Bioveiligheid in het laboratorium

Transcriptie

1 VLAAMS INTERUNIVERSITAIR INSTITUUT VOOR BIOTECHNOLOGIE UNIVERSITEIT GENT Universiteit Antwerpen Bioveiligheid in het laboratorium 3de herziene editie

2 Bioveiligheid in het laboratorium 3e herziene editie, mei 2004 Uitgave van VIB, Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie Redactie: René Custers, regulatory affairs manager, VIB VIB Rijvisschestraat Zwijnaarde tel.: fax.: web: Verantwoordelijke uitgever: Jo Bury, VIB Rijvisschestraat Zwijnaarde Niets uit deze uitgave mag worden verveelvuldigd en/of openbaar gemaakt voor commerciële doeleinden. Voor educatieve doeleinden dient steeds de bron vermeld te worden. Mei 2004

3 VOORWOORD Dit is de derde, herziene editie van het boekje Bioveiligheid in het laboratorium. In dit boekje vindt u alle informatie terug uit de eerste en tweede editie. Er zijn slechts lichte aanpassingen en aanvullingen gedaan, met name in de tekst over ontsmetting en inactivatie. Moderne biotechnologie is een belangrijke technologie in het huidige biologische en biomedische onderzoek. Duizenden onderzoekers in de levenswetenschappen gebruiken dagelijks micro-organismen, planten of dieren op zoek naar de antwoorden op relevante wetenschappelijke vragen. Het gebruik van genetisch gemodificeerde organismen (GGO s) neemt daarin toe. Het is de onderzoekswereld zelf die in het verleden gewezen heeft op het belang van het veilig werken met GGO s. Vandaag zijn er heel wat wetgevingen en richtlijnen van toepassing op GGO s die het doel hebben mens en milieu te beschermen. We willen het belang van het veilig en verantwoord werken met biologisch materiaal en GGO s onderstrepen. Het behoort tot de maatschappelijke verantwoordelijkheid van de onderzoeker om de nodige veiligheidsregels na te leven. Daarnaast behoort het tot de verantwoordelijkheid van de onderzoeker om studenten, of andere mensen die nog weinig werkervaring hebben, op te leiden in de theoretische en praktische aspecten van de bioveiligheid. We hopen dat dit boekje, samen met praktische instructies en begeleiding, een nuttig werkinstrument blijkt om mensen op een veilige manier te verwelkomen in de fascinerende wereld van het biotechnologisch onderzoek. Jo Bury en Rudy Dekeyser algemene directie VIB Voorwoord 3

4 INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING BIOVEILIGHEID INDELING IN RISICOKLASSEN EN RISICO-ANALYSE DE VERSPREIDING VAN ORGANISMEN IN HET LABORATORIUM INPERKING: EEN COMBINATIE VAN INFRASTRUCTUUR EN WERKVOORSCHRIFTEN BESMETTING, ACCIDENTEN, ONTSMETTING EN INACTIVATIE WERKEN MET ENKELE VEELGEBRUIKTE LABORATORIUM-ORGANISMEN REFERENTIES VERKLARENDE WOORDENLIJST BIJLAGE 1: INPERKINGSVEREISTEN BIJLAGE 2: VIB RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN MET GGO S BIJLAGE 3 : DE BIOLOGISCHE RISICOKLASSE VAN ENKELE RELEVANTE PATHOGENEN...64 BIJLAGE 4: LEESCOMMISSIE BIJLAGE 5: INFORMATIEBLAD BIJLAGE 6: ZELFTOETS Inhoudsopgave

5 1. INLEIDING In veel biotechnologisch en biomedisch onderzoek wordt gewerkt met biologisch materiaal. In steeds grotere mate wordt daarbij gebruik gemaakt van moderne moleculair biologische technieken zoals recombinant-dna technologie. In dit boekje wordt een kort overzicht gegeven van de basisprincipes die van belang zijn voor het veilig werken met genetisch gemodificeerde en/of ziekteverwekkende organismen. Daarbij zijn drie typen van beschermende veiligheidsmaatregelen te onderscheiden: a. bescherming van de onderzoeker, b. bescherming van het experiment, en c. bescherming van mens en milieu De verschillende maatregelen zullen in dit boekje zowel worden uitgewerkt voor microorganismen als voor planten en dieren. Iedereen die in een laboratorium met deze organismen werkt moet de basisbegrippen van bioveiligheid kennen en er in de dagelijkse laboratoriumpraktijk naar handelen. Alleen op die manier kan een werksituatie worden gecreëerd die veilig is voor uzelf, voor de medemens en voor het milieu. Het veilig werken met biologisch materiaal wordt bovendien vereist vanuit twee typen van wetgeving die aan de basis liggen van de voorschriften zoals deze in dit boekje worden uitgewerkt: 1. De wetgeving voor de bescherming van de medewerker bij de uitvoering van zijn werk. 2. De milieuwetgeving voor het werken met genetisch gemodificeerde organismen. Voor beide bestaat een Europese wetgeving die in de nationale wetgeving is omgezet. Figuur 1 : Het biohazard teken. Dit teken geeft aan dat er met biologisch risicohoudend materiaal wordt gewerkt (vanaf risicoklasse 2) Inleiding 5

