DE BEPALING VAN VRIJE AMMONIAK IN VISSERIJ PRODUKTEN DOOR VERSNELDE MIKRODIFFUSIE

Transcriptie

1 MINISTERIE VAN LANDBOUW Bestuur voor Landbouwkundig Onderzoek Centrum voor Landbouwkundig Onderzoek Gent PROEFSTATION voor ZEEVISSERIJ Oostende (D irekteur: P. Hovart) DE BEPALING VAN VRIJE AMMONIAK IN VISSERIJ PRODUKTEN DOOR VERSNELDE MIKRODIFFUSIE door W. V Y N C K E Publikatie nr 14/1967.

2 INLEIDING Naast trim ethylam ine i s ammoniak het meest typische b e d e rfprodukt in v i s, sc h a a l- en w eekdieren. M eestal wordt het samen met andere v lu c h tig e stik sto fb a se n a is to ta le v lu c h tig e b asische s tik s to f (IVB) bepaald. Men kan echter v o o ro p stellen dat in Produkten waar ammoniak b ijzo n d er overvloedig gevormd w ordt, de dosering van deze verbinding een nog b e te r in z ic h t in de versheidsgraad kan geven. D it i s vooral voor sohaaldieren en kraakbeenvissen het g ev al. Ammoniak kan tijd e n s h et bederf door v e rsch illen d e r e a k tie s gevormd worden. Het o n ts ta a t door afbraak van ureum, door desa m inering van v r i j e of van e iw itte n a f g e s p lits te aminozuren en v e r wante verbindingen (bv. c re a tin e ), door oxydatie van aminen en door afb raak van nucleïnebasen. Voor de re c h tstre e k s e bepaling van v r i j e ammoniak staan v e rsc h ille n d e volum etrische ( o.a. f o r m o ltitr a tie, jodom etrie na oxydatie met hypobromiet enz.) en k o lo rim etrisch e metodon (o.a. met het N essler re a g en s, met phenol en hypoohloriet enz.) te r beschikking. In b io lo g isch e w eefsels en v lo e is to ffe n komen echter m eestal t a l r i j k e storende bestanddelen voor, zodat de ammoniak e e r s t moet worden afgezonderd. D it kan gebeuren met ionenw isselaars of d e s t i l l a t i e, maar in de meeste g ev allen wordt de voorkeur aan de m ik ro d iffu sie gegeven. In deze p u b lik a tie wordt d it procédé besproken en wordt tevens een nieuwe metode voor versnelde m ik ro d iffu sie met toepas

3 singen voor de o b jek tiev e k w a lite itsb e p a lin g van sch aaldieren en kraakbeenvissen beschreven. 1. De m ik ro d iffu sie. as=s>csaaa=s==:=ss 1.1. P rin c ip e. Ammoniak komt b ij zure ph a is ammonium-ion (NH*) en b ij a lk a lisc h e ph a is gasvormige verbinding (HH^) voor. De m ik ro d iffu sie geschiedt in d rie fazen s (a) de ammoniak wordt in een herm etisch g e slo ten systeem (fig u u r l) door toevoeging van base u i t het analy sev at A v r ijg e s te ld 5 (b) het gas d iffu n d e e rt door de kamer B en (#) het gas wordt door een zuur (bv. H^SO^), in een ab so rp tiev at C, met vorming van een ammoniumzout. De dosering g eschiedt dan door t i t r a t i e of door k o lo rim etrie Faktoren d ie de d iffu sie sn e lh e id beïnvloeden ( l ) D i^ fu sj^ ej^ ijji^ De d i f f u s i e t i j d is evenredig met de dampdruk van de v lu ch tig e verbinding in het analysevat f h ij wordt u itg ed ru k t in fu n k tie van de b eg in k o n cen tratie a in h et analysevat en de hoeveelheid X die na de t i j d t gediffundeerd i s volgens log a A.t mm a - X w aarbij A de ab so rp tiesn e lh eid i s. H ie ru it volgt dat de r e la tie v e hoeveelheid - en n ie t de absolute hoeveelheid - ammoniak d ie na de t i j i t geabsorbeerd w ordt, o n afhankelijk i s van de b eg in k o n cen tratie.

