,86 5,60% TU41 3,78 2,78 10,00% TU42 sla 4,07 pasta 3,10 10,70% TU43 4,34 2,76 2,60% TU81 4,34 2,43 1,20% TU82 sla 4,57 pasta 3,03 2,90% TU83 4,08 2,59 3,20% TU121 4,30 1,78 0,30% TU122 sla 4,04 pasta 2,40 2,30% TU123 4,46 2,32 0,70% Gemiddelde transfer ± St. Dev. 15,50% ± 13,11% 2,60% ± 3,20% 7,50% ± 5,98% 3,80% ± 3,87% 58

59 De transfer van met L. monocytogenes geïnoculeerde sla naar kip en van geïnoculeerde sla naar pasta zijn significant kleiner dan de transfer van geïnoculeerde kip naar de sla. Ook is de transfer van de geïnoculeerde sla naar kip significant kleiner dan de transfer van de geïnoculeerde kip naar pasta. Geen significant verschil werd opgemerkt tussen de transfer tussen de geïnoculeerde sla naar de kip en de transfer tussen de geïnoculeerde kip naar de sla. Indien op dag 0 een component geïnoculeerd wordt met 3.7 log kve/g, dan zal er volgens de resultaten tussen de 2.5 (indien sla geïnoculeerd werd) en de 3.5 log transfer (indien kip geïnoculeerd werd) optreden. Algemeen kan er besloten worden dat er dus inderdaad transfer optreedt en dat de transfer groter is wanneer de kippenblokjes geïnoculeerd zijn Challengetesten Uit de prevalentiescreening blijkt dat er inderdaad occasioneel L. monocytogenes in dergelijke maaltijdsalades kan aangetroffen worden (weliswaar in niet telbare aantallen) maar de productkarakteristieken en condities van bewaring laten mogelijks verder groei toe tot aantallen >100 kve/g op einde houdbaarheid of moment van consumptie. Bovendien is het zo dat er bvb. op de groentencomponent een hoge microbiële belasting is (die mogelijks competitief is en groei-inhiberend is t.o.v. occasioneel pathogenen aanwezig) maar de zetmeelcomponent is dan weer laag microbiologisch belast en wellicht een goed groeimedium voor L. monocytogenes. Ook kan uit de transfertesten worden afgeleid dat er inderdaad interactie optreedt tussen de verschillende deelcomponenten is van de maaltijdsalade en dus mogelijks transfer kan zijn van L. monocytogenes van één component naar een andere component. Om de veiligheid te beoordelen van gekoelde, samengestelde maaltijdsalades tijdens de houdbaarheidstermijn is het dus nuttig om de mogelijke verspreiding en het groeipotentieel van L. monocytogenes te bestuderen doorheen de maaltijdsalade. Ook als slechts één van de deelcomponenten besmet zou zijn, moet met deze interactie tussen deelcomponenten rekening gehouden worden in de challengetesten. Bij de challengetesten met L. monocytogenes werden de maaltijdsalades bewaard bij 4 C gedurende 4 dagen waarna ze nog 2 dagen bewaard werden bij 7 C Fysicochemische parameters De resultaten bekomen bij de transfertesten i.v.m. de ph en de a w zijn vergelijkbaar met deze in de challengetesten. De wateractiviteit van de kip in de challengetesten ligt iets hoger dan bij deze van de transfertesten. Waarschijnlijk omdat de kip van de challengetesten vermoedelijk gekookt is geweest in het toeleveringsbedrijf van de deelcomponenten van de maaltijdsalade betrokken bij deze challengetest. Dit in tegenstelling tot de kip voor de transfertesten waarbij deelcomponenten apart in de winkel werden gekocht en de kip zelf in het lab gebakken is in de pan waarbij uitdroging optreedt. Tabel 18 : ph's en wateractiviteiten van de ingrediënten gebruikt in de challengetesten Challengetesten Dag 0 Dag 6 ph aw ph aw Kip 6,21 0,975 6,06 0,985 Batch 1 Pasta 6,65 1,001 6,59 1,003 Groenten 6,56 1,003 6,17 1,000 Kip 6,07 0,983 5,74 0,983 Batch 2 Pasta 6,48 1,004 6,20 1,003 Groenten 6,32 1,004 6,03 1,003 Kip 6,12 0,983 6,06 0,984 Batch 3 Pasta 6,64 1,003 6,22 1,003 Groenten / 1,003 6,20 1,003 59

60 Er is een verschil merkbaar tussen de ph op dag 0 en dag 6 (de door het toeleveringsbedrijf aangegeven maximale houdbaarheid van de maaltijdsalade). De ph is licht afgenomen, wat waarschijnlijk te wijten is aan de microbiologische activiteit van MZB. De daling is bij alle componenten ongeveer 0.2 eenheid. De wateractiviteit blijft nagenoeg ongewijzigd wellichtdoor de gesloten ondoorlaatbare verpakking. Ook de gassamenstelling werd op dag 4 en 6 gemeten. De oorspronkelijke gassamenstelling op dag 0 na verpakken was 68% N 2, 7% O 2 en 25% CO 2. Indien er groenten aanwezig waren (nl. bij de mix en groenten afzonderlijk) daalde de O 2-concentratie onmiddellijk naar 0 door respiratie. Indien de eiwitcomponent afzonderlijk verpakt werd, daalde de begin O 2-concentratie (7.5%) geleidelijk aan naar ongeveer 4% met uitzondering van batch 2. De gassamenstelling gedurende de challengetest bij afzonderlijke verpakking van de zetmeelcomponent bleef nagenoeg ongewijzigd. Figuur 14 : A : Maaltijdsalade met geïnoculeerde eiwitcomponent B : Geïnoculeerde groentenmengeling Microbiologische parameters De challengetesten werden uitgevoerd enerzijds apart op de afzonderlijke deelcomponenten die in dit geval elk met L. monocytogenes beënt werden en anderzijds op een volledige maaltijdsalade waarbij enkel de eiwitcomponent geïnoculeerd werd met L. monocytogenes (Figuur 14). Daarnaast werden een reeks niet-geïnoculeerde componenten en maaltijdsalades geanalyseerd om de aanwezigheid en groei van nevenflora te bepalen. Een gedetailleerd overzicht van de challengetest-resultaten kan worden teruggevonden in Tabel 26, Tabel 27 en Tabel 28 in bijlage. In de aangeleverde ingrediënten is meermaals aanwezigheid van L. monocytogenes aangetoond, maar steeds niet telbaar (< 1 log kve/g) zodat de resultaten van de challengetesten correct kunnen geïnterpreteerd worden. Naast L. monocytogenes op de geïnoculeerde testunits wordt ook de aantallen van het TKG en MZB opgevolgd op de blanco s. De rauwe groenten hebben op dag 0 overduidelijk het grootste TKG (5-6 log kve/g) met maar weinig MZB (2-3 log kve/g). Het TKG en de MZB-concentratie van zowel de eiwit als zetmeel component komen nagenoeg steeds overeen. Na 6 dagen bedragen de TKG en MZB-concentraties bij alle componenten 6-8 log kve/g. Deze hoge concentraties aan bedervers zal onvermijdelijk sensorische afwijkingen met zich meebrengen en zal in competitie treden met L. monocytogenes voor nutriënten. Er wordt geen groot verschil opgemerkt tussen TKG-MZB concentraties wanneer de mix of de componenten afzonderlijk beschouwd worden. 60

61 KVE/g (log) KVE/g (log) Groenten TKG Eiwit TKG Zetmeel TKG Tijd (Dagen) Figuur 15 : TKG van aparte componenten tijdens bewaring bij 4 C (4 dagen) en 7 C (laatste 2 dagen)(batch 1-2-3) Groenten MZB Eiwit MZB Zetmeel MZB Tijd (dagen) Figuur 16 : MZB van aparte componenten tijdens bewaring bij 4 C (4 dagen) en 7 C (laatste 2 dagen) (batch 1-2-3) 61