6 2. BIOVEILIGHEID Wat is bioveiligheid? De bioveiligheid van laboratoriumwerk staat centraal in dit boekje. Daarbij gaat het om de intrinsieke gevaren van levende organismen en hoe deze veilig te hanteren. Ook genetisch materiaal zoals naakt DNA kan gevaarlijk zijn. Voordat werk met pathogene of genetisch gemodificeerde organismen (GGO s) in een laboratorium wordt gestart, moet stilgestaan worden bij de eigenschappen van die organismen en moeten waar nodig maatregelen worden getroffen om eventuele risico s voor mens of milieu tot een minimum te beperken. Safety first! Welke gevaren? Biologisch materiaal en levende organismen zijn noch intrinsiek gevaarlijk, noch intrinsiek veilig. Eventueel gevaar hangt af van de eigenschappen van een organisme. Eigenschappen van organismen die gevaar inhouden, zijn de volgende: Pathogeniteit De pathogeniteit geeft aan of een organisme - bijvoorbeeld een bacterie, virus, schimmel, of parasiet - in staat is een ziekte te veroorzaken bij een plant, dier of mens. Factoren zoals infectiedosis, virulentie en productie van toxines door de ziekteverwekker spelen een rol in de mate waarin het organisme in staat is een ziekte te veroorzaken. Infectiedosis Besmetting met één pathogeen betekent nog niet automatisch een infectie. De infectiedosis verschilt van pathogeen tot pathogeen. Hieronder volgen enkele voorbeelden van enkele voor de mens relevante infectiedosissen van pathogenen wanneer zij via hun natuurlijke verspreidingsweg verspreid worden: Pathogeen adenovirus influenza virus tuberculose bacteriën typhus bacteriën Infectieuze dosis > 150 pfu (intranasaal) 790 pfu (nasopharyncheaal) 10 bacillen (inhalatie) 10 5 bacteriën (ingestie) pfu = plaque forming units Bron: Material Safety Data Sheets, Health Canada Toxiciteit Toxiciteit is vergiftiging. De meeste stoffen zijn bij normaal gebruik niet in staat een vergiftiging te veroorzaken. De mate van toxiciteit wordt meestal aangegeven in een 6 VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

7 LD50 waarde voor vertebraten uitgedrukt in gewichtseenheden per kg lichaamsgewicht. De LD50 (LD staat voor: Lethal Dose) is de waarde waarbij blootstelling aan het agens tot gevolg heeft dat 50% van de blootgestelde proefdieren dood gaat. Als het gaat om levende organismen (voornamelijk bacteriën), dan gaat toxinevorming vaak gepaard met pathogeniteit. Allergeniteit Allergeniteit is een niet-toxische, door het immuunsysteem gemedieerde, ongewenste reactie van het lichaam op een stof of agens. Immuunglobuline E (IgE) en mestcellen (cellen van het immuunsysteem die onder meer heparine produceren) spelen vaak een rol in de allergische reactie. Een allergische reactie kan zich onder meer uiten in huidirritaties, niezen, astmatische aanvallen, chronische longaandoeningen en kan soms zelfs leiden tot een levensbedreigende shock. Ter voorkoming van long- en huidaandoeningen bij laboratoriumpersoneel dient de mogelijkheid van een allergische reactie mee in overweging genomen te worden en dient ernaar gestreefd te worden om rechtstreeks contact (inademen, huidcontact) van het personeel met allergene stoffen te vermijden. Verstoring van ecologische evenwichten Hier is het met name van belang om mogelijke verstoringen van ecologische evenwichten die verband houden met activiteiten met genetisch gemodificeerde organismen (GGO s) te bespreken. Verstoring van een ecologisch evenwicht zou kunnen gebeuren wanneer een GGO met een bepaalde eigenschap zich ongewenst naar het milieu verspreidt, of wanneer er vanuit dat organisme verspreiding plaatsheeft van genetisch materiaal naar andere organismen in het milieu. Aan de potentiële gevaren die verbonden zijn aan recombinant-dna technologie en de risico-inschatting daarrond zal verderop in dit boekje dieper worden ingegaan. Andere schadelijke effecten Soms zijn er ook andere ongewenste effecten die maken dat extra voorzichtigheid geboden is bij het hanteren van biologisch materiaal. Het is niet mogelijk een limitatieve lijst te maken van dergelijke effecten. Waar het echter om gaat is dat men stil moet staan bij de eigenschappen van materiaal voor ermee te gaan werken. Als belangrijkste categorie kunnen misschien de genen aangeduid worden die immuunmodulerende eigenschappen bezitten. Daarbij is echter lang niet elke immuunmodulatie schadelijk. Om uitsluitsel te geven over het gevaar moeten de eventuele effecten worden nagegaan en is vaak overleg aangewezen. Ter illustratie kan het voorbeeld gegeven worden van het werken met een vacciniavirus waarin een gen gekloneerd is dat voor immuunsuppressie zorgt. De immuunsuppressie zou ervoor kunnen zorgen dat het lichaam een mogelijke infectie met dat virus niet goed kan bestrijden. Infecties met vacciniavirus kunnen in uitzonderlijke gevallen leiden tot een dodelijke encephalitis. Bioveiligheid 7

