Efficiënter screenen naar baarmoederhalskanker. dunne laag cervixcytologie screening met voorkennis van HPV type en lading

Transcriptie

1 Efficiënter screenen naar baarmoederhalskanker door geautomatiseerde dunne laag cervixcytologie screening met voorkennis van HPV type en lading Christophe Depuydt AML - Labo Lokeren Campus RIATOL LABORATORY FOR CLINICAL PATHOLOGY Amerikalei Antwerpen / tel: fax: Christophe.Depuydt@Riatol.be

2 AML filosofie Quality is a science Service an art

3 AML filosofie (2) AML is een vooraanstaand medisch laboratorium dat kwalitatief en wetenschappelijk hoogstaande diagnostiek wil bieden aan haar patiënten, artsen, onderzoekscentra, doorsturende labo s en ziekenhuizen AML is actief in alle subdomeinen en biedt haar diensten aan aan haar klantenbasis die verspreid is over geheel België en Nederland

4 AML filosofie (3) AML is actief in de algemene klinische biologie met Analyses voor huisartsen Analyses voor dierenartsen Daarnaast in een aantal specifieke domeinen een niche focus ontwikkeld: Arbeidsgeneeskunde & Toxicologie Microbiologie Isotopen Anatoom pathologie Moleculaire Biologie

5 ISO accreditatie ISO-kwaliteits-accrediatie sinds 1994 door Ministerie Economische Zaken Zeer brede scope van analyses Jaarlijkse audit Evolutie naar nieuwe norm NBN-EN-ISO Sinds 2008 BELAC certificaat nr. 352-MED ISO15189

6 Competitief Landschap: minder met minder maar groter Aantal Klinische laboratoria in België Labo's Lineair (Labo's)

7 Aantal stalen Klinische Biologie per jaar Totaal aantal aanvragen

8 MEDHOLD Geografische spreiding Labo s Brugge Amerikalei Desguinlei Geel Lokeren Wilrijk (HTB) Brussel Anderlecht Genk

9 Wat is screening? Screening is via eenvoudige technieken een groep van patiënten identificeren, die in aanmerking komen voor verder gericht onderzoek SCREENING DIAGNOSE Cervixcytologie met kwantificering van oncogene HPV types Biopsie Geen of weinig risico Verhoogd risico Normaal screeningspatroon Follow up of doelgerichte onderzoeken

10 Hoe screenen naar BMHK? Cervixcytologie: opsporen van (pre)maligne letsels Behandeling vooraleer een invasief carcinoom ontstaat Premaligne letsels hebben een onvoorspelbaar verloop, dat afhankelijk is v/h aanwezige humaan Papillomavirus type HPV detectie: opsporen van oncogene HPV types -

11 Waarom is HPV belangrijk in de screening van cervixcarcinoom? HPV infectie is oorzakelijk gerelateerd met cervixcarcinoom HPV prevalentie in cervixcarcinoom is wereldwijd 99,7% HPV infectie is noodzakelijk voor het persisteren en de progressie van CIN letsels -

12 HPV DNA tumor virus HPV 18 PCR ± 104 bp HPV18.1 (696) HPV18.2 (799) E7 E6 LCR 1/ MY09 (7035) Consensus PCR ± 450 bp MY11 (6584) E HPV L E2 E4 E5 L2 5 - G A T C C G G C A T G C T A G G C C G T A C - 5

13 Humaan Papillomavirus (HPV) 30 van de meer dan 100 gekende HPV-types kunnen de cervix besmetten Hoog-risico types: 16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,67 en 68 vooral bij CIN 2-CIN 3 en invasieve carcinomen Laag-risico types: 6,11,40,42,43,44,53,72, wratten en condylomen -

14 Dunne laag cytologie Vanaf 1999 werd in Europa dunne laag cytologie geïntroduceerd Betere kwaliteit Minder bloed en uitdroging Minder SBLB Te automatiseren HPV detectie mogelijk

15 Verdeling dunne laag cytologie België ANTWERPEN VL-BRABANT LIMBURG OOST-VLAANDEREN WEST-VLAANDEREN BRUSSEL WALLONIE LBP per jaar Totaal