62 Zoals eerder vermeld werd er L. monocytogenes waargenomen op de initiële componenten van de challengetesten. Deze van nature besmette ingrediënten zijn, naast TKG en MZB, ook opgevolgd geweest wat betreft L. monocytogenes uitgroei. De zetmeelcomponent was bijna steeds besmet met L. monocytogenes maar steeds < 1 log kve/g. In batch 2 van de eiwitcomponent groeide L. monocytogenes uit tot telbare kolonies maar nog steeds onder het criterium van 2 log kve/g. (Tabel 19) Tabel 19 : Uitgroei van L. monocytogenes op niet-geïnoculeerde ingrediënten van de challengetest BATCH 1 BATCH 2 BATCH 3 Groenten Eiwit Zetmeel BLANCO'S ALOA 21 DET ALOA 21 DET ALOA 21 DET DAG 0 TU1 <1 POS <1 NEG <1 POS APART DAG 6 TU3 <1 NEG <1 NEG <1 POS MIX DAG 6 TU2 <1 NEG <1 NEG <1 POS DAG 0 TU1 <1 NEG <1 POS <1 POS APART DAG 6 TU3 <1 POS 1 / <1 POS MIX DAG 6 TU2 1 / 1,78 / <1 POS DAG 0 TU1 <1 POS <1 NEG <1 POS APART DAG 6 TU3 <1 POS <1 POS <1 POS MIX DAG 6 TU 2 <1 POS <1 NEG <1 NEG 21 Log kve/g 62

63 Concentratie L. monocytogenes log kve/g 5.00 Batch 1 Batch 2 Batch Tijd (dag 0-4-6) Kip Groenten Pasta Figuur 17 : L. monocytogenes uitgroei tijdens de challengetest bij 4 C voor 4 dagen en 7 C voor de laatste 2 dagen op iedere component afzonderlijk 63

64 Zoals weergegeven in Figuur 17 en Tabel 20 is het groeipotentieel van L. monocytogenes bij iedere component apart groter dan 0.5 log en kan dus worden besloten dat iedere component afzonderlijk de groei van L. monocytogenes ondersteunt. De resultaten van de challengetest wanneer enkel de eiwitcomponent geïnoculeerd werd in de mix zijn weergegeven in Tabel 20. Hier werd groei vastgesteld in de eiwitcomponent en ook in de groentencomponent aangezien de groeipotentialen groter zijn dan 0.5 log. In de zetmeelcomponent kan enkel voort gegaan worden op de aanwezigheid of afwezigheid van L. monocytogenes omdat er op geen enkel moment een concentratie hoger dan 1 log kve/g werd geteld. Tabel 20 : Microbiologische analyseresultaten challengetesten Pasta Kip Groenten log kve/g Batch 1 Batch 2 Batch 3 Batch 1 Batch 2 Batch 3 Batch 1 Batch 2 Batch 3 Apart Mix 22 Dag 0 Dag 4 Dag 6 Groeipotentieel Dag 0 Dag 4 Dag 6 Groeipotentieel 1,70 3,08 4,05 <1,00P 1,00 1,30 1,85 2,85 3,09 1,29 <1,00P <1,00G 1,30 0,30-1,30 1,85 3,04 3,14 <1,00P 1,00 1,48 1,90 2,62 3,20 <1,00P 1,00 <1,00G 1,70 2,62 3,23 1,53 <1,00P 1,60 <1,00G 0,60-1,60 1,48 2,57 3,40 <1,00P 1,60 1,00 2,04 2,72 3,16 <1,00P <1,00G 1,60 1,30 2,90 3,01 1,07 <1,00P <1,00G 2,00 0,60-1,60 2,04 2,52 3,11 <1,00P 1,30 1,60 1,70 3,13 3,79 2,00 2,70 3,15 1,90 3,14 3,46 1,61 2,15 2,30 3,06 1,06 1,95 2,72 3,51 1,85 2,26 2,79 2,08 2,61 2,85 1,78 2,40 2,32 2,20 2,66 2,48 0,77 1,85 2,45 2,52 1,60 2,72 2,85 2,08 2,45 1,90 2,00 2,97 3,73 2,00 2,45 3,41 1,95 3,01 4,03 1,95 1,95 2,48 3,18 1,70 2,96 3,90 1,00 2,81 3,11 1,48 2,97 4,08 N P P 2,15 2,90 3,98 2,53 P N P 1,00 3,00 4,01 P N P 1,60 2,72 3,65 P P P 2,11 2,74 3,94 2,26 P P P 0,00 2,83 3,86 P P P 2,18 2,96 4,08 N N N 2,00 3,12 4,45 2,06 P P P 2,04 3,15 4,10 P P N 0,47 1,23 / / / 22 P = Aanwezig in 25 g N = Afwezig in 25 g G = Geen detectie uitgevoerd 64

65 Temperatuur ( C) 4.4. Kooktesten De onderzochte maaltijdsalades in de challengetest zou volgens de producent ook als basis voor een maaltijdsoep kunnen dienen. Hierbij zijn de instructies van producent om aan 300 gram maaltijdsalade (bestaande uit 10% kippenblokjes, 55% groentenmix en 35% gekookte pasta) 390 ml kokend water toe te voegen en gedurende 1 minuut te roeren voor consumptie. De producent wil weten of deze hittebehandeling L. monocytogenes voldoende kan afdoden wanneer deze is uitgegroeid tijdens de bewaring van deze maaltijd(soep)salade. Om deze vraag te beantwoorden werden kooktesten uitgevoerd, simultaan met de challengetesten. Er werden 3 batchen voorzien die telkens 3 mix testunits bevatten waarvan enkel de eiwitcomponent geïnoculeerd werd met L. monocytogenes. Na inoculatie van de eiwitcomponent tot ongeveer 1.65 log kve/g werd de mix bewaard bij 4 C voor 4 dagen en 7 C voor de 2 laatste dagen. Na bewaring werd het kokend water toegevoegd en 1 minuut geroerd waarna een representatief staal genomen werd bij elk van deze 9 testunits die vervolgens microbiologisch geanalyseerd werden. Het tijdstemperatuursprofiel van batch 3 na het toevoegen van het kokend water wordt hieronder weergegeven. De gemiddelde temperatuur schommelt in de 3 testunits (2 herhalingen per testunit) tussen 50 C en 55 C. Het tijds-temperatuurprofiel werd enkel geregistreerd bij batch 3 (Figuur 18) Kooktest 1 Kooktest 2 Kooktest Tijd (seconden) Figuur 18 : Tijds-temperatuurprofiel kooktesten Op 1 minuut na het toevoegen van het kokend water werden representatieve staalnames genomen die verder microbiologisch geanalyseerd werden waarvan de resultaten in onderstaande tabellen terug te vinden zijn (Tabel 21). Ook de bijhorende temperaturen na 60 en 120 seconden en de bekomen equivalente F 70 C waarden bij Z-waarde = 7,5 C volgens Lahou et al.(2015) in kant-en-klare samengestelde maaltijden voor batch 3 zijn hierin weergegeven. 65

