Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit

Transcriptie

1 1 Fabrikant Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit Een SURVEYOR Scan KRAS en NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD met DHPLC-systemen Lees deze instructies voor gebruik zorgvuldig voordat u dit product gaat gebruiken. Bewaar deze instructies voor gebruik voor toekomstige referentie.

2 Deze pagina is met opzet leeg gelaten.

3 Inhoudsopgave 1 Fabrikant CRC RAScan Combination Kit Beoogd gebruik Indicaties voor gebruik Principes van de CRC RAScan KRAS en NRAS Mutatie detectie-assay KRAS en NRAS Analyse van patiëntenmonsters met behulp van SURVEYOR Scan Kits SURVEYOR Nuclease Traceerbaarheid van kitcontroles Componenten SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Box (h ) SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Box (h ) Aantal monsters dat met één kit kan worden getest DNA sequencing Extra benodigde apparatuur en reagentia Reagensbereiding Opslag en houdbaarheid Waarschuwingen en voorzorgen Primaire monsterafname, hantering en opslag Assayprocedure Somatische mutatiedetectie met SURVEYOR Scan Kits Een overzicht Stap-voor-stap instructies DHPLC EERSTE opstelling/kalibratie Overwegingen voorafgaand aan KRAS en NRAS Monsteranalyse Template overwegingen Workflow overwegingen Amplificatieprotocol Thermisch cyclerprogramma voor amplificatieprotocol Kwaliteitscontrole van PCR producten SURVEYOR Nuclease Digestie Controleprocedures Kwaliteitscontrole van de CRC RAScan Combination Kit Gebruik van controleplasmide DNA's Interpretatie van de resultaten Analysis van KRAS en NRAS Exons 2, 3 en 4 met behulp van SURVEYOR Nuclease Gegevensbeoordeling van SURVEYOR Scan resultaten Voorbeelden van resultaten Prestatiekenmerken Niveau van detectie van mutaties door middel van SURVEYOR Scan Kits Sequentiebevestiging Beperkingen van de assayprocedure Bijlage A A.1 Plaat lay outplan voor SURVEYOR Scan Kits A.2 Controle DNA stempels A.3 Denaturering HPLC (DHPLC) Systeemvereisten A.4 Laboratoriumopstelling voor PCR assays A.5 Literatuurreferenties Bijlage B Gids voor het opsporen en oplossen van problemen Bestelinformatie Contactgegevens Vertaling Disclaimer Licenties, Handelsmerken & Copyright... 45

4 1 Fabrikant 1 Fabrikant Fabrikant EC Vertegenwoordiger M P Transgenomic, Inc Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Tel Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Tel CRC RAScan Combination Kit 2.1 Beoogd gebruik Uitsluitend voor professioneel gebruik. Transgenomic s CRC RAScan Combination Kit is een in vitro diagnostische assay die somatische mutaties in Exons 2, 3 & 4 van de KRAS en NRAS genen detecteert. Deze mutaties worden aangegeven door SURVEYOR Nuclease knippieken en omvatten die mutaties waarvan bekend is dat ze mogelijk klinisch significant zijn. Deze kit is ontwikkeld voor gebruik in laboratoria voor klinische diagnostiek door personeel dat goed opgeleid is in het testen van DNA dat verkregen is uit formaline-gefixeerd en paraffine-ingebed weefsel. Deze kit is te vinden onder catalogusnummer Deze instructies voor gebruik zijn als download verkrijgbaar op Indicaties voor gebruik Clinici kunnen de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen gebruiken als hulpmiddel bij het beslissen of colorectale kankertumoren van patiënten mogelijk niet reageren op anti-egfr (epidermale groeifactorreceptor) therapeutica zoals panitumumab. De CRC RAScan Combination Kit dient niet te worden gebruikt voor diagnose van colorectale of enige andere vorm van kanker. De CRC RAScan Combination Kit is een assay die de aanwezigheid van mogelijke somatische mutaties in Exons 2, 3 & 4 van de KRAS en NRAS genen detecteert maar de de sequentieidentiteit van de mutatie niet bevestigt. Om de exacte gedetecteerde mutatie te identificeren, is verdere analyse, zoals DNA-sequencing, noodzakelijk. Hoewel de resultaten van de analyse met deze kits de mutatiestatus van de patiënt zullen aangeven, dient rekening te worden gehouden met andere klinische factoren. Resultaten die zijn verkregen met behulp van de CRC RAScan Combination Kit dienen niet de enige methode te zijn die wordt gebruikt bij het nemen van beslissingen met betrekking tot een behandeling van patiënten met colorectale kanker. Het is belangrijk op te merken dat het gebruik van DHPLC voor het identificeren van monsters die positief testen voor een KRAS of NRAS mutatie met deze set alleen gebruikt dient te worden als richtlijn en alle mutaties moeten worden bevestigd door middel van aanvullende analyses, zoals DNA sequencing. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pagina 3

5 3 Principes van de CRC RAScan KRAS en NRAS Mutatie detectie-assay 3 Principes van de CRC RAScan KRAS en NRAS Mutatie detectie-assay 3.1 KRAS en NRAS Therapeutica die zich richten op de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) zijn effectief gebleken tegen colorectale kanker. Research heeft aangegeven dat ongeveer 40% van colorectale tumoren somatische KRAS genmutaties dragen en klinische onderzoeken hebben aangetoond dat mutaties in KRAS exon 2 (codonen 12 en 13) een gebrek aan respons op anti-egfr therapieën voorspellen. Recente oriënterende onderzoeken hebben aangetoond dat de patiëntenpopulatie verder verfijnd kan worden doordat patiënten bij wie de mcrc-tumoren een bijkomende mutatie in KRAS exons 3 en 4 of NRAS exons 2, 3 en 4 herbergen ook niet de neiging vertoonden te reageren op anti-egfr-bevattende behandeling 1-7. Deze kit is ontworpen voor gebruik bij diagnostische analyse van somatische KRAS en NRAS Exons 2, 3 & 4 mutaties. De CRC RAScan Combination Kit is een assay voor het detecteren van alle sequentie en kleine insertie-/verwijderingsveranderingen in Exons 2, 3 & 4 van de KRAS en NRAS genen. Mutaties in KRAS en NRAS codonen 12, 13, 59, 61, 117 en 146 zijn in verband gebracht met het ontbreken van werkzaamheid van panitumumab. In deze kit worden Positive Controls geleverd voor mutaties in codonen 12, 61, 117 en 146. In deze kit wordt Transgenomic's eigen SURVEYOR Nucleasetechnologie gebruikt en geeft, indien gekoppeld aan de DHPLC Systeemtechnologie, simpele en gevoelige detectie van mogelijke mutaties. Het is in staat een mengsel van 2-5% mutant te detecteren in een achtergrond van niet-mutant DNA. Validatie-onderzoeken hebben extreem hoge concordantie aangetoond met sequencing in goed-gekarakteriseerde colorectale kankermonsters. Het gebruik van de CRC RAScan Combination Kit zal zowel de sequencingsbelasting verlagen als de sequence-calling helpen waar automatische sequencing software de aanwezigheid van een laag-niveaumutatie niet verklaart. In verband met de hoge gevoeligheid van deze assay in relatie tot Sanger-sequencing wordt aanbevolen de laboratoriumopstelling te optimaliseren voor vermijden van kruisbesmetting van monsters of controles. Zie voor een voorbeeld van een ideale laboratoriumopstelling Bijlage A.4 Laboratoriumopstelling voor PCR-assays. 3.2 Analyse van patiëntenmonsters met behulp van SURVEYOR Scan Kits De CRC RAScan Combination Kit dient alleen in de context van de hieronder aangegeven workflow te worden gebruikt. Workflow Patiëntenmonster Test KRAS en NRAS Exons 2, 3 & 4 Rapporteer resultaat Figuur 1 CRC RAScan Combination Kit workflow voor screening van KRAS en NRAS Voor een suggestie over hoe 96-wells platen opgezet moeten worden voor analyse van alle KRAS en NRAS Exons 2-4 zie Bijlage A.1 Plaatlay-outplan voor de CRC RAScan Combination Kit. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pagina 4