16 Primaire screening methodes (Baarmoederhalskanker) 1. CYTOLOGIE (FocalPoint prescreening met geassisteerde screening) Sensitiviteit Specificiteit 72,73% 90,70% NPV 99,66% PPV 8,08% FN Ratio FP Ratio 27,27% 9,30% 2. Oncogene HPV detectie (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) Sensitiviteit Specificiteit 100,0% 76,48% NPV 100,0% PPV 4,56% FN Ratio FP Ratio 0% 23,52% 3. Gecombineerde screening: virale lading oncogene HPV > 2 copies / cel Sensitiviteit Specificiteit 100,0% 95,09 % NPV 100,0% PPV 18,64% FN Ratio FP Ratio 0% 4,91% n = 3126, colposcopisch gecontroleerd, CIN 2+ eindpunt

17 Baarmoederhalskanker screening ( ) VOOR AUTOMATISATIE Afname cervicale cellen (BD SurePath ) Abnormale uitstrijk ASC-US, L-SIL, H-SIL DNA extractie uit cervicale afname MANUEEL MANUEEL MANUEEL HPV detectie met Real-time PCR gecombineerd advies MANUEEL MANUEEL

18 Baarmoederhalskanker screening (Vanaf 1 juni 2006) MANUEEL GEAUTOMATISEERD Uitstrijk Voorscreening FocalPoint TM (1000 beelden) NA AUTOMATISATIE Gefixeerde cervicale cellen (BD SurePath ) + GEAUTOMATISEERD Pellet meeting DNA extractie Master Mix pipettering HPV detectie met Real time PCR GEAUTOMATISEERD Efficiënte screening gecombineerd advies

19 Overzicht Baarmoederhalskanker screening SEMI MANUEEL GEAUTOMATISEERD Restmateriaal dunne laag cytologie = 800 µl JANUS TM DNA in 96 deep well LIMS JANUS TM Mmix 2 x 384 well plaat LC 480 HPV resultaten Roche remote Cytologie / PAP FocalPoint TM prescreening SlideWizard TM Screening met HPV voorkennis

20 Dunne laag cytologie SEMI MANUEEL Restmateriaal dunne laag cytologie = 800 µl Cytologie / PAP

21 Dunne laag preparatie - Kleuring Prepmate PrepStain

22 Overzicht Baarmoederhalskanker screening SEMI MANUEEL GEAUTOMATISEERD Restmateriaal dunne laag cytologie = 800 µl JANUS TM DNA in 96 deep well LIMS JANUS TM Mmix 2 x 384 well plaat LC 480 HPV resultaten Roche remote Cytologie / PAP FocalPoint TM prescreening SlideWizard TM Screening met HPV voorkennis

23 FoCalPoint TM Pre-screening van alle preparaten Aanmaak van 15 PAPmaps voor geassisteerde lezing met SlideWizards TM Transfer data naar LIMS Pre-screeening dunne laag cytologie

24 LIMS DNA extractie (JANUS TM ) SEMI MANUEEL GEAUTOMATISEERD Restmateriaal dunne laag cytologie = 800 µl JANUS TM DNA in 96 deep well LIMS JANUS TM Mmix 2 x 384 well plaat LC 480 HPV resultaten Roche remote Cytologie / PAP FocalPoint TM prescreening SlideWizard TM Screening met HPV voorkennis

25 Pellet meting & DNA extractie vanuit dunne laag restcytologie LIMS Monster ID HPV testen Positie Concentratie JANUS TM Monster controle (barcode) Normalisatie (Victor) door OD meting Monster transfer 15 ml tubes -> 96 deep well formaat DNA extractie off board incubatie 56 C Monster positie in deep well DNA concentratie

26 Pellet meting & DNA extractie vanuit dunne laag restcytologie JANUS TM Monster controle Pellet meting (Victor) 15ml -> 96 deep well DNA extractie (96 deep well formaat) Positie transfer DNA concentratie transfer Capaciteit 728 monsters / dag Loopduur: 2hr 15 min / 182 monsters