66 Log kve/g Batch 1 Batch 2 Batch 3 Tabel 21 : Resultaten kooktest met bijhorende temperaturen en equivalente F-waarden ALOA voor 23 ALOA na Detectie Temp soep 60 sec ( C) Temp soep 120 sec ( C) F 70 C waarde na 60 sec ( C) F 70 C waarde na 120 sec ( C) TU1 3,15 1,30 / / / / / TU2 3,06 1 / / / / / TU3 2,79 <1 POS / / / / TU1 2,32 1 / / / / / TU2 2,52 <1 POS / / / / TU3 1,90 <1 POS / / / / TU1 3,41 <1 POS 53,04 50,79 0,0047 0,0084 TU2 3,18 <1 POS 54,74 54,36 0,0051 0,0190 TU3 3,11 1,69 / 50,48 50,70 0,0018 0,0057 Uit de microbiologische resultaten volgt dat na het toevoegen van het kokend water en 1 minuut roeren L. monocytogenes nog steeds aanwezig is. Bij vier testunits op negen wordt nog een concentratie groter of gelijk aan 1 log kve/g vastgesteld. Dit was te verwachten baserend op het tijdstemperatuurprofiel van batch 3 aangezien slechts een maximale gemiddelde temperatuur van 55 C behaald wordt wat onvoldoende L. monocytogenes afdoodt. Ook de bijhorende equivalente F 70 C bedraagt slechts maximaal minuten wat verwaarloosbaar is met een 6-log reductie die enkel bekomen wordt bij een F 70 C waarde van 2 minuten. De reductie door toedoen van deze warmtebehandeling kan slechts bij benadering worden berekend op basis van het temperatuursverloop van batch 3. Theoretische benadering voor batch 3: De initiële concentratie van de gehele mix wordt theoretisch geschat a.d.h.v. de gewichtsverhouding (10%/55%/35%), het gewicht van de maaltijdsalade en de initiële startconcentratie van L. monocytogenes in elke component. Deze bedraagt voor de zetmeel- en groentencomponent minder dan 1 log kve/g. Hiervoor wordt er aangenomen dat er toch een minimale 1 kve/g aanwezig is en voor de eiwitcomponent 1.95 log kve/g (mediaan batch 3). ( kve/g * 30g + 1kve/g * 165g + 1kve/g * 105g)/300g = 9.8 kve/g = 0.98 log kve/g = Initiële concentratie L. monocytogenes op dag 0 Na 6 dagen bewaring groeit L. monocytogenes uit op de eiwitcomponent tot 3.18 log kve/g en tot 1.60 log kve/g op de groentencomponent. (mediaan batch 3). Er wordt L. monocytogenes gedetecteerd op de zetmeelcomponent maar steeds onder de 1 log kve/g zodat deze bijdrage ook tot 1 kve/g kan aangenomen worden. In deze theoretische benadering voor de eindconcentratie moet ook worden rekening gehouden met het volume toegevoegde kokend water (390ml) dat de concentratie L. monocytogenes zal reduceren. ( kve/g * 30g kve/g * 165g+1kve/g * 105g)/300g = 174 kve/g = 2.24 log kve/g = Eindconcentratie L. monocytogenes na 6 dagen bewaring voor toevoegen kokend water 23 Zelfde uitgroei na 6 dagen bij challengetesten 66

67 174 kve/g * 300g /690 g (ml) = 76kve/g = 1.88 log kve/g= Eindconcentratie na toevoeging kokend water zonder afdoding. L. monocytogenes is dus uitgegroeid van initieel ca log kve/g tot 2.24 log kve/g in batch 3. Na het toevoegen van het water wordt dit aantal gereduceerd naar 1.88 log kve/g. Uit de microbiologische analyseresultaten en de theoretische schatting blijkt dat L. monocytogenes na de realistische warmtebehandeling nog steeds aanwezig is waaruit kan geconcludeerd worden dat zelfs een 2 logreductie in dit geval niet bereikt wordt. Desondanks de lage beginbesmetting en het toevoegen van kokend water wordt L. monocytogenes niet helemaal afgedood waardoor deze verhittingsstap in geen geval als voldoende afdodingsstap kan beschouwd worden. 67

68 68

69 5. Discussie Uitgaande van de resultaten (microbiologische analyses van het gamma, transfertesten en challengetesten) werd de veiligheid en kwaliteit van het bestaande gamma maaltijdsalades beoordeeld. De invloed van bepaalde keuzes bij productformulering en bewaaromstandigheden op de microbiologische kwaliteit en veiligheid werd beoordeeld. Vooral de kans dat L. monocytogenes in deze kant-en-klare, gekoelde maaltijdsalades aanwezig is, zich verspreid over verschillende componenten van de maaltijdsalade en eventueel kan uitgroeien werd in detail bestudeerd Microbiologische kwaliteit van onderzochte maaltijden De algmene microbiologische kwaliteit van de maaltijden kan worden beoordeeld a.d.h.v. de bekomen microbiologische resultaten, in het bijzonder a.d.h.v. het TKG van de componenten. Het TKG wordt voorgesteld door HPA (2009) als een goede schattingsparameter voor de algemene kwaliteit van de component en heel de maaltijd in kwestie, en dit blijkt ook in deze thesis. Indien het TKG stijgt dan stijgen inderdaad ook het aantal MZB en gisten. Ook wanneer één component een hoog TKG heeft, dan zal de kans groter zijn dat de TKGen van de andere componenten ook groter zijn. M.a.w. als er één component van slechte kwaliteit aanwezig is dan zal de kans verhogen dat heel de maaltijd van mindere kwaliteit is. Zo waren ook de schimmeltellingen bij de verschillende componenten gecorreleerd met elkaar. Een mogelijke verklaring voor deze correlaties houdt in dat de producent dezelfde kwaliteitseisen stelt voor elke component zodat bij aankoop van kwaliteitsvolle groenten, systematisch ook dezelfde hoge eisen worden gesteld voor de andere componenten waaruit de maaltijd bestaat. Een andere invalshoek steunt op interactie tussen de verschillende componenten waarbij één component van mindere kwaliteit de andere componenten besmet zodat deze ook hogere kiemgetallen bezitten. Een laatste denkpiste kan van slechte bewaaromstandigheden, zoals temperatuursmisbruik, of een defecte verpakking uitgaan zodat alle componenten snel in kwaliteit achteruitgaan en het mogelijks verschil in beginkwaliteit van de componenten laat verdwijnen. Aangezien slechts enkele verpakkingen defecten vertoonden en geen temperatuursmisbruiken werden vastgesteld, (zie verder E. coli en B. cereus), bij aankoop zal deze laatste verklaring slechts een minimale bijdrage leveren aan deze verbanden. Kruiscontaminatie zou inderdaad bevoordeeld worden wanneer de componenten gemengd liggen wat bewezen is bij de zetmeelcomponent zodat dit fenomeen hoogst waarschijnlijk de grootste invloed zal hebben op deze verbanden. Interactie tussen de componenten zal dus een grote invloed hebben in de houdbaarheidsperiode op de kwaliteit. Dertien van de 51 maaltijdsalades werden onaantrekkelijk ervaren op basis van visuele kenmerken. Ook kan de algemene kwaliteit van de maaltijdsalades als ondermaats beschouwd worden aangezien 28 van de 51 mix stalen de richtwaarde, 6.48 log kve/g, voor het TKG overschrijden. Vaak wordt 6 log kve/g als limietwaarde genomen voor TKG naar aanvaardbaarheid van microbiologische kwaliteit (en dus indicator van bederf) op einde houdbaarheid. Echter binnen de microbiologische richtwaarden van het LFMFP-UGent wordt gesteld dat wanneer het TKG op het einde van de houdbaarheid de richtwaarde van 6 log kve/g overschrijdt enkel kan afgekeurd worden wanneer aangetoond is dat het om andere bacteriën dan melkzuurbacteriën gaat en/of sensorische afwijkingen worden waargenomen. Als er wordt gekeken naar de componenten, laat vooral de microbiologische kwaliteit van de eiwitcomponent het afweten. Misschien zijn deze richtwaardes log kve/g wel iets te streng 69