6 3 Principes van de CRC RAScan Scan KRAS en NRAS Mutatiedetectie-assay 3.3 SURVEYOR Nuclease Transgenomic's SURVEYOR Nuclease is een mismatch-specifiek plant-dna-endonuclease dat kan scannen voor bekende en onbekende mutaties en polymorfismen in heteroduplex DNA 8. Het enzym knipt DNA met hoge specificiteit op locaties van base-substitutiemismatch en andere distorsies. Dit DNA-endonuclease knipt beide strengen van een DNA-heteroduplex aan de 3'-zijde van de mismatchlocatie. Insertie/deletiemismatches en alle base-substitutiemismatches worden herkend, maar de efficiëntie van het knippen varieert met de sequentie van de mismatch. Figuur 2. Werkwijze van SURVEYOR Nuclease. Het endonuclease herkent een mismatch en knipt aan de 3'-zijde van elke base in de mismatch. Hierdoor wordt de dubbele DNA-streng geknipt, waarna een enkele base 3'-overhang overblijft. SURVEYOR Nuclease is gebruikt in een groot scala aan contexten om nauwkeurig een verscheidenheid aan mutaties en polymorfismen in genen te detecteren. SURVEYOR Nuclease is met name gebruikt om de aanwezigheid van bekende mutaties in een aantal genen geassocieerd met nierkanker, longkanker, hoofd- & halskanker, leukemie, endometriale kanker te verifiëren en bij voorspelling van het resultaat van radiotherapie 9,10,11. De CRC RAScan Combination Kit is ontworpen voor het knippen van mismatches in KRAS en NRAS Exons 2, 3 & 4 voor daarop volgende analyse door DHPLC. N.B.: indien een monster 100% mutant DNA is, kunnen er geen heteroduplexen worden gevormd en zal het monster verschijnen als "Wild-Type". Tumorbiopsiemonsters zullen echter Wild-Type cellen bevatten als gevolg van tumorheterogeniteit en/of verontreinigend normaal weefsel; N.B. monsters met 5% en 95% mutant DNA zullen identieke chromatogram hebben. N.B.: Voor het PCR-deel van de assay dient alleen het met deze kit meegeleverde DNA Polymerase te worden gebruikt. N.B.: Volg de specifieke instructies in de handleiding van uw DHPLC-systeem. Om deze kit met succes te gebruiken adviseren wij met klem deze handleiding grondig te lezen en de gegeven instructies en richtlijnen zorgvuldig te volgen. Eerste gebruikers dienen de in het hoofdstuk Gebruik van controleplasmide-dna'sbeschreven controleexperimenten uit te voeren. Als u nog vragen hebt of hulp nodig hebt kunt u bellen naar (888) (alleen Noord- Amerika), +1 (402) of +44 (0) (Europa) en vragen naar "KRAS en NRAS support". Als alternatief kunt u ons en op: SURVEYORscan@Transgenomic.com Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen Pag. 5

7 4 Traceerbaarheid van kitcontroles 4 Traceerbaarheid van kitcontroles De met deze kit geleverde controles zijn plasmideklonen van KRAS en NRAS Exons 2, 3 & 4 sequenties. Alle klonen zijn gesequentieerd om de getrouwheid van de sequentie te controleren door middel van vergelijking met NCBI Reference Sequences: NG_ (KRAS) en NG_ (NRAS). De controles hebben een genetische "stempel" Zie Bijlage A.2 Controle DNA-stempels; deze zijn variaties van de KRAS of NRAS Wild-Type sequenties in een regio waarvan niet wordt verwacht dat deze mutaties heeft en kan worden gebruikt voor het opsporen en oplossen van problemen met verontreiniging van monsters door middel van Positive Controls. Zie Bijlage B - Gids voor het opsporen en oplossen van problemen, Probleem 8, voor een voorbeeld van een SURVEYOR Scan spoor van een dergelijke verontreiniging. De "KRAS Control Wild-Type"werd geconstrueerd door middel van synthese en klonen van KRAS Exons 2, 3 en 4 met behulp van de NCBI Reference Sequence NG_ De "KRAS Positive Control Exon 2" werd geconstrueerd door middel van synthese van KRAS Exon 2 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de G12D-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 12 is met een G12D, GGT>GAT, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met KRAS Control Wild-Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "KRAS Positive Control Exon 3" werd geconstrueerd door middel van synthese van KRAS Exon 3 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de Q61H-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 61 is met een Q61H, CAA>CAC, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met KRAS Control Wild-Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "KRAS Positive Control Exon 4A" werd geconstrueerd door middel van synthese van KRAS Exon 4 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de K117N-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 117 is met een K117N, AAA>AAT, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met KRAS Control Wild-Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "KRAS Positive Control Exon 4B" werd geconstrueerd door middel van synthese van KRAS Exon 4 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de A146T-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 146 is met een A146T, GCA>ACA, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met KRAS Control Wild- Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "NRAS Control Wild-Type"werd geconstrueerd door middel van synthese en klonen van NRAS Exons 2, 3 en 4 met behulp van de NCBI Reference Sequence NG_ De "NRAS Positive Control Exon 2" werd geconstrueerd door middel van synthese van NRAS Exon 2 met behulp van de bovengenoemde referentie maar die de G12D-mutatie bevat. DNAsequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 12 is met een G12D, GGT>GAT, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met NRAS Control Wild-Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "NRAS Positive Control Exon 3" werd geconstrueerd door middel van synthese van NRAS Exon 3 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de Q61K-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 61 is met een Q61K, CAA>AAA, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met NRAS Control Wild-Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "NRAS Positive Control Exon 4" werd geconstrueerd door middel van synthese van NRAS Exon 4 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de A146T-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 146 is met een A146T, GCC>ACC, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met NRAS Control Wild- Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pagina 6