4 i B A k2co3 nh3 67 mm 40 mm Figuur 1 Principe van de microdiffusie A: Analysevat B : Diffusiekamer C.- Absorptievat Figuur 2 - Conwayschaal

5 V 2,ume_van_dei v 1oe^s to f f en_e n afmejtin^_en_va,n_d_e i f us ekamer. Het volume van de absorberende v lo e is to f h eeft weinig invloed, op voorwaarde dat de oppervlakte homogeen i s. De reden hiervan l i g t in h et f e i t dat de absorberende v lo e is to f de dampspanning van de diffunderende sto f to t nui terugbrengt wanneer het in overmaat aanwezig i s, h eeft een verandering van volume p ra k tisch geen e ffe k t. De hoeveelheid V van de oplossing in het analysevat h e e ft daarentegen wel een b eslissen d e invloed op de d iffu sie s n e lh e id. A lle andere fak to ren g e lijk b lijv e n d e i s deze snelheid omgekeerd evenred ig met V. D it v o lg t u i t het f e i t dat de snelheid re c h t evenredig i s met de dampdruk, dus met de k o n c en tratie van de v lu ch tig e s to f. De t i j d t d ie nodig i s voor een a b so rp tie van 99,5 $ bedraagt i, 5,3 S. V. 1 t = k \j s. s*~ w aarbij ; S = oplosbaarheid (g/m l) voor een gask o n cen tratie van 1 g/ml s = oppervlakte v lo e is to f in analysevat s! = oppervlakte v lo e is to f in ab so rp tiev at 1 = gemiddelde afstand voor d if f u s ie van d«molekulen 2 k = d iffu s ie k o e ffic ië n t (cm /min) van het gas in de lu c h t. Men h eeft er dus belang b ij V zo k le in m ogelijk te houden» De v e rg e lijk in g toont verder aan, dat men er nut b i j h e eft 1 zo k le in m ogelijk en s en s 1 zo groot m ogelijk te nemen, n l. zo d at de re s p e k tie v e lijk e volumes j u i s t gans de oppervlakte kunnen bedekken.

6 4 « Bi_ept_e_van_dei aag_in het an^l^rsevat^ De t i j d nodig voor een d if f u s ie van 99 j5 $ v anuit een oplo ssin g op d ie p te a (in om), bedraagt voor een dampspanning 0 aan de oppervlakte! 2 a t = 2, k' w aarbij s k = d iffu s ie k o ë ffic ië n t in w ater a is aldus van zeer groot belang en moet zo k le in m ogelijk gehouden worden » te m p e r a tu u r. De d iffu sie sn e lh e id vergroot met stijg e n d e tem peratuur. Zo verm indert de d iffu sied u u r bv. van 40 % wanneer men de temperatuur o p d r ijf t van 20 to t 38 C » ÏÏ_in het ana^s jvat_._ Ammoniak (ïth ) en ammoniumionen (NH*) lig g en steeds in 3 4 evenwicht volgens m +A + H+ 4 < D it evenwicht wordt bepaald door de ph van het m ilieu. De zuurexponent (pk) bedraagt 9?4» Tussen de pil van de o p lo ssin g, de pk en de d isso c ia tie g ra a d ( l = v o lle d ig e io n is a tie ) b e sta a t volgende b etrekking s ph = pk + log - 9»4 + log c <