70 aangezien slechts tien van deze 28 maaltijdsalades als niet aantrekkelijk werd beschouwd. De overige drie niet aantrekkelijke maaltijdsalades voldeden wel aan de TKG-richtwaarde van 6.48 log kve/g. Figuur 19 : Overzicht van de maaltijdsalades waarvan het mix-staal niet voldoet aan de TKG-richtwaarde Caponigro et al. (2010) stelde ook al vast dat er een link bestond tussen de visuele scores van de groenten en het TKG, dus ook de kwaliteit, van de groenten. Toch wordt de kwaliteit van groenten beter beoordeeld a.d.h.v. de visuele score omdat de groenten vaak van nature uit een hoog TKG bezitten waardoor deze parameter een minder goede indicator is voor de kwaliteit (Consumentenbond NL, 2014). Maar toch desondanks deze hoge initiële besmettingsgraad van de groenten, werd er toch een link gelegd met de resterende houdbaarheidstermijn wat minder het geval was bij de eiwitcomponent en helemaal niet het geval was bij de zetmeelcomponent. De groenten/fruit component is de meest besmette component (mediaan TKG =6.60 log kve/g), nauw gevolgd door de eiwitcomponent (mediaan TKG =6.28 log kve/g). Dit komt overeen met de resultaten van Abidias et al. (2010) en Caponigro et al. (2008) die een range waarnamen van 4 log kve/g tot 8 log kve/g voor verwerkte groenten. Kotzekidou et al. (2013) rapporteerde gelijkaardige resultaten voor kant-en-klare sandwiches. In een andere studie naar kant-en-klare levensmiddelen wordt het TKG van de eiwitcomponent licht hoger bevonden dan deze van de groentencomponent (Christison et al., 2008) Op de zetmeelcomponent daarentegen is initieel de nevenflora beperkt door het ondergane kookproces. Ook de challengetesten geven aan dat de zetmeelcomponent initieel de minst besmette component is (mediaan TKG = 3.06 log kve/g). Maar door de vele nevenflora aanwezig op de andere componenten en de interactie die plaats vindt tussen de componenten, ligt de mediaan TKG (5.20 log kve/g) van de zetmeelcomponent toch niet zoveel lager. Dit wordt gestaafd door wanneer de componenten apart liggen, het TKG van de zetmeelcomponent lager ligt en vice versa. Nog wordt dit sterker bevestigd doordat de kwaliteit van de zetmeelcomponent grotendeels beïnvloed wordt door de kwaliteit van de groenten- en eiwitcomponent. E. coli werd ook in 4% van de onderzochte maaltijdsalades aangetroffen. Twee maal in een groentencomponent en één maal in de zetmeelcomponent van een maaltijdsalade waarin ook al een groentencomponent E. coli bevatte. Oliveira et al. (2011) en Abadias et al. (2008) namen duidelijk hogere prevalenties waar in licht verwerkte groenten respectievelijk 53.1% en 11.4%. In vergelijking met voorgaande studies, zijn de onderzochte maaltijden in deze thesis onder goede hygiëneomstandigheden gemaakt. Naast E. coli wordt B. cereus ook aanzien als een indicatororganisme, in het bijzonder voor goede algemene hygiëne, procesbeheersing en temperatuursmisbruik (LFMFP, 2010). B. cereus werd in 4% van de onderzochte zetmeelcomponenten aangetroffen boven de tellimiet die voor B. cereus 2 log 70

71 kve/g bedroeg. Dit is vergelijkbaar met het resultaat van de studie van Kotzekidou et al. (2013) in kanten-klare sandwiches en lager dan de studie van Samapundo et al. (2011) in gekookte pasta in België. De minieme aanwezigheid van B. cereus in de onderzochte maaltijdsalades bevestigen nogmaals de goede hygiëneomstandigheden waarin deze maaltijdsalades geproduceerd werden. Bovendien werden de maaltijdsalades bij een correcte temperatuur van 4 C of 7 C bewaard aangezien B. cereus en E. coli niet uitgegroeid zijn tot hogere aantallen. De koude keten werd steeds gewaarborgd. Bij de bewaring van kant-en-klare, gekoelde, samengestelde maatijdsalades zijn vele factoren betrokken. Volgens Devlieghere et al (2011) en Uyttendaele et al. (2004) zijn ph, a w, compositie van het levensmiddel, toevoegingen, natuurlijke antimicrobiële componenten, biologische structuren, temperatuur, gassamenstelling en de nevenflora de belangrijkste bepalende bewaringsfactoren. Toch belangrijk, indien wordt vertrokken van een product met een slechte kwaliteit dan zal dit tijdens de bewaring niet verbeteren en de houdbaarheid van het product sowieso beperkt zijn. Starten met verse en kwaliteitsvolle ingrediënten is een must voor een goede kwaliteit bij de klant (Ragaert et al., 2014). Tijdens deze thesis zijn ph, temperatuur, a w, gassamenstelling en de nevenflora uitvoerig onderzocht. Van de maaltijdsalades die map-verpakt waren, werd 70% aangeraden bij maximaal 7 C te bewaren. Bij maaltijden die niet map-verpakt waren, werd zelfs 85% aangeraden bij maximaal 4 C te bewaren Toepassing van beide strengste bewaaromstandigheden, map-verpakking en bewaring bij 4 C, komt helaas niet vaak voor, wat toch aan te raden is voor een langere houdbaarheid. Wat vast staat is dat de koude keten ten allen tijde moet gewaarborgd worden zoals reeds aangehaald in de literatuurstudie. Bij de consumenten thuis valt opvallend meer temperatuurmisbruik voor. Uit onderzoek naar de bewaringstemperatuur van gekoelde levensmiddelen bij de consument thuis in Zweden blijkt bijvoorbeeld dat de gemiddelde temperatuur 6.2 C bedraagt voor gemalen vlees (max 11.3 C) en 7.4 C voor kant-en-klare salade (max 18.2 C) (Marklinder et al., 2004). Gelijkaardige resultaten worden bekomen in de Belgische voedselconsumptiepeiling waar een vierde van de ondervraagden aangeeft dat de maximale koelkasttemperatuur 5 C bedraagt. De gemiddelde bewaringstemperatuur bedraagt 7 C. Zorgwekkend is wel dat ook een vierde van de ondervraagden aangeeft dat 9 C niet gehaald wordt tijdens het koelen wat uitgroei mogelijk maakt (Devriese et al., 2004). Deze temperatuurmisbruiken houden meer risico in naarmate een levensmiddel langer bewaard kan worden wat dus toch van iets minder belang is bij de relatief korte houdbaarheid van maaltijdsalades. De temperatuur en map-verpakking hebben duidelijk een grote invloed op de kwaliteit van de maaltijdsalades (Sandhya et al., 2009 ; NZFSA, 2005). Enkel op de zetmeelcomponent, die deel uitmaakt van een maaltijdsalade, blijken deze twee geen significante invloed te hebben. Waarschijnlijk omdat de meer besmette eiwit- en groentencomponent relatief gezien de zetmeelcomponent in veel grotere mate beïnvloeden dan deze twee bewaarparameters. De ph tijdens 6 dagen bewaring neemt licht af bij alle componenten maar zal geen nefaste gevolgen hebben voor de aanwezige flora. Op basis van bepaalde literatuur zou kunnen verwacht worden dat L. monocytogenes, indien aanwezig, in competitie moet treden met de aanwezige nevenflora en hierdoor zou kunnen geremd worden in de groei, (Lardeux et al., 2015) maar dit kan niet eenduidig bewezen worden in deze thesis Microbiologische veiligheid van maaltijdsalades Uit de microbiologische analyses van het gamma is gebleken dat alle 51 onderzochte maaltijden voldeden aan de wettelijke criteria inzake Salmonella en L. monocytogenes. Salmonella was steeds 71