8 Werken met naakt DNA We worden in onze leefomgeving dagelijks geconfronteerd met DNA. In het laboratorium wordt vooral gewerkt met DNA in de vorm van plasmiden, gedigesteerd DNA, of primers. DNA op zich is ongevaarlijk. Maar toch is het werken met DNA niet altijd ongevaarlijk. Met name wanneer het DNA codeert voor een cellulair oncogen. Met een oncogen wordt in dit geval een dominant transformerend gen bedoeld: een gen dat na incorporatie in het genoom de transformatie* van de cel als directe gevolg heeft. Transformatie de omvorming naar een snel en oneindig delende cel - is de belangrijkste eerste stap in tumorvorming. Een prikaccident met dergelijk materiaal brengt een risico met zich mee. Medewerkers die met dit materiaal werken dienen zich bewust te zijn van het risico, dienen handschoenen te dragen en moeten het werken met scherpe voorwerpen tot een minimum beperken. Eenmaal dit DNA in een bacterie of een cel geïncorporeerd is, brengt het niet langer een verhoogd risico met zich mee. Tenzij de cel een packagingcel is waarin het oncogen door een virale vector kan worden opgenomen die het oncogen verder kan verspreiden. Oncogenen en virale vectoren Het kloneren van DNA dat codeert voor een dominant transformerend cellulair oncogen brengt met name een extra risico met zich mee wanneer het in een virale vector wordt gezet die in het genoom integreert. Daarbij wordt onderscheid gemaakt tussen amphotrope en ecotrope virale vectoren aangezien de laatste alleen muizencellen kunnen infecteren. Amphotrope vectoren kunnen ook mensen infecteren en brengen dus een hoger risico met zich mee dan ecotrope. *zie verklarende woordenlijst 8 VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

9 3. INDELING IN RISICOKLASSEN EN RISICO-ANALYSE Pathogene organismen Organismen worden ingedeeld in vier risicoklassen. Organismen die geen ziekten verwekken horen thuis in risicogroep 1. Ziekteverwekkers horen thuis in de groepen 2, 3 en 4, afhankelijk van de mate van ziekteverwekkendheid en de mate waarin therapieën beschikbaar zijn. Om een onderscheid aan te kunnen geven met de risicoklassen voor GGO s wordt de risicoklasse van een natuurlijk pathogeen vaak aangeduid als de biologische risicogroep. Hieronder volgt een overzicht van de definities van de verschillende risicogroepen: Groep 1 Groep 2 Groep 3 Zeer onwaarschijnlijk dat het agens een ziekte veroorzaakt in mensen, dieren of planten. Humane pathogenen Dierpathogenen Fytopathogenen Humane pathogenen Dierpathogenen Fytopathogenen (micro-)organismen die bij de mens een ziekte kunnen verwekken en een gevaar vormen voor de personen die er rechtstreeks mee in contact komen. Hun verspreiding in de gemeenschap is onwaarschijnlijk. Er bestaat meestal een profylaxis of een effectieve behandeling. (micro-)organismen die bij dieren een ziekte kunnen veroorzaken en die in verschillende mate één van de volgende eigenschappen bezitten: beperkte geografische belangrijkheid, overdracht naar andere zwakke of onbestaande species, afwezigheid van vectoren of dragers. Er is een beperkte economische en/of medische impact. Men beschikt meestal over profylactische middelen en/of over efficiënte behandelingen. (micro-)organismen die bij planten een ziekte kunnen veroorzaken, maar waarbij in geval van accidentele verspreiding in het Belgisch leefmilieu geen verhoogd risico voor epidemie bestaat. Het betreft overal voorkomende pathogenen waarvoor er profylactische of therapeutische middelen voorhanden zijn. De niet-inheemse of exotische fytopathogenen, (micro-)organismen die niet in staat zijn om in het Belgische leefmilieu te overleven vanwege de afwezigheid van targetplanten of vanwege ongunstige weersomstandigheden, behoren eveneens tot deze risicogroep. (micro-)organismen die bij de mens een ernstige ziekte kunnen verwekken en een gevaar vormen voor de personen die er rechtstreeks mee in contact komen. Er is een mogelijk risico voor verspreiding in de gemeenschap. Er bestaat meestal een profylaxis of een efficiënte behandeling (micro-)organismen die bij dieren een ernstige ziekte of een epizoötie kunnen veroozaken. Er kan een belangrijke overdracht tussen verschillende species optreden. Bepaalde van deze pathogene agentia vereisen het instellen van sanitaire reglementeringen voor de door de overheid van elk land in kwestie geïnventariseerde species. Er bestaan meestal medische en/of sanitaire profylaxen. (micro-)organismen die bij planten een ziekte kunnen veroorzaken die effect heeft op de economie of op het leefmilieu en waarvoor Indeling in risicoklassen en risico-analyse 9