8 5 Componenten 5 Componenten De CRC RAScan Combination Kit wordt geleverd in een enkele koker als twee afzonderlijke dozen: (a) één doos reagentia voor analyse van KRAS Exons 2, 3 & 4 en (b) één doos reagentia voor analyse van NRAS Exons 2, 3 & 4. Samen bevatten de dozen voldoende reagentia voor de uitvoering van het in Paragraaf 5.3 vermelde aantal analyses. 5.1 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Box (h ) De doos met componenten voor analyse van KRAS Exons 2, 3 & 4 heeft twee binnenboxen: (1) een SURVEYOR Digestiecomponentendoos met 10 reagensbuisjes en (2) een buiten PCRcomponenten en controlebuishouder met 20 reageerbuisjes. Catalogus -nummer Onderdeel Buisdop Kleur 130-Reactiekit Volume verstrekt SURVEYOR Digestiecomponentendoos SURVEYOR Nuclease W Paars 3 x 105 µl SURVEYOR Enhancer W2 Zwart 2 x 105 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor Roze 2 x 105 µl M MgCl 2 Solution Bruin 2 x 105 µl Stop Solution Rood 250 µl PCR componenten- en controledoos DNA Polymerase Helder 2 x 100 µl x DNA Polymerase Reaction Buffer Helder 1 ml dntps (10 mm) Helder 2 x 500 µl F KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µm) Blauw 125 µl R KRAS Primer: Exon 2 Reverse (10 µm) Blauw 125 µl F KRAS Primer: Exon 3 Forward (10 µm) Blauw 90 µl R KRAS Primer: Exon 3 Reverse (10 µm) Blauw 90 µl F KRAS Primer: Exon 4A Forward (10 µm) Blauw 90 µl R KRAS Primer: Exon 4A Reverse (10 µm) Blauw 90 µl F KRAS Primer: Exon 4B Forward (10 µm) Blauw 90 µl R KRAS Primer: Exon 4B Reverse (10 µm) Blauw 90 µl KRAS Control Wild-Type Geel 120 µl KRAS Positive Control Exon 2 Groen 40 µl KRAS Positive Control Exon 3 Groen 40 µl KRAS Positive Control Exon 4A Groen 40 µl KRAS Positive Control Exon 4B Groen 40 µl F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Oranje 125 µl R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Oranje 125 µl Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen Pag. 7

9 5 Componenten 5.2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Box (h ) De doos met componenten voor analyse van NRAS Exons 2, 3 & 4 heeft twee binnendozen: (1) een SURVEYOR Digestiecomponentendoos met 10 reagensbuisjes zonder lege openingen en (2) een buiten PCR-componenten en controlebuishouder met 14 reageerbuisjes. Catalogus -nummer Onderdeel Buisdop Kleur 100-Reactiekit Volume verstrekt SURVEYOR Digestiecomponentendoos SURVEYOR Nuclease W Paars 2 x 105 µl SURVEYOR Enhancer W2 Zwart 105 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor Roze 105 µl M MgCl 2 Solution Bruin 105 µl SURVEYOR Stop Solution Rood 250 µl F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Oranje 2 x 125 µl R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Oranje 2 x 125 µl PCR componenten- en controledoos DNA Polymerase (250 U) Rood 100 µl DNA Polymerase (50 U) Rood 20 µl DNA Polymerase 10X PCR Buffer Helder 1 ml dntps (10 mm) Helder 500 µl F NRAS Primer Exon 2 Forward (10 µm) Blauw 90 µl R NRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µm) Blauw 90 µl F NRAS Primer Exon 3 Forward (10 µm) Blauw 90 µl R NRAS Primer Exon 3 Reverse (10 µm) Blauw 90 µl F NRAS Primer Exon 4 Forward (10 µm) Blauw 90 µl R NRAS Primer Exon 4 Reverse (10 µm) Blauw 90 µl NRAS Control Wild-Type Mix Geel 120 µl NRAS Positive Control Exon 2 Groen 40 µl NRAS Positive Control Exon 3 Groen 40 µl NRAS Positive Control Exon 4 Groen 40 µl 5.3 Aantal monsters dat met één kit kan worden getest De CRC RAScan Combination Kit is ontworpen voor het testen van 230 reacties. Het totale aantal monsters dat met de kit kan worden getest is afhankelijk van de gemiddelde batchgrootte die op enig moment wordt getest omdat in elke reactieplaat één set controlereacties (Wild-Type Controls, Positive Controls en Geen-templatecontroles) moet worden opgenomen. De onderstaande tabel toont het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd met de KRAS en NRAS kit, afhankelijk van de gemiddelde monsterbatch-grootte. Hierbij wordt rekening gehouden met (a) de 21 controles (7x Wild-Type, 7x Positive Controls, 7x Geen-templatecontroles) die voor elke run nodig zijn en (b) de limiet van 230 reacties per kit. N.B.: Bij het draaien van meerdere platen, moet elke set van de 21 hierboven vermelde controles op elke plaat zijn. Daarom zullen twee platen in totaal 42 controlereacties nodig hebben; 3 platen zullen 63 controlereacties nodig hebben; enz. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen Pag. 8

10 5 Componenten Wanneer de monsterbatchgrootte wordt verhoogd, wordt het aantal monsters dat met één kit kan worden getest verhoogd, waardoor de gemiddelde reagenskosten per monster worden verlaagd. De onderstaande tabel is een richtlijn voor het aantal monsters dat met de kits kan worden getest. Monster -batch -grootte Aant. Controlereacties + aant. monsteramplicons Aant. reacties nodig per run Totaal aant. monsterbatchruns per Kit Totaal monsters getest per kit DNA-sequencing sequencing primers (PN's F en R) worden geleverd voor gebruik voor DNAsequencing van alle geteste monsters. De PCR-amplicons die voorafgaand aan SURVEYOR Nuclease-digestie werden gecreëerd dienen voor sequencing te worden gebruikt. 6 Extra benodigde apparatuur en reagentia Extra componenten en apparatuur nodig voor gebruik van de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC omvat het volgende: DHPLC-systeem, kolom, buffers, DNA-grootte standaard - zie Bijlage A.3.1 DHPLC-specificaties voor SURVEYOR Scan-toepassingen voor kenmerken van een geschikt DHPLC-systeem voor gebruik met deze kit Moleculaire biologieklasse water 0,2 ml-pcr-buisjes, strips of 96-wellsplaat Micropipetten Pipettips IJsbad Vortexmixer Microcentrifuge Thermische cycler Agarosegels en agarosegelelektroforese-apparatuur 10% bleekmiddel of soortgelijk reinigingsmiddel 7 Reagensbereiding Alle met deze kit geleverde reagentia zijn klaar voor gebruik. Sommige componenten zullen vóór gebruik moeten worden ontdooid, gevortexed of worden gecentrifugeerd in een microcentrifuge; controleer bijzonderheden in de hieronder vermelde Assayprocedure. Reagentia dienen te worden gecombineerd voor het produceren van mastermixen en reactiemengsels; volledige bijzonderheden worden gegeven in de onderstaande Assayprocedure. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen Pag. 9