72 afwezig in 25g staalname. De totale afwezigheid van Salmonella spp. in de onderzochte maaltijdsalades (0/51 of 0.07%) is een zeer lage prevalentie in vergelijking met eerdere studies zoals Bruno et al. (2005) die een aanwezigheid noteerde in 46.7% van de stalen verwerkte groenten. Ook Oliveira et al (2011) detecteerde 1.2% van de stalen Salmonella spp. Caponigro et al. (2010) daarentegen onderzocht 1158 stalen salade waarvan geen enkele Salmonella spp. bevatte wat overeenkomt met de resultaten van de kleine steekproef in deze thesis. Ook Kotzekidou et al. (2013) kwam tot hetzelfde resultaat bij een onderzoek naar kant-en-klare sandwiches. L. monocytogenes daarentegen was wel in 8 van de 51 maaltijdsalades aanwezig maar steeds minder dan 2 log kve/g zodat alle onderzochte maaltijden voldeden aan de het Europese criterium van minder dan 2 log kve/g op het moment van consumptie. Eigenlijk was deze vaststelling van L. monocytogenes minder dan 2 log kve/g op moment van analyse die gebeurde dezelfde dag of dag na aankoop van de maaltijdsalade in de winkel, maar hierbij werd verondersteld dat consumptie ook dan zou plaatsvinden door een effectieve consument wat bevestigd wordt door het feit dat bij aankoop van de maaltijdsalades in de supermarkten gezien werd dat heel veel personen toen ook deze maaltijdsalades kwamen kopen als optie voor lunch die dag (in plaats van belegd broodje). Deze prevalentie van 16% voor L. monocytogenes ligt in dezelfde lijn dan in de gelijkaardige studie van Gurler et al. (2015) waar eveneens Caesar maaltijdsalades en tonijn maaltijdsalades werden onderzocht met respectievelijk 13% en 7% aanwezigheid van L. monocytogenes. In voorgaande studie werd ook opgemerkt dat kanten-klare gevogelte producten, zoals in de Caesar salade die verwerkte kip-producten bevat, de hoogste aanwezigheid van L. monocytogenes vertoonde van de onderzochte producten. Dit is mogelijks door toedoen van kruiscontaminatie tijdens het versnijden en verwerken van deze gevogelteproducten. Ook Meyer et al. (2012) en Lambertz et al.(2012) rapporteerden dat L. monocytogenes regelmatig aangetroffen wordt in gevogelteproducten. Visserijproducten zoals gerookte zalm werden ook al meermaals in verband gebracht met aanwezigheid van L. monocytogenes. (Uyttendaele et al., 2009 ; Garrido et al., 2009 ; Vitas et al., 2004). Voorgaande studies onderzochten vaak 1 type eiwitcomponent, maar duidelijk wordt dat L. monocytogenes op veel eiwitcomponenten kan voorkomen en uitgroeien. Zo werd ook in deze thesis geen enkel significant verband gelegd met de aanwezigheid van L. monocytogenes en één specifieke eiwitcomponent. Wel steeg de kans op aanwezigheid van L. monocytogenes aanzienlijk indien deze maaltijdsalade een zetmeelcomponent bevatte die vermengd was met een dressing. Zeven van de acht positieve maaltijdsalades, uit de steekproef van 51, bevatte een zetmeelcomponent gemengd met dressing. Ook wanneer de saus niet apart verpakt was, werd de kans op aanwezigheid van L. monocytogenes verhoogd. De beste manier om uitgroei van L. monocytogenes te vermijden is het streven naar afwezigheid van L. monocytogenes in het product. Dit is in het geval van maaltijdsalades niet zo evident, gezien maaltijdsalades een kant en klaar product is en er dus niet echt een verhitting of een andere bewerkingsstap aanwezig is om relevante micro-organismen te elimineren of tot een aanvaardbaar niveau te brengen. Wel kan gestreefd worden om deelcomponenten te gebruiken die vrij zijn van L. monocytogenes. Bij verhitte componenten (zoals gekookt ei, gekookte zalm of kip) moet dit kunnen, op voorwaarde dat ook nabesmetting wordt gecontroleerd. Daarom is het belangrijk te werken in een Listeria vrije omgeving m.b.v. preventie en hygiënemaatregelen. Dit geldt voor alle componenten (en dus ook voor elke toeleverancier) want als in één component L. monocytogenes aanwezig is dan kan deze door in nauw contact te liggen met de andere componenten overgaan op deze componenten. Dit 72

73 kan mogelijk problemen opleveren omdat L. monocytogenes beter lijkt te groeien op de zetmeelcomponent dan op de groentencomponent zoals aangetoond in de challengetesten. Een sterke indicator dat er inderdaad transfer optreedt tussen de componenten is geleverd in de voorgaande prevalentiescreening. Er was duidelijk interactie tussen de componenten van eenzelfde maaltijdsalade omdat de kwaliteit van één component vaak de kwaliteit van de andere componenten beïnvloedde. De grootte van deze transfer werd verder onderzocht tijdens de transfertesten, nu met behulp van de pathogene kiem L. monocytogenes Transfertesten Uit de resultaten van de transfertest wordt afgeleid dat er inderdaad transfer optreedt van L. monocytogenes tussen de componenten die met elkaar in contact lagen. Opvallend is wel dat er beduidend meer transfer optrad wanneer de kip de geïnoculeerde component was en niet de sla (± % tegenover ± %). Dit kan te verklaren zijn doordat de kippenblokjes een kleinere oppervlakte hebben dan de sla voor hetzelfde gewicht. Aangezien de kip en sla telkens een gelijke beginconcentratie hadden van 3.7 log kve/g, hadden de kippenblokjes een grotere oppervlakteconcentratie waardoor er een grotere en snellere transfer plaats vond, desondanks de grotere nevenflora op de rauwe sla. Deze piste kan mogelijks de significante verschillen tussen de transfertesten verklaren al wordt dit niet bevestigd door eerdere transferstudies. Escudero et al. (2012) onderzocht de virustransfer van inox en keramische oppervlakken (versnijmachine of werkblad) naar sla en versneden kalkoenbeleg. Er werd een transfer van 0%-26% naar de sla vastgesteld wat overeenkomt met de transfer efficiëntie in deze thesis die 2,60% % bedroeg. De transfer naar het kalkoenbeleg 55% - 95% lag wel een stuk hoger. Ook Stals et al. (2013) onderzocht deze virustranfser en stelde significante transferverschillen vast die te wijten waren aan het acceptoroppervlak bij murine norovirus. Bij norovirus werden geen transferverschillen opgemerkt ongeacht het donoroppervlak en acceptoroppervlak. Hier bedroegen de transferefficiënties 5-115% wat een zeer brede range is door de vele parameters zoals soort virus, contacttijd, donoracceptoroppervlak Naast deze werden ook transfertesten uitgevoerd met L. monocytogenes (Vorst et al., 2006), maar ook steeds tussen non-food en food materialen wat toch nog steeds andere resultaten zal geven dan tussen twee food producten Challengetesten Er is nu aangetoond dat er inderdaad transfer optreedt tussen de verschillende componenten. Deze transfer is enkel belangrijk wanneer ook aangetoond kan worden dat L. monocytogenes op deze componenten kan uitgroeien wat onderzocht en ook bewezen werd in de challengetesten. Een producent moet inzake voedselveiligheid rond L. monocytogenes steeds aan de wetgeving voldoen. Luber et al. (2011) formuleerde de belangrijkste aanbevelingen om L. monocytogenes zo goed mogelijk te controleren tijdens de bewaring van gekoelde, kant-en-klare voedingswaren waartoe ook de onderzochte maaltijdsalades behoren. Ook werd het belangrijk geacht te weten als producent of je product groei toelaat van L. monocytogenes. Inzicht in het groeipotentieel kan verkregen worden door middel van challengetesten en zo na te gaan of L. monocytogenes niet substantieel kan uitgroeien op het product tijdens de houdbaarheidsperiode waardoor 2 log kve/g op de uiterste houdbaarheidsdatum en moment van consumptie niet wordt overschreden. Dit is ook belangrijk voor een juiste toepassing van de wetgeving.(nørrung et al,2000) 73