10 Groep 4 Humane pathogenen Dierpathogenen Fytopathogene quarantaineorganismen een behandeling ofwel zeer duur uitvalt, ofwel moeilijk toe te passen is, ofwel zelfs niet bestaat. Accidentele verspreiding van deze (micro-) organismen kan het risico op lokale epidimieën doen toenemen. Exotische stammen van fytopathogene (micro-)organismen die gewoonlijk voorkomen in het Belgische leefmilieu en niet opgenomen werden in de lijst van quarantaineorganismen maken eveneens deel uit van deze risicogroep. (micro-)organismen die bij de mens een ernstige ziekte kunnen verwekken en een ernstig gevaar vormen voor de personen die er rechtstreeks mee in contact komen. Er is een verhoogd risico voor verspreiding in de gemeenschap. Er bestaat meestal geen profylaxis of geen efficiënte behandeling. (micro-)organismen die bij dieren een uiterst ernstige panzoötie of epizoötie kunnen veroorzaken met een erg hoog sterftecijfer of met dramatische economische gevolgen voor de getroffen teeltstreken. Ofwel beschikt men niet over medische profylaxis, ofwel is één exclusieve sanitaire profylaxis mogelijk of verplicht Schadelijke (micro-)organismen waarvan het gebruik is onderworpen aan de maatregelen van federale besluiten inzake de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen. Belgische definities van de verschillende risicogroepen. De meeste definities zijn afgeleid van de WHO classificatie van infectieuze micro-organismen. Naast de indeling van een pathogeen in een risicogroep is het altijd van belang te vermelden welke gastheer het pathogeen heeft. Infectieziekten zijn namelijk een wisselwerking tussen pathogeen en gastheer. Bepaalde pathogenen hebben een breed gastheerbereik, andere kunnen slechts één of enkele gastheren infecteren. Ook kan de biologische risicoklasse van een bepaald pathogeen dat zowel de mens als het dier kan infecteren, per gastheer verschillen. Zo is voor de mens de biologische risicoklasse van Herpes virus B klasse 3 en voor het dier klasse 2. Van de indeling van pathogenen in de biologische risicoklassen zijn lijsten gepubliceerd, waarin de biologische risicoklasse van de verschillende organismen kan worden opgezocht. In België zijn de volgende lijsten relevant: hoofdstuk aan Vlarem II ( en bijlage 1 aan het Koninklijk Besluit van 4 augustus 1996 betreffende de bescherming van de werknemers tegen de risico s bij blootstelling aan biologische agentia op het werk (alleen humaan pathogenen; Belgisch Staatsblad 01/10/1996). In bijlage 3 is de biologische risicogroep weergegeven van enkele relevante pathogenen. Opportunistische pathogenen zijn organismen die alleen een ziekte kunnen veroorzaken in mensen of dieren waarvan het immuunsysteem onvoldoende functioneert. Deze organismen worden ingedeeld in groep VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

11 Aan het werken met niet-genetisch gemodificeerde klasse 1 organismen worden in de wetgeving geen eisen gesteld. Toch is het voor niet-genetisch gemodificeerde klasse 1 micro-organismen en cellen sterk aanbevolen om de basisprincipes van Veilige Microbiologische Technieken (VMT) te hanteren (zie hst 5). Het werken met klasse 2, 3 en 4 agentia mag alleen in speciaal daarvoor uitgeruste laboratoria. Genetisch gemodificeerde organismen (GGO s) Recombinant-DNA technologie is niet meer uit moderne biologische en biomedische onderzoekslaboratoria weg te denken. Escherichia coli K12 is daarbij het werkpaard onder de laboratoriumorganismen en wordt door bijna iedereen gebruikt als middel om DNA te kloneren of tot expressie te brengen. Definitie van een GGO GGO s zijn organismen waarvan het genetisch materiaal is gewijzigd op een wijze die niet mogelijk is door voortplanting of natuurlijke recombinatie. Technieken die leiden tot de vorming van een GGO zijn in ieder geval: * recombinant DNA- en RNA- technieken waarbij gebruik wordt gemaakt van gastheer/vectorsystemen; * technieken waarbij genetisch materiaal dat buiten het organisme is geprepareerd, rechtstreeks in een organisme wordt gebracht, daaronder begrepen micro-injectie, macro-injectie en micro-encapsulatie; * celfusie- of hybridisatietechnieken waarbij levende cellen met nieuwe combinaties van genetisch materiaal worden gevormd die van nature niet voorkomen. De volgende technieken worden niet geacht te leiden tot genetische modificatie, op de voorwaarde dat bij de technieken geen gebruik gemaakt wordt van recombinant DNA moleculen of GGO s: * in vitro bevruchting; * conjugatie, transductie, virale infectie, transformatie * polyploïde-inductie. Uitzonderingen op de regels De volgende GGO s zijn uitgezonderd van de regelgeving en vallen ook niet onder de richtlijnen in dit boekje op voorwaarde dat daarbij geen andere recombinant-nucleïnezuurmoleculen of GGO s worden gebruikt dan die welke geproduceerd zijn door middel van één of meer van de hieronder genoemde technieken: * Mutagenese. * Celfusie (met inbegrip van protoplastfusie) van prokaryotische soorten die genetisch materiaal uitwisselen door middel van bekende fysiologische processen. * Celfusie (met inbegrip van protoplastfusie) van cellen van eukaryotische soorten, met inbegrip van de productie van hybridoma s en de fusie van plantencellen. Indeling in risicoklassen en risico-analyse 11