11 8 Opslag en houdbaarheid 8 Opslag en houdbaarheid De kit dient tot gebruik te worden bewaard bij temperaturen tussen de -18 ºC en -25 C in een vriezer met constante temperatuur. Let op de uiterste gebruiksdatum van elke ontvangen kit. Gebruik de kit niet nadat de uiterste gebruiksdatum is verstreken. Het SURVEYOR Nuclease mengsel dat in Stap 7 van SURVEYOR Nuclease digestie werd bereid dient onmiddellijk te worden gebruikt daar SURVEYOR Nuclease W na verloop van tijd inactief wordt bij aanwezigheid van de andere SURVEYOR Nucleasereactiemengselcomponenten. 9 Waarschuwingen en voorzorgen In de geleverde hoeveelheden vormen geen van de in deze kit aanwezige reagentia een gevaar voor de gezondheid. Transgenomic's documentnummer MSD kan worden gedownload van Deze kit bevat geen stoffen van dierlijke of menselijke oorsprong die een infectierisico vormen. Deze kit dient alleen te worden gebruikt door die personen die zijn getraind in de betreffende laboratoriumtechnieken. Tijdens het werken met de componenten van deze kit dient men altijd een geschikte labjas, wegwerphandschoenen en oogbescherming te dragen. Na gebruik dienen de kitcomponenten te worden weggegooid als klinisch afval en in overeenstemming met uw plaatselijke voorschriften. Delen van reagentia die uit buizen in deze kit zijn gepipetteerd, zijn uitsluitend bedoeld voor eenmalig gebruik. Van de componenten van deze kit is aangetoond dat zij na 25 cycli van invriezen en ontdooien nog steeds stabiel zijn. Gebruik deze kit niet wanneer dit aantal cycli van invriezen en ontdooien is overschreden. 10 Primaire monsterafname, hantering en opslag De CRC RAScan Combination Kit is gevalideerd voor gebruik met DNA geëxtraheerd uit formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) colorectale kankertumormonsters. Voor optimale DNA-extractie dient het weefsel gedurende uur voorafgaand aan het inbedden in paraffine te worden gefixeerd in formaline. Tumorenbiopten zijn een heterogeen mengsel van tumorcellen en niet-tumorcellen. Bovendien is de tumor zelf een heterogeen mengsel van tumorcellen met mutaties en tumorcellen zonder mutaties. Daar deze somatische mutaties mogelijk niet gelijkmatig door de tumor zijn verspreid, kan de resulterende mutationele analyse van verschillende delen van dezelfde tumor verschillend zijn. Om de waarschijnlijkheid van het detecteren van een mutatie te verhogen, dient DNA van de tumorregio van het weefsel te worden geïsoleerd door alleen het tumorgebied van het glaasje te schrapen met behulp van een vers, steriel scalpel voor elk nieuw glaasje. Voor succesvol gebruik van deze kit dient het geëxtraheerde DNA te voldoen aan de criteria die worden vermeld in Template-overwegingen. N.B.: Geëxtraheerde DNA-monsters die niet voor onmiddellijke analyse met deze kit zijn bedoeld dienen bevroren te worden opgeslagen bij -20 ºC tot -80 ºC. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pag. 10

12 11 Assayprocedure 11 Assayprocedure 11.1 Somatische mutatiedetectie met SURVEYOR Scan Kits - Een overzicht Mutatiedetectie en bevestiging met SURVEYOR Nuclease houdt drie stappen in: Stap 1 - Bereid PCR-amplicons uit mutant (test) en normaal (referentie) DNA, ga door vanaf de laatste PCR-amplificatiecyclus om alle dubbele strengen te smelten en laat ze vervolgens langzaam afkoelen voor optimale vorming van hetero- en homoduplexen (heteroduplexen treden op wanneer één streng van een Wild-Type sequentie uitgloeit met één streng van een mutantsequentie). Stap 2 - Behandel een deel van het uitgegloeide heteroduplex-/homoduplexmengsel met SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease zal beide strengen heteroduplex DNA knippen waardoor DNA-fragmenten ontstaan. Het Control Wild-Type DNA, dat op dezelfde manier wordt behandeld, doet dienst als achtergrondcontrole. Stap 3 - Analyseer de DNA-fragmenten op een DHPLC-systeem. De vorming van nieuwe knipproducten, als gevolg van de aanwezigheid van één of meer mismatches, wordt aangegeven door de aanwezigheid van extra chromatografische pieken. De migratietijden van de knipproducten geven de grootte van de fragmenten aan en daarom ongeveer de locatie van de mismatch of mismatches. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen Pag. 11

13 12 Stap-voor-stap instructies 12 Stap-voor-stap instructies 12.1 DHPLC EERSTE opstelling/kalibratie Raadpleeg bij het opstellen van de SURVEYOR Nuclease-plaat voor analyse door DHPLC de Bijlage A.3 Denaturing HPLC (DHPLC) Systeemvereisten Overwegingen voorafgaand aan KRAS en NRAS Monsteranalyse Voorafgaand aan het laten lopen van monsters op een DHPLC-systeem, moet een passende DNA-groottestandaard worden verwerkt om zeker te stellen dat het systeem goed werkt. Laboratoriumpersoneel dat het instrument gebruikt dient de kwaliteit van de DNAgroottestandaardresolutie te controleren alvorens aan de analyse te beginnen Template-overwegingen 1. Gebruik voor FFPE-geïsoleerd template-dna normale laboratoriumprocedures om de kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerd DNA te bepalen om zeker te stellen dat er voldoende template is voor PCR. 2. De 260/280 absorptieratio dient hoger te zijn dan 1, Voor het bespoedigen van de PCR-opstelling de werktemplateconcentratie instellen op ongeveer 12,5 ng/µl. Verdun het template-dna indien nodig in moleculaire biologieklasse water Workflow-overwegingen De kit is ontworpen om analyse van 230 reacties mogelijk te maken. Kleinere monsterbatches kunnen wel worden gedraaid, maar de kitcontroles en een "geen templatecontrole" moeten bij elke batch monsters worden opgenomen. Er zitten voldoende controlematerialen in de kit voor 230? reacties van alle te gebruiken combinaties van monsterbatchgrootten. Over het algemeen dient het verwerken van monsters van begin tot einde te worden uitgevoerd volgens de beschrijving in deze instructies voor gebruik. Wanneer het verwerken van een monster vóór voltooiing van alle stappen moet worden gestopt, dient het DNA bij -20 C op de aangegeven punten te worden bewaard. Blootstelling van elk bevroren monster aan herhaalde ontdooieninvriezen cycli dient echter te worden vermeden en bevroren opslag bij (-18 tot -25 C) van PCRgeamplificeerde DNA of SURVEYOR Nuclease-digestieproducten gedurende langere perioden (>1 week) dient te worden vermeden. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pag. 12