74 De ph en a w zijn geen limiterende factoren voor de groei van L. monocytogenes in deze challengetesten. De groei zal voornamelijk worden vertraagd door de lage temperaturen die de lagfase verlengen (Beumer et al., 1996 ; Skalina et al., 2010). Het is duidelijk dat alle componenten apart de groei van L. monocytogenes ondersteunen omdat het groeipotentieel telkens groter is dan 0.5 log log kve/g. Zelfs na 4 dagen bij 4 C kan al een groeipotentieel van meer dan 0.5 log kve/g worden opgetekend. In de hierop volgende 2 dagen bewaring bij 7 C groeit L. monocytogenes nog verder uit. Gelijkaardige resultaten worden bekomen bij onderzoek naar andere kant-en-klare levensmiddelen (Midelet-Bourdin et al., 2010 ; Skalina et al., 2010). L. monocytogenes groeide tijdens de 6 dagen bewaring uit van de startconcentratie 1.7 log kve/g tot ongeveer 3.10 log kve /g bij de geïnoculeerde groenten. De eindconcentraties bij de geïnoculeerde kip en pasta, respectievelijk ongeveer 3.50 log kve/g en 4.00 log kve/g, is aanzienlijk hoger. Dit is hoogstwaarschijnlijk te verklaren doordat zowel de kip als de pasta gebakken/gekookt zijn geweest voordat ze geïnoculeerd werden waardoor er weinig nevenflora aanwezig was bij de inoculatie. De rauwe groenten hebben geen kiemafdodende stap ondergaan waardoor L. monocytogenes moet concurreren met nevenflora (Gnanou Besse et al., 2006). Eerst met de Enterobacteriaceae, die door de lage temperatuur meestal niet zo snel kunnen uitgroeien (Skalina et al., 2010), en vervolgens met MZB (Beumer et al., 1996) waarvan sommige stammen ook koude-geadapteerd zijn en ook wel relatief snel kunnen uitgroeien. De resultaten bekomen in deze challengetesten vertoonden wel een grote inter-batch variabiliteit wat overeenkomt met de studie van Vermeulen et al. (2011) waar aangeraden wordt om zeker drie verschillende batchen te testen. De 3 replica testen binnen 1 batch uitvoeren lijkt minder belangrijk omdat de intra-batch variabiliteit vaak minder groot is. De grote aantallen MZB op dag 4-6 bij elke component vertragen waarschijnlijk de groei van L. monocytogenes maar inhiberen deze niet zoals ook meermaals werd vastgesteld in andere onderzoeken (Beumer et al., 1996 ; Dalgaard et al., 2004 ; Vermeulen et al., 2011). Zoals eerder gezegd heeft L. monocytogenes groeipotentieel op gekookte pasta. Toch groeide deze niet uit in de maaltijdsalades waar deze pathogeen in aanwezig was. Dit werd in zeven van de acht positieve maaltijdsalades waarschijnlijk belet doordat de zetmeelcomponent gemengd werd met een dressing met een lage ph (< 4-5) waardoor de aanwezigheid van L. monocytogenes dus geen probleem vormde. De inhiberende werking van deze lage ph werd ook aangetoond in de studie van Hwang et al. (2014) en Alali et al. (2012). Ook werd steeds een challengetest uitgevoerd waarbij enkel de eiwitcomponent geïnoculeerd werd en de andere componenten niet, de zogenaamde mix. Na 6 dagen werd in 2 batchen van deze mix in de pasta L. monocytogenes gedetecteerd, steeds < 10 kve/g. Mogelijks omdat tijdens de staalname de pasta in contact gekomen is met kleine achtergebleven stukjes besmette kip of groenten en niet door groei/spreiding/woekering van L. monocytogenes. Op de niet-geïnoculeerde groenten daarentegen konden wel tellingen worden uitgevoerd op dag 4 en 6. Dit bevestigd nogmaals de resultaten van de transfertest dat er inderdaad transfer optreedt zelfs bij lagere inoculatie van de besmette component. De geïnoculeerde kippenblokjes bereikten qua L. monocytogenes contaminatie een 3 log kve/g concentratie. Zoals hier ook weer het geval zijn vergelijkbare studies met meerdere componenten nodig om deze resultaten te bevestigen. Uitgroei is dus mogelijk op alle drie de componenten waardoor een TGT-datum toch aan te raden is. Slechts één producent, 5 maaltijdsalades uit de prevalentiescreeningen, heeft er toch voor gekozen om een THT-datum te verkiezen en dus de consument na deze houdbaarheidsperiode zelf te laten beslissen of een maaltijd al dan niet eetbaar is, vooral dan op basis van sensorische kwaliteit (geen 74

75 visuele, geur- of smaakafwijking) echter de sensorische kwaliteit zegt niets over de microbiologische veiligheid met betrekking tot L. monocytogenes gezien hogere aantallen L. monocytogenes niet noodzakelijk gepaard gaan met afwijkende sensorische kwaliteit. Het gebruik van een THT datum brengt dus onnodige risico s met zich mee. Natuurlijk kan het risico ook beperkt worden door aan de maaltijdsalades een maximale houdbaarheidsperiode te geven van 5 à 6 dagen zoals in de praktijk al wordt toegepast. De controle op uitgroei kan ook bekomen worden door aanpassing van de bewaringsparameters. Zo moet de koude keten (bij voorkeur < 5 C) ten allen tijde gewaarborgd worden, zowel voor de kwaliteit als de veiligheid (Ceuppens et al., 2015). Indien de producent weet dat er toch L. monocytogenes aanwezig is in zijn maaltijdsalade, moet deze de groei van L. monocytogenes op een andere manier controleren door bij voorkeur de componenten te mengen met een dressing zodat de ph verlaagd wordt wat het geval was bij zeven maaltijdsalades waarbij L. monocytogenes gedetecteerd werd. Uit de resultaten van de kooktest blijkt dat het toevoegen van 390 ml kokend water (100 C) aan 300 g geïnoculeerde maaltijdsalade met kiemgetal 2.24 log kve/g bij 7 C en roeren gedurende 1 minuut voor staalname, niet voldoende blijkt voor totale afdoding van L. monocytogenes in de resulterende portie maaltijdsoep. Uit het temperatuursverloop tijdens de bereiding van de maaltijdsoep wordt afgeleid dat er slechts een maximale temperatuur van 55 C behaald wordt. Deze 55 C gedurende 1 minuut zal een zeer lage afdoding hebben aangezien bij vele producten 1 log reductie pas wordt waargenomen voor L. monocytogenes bij 57 C gedurende minuten (Felicio et al., 2011). Ook voor de Z-waarde worden in de literatuur zeer grote verschillen aangetroffen voor L. monocytogenes. Lado et al. concludeerde uit vele studies dat de gemiddelde Z-waarde 7.6 C bedraagt, maar Doyle et al. stellen toch 7.1 C voorop met een range van 4.3 C 29.3 C. De grote range in hitteresistentie is vooral te wijten aan de diversiteit van de verschillende L. monocytogenes stammen, maar ook aan physiologische toestand van de cultuur, de voorafgaandelijke groeicondities, producteigenschappen zoals wateractiviteit en ph enz. (Doyle et al., 2001) De tijds-temperatuurgrens waarbij L. monocytogenes helemaal is afgedood is dus niet eenduidig te bepalen. Maar met zekerheid kan gezegd worden dat door de lage bereikte temperaturen in de kooktest, deze pathogeen maximaal 1 à 2 log reductie zal ondergaan wat dus onvoldoende is. Bijgevolg blijkt ook de maaltijd(soep) dus te beschouwen als een RTE of kant en klaar product aangezien de verhittingsstap verhitting er niet in zal slagen om L. monocytogenes te elimineren, of indien voorafgaandelijk aanzienlijke uitgroei heeft plaatsgevonden ook mogelijk tijdens gekoelde bewaring te reduceren tot een aanvaardbaar niveau (nl. < 100 kve/g op moment van consumptie). 75