12 * Zelfklonering, dat wil zeggen het verwijderen van nucleïnezuursequenties uit een cel van een organisme, al dan niet gevolgd door de reïnsertie van dit nucleïnezuur of een deel daarvan (of een synthetisch equivalent) eventueel na een aantal voorafgaande enzymatische of mechanische bewerkingen in cellen van dezelfde soort of cellen van een fylogenetisch nauw verwante soort waarmee eerstgenoemde soort genetisch materiaal kan uitwisselen door middel van bekende fysiologische processen, voorzover het onwaarschijnlijk mag worden geacht dat het resulterende micro-organisme een ziekte kan verwekken bij mens, dier of plant. Bij zelfklonering mag gebruik worden gemaakt van recombinante vectoren waarvan het gebruik in combinatie met de betrokken microorganismen in de loop der tijd veilig is gebleken. Recombinant-DNA GGO s Inmiddels kan een groot aantal organismen genetisch gemodificeerd worden, bijvoorbeeld: bacteriën, gisten, schimmels, insecten (fruitvlieg), parasieten, nematoden, planten, kikkers of zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, geiten, schapen, varkens, runderen). Bij genetische modificatie zijn altijd de volgende componenten betrokken: 1. Een gastheer (het te modificeren organisme); N.B. De term gastheer heeft hier een andere betekenis dan in de context van pathogenen (zie verklarende woordenlijst) 2. Een donorsequentie (of insert), afkomstig uit een bepaald organisme (het donororganisme). Ook wordt steeds vaker gewerkt met een synthetisch vervaardigde sequentie. Deze sequentie kan ofwel van nature in een bepaald organisme voorkomen, ofwel volledig nieuw zijn. 3. En in veel, maar niet alle gevallen een (genetische) vector. Voor transformatie van bacteriën worden meestal plasmiden als vector gebruikt. In andere gevallen worden virussen of virale vectoren gebruikt. Voorbeelden van gevallen waarin geen genetische vector wordt gebruikt zijn de micro-injectie van DNA in de pronucleus van een bevruchte eicel, of de modificatie van een plant met behulp van het genenkanon. Afhankelijk van het gebruikte systeem zal een vector al dan niet aanwezig blijven in het uiteindelijke GGO. De risico-analyse GGO s zijn (net als niet-ggo s) noch intrinsiek gevaarlijk, noch intrinsiek veilig. Daarom wordt per geval een risico-analyse uitgevoerd. De risico-analyse is een drietrapsproces waarin achtereenvolgens: 1. De eigenschappen van de gastheer, vector en donorsequenties die gevaar met zich meebrengen zoals pathogeniteit, toxiciteit, mogelijkheden tot verspreiding van het organisme en overdracht van genetisch materiaal worden geïdentificeerd. Dit leidt tot een eerste identificatie van het niveau van risico. 2. Vervolgens wordt vastgesteld welke maatregelen nodig zijn om het organisme veilig te kunnen hanteren. Daarbij wordt rekening gehouden met: 12 VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

13 * De eigenschappen van het milieu dat aan het GGO zou kunnen worden blootgesteld. * Het type en de schaal van de activiteit. * Eventuele niet-standaard handelingen. 3. Aan de hand van de uitkomst van de stappen 1 en 2 wordt dan de risicoklasse vastgesteld. Net als bij pathogenen worden GGO s ingedeeld in vier risicoklassen, en wel als volgt: Risicoklasse 1 GGO s die geen of een verwaar- Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 1 loosbaar risico inhouden voldoende is om zowel de mens als het milieu te beschermen Risicoklasse 2 GGO s die weinig risico inhouden Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 2 voldoende is om zowel de mens als het milieu te beschermen Risicoklasse 3 GGO s die een matig risico Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 3 inhouden voldoende is om zowel de mens als het milieu te beschermen Risicoklasse 4 GGO s die veel risico inhouden Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 4 voldoende is om zowel de mens als het milieu te beschermen De risicoklassen bepaald door de Europese richtlijn 98/81/EG betreffende het ingeperkt gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen. Er is inmiddels al heel wat ervaring met de risico-analyse van GGO s. Dit heeft geleid tot richtlijnen voor het indelen van GGO s. Deze richtlijnen zijn weergegeven in bijlage 2. Ze zijn niet wettelijk bindend, maar het volgen van deze richtlijnen en de hierboven weergegeven principes voor de risico-analyse vergemakkelijken de implementatie van de wettelijke vereisten. Afhankelijk van het type en de schaal van de activiteit dient nog nagegaan te worden of er bijzondere aanvullende maatregelen nodig zijn of dat er maatregelen van het basisinperkingsniveau achterwege kunnen blijven. De vier inperkingsniveaus voor laboratoria, proefdierverblijven en serres zijn beschreven in bijlage 1. Hieronder wordt een vergelijking gemaakt tussen de indeling van pathogenen en GGO s in risicoklassen en de bijbehorende basisinperkingsniveaus. Klasse Pathogenen GGO s Basisinperking Risicoklasse 1 Niet-pathogenen Geen of verwaar- Niveau 1 voor GGO s, VMT voor loosbaar risico niet-gemodificeerde micro-organismen of cellen* Risicoklasse 2 Zwak pathogenen Weinig risico Niveau 2 Risicoklasse 3 Matig pathogenen Matig risico Niveau 3 Risicoklasse 4 Zware pathogenen Veel risico Niveau 4 * N.B.: niveau 1 omschrijft vereisten voor zowel de infrastructuur als werkvoorschriften, ook al zijn de eisen aan de infrastructuur zeer beperkt. VMT (Veilige Microbiologische Technieken) omschrijft alleen een werkwijze. Indeling in risicoklassen en risico-analyse 13