7 H ieru it kan men berekenen hoeveel ammoniak in g eïo n iseerd e vorm voorkomt b i j v e rsc h ille n d e ph waarden. Deze betrekking wordt g ra fisc h in fig u u r 3 weergegeven. Men bemerkt dat de ph hoger dan 11 moet liggen om in optim ale omstandigheden te werken Ipvloed van kat_i n_en_en anionen. Het v r i j s t e l l e n van ammoniak hangt n ie t a lle e n van de ph, maar eveneens van bepaalde aanwezige ionen a f, daar deze de dampdruk van ammoniak beïnvloeden. B ij de kationen neemt de a k t i v i t e i t a is v o lg t toe ; Mg++ ( Ca++( Li+^ HH* Na+<( K+ Voor de anionen h e e ft men s I ( B r" Cl" HO HPO"<( F~ < OH" < BO" CO"" H ieru it v o lg t dat kalium karbonaat (K^CO^) en kaliummetab o raat (KBO ) de meest g eschikte verbindingen z ijn. M eestal wordt de e e rste verbinding g e b ru ik t. Voor oplossingen d ie ste rk zuur z ijn, i s het echter aan te raden het m etaboraat te gebruiken om de ste rk e CO^-ontwikkeling te verm ijden M ik ro d iffu sietech n iek. Voor de p rak tisch e u itv o e rin g van de m ik ro d iffu sie h e eft de metode van Conway (l) brede toepassing gevonden, n ie t a lle e n voor de bepaling van ammoniak, maar eveneens van een ganse gamma andere verbindingen (aminen, zuren, aldehyden, e n z.). B ij deze metode worden z.g.n. Conwayschalen g ebruikt d ie u i t g la s, p o rse lein of p la s tie k vervaardigd z ijn. Z ij bestaan u i t een binnen- en een

8 Figuur 3. - invloed van de ph op de veel heid gasvormig NH3

9 6. buitenkuvet (fig u u r 2 ). De te onderzoeken ammoniakoplossing wordt in de buitenkuvet en het absorberend zuur in de binnenkuvet g ep ip e- te e rd. Na toevoeging van loog aan de b u ite n s te kuvet wordt het geheel herm etisch met een in g ev ette p la a t g e slo ten. Alhoewel deze metode r e l a t i e f eenvoudig en zeer nauwkeurig i s, b e z it z ij toch e rn stig e nadelen, n i. s (a) de c e l i s r e l a t i e f duur, (b) het verw ijderen van het v e t, dat noodzakelijk i s voor de lu c h td ic h th eid, i s n ie t a l t i j d eenvoudig, (e) de d iffu sied u u r i s r e l a t i e f lang, (d) het gebruik van k o lo rim etrie a is d o seringstechniek v e re is t het k w a n tita tie f overhevelen van de a b s o rp tie v lo e is to f. Om deze m oeilijkheden te om zeilen, hebben Seligson et a l. ( 2) een versnelde m ikrodiffusiem etode voor de bepaling van ammoniak in bloed v o o rg esteld. B ij deze metode worden a is m ik ro d iffu sie c e lle n k lein e fle s s e n (bv. p e n i c i l l i n e f l e s j e s ), waarvan de stop van een glazen s ta a f met geradeerd u ite in d e voorzien i s, aangewend. D it u ite in d e wordt met zwavelzuur bevochtigd en vervangt aldus het a b so rp tie v a t. De te analyseren oplossing komt in de f le s te r e c h t. Na a lk a lis e rin g la a t men de f l e s gedurende een k o rte t i j d in h o rizon tale p o s itie in een ro ta to r d ra a ien, waardoor de oplossing gans de wand van de f l e s b ev o ch tig t. Op deze w ijze wordt het d if f u s ie - oppervlak s a a n z ie n lijk v erg ro o t, te r w ijl het volume V en de d ie p te a minimaal gehouden worden (z ie ). De d iffu sied u u r wordt dan ook gevoelig verm inderd. Na de d if f u s ie wordt de ammoniak d ie door het zwavelzuur op de s ta a f gebonden werd, k o lo rim etriseh bepaald met N esslerreagens. Vyncke en Merlevede hebben deze metode aangepast voor schaaldieren en er h et nut voor de o b jek tiev e k w a lite itsb e p a lin g van aangetoond (3 ). In onderhavige p u b lik a tie werd de tech n iek nog v erb eterd ; z ij werd tevens op kraakbeenvissen to eg ep ast.