76 76

77 6. Conclusie De resultaten van de prevalentiescreening geven aan dat kant-en-klare, samengestelde en gekoelde maaltijdsalades in verschillende Belgische supermarkten voldoen aan alle microbiologische veiligheidscriteria inzake Salmonella spp. en L. monocytogenes. L. monocytogenes werd wel in 8 van de 51 maaltijdsalades aangetroffen, maar steeds onder de wettelijke limiet van 2 log kve/g. De aanwezigheid van L. monocytogenes werd enkel in verband gebracht met de aanwezigheid van een dressing/saus die vermengd was met de zetmeelcomponent of alle componenten. Deze dressing zorgde evenwel voor een lage ph die uitgroei kon vermijden. Er werden ook slechts in 4% van de maaltijden de indicatororganismen E. coli en B. cereus geteld, steeds < 2.1 log kve/g. Dit wijst op goede hygiënepraktijken, procesbeheersing en goede controle van de koude keten waardoor L. monocytogenes blijkbaar ook niet substantieel kon uitgroeien in de aangekochte maaltijdsalades. Er werd verder geen verband gevonden tussen de voedselveiligheid en de kwaliteit van de maaltijdsalades die bij 28 van de onderzochtte maaltijdsalades de richtwaarde van 6.48 log kve/g overschreed. A.d.h.v. deze richtwaarde kan de algemene kwaliteit van de onderzochte maaltijdsalades als ondermaats beschouwd worden. Desondanks dit hoge aantal overschrijdingen werden hiervan slechts tien maaltijden onaantrekkelijk beschouwd op basis van visuele kenmerken. Dit wijst mogelijks op de iets te strenge richtwaarden zeker op het einde van de houdbaarheidsperiode die in de praktijk 5 à 6 dagen bedraagt in de supermarkt. Voor deze houdbaarheidstermijn wordt een TGT-datum aangeraden omdat elke component groei toelaat van L. monocytogenes zoals bewezen in de challengetesten. De zetmeelcomponent, in dit geval gekookte pasta, ondersteunde de groei van L. monocytogenes het meest. Waarschijnlijk omdat de gekookte pasta een ideale voedingsbodem is met weinig nevenflora die echter wel meer aanwezig is op de eiwit- en groentencomponent. Deze laatste bleek de meest besmette component te zijn met een gemiddelde van 6.80 log kve/g en een grote invloed te hebben op de kwaliteit van de andere componenten in eenzelfde maaltijdsalade. Zo gaven de resultaten aan dat de kwaliteit/tkg van één component, een goede indicator was voor de kwaliteit/tkg van de hele maaltijd. Het voorgaande en de significante invloed van de aparte ligging van de componenten op de kwaliteit van de zetmeelcomponent, bewijzen dat er interactie is tussen de componenten onderling. Dit heeft consequenties voor de producenten die genoodzaakt zijn om van alle startcomponenten een standaard kwaliteit te eisen zodat de gehele maaltijdsalade ook kwaliteitsvol kan zijn. Deze interactie is ook bewezen in de tranfsertesten voor L. monocytogenes. Waarbij transferpercentages werden bekomen van 2-15% bij een startinoculatie van 3.7 log kve/g. Deze transfertesten tonen aan dat L. monocytogenes mogelijks kan uitgroeien op een andere component dan waar L. monocytogenes oorspronkelijk op aanwezig was. Dit houdt risico in voor kanten-klare, gekoelde en samengestelde maaltijdsalades waarin deze drie componenten aanwezig zijn. Echter is het risico beperkt door de relatief korte houdbaarheid van de onderzochte maaltijdsalades, maar dit kan wel problemen met zich meebrengen voor langere houdbare kant-en-klare, samengestelde en gekoelde levensmiddelen. Zoals reeds aangetoond in literatuur wordt in deze thesis nogmaals bewezen dat het respecteren van de koude keten noodzakelijk is voor het zou goed en lang mogelijk borgen van de kwaliteit van de maaltijdsalades en om uitgroei van L. monocytogenes te voorkomen. Ook map-verpakking bleek een grote positieve invloed te hebben op de verlenging van de houdbaarheid. 77

78 78

79 7. Aanbevelingen voor verder onderzoek Uit de 51 onderzochte maaltijden kon al veel worden afgeleid maar toch zijn in de toekomst grotere steekproeven aangeraden om statistisch gezien meer significante verschillen aan te tonen. Nu waren enkele p-waarden net niet significant die waarschijnlijk te wijten waren aan de grootte van de steekproef. Bij een aparte ligging van de componenten, de maaltijdsalade minder kans heeft op aanwezigheid van L. monocytogenes) Bij verhoging van de zuurtegraad van de zetmeelcomponent, de maaltijdsalade meer kans heeft op aanwezigheid van L. monocytogenes. (wel boven de ph-grens waarbij L. monocytogenes niet meer kan overleven) Bij een aparte ligging van de componenten, verlaagt het TKG van de eiwitcomponent De interactie tussen de kwaliteit van de componenten is duidelijk naar voor gekomen maar hier werd nog maar weinig aandacht aan besteed in de bestaande literatuur. De aparte ligging van de componenten heeft duidelijk invloed op de kwaliteit van de maaltijdsalades. Maar hier is nog nauwelijks onderzoek naar gedaan. Op het vlak van voedselveiligheid is L. monocytogenes overduidelijk de pathogeen met het meeste risico in deze kant-en-klare, samengestelde en gekoelde maaltijdsalades. De beperkte houdbaarheidsperiode van de onderzochte maaltijdsalades verkleinde dit risico aanzienlijk bij optimale bewaaromstandigheden. Maar L. monocytogenes kan mogelijks wel meer problemen opleveren bij kant-en-klare, samengestelde en gekoelde voedingsproducten die langer houdbaar zijn zoals wraps, sandwiches en sushi. Ook zal de interactie tussen de componenten zoals aangetoond in de transfertesten een belangrijke parameter zijn om mee rekening te houden. 8. Bijlagen 79

80 Tabel 22 : Overzicht van prevalentiescreeningen i.v.m. RTE-foods Jaar Land Auteurs RTE-Producten (tenzij RTC) Pos/Tot (>Limiet) Gezocht op Opmerkingen 1999 België Uyttendaele Rauwe gerijpte Vleesproducten 113/824 L. monocytogenes Meestal >10kve/g Gekookte vleesproducten 167/3405 L. monocytogenes Na snijden (6,65%) >voor (1,56%) Mayonaise gebaseerde salades 186/874 L. monocytogenes Kruiscontaminatie + hoge ph Bereidde maaltijden 92/786 L. monocytogenes Vooral vegetarische maaltijden 2000 Japan Inoue RTC Vleesproducten 33/128 L. monocytogenes RTC duidelijk meer besmet. Gerookte zalm en rte seafood 12/305 L. monocytogenes Groenten 0/285 L. monocytogenes 2013 Spanje Gonzalez Gerookte zalm 6/125 L. monocytogenes Jonge alen 0/65 L. monocytogenes Surimi 0/60 L. monocytogenes 2010 Italië Caponigro Salade 0/1158 Salmonella Salade 0/1158 L. monocytogenes Salade 27% E. coli 2012 Canada Kovacevic Visproducten 8/40 L. monocytogenes Deli-meats 0/40 L. monocytogenes 2012 Duitsland Meyer Frankfurter (kip) 5/114 (2) L. monocytogenes Op einde houdbaarheid! Verhitte kippenborst 1/57 L. monocytogenes Op TGT Kookworsten (kip) 4/11 L. monocytogenes Tussen kve/g-Op TGT 2004 Spanje Vitas Producten gekookt 35/396 L. monocytogenes Producten gefermenteerd 23/345 L. monocytogenes Gerookte zalm gesneden 28/100 L. monocytogenes Zachte kazen 1/99 L. monocytogenes 2013 Kroatië Kovacevic Groenten, salades 1/100 L. monocytogenes < 100 kve/g 2012 Zweden Lambertz Zachte en half harde kazen 2/525(1) L. monocytogenes Op einde houdbaarheid! Gekookte vleesproducten 6/507 L. monocytogenes Op einde houdbaarheid! Gerookte zalm 67/558(1) L. monocytogenes Op einde houdbaarheid! 2009 Spanje Garrido Vacuüm Gerookte vis 33/142 L. monocytogenes Vacuüm deli meats 20/220 L. monocytogenes Vacuüm heeft toch invloed Opened deli meats 37/200 L. monocytogenes 2013 Iran Akya Ongekookte worsten 2/58 L. monocytogenes Vlees-producten meer besmet RTE-levensmiddelen( ook maaltijdsalades) 0/103 L. monocytogenes 2009 België Uyttendaele Mayonaise-gebaseerde deli-salades 80/1187 L. monocytogenes Veel visserij producten als pos 80