27 LIMS PCR voorbereiding (JANUS TM ) SEMI MANUEEL GEAUTOMATISEERD Restmateriaal dunne laag cytologie = 800 µl JANUS TM DNA in 96 deep well LIMS JANUS TM Mmix 2 x 384 well plaat LC 480 HPV resultaten Roche remote Cytologie / PAP FocalPoint TM prescreening SlideWizard TM Screening met HPV voorkennis

28 JANUS TM : PCR setup JANUS TM Monster controle 4 µl Master mix zonder wegwerp tips 96 deep well DNA transfer naar 384 well plaat (1 µl monster) Integrated plate sealer zonder centrifugatie Werk lijst transfer en gesealde 384 well plaat naar Roche LightCycler 480 Capaciteit 910 monsters / dag Looptijd: 1hr 20 min / 182 samples

29 JANUS TM : PCR setup 1 µl DNA + 4 µl master mix zonder wegwerp tips, zonder centrifugatie, geïntegreerde sealing PCR setup Macro 1 : 4 triplex PCR s Pipetteer duur 60 min PCR setup Macro 2 : 4 duplex PCR s Pipetteer duur 35 min Within-run variatie (3 µl pipettering) Minder dan 2,15 % per tip / naald Between-run tip / naald variatie = 3,83 % Accuraatheid = 98,7 %

30 Real time quantitative HPV PCR on liquid based cytology TaqMan TM based assays Typing and quantification of HPV types: 6E6,11E6,16E7,18E7,31E6,33E7/L1,35E4/E6,39E7,45E7,51E7, 52E7/L1,53E6,56E7,58E7/L1,59E7,66E6,67L1 and 68E7 β-globin control PCR: For each sample a control PCR s is performed Viral load was expressed as HPV copies / cell => 20 real time PCR s / sample Moberg et al 2003; J Clin Microbiol: 41(7): Flores-Mungia et al 2004; J Mol Diagn; 6(2): Depuydt et al 2006; Cytopathology 17: 1-8

31 HPV Virale lading HPV copies / cel 40 HPV copies (HPV PCR) Σ = 20 cells (β-globin PCR) Virale lading = 40 HPV copies / 20 cellen = 2 HPV copies/cel

32 Roche LightCycler 480 LightCycler 480 kwantitatieve PCR analyse in 384 well formaat Snelle cycling (65 min) 5 µl reactie volume Triplex PCR s zonder afdraaien Resultaten transfer via LIMS module en Roche remote Capaciteit 9000 PCR s / dag doorlooptijd: 65 min / run resultaten / dag

33 Interface JANUS Roche LC 480 (Roche remote) Roche remote Staal input (werk lijst) in de LC 480 Resultaten transfer naar LIMS (27000 / dag) Cp, copies, lading Start / stopt LC 480 Automatisch nieuwe 384 well plaat aanmaak Get Sample ID from File/LIMS LIMS Get Sample Bloc Scan Barcode Get first PCR plate Scan Barcode Pipet Samples/ Controls/ Mastermix NO Input From User : Amount of Sample blocs to do Check : Finish LightCycler Run OK NO Check : Start LightCycler Run OK NO Check Do Second PCR Plate OK Put Sample ID ready for import to LightCycler YES YES YES Input For recovery : How many PCR plates in input stacker Which PCR plate (first/second) to do Redefine previous sample bloc setting Finish Run Start Run Get second PCR plate Scan Barcode Pipet Samples/ Controls/ Mastermix Put Results back to LIMS Put sample ID from Janus into LightCycler Seal Put Plate in Input Stacker Yes Check if second PCR plate is Done No

34 LC macro s 20 real time PCR s per monster (4 triplex en 4 duplex PCR s) 65 min / run standard curve voor elk HPV type Roche LightCycler 480

35 HPV PCR QC data (LIMS) HPV 16 E7 23,06 HPV 18 E7 26,64 HPV 31 E6 23,98 HPV 33 E6 25,43 HPV 33,52,58,67 L130,20 HPV 35 E6 HPV 39 E7 HPV 45 E7 HPV 51 E7 HPV 52 E7 HPV 53 E6 HPV 56 E7 HPV 58 E7 HPV 59 E7 HPV 66 E6 HPV 68 E7 HPV 6 E6 h b-globin Mean Cp 30,10 25,55 28,94 25,58 27,24 24,18 25,44 27,81 25,82 25,01 26,96 25,69 20,90 SD 0,39 0,55 0,72 0,94 0,87 1,29 0,24 0,62 0,22 0,44 0,17 0,3 0,93 0,28 0,37 0,93 0,45 1,24 CV (%) 1,7 2,1 3,0 3,7 2,9 4,3 0,9 2,1 0,9 1,6 0,7 1,2 3,3 1,1 1,5 3,4 1,8 4,9 n HPV 16

36 Overzicht Baarmoederhalskanker screening SEMI MANUEEL GEAUTOMATISEERD Restmateriaal dunne laag cytologie = 800 µl JANUS TM DNA in 96 deep well LIMS JANUS TM Mmix 2 x 384 well plaat LC 480 HPV resultaten Roche remote Cytologie / PAP FocalPoint TM prescreening SlideWizard TM Screening met HPV voorkennis

37 SlideWizard TM combinatie van computer gestuurde screening met SlideWizards en HPV resultaat met virale lading van 16 oncogenic HPV types 60 -> 150 preparaten per screenster per dag Computergestuurde screening met voorkennis van HPV status

38 Totaal aantal HPV (PCR) testen per maand 2005 vs 2006 Juni 2006 start nieuwe geautomatiseerde screening PCR tests Aantal monsters PCR tests Monsters n = Monsters n = 62894

39 Gemiddeld 14 dagen ,2 7,2 8,0 9,6 10,6 12,4 12,6 10,5 12,6 11,5 11,3 12,2 11,1 9,9 10,7 9,4 14,3 14,1 15,7 14,9 15,9 16,4 16,2 18, Respons tijd gecombineerd protocol (cytology + HPV) Gemiddeld 7 dagen Delta gecombineerd advies, cytologie + HPV resultaat Aantal dagen

40 HR HPV detectie / afwijkende cytologie Periode sept dec 2008; n = % 8.5% 4.0% jan/07 feb/07 mrt/07 apr/07 mei/07 jun/07 jul/07 aug/07 sep/07 okt/07 nov/07 dec/07 jan/08 feb/08 mrt/08 apr/08 mei/08 jun/08 jul/08 aug/08 sep/08 okt/08 nov/08 dec/08 % HPV HR % AFW % ASC-US % L-SIL dec/06 nov/06 okt/06 sep/06 %

41 Gevoeligheid / specificiteit voor de detectie van baarmoederhalskanker (CIN2+) Screening zonder kennis van HPV Screening met kennis van HPV Primaire HPV Screening Gevoeligheid 58.14% 74.42% 95.35% Specificiteit 94.35% 93.48% 84.93% NPV 99.34% 99.59% 99.92% PPV 13.37% 14.61% 8.67% FPR 5.65% 6.52% 15.07% FNR 41.86% 25.58% 4.65%

42 Conclusie automatisatie Minder manuele stappen (fouten) Alle stappen zijn gebarcodeerd en traceerbaar Geautomatiseerde normalisatie (Victor) Geautomatiseerde DNA extractie (JANUS TM ) 1 wegwerp tip per monster Geautomatiseerde PCR setup (25 µl -> 5µl / 384 well) zonder wegwerp tips 5 x minder kosten (JANUS )!!! Geautomatiseerde PCR run en resultaten transfer (Roche LC 480 JANUS LIMS)

43 Conclusie Baarmoederhalskanker screening Juistere resultaten HPV detectie bij alle monsters alvorens 2e lezing Vermindering van # vals positieve / negatieve cytologie Efficiëntere follow-up (individuele patiënten) 75-85% van de uitstrijkjes zijn HPV negatief Verlenging van het screenings interval (1 -> 5 jr) Efficiëntere screening > preparaten / screener / jaar 50 % reductie in omloopduur gecombineerd protocol (14 dagen -> 7 dagen) => Globale reductie in kost => Verbeterde kwaliteit

44

45 Meer informatie Onze websites : Contact: tel Christophe.Depuydt@riatol.be