14 12 Stap-voor-stap instructies Analyse van monsters dient de hieronder getoonde workflow te volgen: Schraap weefsel 1 DNAisolatie & PCR 2 Gelelektroforese 3 5 SURVEYOR Scan Mislukt Score Robuust/Zwak PCR 4 SURVEYOR Nuclease & DHPLC-analyse SURVEYOR Scan Positief SURVEYOR Scan Negatief 7 6 Sequentiebevestiging NVD 8 Sequentiekwaliteit Mislukt Sequentiekwaliteit Goed 9 Mutaties in KRAS of NRAS codonen G12, G13, A59, Q61, K117 of A146 NVD Figuur 3 Workflow van CRC RAScan Combination Kit analyse Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pag. 13

15 12 Stap-voor-stap instructies Opmerkingen bij Figuur 3 1. Isoleer het DNA uit FFPE met behulp van standaard laboratoriumprocedures. 2. Voer PCR uit en controleer de kwaliteit van DNA door middel van gelelektroforese. 3. Registreer of de PCR-band Robuust ( 20 ng) of Zwak (<20 ng) is. Bereid, wanneer er meerdere PCR-banden zijn, vers genomisch DNA uit FFPE. 4. Met monsters die zijn geklasseerd als hetzij Robuust PCR of Zwak PCR na PCRamplificatie, gaat u door naar SURVEYOR Nuclease-behandeling en DHPLCsysteemanalyse. N.B. met een zwakke PCR-call is er mogelijk niet voldoende DNA voor het genereren van duidelijke resultaten door middel van DHPLC, maar er is mogelijk wel voldoende DNA voor sequentiëring. 5. Zie Bijlage B Gids voor het opsporen en oplossen van problemenvoor voorbeelden van mislukte SURVEYOR Scan resultaten. Alle monsters met een mislukt SURVEYOR Scan resultaat dienen opnieuw te worden bewerkt hetzij door middel van: a. het herhalen van PCR wanneer er voldoende genomisch DNA over is. b. het opnieuw extraheren van DNA uit FFPE; dit dient de tweede keuze te zijn daar het gewoonlijk ongewenst is om nog een FFPE-blok te snijden. c. bij gebruik van een andere sectie of een ander blok dient de gehele assay te worden herhaald daar verschillen in digesties het gevolg kunnen zijn van tumorheterogeniteit. 6. Als er geen zichtbare knippieken zijn, noteert u een negatief SURVEYOR Scan-resultaat, d.w.z. NVD = Geen variant gedetecteerd. 7. Wanneer een monster SURVEYOR Nuclease-knipproducten vertoont (komt niet overeen met de relevante Wild-Type Control) dienen zij te worden opgestuurd voor sequentiëringsbevestiging. 8. Wanneer sequentiebevestigingsanalyse onacceptabel is, dan: a. herhaalt u PCR wanneer er voldoende genomisch DNA over is, of b. extraheert u opnieuw DNA uit FFPE; dit dient de tweede keuze te zijn daar het gewoonlijk ongewenst is om extra glaasjes uit een FFPE-blok te snijden. 9. Wanneer sequentiebevestigingsanalyse acceptabel is, dienen de resultaten aan te geven: a. Wild-Type sequentie, dat wil wil zeggen, Geen variant gedetecteerd (NVD); of b. Variant gedetecteerd. Wanneer sequentiebevestiging een baseverandering aangeeft die resulteert in een aminozuurverandering op: i. codon 12 of 13 ii. codon 59 of 61 iii. codon 117; of iv. codon 146 beoordelen als KRAS of NRAS mutatie positief. N.B.: het is mogelijk een positieve SURVEYOR Scan-call te hebben die ook resulteert in "geen variant gedetecteerd" uit een sequentiebevestigingstest. Het detectieniveau (LOD) van SURVEYOR Nuclease op een DHPLC-systeem is slechts 2% mutant in 98% Wild-Type DNA voor sommige mutaties, terwijl de sequentiërings-lod ongeveer 10-25% mutant is in 90-75% Wild- Type DNA. N.B.: indien een monster 100% mutant DNA is, kunnen er geen heteroduplexen worden gevormd en zal het monster verschijnen als "Wild-Type? Tumorbiopsiemonsters zullen echter Wild-Type cellen bevatten als gevolg van tumorheterogeniteit en/of verontreinigend normaal weefsel. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen Pag. 14

16 12 Stap-voor-stap instructies N.B.: monsters met 5% en 95% mutant DNA zullen identieke chromatogram hebben. N.B.: positieve SURVEYOR Scan-resultaten kunnen het gevolg zijn van andere baseveranderingen dan die, die KRAS- of NRAS-activerend bleken te zijn. Hoewel deze mutaties zeldzaam zijn, zal bevestiging via een andere methode, zoals DNA-sequentiëring, nodig zijn om te bepalen of een positief SURVEYOR Scan-resultaat een KRAS- of NRAS-activerende mutatie is of niet. N.B.: het formaline-fixatieproces dat wordt gebruikt bij het bereiden van FFPEtumorbiopsiemonsters kan resulteren in deaminering van cytosinen. Deze deaminering zet cytosine om in uracil. Het polymerase zal dit uracil "lezen" als een thymine en een adenine opnemen in de gekopieerde strengen. Dit zal vervolgens lijken op een mutatie waarin de normale G nu wordt vervangen door een A die ervoor zorgt dat een GC in A/T-mutatie verandert die een artefactmutatie is die resulteert uit het fixatieproces en geen werkelijke somatische mutatie is. Dit zijn zeldzame voorvallen, maar wanneer zij vroeg in de PCR-cyclus worden gekopieerd, zullen zij "lijken" op mutaties. Zij herhalen niet bij heranalyse. Voorbeelden van mogelijke cytosinedeamineringsmutaties die overwogen zouden worden voor het bepalen van de behandeling van een patiënt zijn voor KRAS: - Codon 12: AGT (G12S) en GAT (G12D) - Codon 13: AGC (G13S), GAC (G13D) en GGT (G13G, een stille mutatie) - Codon 146: GCA>ACA (A146T) Voorbeelden van mogelijke cytosinedeamineringsmutaties die overwogen zouden worden voor het bepalen van de behandeling van een patiënt zijn voor NRAS: - Codon 12: GGT> AGT (G12S) of GAT (G12D) - Codon 13: GGT> AGT (G13S), GAT (G13D) of GGC (G13G, een stille mutatie) - Codon 146: GCC>ACC (A146T) Daarom is het raadzaam elke dergelijke mutatie te bevestigen door middel van duplicaatanalyse van hetzelfde genomische DNA of alle monsters vanaf de start van de analyse te onderwerpen aan duplicaatanalyse Amplificatieprotocol 1. De Transgenomic voorgemengde dntp-oplossingen (PN's en ) worden geleverd in een werkconcentratie van 10 mm totale deoxynucleotide (2,5 mm van elk van de vier deoxynucleotiden). 2. De KRAS en NRAS Forward en Reverse PCR primers (KRAS PN's F/R, F/R, F/R en F/R; NRAS PN's F/R, F/R en F/R) worden geleverd op 10 µm. 3. Neem de 10 µm primers, 10 mm dntp's en DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN ) uit de vriezer en laat ze op ijs ontdooien. 4. Na het ontdooien alle kitcomponenten ~10 seconden vortexen om ze grondig te mengen, kort centrifugeren ~10 seconden om zeker te stellen dat er geen vloeistof achterblijft op de doppen van de buisjes en op ijs plaatsen. 5. Bereid de mastermixen op ijs. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen Pag. 15

17 12 Stap-voor-stap instructies 6. Gebruik de volgende tabel als richtlijn voor het bereiden van een mastermix voor elk van KRAS Exon 2, KRAS Exon 3, KRAS Exon 4A, KRAS Exon 4B reacties, NRAS Exon 2, NRAS Exon 3 en NRAS Exon 4 reacties: Aantal reacties (7 Monsters + 3 controles): 10 Volumeberekening: Watervolume (µl) 330** DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) 50 dntp's (µl) 40 Forward Primer (µl) 25 Reverse Primer (µl) 25 DNA Polymerase (µl) 10 Totaal volume mastermix 48.0 **N.B.: De gebruiker dient ernaar te streven minimaal 25 ng DNA per 50 µl PCRreactie te hebben. Wanneer geëxtraheerde DNA-concentraties minder zijn dan 12,5 ng/µl, het volume van geëxtraheerd DNA proportioneel verhogen om 25 ng per reactie zeker te stellen. Verlaag ook het watervolume in de mastermixen met dezelfde hoeveelheid om te resulteren in 50 µl per reactie. Alle met deze mastermixen bereide monsters dienen geëxtraheerd DNA verdund te hebben tot ongeveer hetzelfde laagste concentratieniveau. Het gebruik van geëxtraheerde DNA-concentraties van minder dan 5 ng/µl wordt afgeraden. 7. Bereken de benodigde volumes voor elke gegeven mastermix door middel van referentie met de bovenstaande tabel; N.B.: (a) Voor mastermix 1, KRAS Exon 2, zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 2 en de KRAS Exon 2 geen-templatecontrole (NTC1). (b) Voor mastermix 2, KRAS Exon 3, zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 3 en de KRAS Exon 3 geen-templatecontrole (NTC2). (c) Voor mastermix 3, KRAS Exon 4A zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4A en de KRAS Exon 4A Geen-templatecontrole (NTC1). (d) Voor mastermix 4, KRAS Exon 4B zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4B en de KRAS Exon 4B Geen-templatecontrole (NTC4). (e) Voor mastermix 5, NRAS Exon 2 zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn voor de NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 en de NRAS Exon 2 Geen-templatecontrole (NTC5). (f) Voor mastermix 6, NRAS Exon 3 zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn voor de NRAS Control Wild-Type, de NRAS Positive Control Exon 3 en de NRAS Exon 3 Geen-templatecontrole (NTC6). (g) Voor mastermix 7, NRAS Exon 4 zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn voor de NRAS Control Wild-Type, de NRAS Positive Control Exon 4 en de NRAS Exon 4 Geen-templatecontrole (NTC7). N.B.: houd er rekening mee dat een iets groter mastermixvolume dan deze berekening nodig zal zijn om verliezen tijdens het pipetteren op te vangen. 8. Voorzie 0,2 ml PCR-buisjes of wells van een 96-wellsplaat van een etiket met de juiste monsterinformatie. 9. Voorzie 2,0 ml centrifugebuisjes voor het bereiden van mastermix van een etiket. 10. Voeg de gewenste hoeveelheid moleculaire-biologieklasse water toe aan de 2,0 ml centrifugebuisjes met het etiket "Mastermix". Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pag. 16

18 12 Stap-voor-stap instructies 11. Voeg de gewenste hoeveelheid DNA Polymerase 10X PCR Buffer aan de mastermixbuisjes toe. 12. Voeg de gewenste hoeveelheid van de 10 mm dntp's toe aan de mastermixbuisjes. 13. Voeg de gewenste hoeveelheid van de KRAS of NRAS Forward Primers toe aan hun respectievelijke mastermixbuisjes. 14. Voeg de gewenste hoeveelheid van de KRAS of NRAS Reverse Primers toe aan hun respectievelijke mastermixbuisjes. 15. Neem de DNA Polymerase (PN ) uit de vriezer. 16. Centrifugeer de DNA Polymerase gedurende ~10 seconden. 17. Vortex de DNA Polymerase gedurende ~10 seconden. 18. Voeg de gewenste hoeveelheid van de DNA Polymerase toe aan de mastermixbuisjes. 19. Doe de dop op de mastermixbuisjes. 20. Vortex de mastermixbuisjes vóór gebruik gedurende ~30 seconden en centrifugeer vervolgens kort gedurende ~10 seconden. 21. Bewaar op ijs tot gebruik. 22. Pipetteer 48,0 µl (zie bovenstaande opmerking in stap 6) van de mastermix in de juiste wells, vervang pipettips tussendoor bij gebruik van een enkelkanaalspipet. Zorg er bij gebruik van een herhalingspipet voor dat er van de ene well naar de andere niet wordt gemorst of gespetterd. Houd de plaat op ijs. 23. Doe 2,0 µl (zie bovenstaande opmerking in stap 6) van elke monstertemplate DNA of water (geen templatecontrole, NTC) in de juiste wells. Gebruik afzonderlijke pipettips voor elk monster en vermijd kruisverontreiniging van de monsters door spetteren. Doe, zodra u klaar bent met pipetteren, een dop op de wells met de monster-dna's en de NTC met de 8-dopsstrips (wanneer u een 96-wellsplaat gebruikt) of doe een dop op de 0,2 ml PCRbuisjes. Controleer of de doppen goed zijn gesloten. 24. Open pas daarna één voor één de controle template DNA's (PN's , , , , , , , & ) van de kits. Pipetteer 2,0 µl van elk van de controletemplates het laatst om de kans op verontreiniging van een DNA-monster te verminderen. Doe opnieuw op elke well een dop met de 8-dopsstrips (wanneer u een 96-wellsplaat gebruikt) of doe een dop op de 0,2 ml-pcr-buizen. Controleer of de doppen goed zijn gesloten. N.B.: Goede praktijk is het plaatsen van de geen-templatecontroles (NTC) in wells die zich niet naast Positive Controls of monsters bevinden. N.B.: Voor een suggestie over hoe 96-wellplaten opgezet moeten worden voor analyse van alle KRAS en NRAS exons 2-4 zie Bijlage A.1 Plaat-lay-outplan voor SURVEYOR Scan Kits. 25. Vortex (~1/2 toerental) gedurende 10 seconden. 26. Centrifugeer gedurende 1-2 minuten om zeker te stellen dat alle oplossingen op de bodem van de wells of buisjes worden verzameld. Verifieer of de oplossingen zich onderin elke well of elk buisje bevinden. Indien dit niet het geval is, het centrifugeren herhalen. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen Pag. 17