10 2. Experim enteel_gedeelte Modus operandi Re agen tija. A lle oplossingen dienen met ammoniakvrij w ater b ereid te worden. Voor met ionenw isselaars gedem ineraliseerd w ater i s deze voorwaarde vervuld. Gewoon g e d e s tille e rd w ater moet door een kolom Am berlite Monobed I I I (Rohm & Haas, P h ilad elp h ia, U.S.A.) of een analoog h ars gezuiverd worden, Standaard ammoniak oplossing? 250 yg-g U per ml ( l,l8 0 g ammoniums u lfa a t per l i t e r ). - Zwavelzuur 1 U. - Kalium karbonaat, verzadigde oplossing. N esslerreagens s volgende m o d ifik atie b leek de g ro o ts te s t a b i l i t e i t en gevoeligheid te geven s Oplossing 1 ; Ios 40 g rood Hgl^ p.a. en 30 g KI p.a» in 100 ml w ater Oplossing 2 : Io s 95 g NaOH p.a. in ml w ater. Meng 1 en 2 en la a t d rie dagen sta a n. Dekanteer de k la re bovenstaande v lo e is to f in een bruine f l e s en bewaar in het donker. Verdun 1 s 25 voor gebruik ApjDar_atuur_j_ - M ik ro d iffu sie f le s j e s. De door Seligson et a l (2) voorgestelde p e n ie illin e f le s je s werden na t a l r i j k e m o d ifik aties u ite in d e lijk vervangen door f le s je s met gerodeerde h als (B24), voorzien van doorboorde polyethyleen stop met glazen s ta a f. De sta a f wordt v astg ek leefd met gewone u n iv e rse e l-

11 lijm i hierdoor i s de stop tevens herm etisch d ic h t. Het u ite in d e van de s ta a f is holvormig v e rd ik t en gerodeerd. De afmetingen z ijn in fig u u r 4 vermeld. Met deze f le s je s wordt het in b rengen en het verw ijderen van de s ta a f zonder de wanden te raken door de B24- opening vergem akkelijkt. Deze opening i s maximaal, daar men rekening moet houden met het r e l a t i e f k le in e volume van de d if f u s ie f le s. M ikrodiffusierot a t o r. De m ik ro d iffu sie ro ta to r "M ulti Purpose R otator" Model 150 V ( S c ie n tif ic In d u s trie s, Hew York, U.S.A.) werd e e rs t beproefd, doch h et vasthechtingssysteem met klemmen voor de f l e s j e s b leek n ie t gesch ik t te z ijn. De ro ta tie k o p werd dan ook vervangen door een z e lf ontworpen model (fig u u r 5) D it model b e sta a t u i t d rie schijven u it p le x ig la s van 27 cm diam eter. De e erste s c h ijf d ien t a is grondplaat voor de f l e s j e s 5 de tweede is voorzien van 12 openingen van 4 cm diam eter. Deze twee schijven z ijn op de c e n tra le a s, op een afstan d van 3,5 cm van elk aar b e v e s tig t. De derde p la a t h e eft 12 openingen van 1 cm diam eter d ie ju i s t over de glazen staven passen en komt op de stoppen van de f l e s j e s te ru s te n. Het geheel wordt door middel van een vlinderm oer v astg ed raaid. De f le s je s staan aldus in de ro ta tie k o p stev ig v a st en z ijn te r z e lf d e r tijd herm etisch g e slo te n. De r o ta to r kan zowel in h o riz o n ta le a ls in v e r tik a le stand gedraaid worden (fig u ren 5 en 6). K olorim eter. Y itatro n Model UC 100 (Bergen op Zoom, Hederland) met v ie rk a n te kuvetten van 10 mm lichtw eg Uer_kwij_z_e. Tien g v is worden gedurende 2 min met 4OO rai w ater gehomogen iseerd 1 ml van de bovenstaande v lo e is to f ( f i l t r e r e n is o v er-