14 4. DE VERSPREIDING VAN ORGANISMEN IN HET LABORATORIUM Natuurlijke besmettingswegen Pathogenen hebben elk hun eigen besmettingsweg via welke ze van het ene naar het andere organisme overgedragen worden. Hieronder volgen enkele belangrijke besmettingswegen: Besmettingsweg Huidcontact Via de lucht of via aërosolen Prikken (insecten, injectienaalden) Bloed-bloed contact Via wonden Via faecaal materiaal voorbeeld schimmels mazelenvirus griepvirus malariaparasiet gele koorts parasiet HIV-virus hepatitis B virus Staphylococcen Typhus bacteriën Poliovirus Al deze besmettingswegen kunnen, afhankelijk van het type werk dat gedaan wordt, in het laboratorium voorkomen. Bij organismen die zich via de lucht kunnen verspreiden, spelen kleine druppeltjes of druppelkernen een rol, maar kan verspreiding ook plaatsvinden via direct contact met bijvoorbeeld de handen, zakdoeken en kleren. contact druppeltjes druppelkernen druppels stof contact secundaire reservoirs zakdoeken kleren beddegoed contact Figuur 2: Verspreiding van micro-organismen via de lucht 14 VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

15 Verspreidingswegen Blootstelling van laboratoriummedewerkers aan organismen kan op verschillende manieren gebeuren. In principe kan elke open bron van organismen (bijv. een geopende petrischaal) een bron van verspreiding van deze organismen zijn. Nu zal een houder in de praktijk alleen geopend worden wanneer er geen besmetting van het materiaal in de houder kan plaatsvinden, dus bij een vlam, of in een veiligheidskabinet. De praktijk laat zien dat van de meeste laboratoriuminfecties de oorzaak onbekend is. In de gevallen dat de oorzaak wel bekend is gaat het om prikaccidenten, morsen, kapot glaswerk, met de mond pipetteren en om het bijten of krabben door een proefdier. Aërosolen Binnen de verschillende verspreidingswegen verdienen aërosolen bijzondere aandacht. Aërosolen zijn zeer fijne vloeistofdruppeltjes die zich via de lucht kunnen verspreiden. Aërosolen ontstaan bijvoorbeeld bij het openen van flesjes met vloeistoffen waarop een natte stop zit, of bij vortexen, blenden, bij het leegblazen van een pipet of het uitgloeien van een natte entnaald. Aërosolvorming moet zoveel mogelijk worden vermeden. Bij werk met organismen die een bepaald gevaar inhouden (vanaf risicoklasse 2) moeten aërosolproducerende werkzaamheden zoveel mogelijk in een veiligheidskabinet worden uitgevoerd. Gieten van vloeistof Vallende druppels Uitblazen van pipetten Openen van vochtige stoppen Centrifugeren van open buizen te warme entogen Figuur 3: aërosolproducerende handelingen Ongewenste verspreiding van organismen of van genetisch materiaal Zoals hierboven duidelijk mag zijn geworden betekent de verspreiding van voor de mens gevaarlijke organismen een risico voor de medewerker (uzelf of uw collega s). Wanneer verspreiding naar een medewerker mogelijk is, is ook verspreiding naar het milieu niet uitgesloten. Verspreiding van organismen of van genetisch materiaal naar het milieu toe is De verspreiding van organismen in het laboratorium 15

16 vaak ongewenst omdat dit een risico met zich mee kan brengen in de zin van verspreiding van pathogeniteit, toxiciteit of verstoring van een ecologisch evenwicht. Dit geldt zeker voor de pathogenen en de GGO s die in de risicoklassen 2, 3 en 4 thuishoren. Voor de organismen (en hun genetisch materiaal) die thuishoren in risicoklasse 1 - zij brengen geen of een verwaarloosbaar risico met zich mee - geldt ook dat de verspreiding van het organisme of van genetisch materiaal naar het milieu toe moet worden beperkt. Bacteriën, gisten, schimmels Bacteriën zijn in veel gevallen in staat genetisch materiaal over te dragen. Zeker wanneer gewerkt wordt met vectoren die zelfoverdraagbaar zijn. Om te voorkomen dat genetisch materiaal makkelijk wordt overgedragen wordt daarom in de praktijk in de meeste gevallen gewerkt met vectoren die moeilijk of helemaal niet mobiliseerbaar zijn. The plasmid contains genes that code for the sex piliproteins sex pili chromosome Single stand DNA is transferred through the pilus to the receiver Figuur 4: Overdracht van een zelfoverdraagbaar plasmide door middel van conjugatie Zelfoverdraagbaarheid Natuurlijke plasmiden uit bacteriën bezitten soms de eigenschap om zichzelf over te kunnen dragen naar verwante bacteriën. Dit betekent dat zij de genen dragen die zorgen voor de aanmaak van de structuren ( pilli ) waarmee de ene bacterie een verbinding legt met de andere bacterie. Het plasmide wordt dan door dit kanaal overgedragen. De frequentie van overdracht van zelfoverdraagbare plasmiden ligt ook relatief hoog (10-3 tot 10-5 ). Dierlijke en menselijke cellen Dierlijke en menselijke cellen kunnen zich niet zomaar naar het milieu verspreiden. Nietbesmette cellen kunnen ook geen genetisch materiaal ongewenst naar het milieu overdragen. Dierlijke en menselijke cellen zijn ten dode opgeschreven wanneer zij aan een niet- 16 VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