19 12 Stap-voor-stap instructies 12.6 Thermisch cyclerprogramma voor amplificatieprotocol 1. Gebruik het volgende thermische cyclerprotocol voor PCR-amplificatie en heteroduplexvorming: 15 cycli 30 cycli Eerste denaturatie 95 C 5 minuten Touchdownamplificatie 95 C 30 seconden 62 C, -0,5 ºC/cyclus 30 seconden 72 C 25 seconden Amplificatie 95 C 30 seconden 55 C 30 seconden 72 C 25 seconden Eindextensie 1 cyclus 72 C 2 minuten Heteroduplex-vorming 95 ºC 2 minuten 12 C 12.7 Kwaliteitscontrole van PCR-producten Stoppen 1. Het is raadzaam dat amplicon-kwaliteit en kwantiteit worden gecontroleerd door middel van gelelektroforese (of gelijksoortige middelen) alvorens door te gaan naar SURVEYOR Nuclease-digestie. 2. Analyseer een deel van het PCR-product samen met een aantal verschillende hoeveelheden van een 100-bp DNA-massaladder. 3. Gebruik de ladder om de concentratie van het geamplificeerde DNA te bepalen. 4. Er mag slechts een enkele band van meer dan 20 ng/µl, die overeenkomt met het hoofd PCR-product, te zien zijn. 5. Wanneer er meerdere banden aanwezig zijn, controleer dan of de kwaliteit van het inputtemplate-dna voldoende was (zie Bijlage B Opsporen en oplossen van problemen). 6. Wanneer geen product wordt opgemerkt, controleer dan of de kwaliteit van het inputtemplate-dna voldoende was (zie Bijlage B Gids voor het opsporen en oplossen van problemen). Wanneer de kwaliteit voldoet aan de specificaties, verhoog dan het templatevolume tot 4,0 µl per 50 µl reactie (verminder het water per reactie tot 31,0 µl). 7. Er mogen geen PCR-producten zichtbaar zijn in het geen-template-controlemonster. Wanneer er DNA-producten zichtbaar zijn, is bij deze controle verontreiniging waarschijnlijk; zie Bijlage B - Gids voor het opsporen en oplossen van problemen. 8. Beoordeel de PCR als Robuuste PCR of Zwakke PCR. a. Robuuste PCR dient een enkele band van meer dan of gelijk aan 20 ng/µl te hebben. b. De zwakke PCR dient een enkele band van minder dan 20 ng/µl te hebben. c. Ga door naar SURVEYOR Nuclease digestie met zowel Robuuste als Zwakke PCR-beoordelingen. TIP: in dit stadium kunnen PCR-producten bij minder dan of gelijk aan -20 ºC gedurende maximaal één week worden opgeslagen. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pag. 18

20 12 Stap-voor-stap instructies 12.8 SURVEYOR Nuclease Digestie 1. Nadat het monster-pcr van voldoende kwaliteit en kwantiteit wordt geacht, voert u de SURVEYOR Nuclease digestiereactie op de hieronder beschreven wijze uit. Een monsterconcentratie van meer dan of gelijk aan 20 ng/µl is noodzakelijk voor optimale digestie door middel van SURVEYOR Nuclease. 2. Ontdooi de buisjes met 0,15 M MgCl 2 Solution en SURVEYOR Enhancer Cofactor op ijs. 3. Voeg 10,0 µl van elk hierboven vermeld PCR-geamplificeerd monster toe aan een nieuwe 0,2 ml-pcr-buis of well van een 96-wellsplaat. 4. Bereid een vers mengsel van 0.15 M MgCl 2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 en SURVEYOR Nuclease W (SURVEYOR Nuclease mengsel). Gebruik de volgende tabel als richtlijn voor het bereiden van een SURVEYOR Nuclease Digest mastermix voor analyse van meerdere monsters. Het onderstaande voorbeeld heeft de volumes voor een mastermix voor 10 monsters. Houd er rekening mee dat een iets groter mastermixvolume dan deze berekening nodig zal zijn om verliezen tijdens het pipetteren op te vangen. Aantal SURVEYOR Nuclease Digestreacties: 10 Volumeberekening: 0.15 M MgCl 2 Solution (µl) 10.0 SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl) 10.0 SURVEYOR Enhancer W2 (µl) 10.0 SURVEYOR Nuclease W (µl) 20.0 Totaal mastermixvolume: 50.0 Voeg aan elke 5 µl SURVEYOR Nuclease mastermix PCR-geamplificeerd monster (µl) 10.0 Totaal volume SURVEYOR Nuclease Digestreactie: 15.0 a. Centrifugeer elk reagens vóór gebruik. b. Vortex elk reagens voorzichtig voorafgaand aan pipettering; centrifugeer kort gedurende ~10 seconden na elke vortexstap. c. Voeg voor elke digestie de volgende componenten toe aan een 0,2 ml-pcr (of groter) microcentrifugebuis. 1.0 µl 0.15 M MgCl 2 Solution (PN ) 1.0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN ) 1.0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (PN ) 2.0 µl SURVEYOR Nuclease W (PN ) Of voeg 5 µl mastermix zoals bereid in de bovenstaande tabel toe. 5. Vortex voorzichtig de SURVEYOR Nuclease-digest mastermix gedurende 10 seconden op lage snelheid 6. Centrifugeer de SURVEYOR Nuclease-digest mastermix gedurende 10 seconden op lage snelheid. 7. Zet de SURVEYOR Nuclease-digest Master Mix tot gebruik op ijs. N.B.: De in Stap 7 bereide SURVEYOR Nuclease Digest mastermix dient onmiddellijk te worden gebruikt daar SURVEYOR Nuclease W na verloop van tijd inactief wordt in aanwezigheid van andere SURVEYOR Nuclease Digest mastermixcomponenten. 8. Pipetteer een 5,0 µl-deel van de SURVEYOR Nuclease Digest mastermix in elke buis of well die een 10,0 µl deel van PCR-geamplificeerd product bevat (zie bovenstaande Stap 3). Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen Pag. 19

21 12 Stap-voor-stap instructies 9. Na het pipetteren de 0,2 ml-pcr-buizen of 96-wellsplaat gedurende 10 seconden centrifugeren. 10. De 0,2 ml-pcr reageerbuizen of 96-wellsplaat gedurende 10 seconden voorzichtig vortexen. 11. Gedurende 10 seconden bij lage snelheid centrifugeren (deze stap is met name belangrijk wanneer de digestie wordt uitgevoerd in een instrument zonder verwarmde deksel). 12. Gedurende 30 minuten bij 42 C incuberen. 13. Voeg 1,0 µl SURVEYOR Stop Solution (PN ) toe aan elke buis of well en vortex voorzichtig (totaal SURVEYOR Nucleasereactievolume is 16,0 µl). TIP: SURVEYOR digestieproducten kunnen maximaal één week worden opgeslagen bij -20 ºC. 14. Laad de monsterdigests op een DHPLC-systeem. N.B.: Voor voorgestelde DHPLC-systeemgradiëntinstellingen voor het analyseren van SURVEYOR Nuclease digests, kunt u bezoeken. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen Pag. 20

22 13 Controleprocedures 13 Controleprocedures 13.1 Kwaliteitscontrole van de CRC RAScan Combination Kit In de kit bevinden zich controleplasmide-dna's om kwaliteitscontroles op specifieke stappen in de assayprocedure te bieden. Voor het Amplificatieprotocol, bieden deze controles een middel om zeker te stellen dat de mastermixen correct worden bereid en amplificatie correct functioneert. Controles zonder template (waar water wordt toegevoegd in plaats van template-dna) zijn ook nodig om te controleren op mogelijke verontreiniging van kitcomponenten met ongeacht welke DNA-template van buitenaf. In de SURVEYOR Nuclease digestiefase geven de amplicons van deze controleplasmide-dna's na een effectieve controle aan dat de knipreactiecondities (SURVEYOR Nuclease Digest mastermixbereidings- en incubatiecondities) bevredigend waren. In de analysefase bieden de DHPLC systeemchromatogram van de SURVEYOR Nuclease gedigesteerde controle-amplicons richtlijnen met betrekking tot waar het knipproduct een piek bereikt in overeenstemming met die mutaties in KRAS en NRAS Exons 2, 3 and 4, zelfs op lage niveaus, zullen eluteren (zie Figuren 4-10). Knipproductpieken die overeenkomen met andere mutaties in KRAS of NRAS Exons 2, 3 en 4 kunnen in iets andere posities eluteren. Wanneer de PCR-amplicons niet overeenkomen met de resultaten die worden omschreven in Kwaliteitscontrole van PCR-producten, raadpleeg de Bijlage B - Gids voor het opsporen en oplossen van problemen of neem contact op met de Technische ondersteuning van Transgenomic alvorens door te gaan met volgende stappen bij de analyse van monsters. Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pag. 21

23 13 Controleprocedures 13.2 Gebruik van controleplasmide-dna's De kits worden geleverd met negen controle-dna's: KRAS Control Wild-Type; PN KRAS Positive Control Exon 2; PN KRAS Positive Control Exon 3; PN KRAS Positive Control Exon 4A; PN KRAS Positive Control Exon 4B; PN NRAS Control Wild-Type; PN NRAS Positive Control Exon 2; PN NRAS Positive Control Exon 3; PN NRAS Positive Control Exon 4; PN Deze controle-dna's zijn plasmiden met inserties. De Positive Controls bevatten elk twee plasmiden: een mengsel van de KRAS of NRAS Control Wild-Type en een mutatiekloon die verschilt van het Wild-Type bij een enkel basepaar. De controles worden in afzonderlijke flacons geleverd, elk in een concentratie van 10 5 kopieën/µl. KRAS en NRAS Exons 2, 3 en 4 Forward en Reverse PCR-primers die nodig zijn voor PCRamplificatie worden afzonderlijk geleverd in de kits. Volg de instructies die u kunt vinden in Amplification Protocol, SURVEYOR Nuclease digestie en analyse van KRAS en NRAS Exons 2, 3 & 4 met behulp van SURVEYOR Nuclease voor het gebruik van deze controles. WIJ ADVISEREN PERSONEN DIE DIT VOOR HET EERST GEBRUIKEN MET KLEM ALLEEN TE EXPERIMENTEREN MET DE CONTROLES ALVORENS GENOMISCHE MONSTERS TE TESTEN 14 Interpretatie van de resultaten 14.1 Analysis van KRAS en NRAS Exons 2, 3 en 4 met behulp van SURVEYOR Nuclease Voor vergelijkings- en controle doeleinden, ALTIJD SURVEYOR Nuclease digestie uitvoeren op elk van de controles (Wild-Type en Positive Controls), een geen-template controle, evenals de monster-dna's en laat in hetzelfde DHPLC-systeem monsterplaat draaien. In de SURVEYOR Nucleasedigestiefase, geven de amplicons van deze 3 Controle Plasmide- DNA s na een effectieve controle aan dat de knipreactiecondities (SURVEYOR Nucleasemengselbereidings- en incubatiecondities) bevredigend waren. In de analysefase bieden de DHPLC-systeemsporen van deze SURVEYOR Nuclease gedigereerde controle-amplicons richtlijnen vanwaar de DNA-fragmenten resulterend uit knippen op deze specifieke mutatiesmismatchlocaties, zelfs op lage niveaus, zullen eluteren (zie Figuren 4-10). Wanneer hetzij de PCR-amplicons of de SURVEYOR Nuclease knipfragmenten die zijn ontleend aan de controle-dna's niet overeenkomen met de omschreven resultaten, raadpleeg dan de Bijlage B - Gids voor het opsporen en oplossen van problemen of neem contact op met Technische ondersteuning van Transgenomic alvorens door te gaan met andere stappen in de analyse van monsters. De hieronder gegeven voorbeelden zijn uitsluitend voor illustratiedoeleinden en dienen NIET te worden gebruikt om de identiteit van een gegeven mutatie te bepalen. Bevestiging van de identiteit van een mutatie is nodig voor het ondubbelzinnig bepalen van de aanwezigheid van een specifieke base-verandering in Exons 2, 3 of 4 van de KRAS en NRAS genen. SURVEYOR Nuclease knipt in alle mismatches die het resultaat zijn van heteroduplexvorming tussen Wild-Type en mutante DNA's, niet alleen mutaties in Exons 2, 3 of 4.SURVEYOR Nuclease bevestigt de aanwezigheid van een mismatch. De specifieke identiteit van de base-verandering is nodig voor het bepalen van KRAS- en NRAS- Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pag. 22