81 Gekookte vleesproducten (geen paté) 7/287 L. monocytogenes Gerookte vis 25/90 (4) L. monocytogenes 2013 Griekenland Kotzekidou Kant-en-klare sandwiches met allerhande beleg. 5/65 L. monocytogenes Betere hygiëne! Kant-en-klare sandwiches met allerhande beleg. 11/63 Salmonella spp. Kant-en-klare sandwiches met allerhande beleg. 3/48 Bacillus cereus Kant-en-klare sandwiches met allerhande beleg. 4/47 E. coli Kant-en-klare sandwiches met allerhande beleg. 11/100 S. aureus 2008 Spanje Abidias Gesneden groenten 0/236 L. monocytogenes Gesneden groenten 2/236 Salmonella spp. Gesneden groenten 27/236 E. coli Gesneden groenten 0/236 Y. enterocolitica,c. jejuni Gesneden fruit 0/21 Op alle voorgaande 2004 Ierland Whyte Groenten 0/46 Campylobacter jejuni Sandwiches 0/20 Campylobacter jejuni 2015 Spanje Doménech Gepasteuriseerde kaas 14/624 L. monocytogenes Gepasteuriseerde kaas 0/289 Salmonella spp. Gekookte ham 8/487 L. monocytogenes Gekookte ham 0/316 Salmonella spp. Gerookte zalm 69/803 L. monocytogenes Gerookte zalm 0/205 Salmonella spp Brazil Oliveira RTE-bladgroenten 86/162 E. coli Hygiëne problemen. RTE-bladgroenten 6/162 L. monocytogenes RTE-bladgroenten 2/162 Salmonella spp Estland Kramarenko RTE-meat, salads, fish, egg 0/7000 Salmonella spp. RTE-mayonaise gebaseerde salades 2/221 Salmonella spp Griekenland Xanthoupoulos Salade Zeer laag Listeria monocytogenes 2011 België Samapundo Gekookte pasta 16/80 Bacillus cereus spp Griekenland Sergelidis RTE-salads 27/80 S. aureus 2012 Iran Zarei RTE-zeeproducten 0/55 L. monocytogenes RTE-zeeproducten 0/55 V. parahaemolyticus RTE-zeeproducten 8/55 S. aureus Kruiscontaminatie RTE-zeeproducten 1/55 Salmonella spp. 81

82 Figuur 20 : Beslissingsboom bij keuze voor THT of THT 82

83 Tabel 23 : Microbiologische criteria en richtwaarden bij het beoordelen van de kwaliteit van de 51 onderzochte maaltijdsalades Kaas Doel Tolerantie TGT-THT TKG 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+06 Cat. 1F MZB 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+07 Cat. 1F Gisten 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+05 Cat. 1H Schimmels 1,00E+02 1,00E+03 geen visuele schimmelgroei Cat. 1H Enterobacteriaceae 5,00E+01 5,00E+02 n.v.t. Cat. 1F E. coli 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+03 Cat. 1H en Cat. 1I Eiwit component Ei Verhit Vlees Verhitte visserijproducten Gerookte vis (Aw > 0,94) TKG 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+06 Cat. 7E MZB 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+07 Cat. 7E Gisten 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+05 Cat. 7E Schimmels 1,00E+02 1,00E+03 geen visuele schimmelgroei Cat. 7E Enterobacteriaceae 5,00E+01 5,00E+02 n.v.t Cat. 7E E. coli <10 5,00E+01 5,00E+01 Cat. 7E TKG 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+06 Cat. 3G MZB 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+07 Cat. 3G Gisten 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+05 Cat. 3G Schimmels 1,00E+02 1,00E+03 geen visuele schimmelgroei Cat. 3G Enterobacteriaceae 5,00E+01 5,00E+02 n.v.t. Cat. 3G E. coli <10 5,00E+01 5,00E+01 Cat. 3G TKG 1,00E+03 1,00E+05 1,00E+06 Cat. 4C MZB 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+07 Cat. 4C Gisten 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+05 Cat. 4C Schimmels 1,00E+02 1,00E+03 geen visuele schimmelgroei Cat. 4C Enterobacteriaceae 5,00E+01 5,00E+02 n.v.t. Cat. 4C E. coli (niet schelp) <10 5,00E+01 5,00E+01 Cat. 4C E. coli (schelp) 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+01 Cat. 4C TKG 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 Cat. 4F MZB 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+07 Cat. 4F Gisten 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+05 Cat. 4F Schimmels 1,00E+02 1,00E+03 geen visuele schimmelgroei Cat. 4F Enterobacteriaceae 5,00E+01 5,00E+02 n.v.t. Cat. 4F E. Coli 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+03 Cat. 4F Zetmeel component Groenten /fruit componen t Mix component TKG 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+06 Cat. 7E MZB 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+07 Cat. 7E Gisten 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+05 Cat. 7E Schimmels 1,00E+02 1,00E+03 geen visuele schimmelgroei Cat. 7E E. coli <10 5,00E+01 5,00E+01 Cat. 7E B. cereus 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+05 Cat. 7E TKG 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+08 Cat. 5D MZB 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+07 Cat. 5D Gisten 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 Cat. 5D Schimmels 1,00E+03 1,00E+04 geen visuele schimmelgroei Cat. 5D E. coli 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+03 Cat. 5D m M TKG 3,00E+05 3,00E+06 FAVV MZB 1,00E+03 1,00E+04 FAVV E. coli 1,00E+01 1,00E+02 FAVV Salmonella Afwezig in 25 g FAVV L. monocytogenes 1,00E+02 EC Doel Tolerantie TGT-THT MZB 1,00E+04 1,00E+06 1,00E+07 LFMFP 83

84 Tabel 24 : Legende bij tabel 22 Cat. 1F Cat. 1H Cat. 1I Cat. 3G Cat. 4C Cat. 4F Cat. 5D Cat. 7E Gepasteuriseerde zuivelproducten welke onderhevig zijn aan nabesmetting (zuiveldessert zoals pudding, rijstpudding) Harde en halfharde kazen gemaakt van gepasteuriseerde melk (<50% vocht- type Gouda, Edam, Gruyère, geraspte kaas) Halfzachte en zachte kazen(eventueel met oppervlakte rijping of rood bacterie cultuur) (> 50% vocht - type Brie, Camembert, Munster, Port Salut, ) Gekookte vleesproducten gepasteuriseerd welke onderhevig zijn aan nabesmetting Verhitte visserijproducten, onderhevig aan nabesmetting (inclusief warm gerookte producten) Gerookte (gezouten/gedroogde) vis en aw >0,94 (groeilimiet voor gram-negatieve bacteriën) (Gewassen) versneden groenten (IV de gamma) (ready-to-eat of ready-to-cook) Producten gepasteuriseerd welke onderhevig zijn aan nabesmetting (bv. koelverse maaltijden of maaltijdcomponenten) Tabel 25 : Overzicht onderzochte variabelen Geschaalde variabelen Eenheid Nominale variabelen Mogelijkheden Gewicht g Temperatuur 4 C-7 C Prijs Map Ja/Nee Houdbaarheid Dagen Apart Ja/Nee EiwitTKG log kve/g Type eiwit Vlees/Vis/Kaas/Vlees en Kaas EiwitGIST log kve/g Zetmeel dressing Ja/Nee EiwitSCHIMMEL log kve/g Producent 12(a, b, c..) EiwitMZB log kve/g Supermarkt 7 (a, b, c..) EiwitENTERO log kve/g LMONO detectie Ja/Nee EiwitECOLI log kve/g Saus apart Ja/Nee EiwitpH / ZetmeelTKG log kve/g Ordinale variabelen Categorie ZetmeelGIST log kve/g Eiwit categorie 0,1,2,3,4 ZetmeelSCHIMMEL log kve/g Zetmeel categorie 0,1,2,3 ZetmeelMZB log kve/g Groenten categorie 0,1,2,3 ZetmeelECOLI log kve/g Mix categorie 0,1,2,3 ZetmeelBCEREUS log kve/g ZetmeelpH / GroentenTKG log kve/g GroentenGIST log kve/g GroentenSCHIMMEL log kve/g GroentenMZB log kve/g GroentenECOLI log kve/g GroentenpH / MixTKG log kve/g MixGIST log kve/g MixSCHIMMEL log kve/g MixMZB log kve/g MixECOLI log kve/g MixpH / O 2-concentratie % CO 2-concentratie % Prijs/Gewicht /kg 84

85 Figuur 21 : Boxplot van de verschillende combinaties bij de transfertesten (SPSS) 85