17 steriele omgeving worden blootgesteld. Een uitzondering wordt gevormd door cellen die van nature in een niet-steriele omgeving moeten overleven, zoals bijvoorbeeld vissen- of kikkereicellen. In het geval van niet-besmette cellen zijn de maatregelen die getroffen worden om de celkweek te beschermen ook voldoende om het milieu te beschermen. De overdracht van genetisch materiaal vanuit dierlijke en menselijke cellen naar de omgeving kan alleen wanneer de cellen besmet zijn met biologische agentia - bijv. virussen - die in staat zijn het genetisch materiaal te mobiliseren. De vraag of cellen al dan niet geïnfecteerd zijn is uit oogpunt van bioveiligheid belangrijk. Eventueel aanwezige virussen kunnen een gevaar vormen voor de medewerker of het milieu en maatregelen dienen daarop afgestemd te zijn. Besmette dierlijke cellen en menselijke cellen Bij activiteiten met dierlijke cellen kan onderscheid gemaakt worden tussen primaire celculturen en established cell lines. Primaire celculturen worden gemaakt door een biopt van een dier of mens in cultuur te brengen. Vaak kan van dergelijke cellen niet op voorhand uitgesloten worden dat ze besmet zijn met een ziekteverwekker, bijv. een virus. Daarom dient met primaire cellen altijd enige voorzichtigheid te worden betracht. Established cell lines zijn culturen die al langer in kweek zijn en die geïmmortaliseerd zijn zodat ze oneindig blijven delen. Meestal is gekend of ze vrij zijn van ongewenste besmettingen. De immortalisatie van dergelijke cellen kan op verschillende manieren tot stand zijn gekomen: spontaan (zoals bijv. bij NIH-3T3 cellen), als gevolg van een natuurlijke virale infectie (bijv. HELA cellen, waarin enkele genen van het HPV virus aanwezig zijn), of door de cellen te transfecteren met een factor die immortalisatie tot gevolg heeft. Bij het hanteren van viraal geïmmortaliseerde cellijnen in combinatie met vectoren waarin virale componenten aanwezig zijn, moet altijd nagegaan worden of het mogelijk is dat er viruspartikels gevormd worden. Als dat zo is dient de cellijn ingeschaald te worden in de risicoklasse van het betreffende virus. Virussen Bij virussen kan onderscheid gemaakt worden tussen wild type virussen en virale vectoren (van virus afgeleide virale constructies). Het gebruik van virussen of virale vectoren impliceert ook altijd het gebruik van gastheercellen. Zonder gastheercellen geen vermenigvuldiging van het virus. In de praktijk komen er drie typen handelingen voor: (1) celkweek om virus te produceren, (2) het hanteren van virus bevattende supernatanten (voor kwaliteitscontrole, etc ) en (3) het transduceren van een te onderzoeken cellijn, proefdier of plant. Zeker in de virussupernatanten kan het virus in grote hoeveelheden en geconcentreerd aanwezig zijn. Voorzichtigheid bij het hanteren van de supernatanten is geboden. Na infectie van cellen, plant of proefdier hangt het gevaar af van de mogelijkheden van het virus of de virale vector om zich nog te kunnen vermenigvuldigen. Soms wordt gewerkt met replicatiedefectief virus, wat betekent dat het virus wel de cellen kan infecteren, maar De verspreiding van organismen in het laboratorium 17

18 zich niet meer kan vermenigvuldigen. De verspreidings- en overlevingsmogelijkheden verschillen van virus tot virus. Sommige viruspartikels kunnen via de lucht verspreiden en kunnen soms buiten de gastheer lang overleven. Andere virussen, zoals bijvoorbeeld HIV, zijn buiten de gastheer zeer kwetsbaar. Plantenvirussen hebben soms een vector nodig om zich te kunnen verspreiden: vaak een insect die het virus opzuigt en zo de verspreiding naar andere planten bewerkstelligt. Transgene planten Transgene planten worden in-vitro gekweekt, in fytotrons/kweekcellen en in serres en ze lopen niet zomaar weg. Toch verdient de ongewenste verspreiding naar het milieu bijzondere aandacht. Zonder de juiste maatregelen kunnen pollen (stuifmeel) zich via de lucht of met behulp van insecten naar het milieu verspreiden. Of dit een reëel risico vormt hangt af van de vraag of de plant een zelfbevruchter is of een kruisbevruchter. Bij een strikte zelfbevruchter blijft de verspreiding van pollen immers zonder effect. In het geval van een kruisbevruchter is van belang na te gaan of er bloeiende verwante planten in het milieu voorkomen waarmee de plant zou kunnen hybridiseren (kruisbevruchten). Daarnaast kunnen zaden van transgene planten zich soms gemakkelijk ongewenst verspreiden. Zaden kunnen heel fijn of kleverig zijn en worden dan gemakkelijk meegenomen door een onderzoeker die een kweekcel of serre verlaat. pollen zaad stengelbasis Figuur 5: de reproductieve delen van Brassica Niet alleen pollen en zaden kunnen aanleiding geven tot de ongewenste verspreiding van genetisch materiaal van planten. Ook bepaalde plantendelen kunnen soms, afhankelijk van de plant, nog gemakkelijk uitgroeien tot een hele plant. Zo kan een takje van een wilg nog uitgroeien tot een hele boom en kan de stronk van kool nog wortel schieten. Dit betekent dat bij het hanteren van transgene planten of transgeen plantenmateriaal speciale aandacht moet worden besteed aan de mogelijke verspreiding van de delen van de plant die (nog) reproductief zijn. Indien er een reële kans bestaat dat de plant zich in het milieu kan vestigen of indien uitkruising naar (bloeiende) verwanten mogelijk is, dient reproductief plantenmateriaal eerst gedood te worden voordat het als afval wordt afgevoerd. 18 VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