12 Lf> CD gerodeerd ui t einde Figuur 4. Mikrodiffusiefles (afmetingen in mm )

13 Mikrodiffusierotator in vertikale stand Fig. 6 Mikrodiffusierotator in horizontale stand

14 9. bodig) wordt in een m ik ro d iffu sie fle s je g ep ip eteerd. Eén ml v erzadigde kalium karbonaatoplossing wordt toegevoegd en onm iddellijk daarop wordt bet u ite in d e van de glazen s ta a f over oa 5 mm i *1 1 ^ zwavelzuur gedompeld 5 bet o v e rto llig e zuur wordt afgeschud en de stop wordt op bet f l e s j e g e p la a ts t zonder de wanden te raken. De f l e s j e s worden in h o riz o n ta le stand in de ro ta to r g e p la a ts t en v a s t geschroefd. De ro ta tie k o p wordt in v e rtik a le p o s itie gewenteld, de motor wordt aangeschakeld en op 50 toeren per minuut geregeld. Na 30 min wordt het ro te re n sto p g ezet. De s ta a fje s worden u i t de f le s je s v erw ijd erd, zonder de wanden te raken en in een beker van 10 ml, die 5 nii N esslerreagens 1 s 25 b ev at, geroerd. De e x tra k tie van de o ra n je -g e le oplossing wordt b ij 403 m gemeten. De k o n cen tratie wordt van een ijkkurve afgelezen die met r e s p e k tie v e lijk 2,5 > 5 en 1,5 _/Ag NH^ - N,opges te ld werd. A lle m ikrodiffusiebepalingen moeten in s t r i k t g e sta n d a rd i- seerde omstandigheden worden u itg ev o erd. Het volume van de d if f u s ie - f l e s j e s, de d iffu sieo p p erv lak ten en de ro ta tie s n e lh e id kunnen gemakk e lijk konstant gehouden worden en z ijn daarom van minder belang. Sterke v a r ia tie s in kamertemperatuur dienen ech ter vermeden te worden, verm its de d iffu sied u u r hierdoor beïnvloed wordt (z ie 1.2«4»)«2.2. Experim entele stu d ie van de metode D iffusiekiffve. Het toevoegen van 1 ml verzadigde kalium karbonaatoplossing brengt de ph op 12,2 à 12,3, hetgeen een optim ale d if f u s ie verzek ert (z ie 1.2.5*)*

15 De d iffu siek u rv en van een zuivere ammoniakoplossing en van v is e x tra k t werden bepaald (fig u u r 7)«H ie ru it b l i j k t, dat beide kurven een analoog verloop hebben en dat b ij v is e x tra k t geen hydrolyse o p tre e d t. De d iff u s ie is na ongeveer 75 min beëindigd, maar ca 92 % en 98 io ammoniak komen re s p e k tie v e lijk in 15 en 30 min over. Er v a lt op te merken, dat wanneer de f l e s j e s n ie t g ero teerd worden, de d i f f u s ie 18 à 24 nur d u u rt. De d iffu siek u rv en z ijn zeer reproduceerbaar en in p rin cip e kan dan ook een k o rte d iffu sie d u u r (bv* 10 min) genomen worden. Het i s echter aan te raden 30 min te nemen, daar in deze omstandigheden de ro ta tie d u u r n ie t nauwkeurig moet worden in acht genomen. Daarenboven z ijn, in d it g ev al, k lein e f lu k tu a tie s in d raaisn elh eid zonder belang ( 2 ) _Storende_bj3S_tanddelen. Naast ammoniak produceren ook d iv erse andere verbindingen een kleur met het N esslerreagens. Voor v is b e tr e f t het vooral dimethylamine en trim ethylam ine, d ie samen met ammoniak Loor de a l k a lis e rin g vrijkom en, diffunderen en a is s u lfa a t op het s ta a fje worden gebonden. U it kontroleproeven uitgevoerd met 10 N van beide verbindingen, overeenkomend met 40 mg N per 100 g v is, b leek dat in de gegeven omstandigheden h et N esslerreagens n ie t gekleurd werd, en dat het b lijk b a a r n ie t gevoelig genoeg i s voor deze verbindingen. Dimethylamine en trim ethylam ine sto ren dan ook de ammoniakbepaling n ie t. In sch aald ieren en v ooral in kraakbeenvissen (bv. doornh a a i, rog) komen g ro te hoeveelheden ureum voor, n l. to t 2000 mg per

16 z co en XT g Ol. en o

17 100 g v is (4 ) Door a lk a lis e rin g kan d it ureum door hydrolyse ammoniak v r i j s t e l l e n, hetgeen de bepaling zou v erv alsen. U it kontroleproeven, uitgevoerd met 5OO JJbg ureum bleek geen ammoniak v r i j te komen, hetgeen ongetw ijfeld aan de zeer k o rte d iffu sie d u u r te w ijten i s. D it is een b e la n g rijk voordeel, gezien de metode aldus to e la a t v r i j e ammoniak te bepalen in ureum rijke v is se n, hetgeen met de meeste andere metoden (bv. d e s t i l l a t i e ) n ie t m ogelijk is » Stabi^li_teit_ van d.e_kleur_o_ De e x tin k tie van de o ran je-g ele N essleroplossing bleek gedurende ca 30 min s ta b ie l te z ijn. Wanneer de kolo rim etrisch e bepaling n ie t onm iddellijk kan geschieden, moet de oplossing van de lu ch t afgeschermd worden. In 30 min verm indert de e x tin k tie anders met ca 8 $>. 2.3» Toepassingen voor de objektieve k w a lite itsb e p a lin g. 2.3.I G_arnaa_l en_noors_e k re e ft^ In een vorige p u b lik a tie (3 ) werd het nut van de metode voor de objektieve k w a lite itsb e p a lin g van g arn aal (Crangon v u lg a ris en Noorse k re e ft (Nephrops norvegicus L) aangetoond. Het ammoniakg e h alte bleek met de o rganoleptische keuring goed overeen te komen. Figuur 8 geeft typische bederfkurven voor gepelde garnaal en ongepelde Noorse k re e ft d ie b ij 1 à 3 C bewaard werden. Men bemerkt dat g arnaal v eel vlugger b e d e rft dan Noorse k re e f t. De grens voor b ederf b l i j k t rond 45 rag N per 100 g te lig g en.

18 00 en <a

19 Ook voor h et v erg elijk en d onderzoek b leek de metode waardevol te z ijn. Zij werd reeds toegepast voor de stu d ie van de bewaartem peratuur van g arn aal (5) en voor het te s te n van div erse fak to ren (zo u tg eh alte van het kookwater, w ijze van verpakking enz.) tijd e n s de bewerking van Noorse k re e ft (6) I Doornhaai^. De k w a lite itsb e p a lin g van doornhaai (Squalus acan th ias L) - zoals van a lle kraakbeenvissen s t e l t bijzo n d ere problemen. Zoals reeds werd vermeld, bevat deze v is immers een g ro te hoeveelheid ureum d ie in gans het lichaam (sp ie re n, ingewanden, bloed, slijm ) voorkomt. Onder invloed van een b a k te rie e l enzym, de u rease, wordt ureum to t kooldioxyde en ammoniak afgebroken s (NH2) > C NH3 De ontbinding van ureum b egint v66r de desaminering van de aminozuren, hetgeen een r e l a t i e f hoog g eh alte aan ammoniak in het beginstadium van het bederf g e eft en een vluggere a lk a lis e rin g b i j de kraakbeenvissen dan b ij de beenvissen veroorzaakt (7). Door de aanwezigheid van ureum kunnen k la ssie k e metoden, zoals de TVB-bepaling en de bepaling van de v lu c h tig e zuren n ie t toegepast worden, daar tijd e n s h et d e s tille r e n ureum eveneens in ammoniak en kooldioxyde g e s p li ts t w ordt. Zoals reed s werd g e c ite e rd, b l i j k t d it tijd e n s de versnelde m ik ro d iffu sie n ie t het geval te z ijn. V ooraleer de v lu c h tig e ammoniak te bepalen, dienen echter enkele voorzorgen genomen te worden.

20 In het slijm en h et hloed d ie zich op de huid van de doornhaai bevinden, wordt gem akkelijk ammoniak gevormd, vooral wanneer de v is enige t i j d aan hogere tem peraturen werd b lo o tg e ste ld, zoals bv. op het dek van het schip vèèr het stuwen in het ruim en in de vism ijn vèèr de verkoop. De ammoniak is dan zeer gem akkelijk organole p tis c h waar te nemen, maar d it betekent evenwel nog n ie t a l t i j d dat de v is van mindere k w a lite it i s ; in het v le es z e lf kan immers weinig of geen ammoniak gevormd z ijn. Vèèr de monstername moet de v is dan ook goed met gekoeld w ater gespoeld worden. Doornhaai wordt m eestal k o rte tijd na de openbare verkoop ontkopt en g estro o p t en in deze vorm in de handel onder de benaming "zeepaling" gebracht. Door deze bewerking komt veel bloed aan de oppervlakte v r i j (de rode k leu r i s trouwens een kenmerk van v e rs h e id ), dat gem akkelijk ammoniak kan afgeven. Om deze reden i s het ook in d it geval aan te raden de v is goed vèèr de monstername te spoelen. Figuur 9 g eeft een gemiddelde bederfkurve voor doornh a a i, d ie vanaf de vangst b ij I o C in i j s in gegutte toestand bewaard werd. De v isse n waren afkom stig van de v is s e r ijs e k to r Noordzee-Zuid en werden in de periode o k to b er-jan u ari gevangen. d e r tig ta l 'waarnemingen. Ieder punt op de g ra fie k i s het gemiddelde van een De sp reid in g sb reed te werd tevens aangeduidc Men bemerkt dat de ammoniakontwikkeling gedurende de e e rste acht dagen gering i s, om dan vlug op te lopen. De grens van bederf kan voorlopig op ca 60 mg N fo g e ste ld worden.

21

22 keuring goed overeen. De ammoniakwaarden kwamen met de organoleptische Ook voor het v erg elijk en d onderzoek b l i j k t de metode waardevol te z ijn. Z ij werd reeds toegepast voor de stu d ie van de invloed van de tem peratuur op de houdbaarheid van doornhaai (8) ( 9)» 2.4«Andere toepassingen van de m ik rodiffusie van ammoniak ïe a li^ jra n _ u re m ii_ in vi^s. - P rin cip e s men voegt aan de te onderzoeken oplossing een weinig urease to e, waardoor het aanwezige ureum k w a n tita tie f in ammoniak wordt omgezet. De optim ale ph l i g t tu ssen 7 en 8. Een eenvoudige omrekening g e eft h et procent ureum. Deze bepaling die met Conwayschalen kan worden uitgevoerd (l), werd h ie r aan de versnelde m ikrodiffusiem etode aangepast. - U itvoering s men homogeniseert 10 g v is in 4 OO ml ammoniakvrij w ater en verdunt vervolgens 1 ml f i l t r a a t to t 50 ml» Men p ip e te e rt hiervan 1 ml in een d if f u s ie f le s je en voegt 0,5 nl u rease fo sfa ato p lo ssin g to e. Deze oplossing wordt bereid door 50 mg u rease (Merck) in 100 ml fo s fa a tb u ffer ph 7 op te lo ssen. Men la a t 15 min b ij kamertemperatuur staan, voegt 1 ml verzadigde kalium karbonaatoplossing toe en v o ert verder de ammoniakbepaling zo als hoger beschreven u i t. Men b e p aalt te r z e lf d e r tijd in een blanko proef het o o rsp ro n k elijk ammoniakgehalte dat dan van het p ro e fre s u lta a t dient afgetrokken te worden v o o raleer het ureumgehalte t e berekenen Bej3a2Ling_v_an_d_e nr^a^e-akti_vi_t_eit i_n_vi_s_j_ Onder u rease ak ti v i t e i t v e rs ta a t men de hoeveelheid

23 ureum d ie door het enzym in een "bepaalde t i j d afgebroken w ordt. Deze bepaling g eeft een goed beeld van de aanwezige hoeveelheid urease en kan van belang zijn voor diep er doorgevoerde b e d e rfstu d ie s van v is. De k la ssie k e metode van Sunner en Hand (io) werd aan de versnelde m ik ro d iffu sie aangepast. V ijf tig g v is worden in 200 ml w ater gehomogeniseerd. Men p ip e te e rt 1 ml f i l t r a a t in een m aatkolf van 50 ml, p la a ts t de k o lf in een term o statisch waterbad op 20 +_ 0,1 C en voegt a ch tereenvolgens 1 ml fo s fa a tb u ffer ph 7 en 1 ml 3 fo ureumoplossing to e. Deze oplossingen werden vooraf op 20 C g ebracht. Men vermengt de oplossingen en la a t j u i s t 5 min in het waterbad sta a n. Ken voegt dan 1 ml IN HOI toe en schudt. Men v u lt aan t o t de m erkstreep en onderwerpt 1 ml aan de m ik ro d iffu sie volgens de gewone metode. Men drukt de a k t i v i t e i t u i t in mg ureum/uur. SAMENVATTING. Na het bespreken van h et p rin cip e van de m ik rodiffusie metode voor de bepaling van v r ij e ammoniak wordt een nieuwe metode voor versnelde m ik ro d iffu sie met toepassingen voor de objektieve k w a lite itsb e p a lin g van schaaldieren en kraakbeenvissen beschreven. Voor de metode worden k lein e d iff u s ie fle s s e n gebruikt waarvan de polyethyleen stop van een glazen s ta a f met bolvormig ge

24 rodeerd u ite in d e voorzien i s. D it u ite in d e wordt met zwavelzuur bevochtigd. Het te analyseren ex tra k t wordt in de f l e s gepipeteerd en g e a lk a lise e rd. Door h et ro te re n van de fle s s e n in een sp eciale mikrod iff u s ie ro ta to r wordt de d if f u s ie tijd a a n z ie n lijk verminderd (30 m in). De ammoniak wordt door het zwavelzuur gebonden en k o lo rim etrisch met N esslerreagens bepaald. Er tre e d t geen hydrolyps op van ureum of peptiden en dimethylamine en trim ethylam ine sto ren de bepaling n i e t. urease g ebruikt worden. De metode kan ook voor de bepaling van ureum en De metode werd op g arn aal (Crangon v u lg a ris F ), Noorse kreeft(n ephrops norvegicus L) en doornhaai (Squalus acanth ia s L) to eg ep ast. De organoleptische keuring kwam met de ammoniakbepalingen goed overeen. LITERATUUR. (1) E. Conway - M icrodiffusion A nalysis and Volumetric E rro r, 5de U itg., Crosby Lockwood & Son Ltd, London, I 962. ( 2 ) D. Seligson en H. Seligson - A m icrodiffusion method fo r the determ ination of n itro g en lib e ra te d as ammonia Jo u rn al of Laboratory and C lin ic a l Medicine, 8, 324, 1951» (3) W. Vyncke en E. Merlevede Spoilage of f is h and crustaceans j Rapid determ ination of v o la tile ammonia by accelerated microd iffu sio n - Archives Belges de Médecine S o ciale, Hygiene, Médecine du T rav ail et Médecine Légale, 21_ ( 3 ), 147, 1963.

25 (4) W. Simidu en K. O isi, B u lle tin of the Japanese Society of Scient i f i c F is h e rie s, _16, 547, 1951 «(5) W. Vyncke - Studie van de fa k to re n die de houdbaarheid van g arnalen beïnvloeden - Landbouwtij d s c h r i f t, 1, 815, ( 6) P. Hovart en W. Vyncke - Handling and processing Norway lo b ste rs F ishing News In te rn a tio n a l, 3_, 117 en 221, 1964* (7) F. Soudan - La conservation par le fro id des poissons, cru stacés et m ollusques, J. B a illiè r e et fils, P a ris, 1965«(8) W. Vyncke - The in flu en ce of tem perature on f i s h as measured by o b je ctiv e q u a lity methods - F ishing News In te rn a tio n a l, _6, 39, (9). Vyncke - De invloed van de tem peratuur en de o b jek tiev e kwa lite its b e p a lin g van v is - M in isterie van Landbouw, P ro e fsta tio n voor Z e e v iss e rij, Oostende, p u b lik a tie n r. 12, I 966. (IO) J. Sunner en D. Hand - Jo u rn al of B io lo g ical Chem istry, J_6, 149, N ovemb e r 1967«

26