19 De verspreiding van transgene planten of transgeen plantenmateriaal Pollen Zaden Reproductieve delen Zandraket In een serre is Arabidopsis een De zaden zijn erg klein. Bij aanra- Alleen pollen en zaden. zelfbevruchter. De kans dat ver- king springen de hauwen open en spreiding van pollen een effect worden de zaden de lucht in geheeft is uitermate klein schoten. Speciale aracons of andere gelijkwaardige middelen zijn nodig om de verspreiding tegen te gaan. Tabak Zelfbevruchter. De kans dat ver- Geen speciale opmerkingen Alleen pollen en zaden. spreiding van pollen een effect heeft is uitermate klein. Rijst Zelfbevruchter. De kans dat ver- Geen speciale opmerkingen Alleen pollen en zaden. spreiding van pollen een effect heeft is uitermate klein. Tomaat Insectbestuiver / zelfbevruchter. Geen speciale opmerkingen Alleen pollen en zaden. Bestuivende insecten moeten worden geweerd. Aardappel Zelfbevruchter. De kans dat ver- Geen speciale opmerkingen De verspreiding van knollen spreiding van pollen een effect moet ook worden tegengegaan. heeft is uitermate klein. Brassica Insectbestuiver / zelfbevruchter. Geen speciale opmerkingen De verspreiding van wortels Bestuivende insecten moeten en stronken moet ook worden worden geweerd. tegengegaan. Maïs Windbestuiver. De verspreiding van Geen speciale opmerkingen Alleen pollen en zaden. stuifmeel vanuit een serre is ononwaarschijnlijk, zeker als ramen voorzien zijn van insectengaas. Tarwe Zelfbevruchter. De kans dat ver- Geen speciale opmerkingen De verspreiding van wortels en spreiding van pollen een effect stronken moet ook worden heeft is uitermate klein. tegengegaan. Transgene dieren Bij transgene dieren moet voorkomen worden dat de dieren zich ongewenst verspreiden. Afhankelijk van het dier is dit gemakkelijk of soms moeilijker te voorkomen. Kleine knaagdieren zoals de muis dienen in degelijke kooien gehuisvest te worden en de dierverblijven dienen zo ontworpen te zijn dat ontsnapping niet zomaar mogelijk is. Bij toepassing van een genetisch gemodificeerd micro-organisme of een wildtype pathogeen in een dier dient per geval bepaald te worden op welke wijze het micro-organisme of het pathogeen zich zou kunnen verspreiden vanuit het proefdier en dienen de inperkende maatregelen daarop afgestemd te worden. Het kan dan soms nodig zijn de dieren in individueel geventileerde kooien te huisvesten en al het materiaal dat in aanraking is geweest met de dieren te ontsmetten. Bij gebruik van cellen of ander biologisch materiaal in dieren dient bijzondere aandacht besteed te worden aan de mogelijke aanwezigheid van pathogene virussen in dit materiaal. Sommige cellijnen zijn besmet met virussen. Zijn dergelijke virussen aanwezig, dan dienen de inperkende maatregelen aangepast te worden indien de mogelijkheid bestaat dat het virus zich verspreidt. De verspreiding van organismen in het laboratorium 19

20 5. INPERKING: EEN COMBINATIE VAN INFRASTRUCTUUR EN WERKVOORSCHRIFTEN Aan de vier risicoklassen voor activiteiten met pathogene of genetisch gemodificeerde organismen zijn vier basisinperkingsniveaus gekoppeld. Inperking van de gevaren wordt bereikt door de toepassing van een combinatie van maatregelen van infrastructuur en het hanteren van speciale werkvoorschriften. Inperking van gevaren = Infrastructuur + werkvoorschriften Wanden, deuren, veiligheidskabinet, werkoppervlakken, etc Niet eten, drinken of roken, handen wassen, etc Elke trede in de inperkingsniveaus (bijv. van niveau 1 naar 2, of van 2 naar 3) voegt een aantal eisen toe aan de eisen aan infrastructuur en werkvoorschriften van het voorgaande niveau. Niet alleen voor laboratoria zijn deze inperkingsniveaus gedefinieerd, ook voor serres, proefdierverblijven en grootschalige procesinstallaties zijn de verschillende niveaus van inperking uitgeschreven. Een overzicht van de eisen aan de inperkingsniveaus van laboratoria, serres en proefdierverblijven zijn te vinden in de bijlagen aan dit boekje. De eisen voor procesinstallaties zijn op te vragen bij de bioveligheidsverantwoordelijke en terug te vinden op ventilation sink laboratory coat closed door desinfection of benches Figuur 6: inperking in een laboratorium 20 VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium