De therapeutische perspectieven van embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar De therapeutische perspectieven van embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Marieken VANDEN BROUCKE Promotor: Björn Heindryckx Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUND

2 Inhoudsopgave ABSTRACT... 3 INLEIDING... 3 METHODOLOGIE... 4 RESULTATEN DE STAMCEL De normale embryogenese De eerste week De tweede week De derde week Definitie Indeling Indeling volgens ontwikkelingspotentieel Indeling volgens oorsprong DE GESCHIEDENIS VAN HET STAMCEL ONDERZOEK STRATEGIEËN VOOR REPROGRAMMERING OF DE PRODUCTIE VAN PATIËNT SPECIFIEKE STAMCELLEN Nucleaire transfer (NT) of Somatische Cel Nucleaire Transfer (SCNT) Fusie Spontane reprogrammering door kweekcondities Geïnduceerde pluripotente stamcellen Mechanisme van de belangrijkste 4 transcriptiefactoren ROL VAN DE EPIGINETICA BIJ REPROGRAMMERING In vivo reprogrammering Na de fertilisatie Pluripotentie en epigenetica Epigenetica en differentiatie De transcriptie factoren De epigenetische factoren die het cellot bepalen Factoren die het cellot vastleggen MOLECULAIRE HANDTEKENING VAN PLURIPOTENTIE TESTEN VOOR PLURIPOTENTIE De strengste test Minder strenge testen maar bruikbaar bij de mens Testen voor het differentiatie-potentieel in vitro in vivo Morfologie en cel cyclus Genexpressie en epigenetica Pluripotentie categorieën De gouden standaard is onderweg ES CELLEN Ontdekking Ethiek Problemen en oplossingen Xeno-free Productie op grote schaal IPS-CELLEN De ontdekking ->perfectioneren selectieprocedure -> betere populatie iPS-cellen versus ES cellen Ethisch Immuunafstoting Ziektemodelen Carcinogenese Efficiëntie zijn ES-cellen en ips-cellen gelijk? Moleculaire testen Biologische testen Mogelijke problemen en oplossingen Efficiëntie van ipsc reprogrammering Inbreng van virale factoren

3 De selectie van volledig gereprogrammeerde cellen TOEKOMSTIGE TOEPASSINGEN VAN ES CELLEN EN IPS-CELLEN IN DE REGENERATIEVE GENEESKUNDE Ruggenmergletsels DISCUSSIE REFERENTIELIJST Marieken Vanden Broucke Pagina 3

4 Abstract Humane embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen worden voorgesteld als een waardig alternatief voor regeneratieve geneeskunde. Voor dit kan omgezet worden in de praktijk moeten er verschillende obstakels worden overwonnen. Zo kan het gebruik van dierlijke producten bij de isolatie en het kweken van de cellen leiden tot pathogene overdracht en immuunreacties, is er een risico op carcinogenese, staan de differentiatieprotocollen vaak nog niet op punt, is de zuivering van gedifferentieerde cellen vaak onvoldoende en kan het gebruik van integrerende vectoren bij de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen insertionele mutagenese veroorzaken. Toch werden er al successen geboekt en is de eerste klinische trail van start gegaan. Inleiding Alle 220 gespecialiseerde celtypes in ons lichaam vinden hun oorsprong vanuit 1 unicellulaire bevruchte eicel, de zygote (1). Dit wonderbaarlijke proces intrigeert dan ook al eeuwen vele wetenschappers. In de jaren 1880 kwam de bioloog August Weisman met de eerste theorie die dit ontwikkelingsproces kon verklaren, de 'germ plasm' theorie. Hij stelde dat de grote verschillen tussen de verschillende celtypes veroorzaakt worden door een asymmetrische deling. Alle cellen zouden dus een verschillende fractie krijgen van het genetisch materiaal van de zygote en op deze manier verschillende kenmerken verkrijgen. Maar in 1938 werd dit idee definitief afgedaan. Hans Spemann wist uit één bevruchte eicel van een salamander, twee salamanders te ontwikkelen, onafhankelijk van elkaar. Hiermee werd het principe van nucleaire equivalentie in het leven geroepen. Cellen splitsen zich symmetrisch waardoor alle cellen dus het zelfde genetisch materiaal bevatten(2). In 1952 werd dit voor goed bewezen door een baanbrekend experiment van Thomas King en Robert Briggs. De twee wetenschappers verwisselden de kern van een onbevrucht eicel voor een kern van een later ontwikkelingsstadium( het blastulastadium). Dit proces staat nu bekend als Nucleair Transfer (NT) of klonen. Uit deze eicel ontstond een volledig kikkerembryo(2). King en Briggs waren er echter van overtuigd dat dit op een bepaald moment in de ontwikkeling niet meer mogelijk was. Er zouden dus irreversibele veranderingen optreden bij het ontwikkelingsproces (2). Maar later werden ook NT experimenten succesvol uitgevoerd met verdere ontwikkelingsstadia. De meest ophefmakende was Dolly. Dit gekloonde schaap werd in 1997 geboren. Ze was het succesvol resultaat van een klonering experiment waarbij een volwassen cel als donorcel werd gebruikt. Het was de eerste keer in de geschiedenis dat dit gebeurde bij zoogdieren (1). Hiermee werd er definitief aangetoond dat er geen irreversibele processen plaatsvinden bij het ontwikkelingsproces. De reversiebele veranderingen die aan de basis liggen van het differentiatie proces worden nu epigenetische fenomen genoemd (2). Door deze epigenetische factoren te beïnvloeden zou men dus de differentiatie van een cel kunnen sturen en op deze mannier specifieke cellen kunnen kweken in vitro. Dit kan vele mogelijkheden bieden. Want weefsels en cellen zijn momenteel onvoldoende voorhanden zowel voor donatie/ transplantatie in de regeneratieve geneeskunde, als voor onderzoek naar geneesmiddelen, biologische en pathologische 4

5 processen. Ook zou men door de nieuwe kennis over het ontwikkelingsproces, nieuwe strategieën kunnen ontwikkelen om bepaalde ontwikkelingsstoornissen te behandelen (3-5). De ontwikkeling van deze weefsels kan men op twee mannieren betrachten. Ten eerste kan men een volwassen cel reprogrammeren naar een ander type gedifferentieerde cel (transdifferentiatie of lineage conversion). Maar men kan ook een stamcel in vitro laten differentiëren naar het gewenste celtype. Enkel dit laatste is opgenomen in deze masterproef (1). Om embryonale stamcellen te kunnen gebruiken moet men deze eerst in vitro kunnen kweken zonder dat ze spontaan differentiëren. Dit werd in 1981 mogelijk voor embryonale stamcellen afkomstig van de Inner Cel Mass (ICM) van een muizenblastocyst maar pas in 1998 werd dit ook mogelijk voor menselijke embryonale stamcellen (1). Deze stamcellen zijn pluripotent, dit betekend dat ze alle cellen uit de 3 kiembladen (ectoderm, endoderm en mesoderm) kunnen voortbrengen maar geen oorsprong geven aan de extraembryonale structuren zoals de placenta (1). Omdat er een bevruchte eicel wordt vernietigd die eigenlijk tot een menselijk individu kan leiden, vormt dit volgens sommigen een ethisch probleem. Ook al zijn deze embryo s meestal overtallige embryo s na In Vitro Fertilisatie (IVF). De ethische bezwaren vormden dan ook lang een blok aan het been van het stamcelonderzoek (6). In 2006 slaagde men er in om met behulp van transfectie met welbepaalde transcriptiefactoren een volwassen cel om te vormen tot cellen die zeer veel gelijkenissen vertoonden met embryonale stamcellen, de geïnduceerde pluripotente stamcel of ipsc (induced pluripotent stem cells)(7). Men zou zelf durven stellen dat ze identiek zijn aan embryonale stamcellen maar dit moet nog definitief bewezen worden. De introductie van de ipsc heeft nog een grotere therapeutische waarde, aangezien deze, in theorie patiënt specifieke regeneratieve geneeskunde mogelijk maakt. Imuunafstoting zou hier geen probleem meer vormen ((1, 4, 5, 8), maar recente publicaties toonden aan dat de overexpressie van bepaalde factoren in ipsc toch immuunafstoting zou veroorzaken (9). De reprogrammering van cellen kan ook op andere manieren maar deze zijn minder gemakkelijk toe te passen in een klinische context (10). Nu men dus stamcellen heeft om te differentiëren, komt de stap naar de therapie veel dichter. Maar de weg is nog lang en er is nog veel onderzoek nodig vooraleer dit werkelijkheid kan worden. De differentiatie van de embryonale stamcellen (ES cellen) en de geïnduceerde pluripotente stamcellen (ips cellen) staat nog lang niet op punt, de productie van deze cellen is nog te inefficiënt en de protocollen bevatten vaak nog dierlijke producten en cellen die een risico op pathogene overdracht geven. Het inbrengen van transcriptiefactoren, bijvoorbeeld bij de generatie van IPS cellen, vormt tevens een risico op ongunstige mutaties. Ook is het een inherente eigenschap van stamcellen om ongelimiteerd te delen. Dit zorgt dat een onvolledige zuivering van de gedifferentieerde cellen van de onvolledige gedifferentieerde cellen kan leiden tot tumorvorming in vivo (1, 4, 5, 8). Er zijn echter al verschillende hoopgevende studies op dieren gepubliceerd. Deze tonen aan dat de therapeutische mogelijkheden van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen hoopvol zijn. Zo zijn er studies die positieveresultaten toonden bij ruggenmergletsels, Parkinson, diabetes, sikkelcelanemie, hartinfarcten en andere. Recent is het eerste humane klinische onderzoek van start gegaan die zal uitwijzen Marieken Vanden Broucke Pagina 5

6 of stamceltherapie gebruik makend van embryonale stamcellen recent opgelopen ruggenmergletsels bij de mens kan helpen herstellen. Het is nog afwachten naar de resultaten (3). Methodologie Om dit werkstuk te creëren ging ik eerst op zoek naar de basiskennis waar ik op kon verder bouwen. Deze informatie vond ik op de website; Deze is opgesteld door de National Institut of Health en bevat vele interessante links maar vooral goede basis informatie die zonder veel voorkennis te begrijpen valt. De opgedane kennis maakte me in staat om mijn onderwerp beter af te bakenen en een aantal zoektermen te selecteren. Met behulp van Pubmed en een combinatie van verschillende zoektermen zoals; embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, differentiation, derivation, cellulair reprogramming, epigenetics, therapeutic, telomerase, spinal cord injury, maakte ik een selectie van de meest relevante artikels. Dit eerst op basis van de titel en het publicatiejaar en daarna door het lezen van de abstracts. Van de duizenden gevonden publicaties werden er uiteindelijk 65 geselecteerd. Resultaten 1.1 De stamcel De normale embryogenese De eerste week Na de versmelting van de eicel met de zaadcel in de eileider, reist de bevruchte eicel verder naar de baarmoeder. Tijdens deze reis gaat de nieuw samengestelde cel, de zygote zich delen, dit gebeurt echter zonder toename in volume waardoor deze delingen ook vaak klievingsdelingen worden genoemd. Het aantal cellen stijgt dus, maar het totale volume van het embryo niet. De cel deelt zich in 2,daarna in 4, dan in 16 enzo verder. Na compactie van het embryo vindt de eerste differentiatie plaats waarbij de cellen differentiëren in twee groepen; een buitenste cellaag en een binnenste cel massa. De buitenste cellaag noemt men de trofoblast en zal later oorsprong geven aan een groot deel van de placenta en de hieraan geassocieerde membranen. De binnenste cel massa (inner cell mass), ook wel embryoblast genoemd geeft oorsprong aan het volledig embryo en het amnion. Op dit blastocyst stadium ontstaat er tussen de cellen een met vocht gevulde holte, de blastocoele. Dit is op de 5de tot 6de dag (naargelang de species) van de ontwikkeling waarbij het embryo uit een holle bal bestaat uit ongeveer 100 cellen. Op dit punt betreedt het embryo de uterus en kan de innesteling beginnen(11, 12) De tweede week In het begin van de 2de week vindt de tweede segregatie plaats, waarbij de embryoblast zich splitst in het epiblast of primair ectoderm en de hypoblast of primair endoderm. In de epiblast vormdt zich een holte de amnion holte. Deze wordt afgelijnd door afgeplatte epiblastcellen die de amniotisch membraan vormen. De rest van het epiblast en het hypoblast vormen een bilaminaire groeischijf. Deze groeischijf zal later instaan voor het eigenlijke embryo en enkele van de extra-embryonale membranen. Tijdens de 2de week van de ontwikkeling zullen er cellen vanuit het hypoblast migreren om de blastocoele om te vormen tot de primaire 6

7 dooierzak, hierna zal een tweede migratiegolf deze primaire dooierzak omvormen in de definitieve of secundaire dooierzak (11, 12). In het midden van de tweede week ontstaat het extra-embryonaal mesoderm. Deze cellaag is nog van bediscussieerde oorsprong maar vormt zich tussen enerzijds de trofoblast en anderzijds de dooierzak. Een nieuwe holte, de chorionholte vormt zich tussen twee lagen van het extra-embryonaal mesoderm. Ondertussen gaat de implantatie van het embryo in de uterus verder met opsplitsing van het trofoblast weefsel in de cytotrofoblast die het endometrium invadeert en hierbij de blastocyst in de uterine wand trekt, en het syncytiotrofoblast die de perifere aflijning van het embryo verzorgd. Vanaf de tweede week wordt het begin van de placenta waargenomen. Hierbij werken het extra-embryonaal mesoderm en het trofoblastweefsel samen met de uterus via de vorming van chorion villi die ingroeien in maternale bloedsinussen(11, 12) De derde week De belangrijkste gebeurtenis in de 3de week na de bevruchting is de gastrulatie. Deze start met het ontstaan van de primitiefstreep, in het epiblast dicht bij het caudale einde van de bilaminaire groeischijf. Bovenaan deze streep bevindt zich een indeuking, de primitieve pit omringd door een ophoging die men de primaire knoop noemt. De epiblastcellen kunnen nu migreren aldoor de primitiefstreep naar de toekomstige ruimte tussen het epiblast en het hypoblast. Sommige van deze epiblast cellen invaderen het hypoblast en vervangen op deze wijze het primair endoderm door het definitieve of secundaire endoderm. Tussen de epiblast en het endoderm vormen de invaderende epiblastcellen een derde laag, het intraembryonaal mesoderm. Het epiblast of primair ectoderm word omgevormd tot het definitieve ectoderm. De gastrulatie vormt de bilaminaire kiemschijf om tot een trilaminaire kiemschijf met een endoderm, mesoderm en ectoderm. Deze trilaminaire kiemschijf vormt het vertrekpunt van de organogenese(11, 12) Definitie Een stamcel is een ongespecialiseerde, pluripotente, klonogene voorlopercel die bij gebruik van de juiste kweekmedia niet alleen in leven kan worden gehouden, maar zichzelf kan vernieuwen door celdeling en die in bepaalde omstandigheden tot verschillende weefselspecifieke cellen kan differentiëren; een stamcel bij uitstek en in optima forma is de bevruchte eicel (zygote) (13). A stem cell is a cell that is capable of self-renewal to an extent that it can perpetuate itself indefinitely (14). We kunnen dus besluiten dat een stamcel twee belangrijke eigenschappen bezit. Ten eerste bezit ze een bepaald differentiatiepotentieel, ten tweede heeft ze de mogelijkheid om zichzelf onbeperkt en ongedifferentieerd te vernieuwen doormiddel van celdeling Indeling De indeling van stamcellen gebeurt meestal aan de hand van hun ontwikkelingspotentieel en op basis van hun oorsprong. Marieken Vanden Broucke Pagina 7

8 Indeling volgens ontwikkelingspotentieel Totipotente stamcellen Totipotentie: het vermogen van embryonale cellen om zich in alle richtingen te differentiëren (13). Wanneer de zaadcel versmelt met de eicel, ontstaat een zygote. Een zygote is een voorbeeld van een totipotente stamcel; deze cel is namelijk in staat om uit te groeien tot een compleet organisme (alle 220+ verschillende cellen) inclusief het extra-embryonaal weefsel zoals placenta, moederkoek,... (1) De vroege blastomeren die ontstaan door klievingsdelingen van de zygote zijn ook totipotent (10) Pluripotent Op het blastocyst stadium zal de eerste vorm van differentiatie gebeuren. De cellen splitsen zich op in een trofoblast aflijning en een inner cell mass die respectievelijk instaan voor de ontwikkeling van de extraembryonale structuren en het eigenlijke embryo (11). De cellen van de inner cell mass zijn pluripotent, wat wil zeggen dat ze aanleiding kunnen geven tot zowel endodermale, ectodermale en mesodermale structuren. Ook Embryonale stamcellen en epiblast stamcellen zijn pluripotent (1) Multipotent Multipotente stamcellen zijn cellen die tot een beperkt aantal celtypes kunnen differentiëren. Hun differentiatie en proliferatiemogelijkheden zijn meer beperkt daar ze enkel tot cellen van één kiemlaag kunnen differentiëren, hoewel men heeft aangetoond dat ze ook over een zeker plasticiteit beschikken. Ze zijn vaak committed prognitors. De meeste multipotente stamcellen zijn volwassen stamcellen (adult stem cells of AS-cellen). Een volwassen stamcel is een nog niet gedifferentieerde of een niet-gespecialiseerde cel die na de geboorte voorkomt in een gedifferentieerd en gespecialiseerd weefsel van een organisme. Ze zijn nodig in het lichaam om bepaalde cellen met een korte levensduur te vervangen. Voorbeelden van AS zijn de hematopoietische (bloedvormende) stamcellen, neurale stamcellen uit hersenweefsel, stamcellen in huid- en vetweefsel. Aanvankelijk was men er vast van overtuigd dat de AS zeer geringe differentiatie- en proliferatiemogelijkheden had. Maar recent onderzoek van de Belgische onderzoekster Catherine Verfaillie bewees het tegendeel. Ze slaagde erin AS toch te laten differentiëren tot cellen van een ander kiemblad (15).. Wanneer committed prognitorcellen van de embryo in verschillende micro-omgevingen worden geplaatst kan het lot van de cellen veranderen en kunnen ze plots toch in staat zijn om cellen van een ander kiemlaag te produceren, alhoewel dit met slechts zeer lage efficiëntie gebeurt, dit fenomeen noemt men plasticiteit (16) Unipotent Unipotente stamcellen zijn in staat om aan één welbepaald type gedifferentieerde cel oorsprong te geven. Testiculaire stamcellen zijn hier een voorbeeld van (1) Indeling volgens oorsprong Embryonale stamcellen of ES 8

9 Een embryonale stamcel is een pluripotente cel die uit de ICM van een blastocyst wordt geïsoleerd; deze cellen zijn in principe uitermate geschikt voor weefselgeneratie, maar het gebruik ervan is beperkt door tumorgeniciteit; daarom worden vaak somatische, meer weefselspecifieke stamcellen gebruikt, bijv. stamcellen uit darmcrypten of uit de basale laag van de epidermis, waaruit dan uitsluitend resp. darmepitheel of huid kan ontstaan(13). Embryonale stamcellen worden gepreleveerd in het pré-implantatiestadium wat hun dus doet verschillen van de epiblast stamcellen. Beiden zijn echter pluripotent maar er zijn wel duidelijke verschilpunten (12) Epiblast stamcellen De epiblast stamcellen vinden net als de embryonale stamcellen hun oorsprong uit de cellen van de inner cell mass maar deze keer na de implantatie van het embryo. Ze zijn pluripotent maar hun ontwikkelingspotentieel is beperkter. Zo zijn ze minder efficiënt in het genereren van chimeren en hebben reeds een X-chromosoom inactivatie ondergaan. Ook vertonen ze een heterogene expressie van vroege lijnspecifieke markers (12). Muizen EpiSCs hebben meer gelijkenissen met humane ES-cellen dan dat de muizen ES-cellen hebben (2, 12) Foetale stamcellen Cells derived from a FETUS that retain the ability to divide, proliferate and provide progenitor cells that can differentiate into specialized cells. (Mesh) Gereprogrammeerde cellen zie verder 1.2 De geschiedenis van het stamcel onderzoek 1883 Germ plasm theorie; cellulaire differentiatie zou worden verklaard door asymmetrische deling (August Weismann) (2) Nucleaire equivalentie wordt aangetoond aan de hand van het bekomen van 2 volledige salamanders uit 1 bevruchte eicel. Er werd bewezen dat wanneer cellen delen de dochter cellen de zelfde erfelijke informatie bevatten als elkaar en als de voorloper cel. (Spemann) (2) Eerste nucleair transfer (NT) experiment bij kikkers (Briggs and King) Waarbij cellen van het blastula stadium werden getransplanteerd samen met nucleoplasma in een onbevrucht eitje. Thomas King en Robert Briggs waren er echter van overtuigd dat dit enkel mogelijk was bij vroeg embryonale cellen en dat onze cellen dus irreversibele veranderingen ondergaan bij hun maturatie (1, 2) John Gurdon en zijn collega s publiceerden een onderzoek waarin nucleaire transfer experimenten werden uitgevoerd met latere ontwikkelingsstadia zoals de intestinale cellen van een kikkervisje. Hij toonde aan dat het epiginoom van gedifferentieerde cellen gereset kan worden naar een pluripotente status (1, 2, 12). Marieken Vanden Broucke Pagina 9

10 1964 Demonstratie dat embryonic carcinoma cellen (EC cellen) afkomstig uit teratoma's pluripotent zijn( Kleinsmith en Pierce) (1) De eerste pluripotente cel die men in een laboratorium kon kweken was afkomstig van een kiemceltumor meer bepaald een teratocarcinoma. Wanneer deze kanker cellen uitgezet worden in een weefsel cultuur vormen er zich embryonale carcinoma cellen. Dit demonstreerde dat kankercellen gereprogrammeerd kunnen worden tot pluripotente cellen (1) EC cellen kunnen somatische cellen reprogrammeren in hybriden (Millers Ruddle) (1). Thymocieten werden door een fusie experiment met embryonale carcinomacellen gereprogrameerd tot pluripotente cellen (17) Isolatie van muis embryonale stamcellen uit de inner cell mass (ICM) van muis blastocysten. (Evans en Kaufman, Martin) (2) 1987 Transdifferentiatie van fibroblasten naar spiercellen door middel van Myod (Davis et all.) (2) 1992 Isolatie van muis embryonale germ cellen (EG cellen) uit foetale germ cellen (Resnick er al en Matsui et al.). (2) 1997 Eerste gekloonde zoogdier uit een volwassen cel (Dolly) (Wilmut et al.). (2) 1998 Derivatie van humane ES cellen (Thompson et al.). (2) 2006 Eerste geïnduceerde pluripotente stamcellen (ips-cellen) gegenereerd uit volwassen muis fibroblasten (Takahashi en Yamanaka) (7). 1.3 Strategieën voor reprogrammering of de productie van patiënt specifieke stamcellen Muizen en menselijke embryonale stamcellen kunnen geïsoleerd worden uit de ICM van de blastocyst. Ze worden als een waardevolle bron voor celtransplantatie therapie beschouwd. Er is echter nog steeds immuun afstoting mogelijk waardoor de toepassing van deze transplantaties bemoeilijkt wordt. Deze problemen kunnen gedeeltelijk worden opgelost door somatische volwassen cellen te reprogrammeren(10). Reprogrammering is een fysiologisch verschijnsel tijdens de levenscyclus in het vroege embryo en de kiemcellen maar kan ook worden bereikt in vitro waarbij epigenetische markers gereset worden om een wijder ontwikkelingspotentieel te verkrijgen(18). Op deze wijze reset men als het ware een ander celtype (meer gedifferentieerd) naar de pluripotente stamcel status. Een andere mogelijkheid voor de generatie van patiënt specifieke cellen is de mogelijkheid tot transdifferentiëren van bepaalde cellen naar een andere weefselspecifieke cellijn(1). Men moet er rekening mee houden dat cellen in weefselculturen in contrast tot cellen die zich in het embryo bevinden, blootgesteld worden aan andere selecterende condities, en dit resulteert in cellulaire statussen die niet zijn zoals men ze zou zien in vivo. Aangezien deze cellen zich aanpassen aan de proliferatie in weefselculturen die slechts ten dele de situatie in vivo benadert(8). 10

11 1.3.1 Nucleaire transfer (NT) of Somatische Cel Nucleaire Transfer (SCNT) De eerste Nucleaire Transfer experimenten werden ontwikkeld om te evalueren of de kern van een embryonale cel identiek is aan deze van een volwassen somatische cel. Nucleair transfer experimenten met amfibieën in de jaren 50 en 60 en later bij zoogdieren demonstreerden dat het genoom van volwassen cellen en zelf dat van terminaal gedifferentieerde cellen de capaciteit behouden om oorsprong te geven aan levensvatbare klonen. Dit is een bewijs dat de beperking in differentiatiepotentieel tijdens de ontwikkeling het gevolg is van epigenetische modificaties, in plaats van genetische veranderingen (1). Wanneer een nucleus van een gedifferentieerde somatische cel wordt getransplanteerd in een ontkernde oocyt of een ontkernde stamcel, word nucleaire herprogrammering geïnitieerd. Na artificiële activatie van de gereconstrueerde eicel kan deze uitgroeien in vitro tot een embryo. Wanneer dit gekloonde embryo ingeplant wordt in een baarmoeder kan dit aanleiding geven aan een volledig organisme met het genetisch materiaal van de donor. Dit laatste word klonen genoemd. Dit soort experimenten toonde voor eens en voor altijd aan dat er geen irreversibele veranderingen gebeuren bij het differentiatie proces (op enkele uitzonderingen na zoals homologe recombinatie in de lymfocyten). Met andere woorden cel differentiatie gaat gepaard met veranderingen in gen expressie en niet met veranderingen in genetische substantie(16). Dit geeft een indicatie dat er factoren aanwezig zijn in de recipiënt cel die het genetisch materiaal van de donor epigenetisch kunnen modificeren (17). Maar vele gekloonde dieren vertonen fenotypische en genetische abnormaliteiten dat suggereert dat nucleaire reprogrammering leidt tot foute epigenetische reprogrammering. Anderzijds zijn embryonale stamcellen die afkomstig zijn van gekloonde embryo's verkregen na een NT-experiment niet te onderscheiden van normale ES-cellen. Dit zou kunnen veroorzaakt worden door een positieve selectie voor volledige reprogrammering die gebeurt bij het kweken in vitro (19). De amfibieën waren de eerste dieren waarbij er succesvol NT experimenten werden beschreven, de eerste in 1952, Thomas Briggs en Robert King slaagden er toen in om uit de vroege embryonale blastula stadia van een kikker, via een NT in een ontkernde oocyt, zwemmende kikkervisjes te creëren. Zij slaagden er echter niet in om dit zelfde te bereiken met verdere ontwikkelingsstadia. Hun besluit was dan ook dat er ergens in het differentiatieproces, irreversibele genetische veranderingen optraden. Gurdon en zijn collega's konden later vruchtbare volwassen kikkers ontwikkelen uit een NT-experiment waarbij de intestinale celkernen van kikkervisjes in een ontkernde eicellen werden gebracht. Wanneer men echter als donorkern een adulte celkern gebruikte konden er wel kikkervisjes maar geen volwassen kikkers worden gegenereerd (2). Door de kleinere celgrootte bij zoogdieren is een kerntransplantatie technisch moeilijker. Maar in 1996 kwam er een doorbraak; Wilmut en zijn collega's waren er in geslaagd om uit een gedifferentieerde volwassen follikelcel een gekloond schaap te laten ontwikkelen. Dit gekloonde dier werd Dolly genaamd en werd wereldbekend(1). Na Dolly duurde het niet lang voor verscheidene andere zoogdieren werden gekloond. Zoals honden (20, 21), katten (22), paarden (23, 24), koeien (25, 26) en kamelen (27). Een omgekeerde relatie tussen de differentiatiegraad en de efficiëntie van reprogrammering zou zowel bij de amfibieën als de zoogdieren op te merken zijn. (36) Marieken Vanden Broucke Pagina 11

12 Alhoewel het klonen van muizen slechts een zeer lage efficiëntie heeft, is de efficiëntie van de generatie van muis embryonale stamcellen, via NT, vergelijkbaar met deze van het verkrijgen van gewone muis ESC uit de ICM van de blastocyst (10). Het feit dat er onbevruchte eicellen nodig zijn voor deze techniek van SCNT kan beperkingen opleggen voor de derivatie van menselijke NT-ES-cellen. Maar men heeft ontdekt dat men het zelfde kan bereiken wanneer men de celkern van een volwassen somatische cel inbrengt in een ontkernde zygote. Bij dit protocol is het noodzakelijk om tijdens de mitose van de zygote de celcyclus stil te leggen doormiddel van de toevoeging van nocodazole, de chromosomen te verwijderen en de donor afkomstige mitotische chromosomen in te brengen. Vooral het stil leggen van de meiose is hier essentieel, aangezien het niet mogelijk is om cellen ouder dan het vier cellig embryo stadium te kloneren met een interfase zygote als recipiënt-cel (10, 17, 28). Men slaagde er in om op deze wijze verschillende embryonale stamcellijnen te ontwikkelen afkomstig van embryonale en somatische donorcellen. Chimere muizen embryo's met germline transmissie werden op deze mannier gevormd. Dit bewijst hun volledige reprogrammering. Het voorgaand onderzoek werd uitgevoerd bij de muis, bij de mens werd deze techniek nog niet beschreven maar het zorgt wel voor de mogelijkheid dat afgedankte embryo's verkregen na IVF behandeling kunnen worden gebruikt voor de derivatie van NT-ES-cellen in plaats van oocyten (17, 28). Het maakt ook de weg vrij voor de hypothese dat het mitotisch cytoplasme van de nu al aanwezige humane embryonale stamcellijnen efficiëntere reprogrammering kan bewerkstelligen dan de vorige geteste interfase extracten. Volgens Egli en zijn collega's zou het verschil tussen de oocyt versus zygotische cellen als acceptorcel zich bevinden bij het feit dat de noodzakelijke factoren voor reprogrammering tijdens de interfase slechts gelokaliseerd voorkomen, waar ze tijdens de meiose net vrijkomen en dus wel kunnen meewerken aan de reprogrammering (17) Fusie Het eerste fusie experiment werd beschreven door Miller en Ruddle. Zij wisten thymocyten te fusioneren met embryonale carcinoma (EC) cellen. Uit dit huwelijk ontstond een pluripotente tetraploïde hybride cel of een pluripotente cel met dubbel zoveel genetisch materiaal(17). Later werden de zelfde resultaten geboekt door fusie met ES cellen en EG cellen (1). Wanneer deze gereprogrameerde pluripotente stamcellen in een immuungedeprimeerde muizenpopulatie werden ingebracht vormden zich teratoma's die bestonden uit weefsel afkomstig uit de drie kiemlagen. Ook brengen ze genen tot expressie die centraal staan bij het verkrijgen en behouden van pluripotentie zoals; Oct4, NANOG en Sox2. Dit bewijst dat ze pluripotent zijn maar of deze cellen effectief volledig zijn gereprogrameerd weet men nog niet. Verder onderzoek met gen expressie analyses en chromatine immunoprecipatie analysen zullen de graad van reprogrammering beter kunnen vaststellen (17, 28). Door de aanwezigheid van het kernmateriaal van de stamcel waarmee de somatische cel wordt gefuseerd is er een het probleem van immuunrejectie. Hiervoor zijn verschillende strategieën bedacht. Het is mogelijk om selectief bepaalde ES-cel afkomstige chromosomen te verwijderen zoals de Major Histocompatiblillity complex (MHC) loci. Het volledig verwijderen van al het genetisch 12

13 materiaal afkomstig van de ES-cel wordt een technische uitdaging doordat dit leid tot een ernstige instabiliteit van het genoom (10). Sommige groepen onderzoekers geven dan ook de voorkeur om te proberen cellen te reprogrammeren met humaan ES-cel extract afkomstig uit de metafase (17, 28). EScellen, ECC, EpiSC-cellen, EGC's en multipotent germline stamcellen zijn allen in staat om via fusie met een somatische cel reprogrammering te induceren. Allen zijn afkomstig van het embryo of de kiemcellijn. De grootste overeenkomst tussen deze cellen in vivo is dat ze allen Oct4 endogeen tot expressie brengen. Deze transcriptiefactor lijkt op deze mannier gelinkt aan het herwinnen van de pluripotentie na explantatie. Alhoewel al deze stamcellen pluripotent zijn slaagt men er enkel bij de ES-cellen in om via tetraploïde complementatie muizen te vormen die enkel afkomstig zijn van de ES-cellen ook all-stamcel-muizen genaamd. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt doordat ES-cellen in tegenstelling tot de rest gebalanceerde parentale imprinting vertonen die noodzakelijk is voor een normale ontwikkeling. De EG-cellen en de mgscellen zijn hun imprinting verloren of hebben een enkel een vaderlijke imprint (19) Spontane reprogrammering door kweekcondities Net zoals de ES-cellen niet bestaan in vivo, ze worden getransformeerd en gereprogrammeerd door het lange termijn kweken van de ICM cellen, zo kunnen pluripotente Embryonale germ (EG) cellen worden gecreëerd door een lange termijn cultuur van primordiale kiemcellen. Deze vaststelling wijst er op dat het mogelijk moet zijn om pluripotente cellen te genereren doormiddel van het kweken van andere meer mature celtypes in vitro (10). De Belgische Catherine Verfaillie en haar collega s deden dit met adulte stamcellen, door het langdurig kweken van beenmerg heamotopoetische stamcellen. Ze noemden deze nieuwe soort cellen de Multipotente adulte prognitor cellen of MAPCs. MAPCs verschillen van de ES-cellen in dat ze een lagere serum concentratie nodig hebben en op een lage densiteit moeten worden gehouden. Ook kunnen ze in geselecteerde gevallen chimere muizen vormen en aan de germ line transmissie deelnemen. Maar er is nog meer onderzoek nodig (29). Ook door het kweken in vitro van germline stam (GS) cellen afkomstig van neonatale muizentestis kan men pluripotente stamcellen genereren. Deze werden multipotente germline stam cells genaamd of mgs-cellen. De kweekmethoden van de GS cellen zijn anders dan deze van de mgs-cellen die op hetzelfde medium als ES-cellen worden onderhouden. mgs-cellen en ES-cellen hebben verschillende gemeenschappelijke kenmerken, zo kunnen ze in het zelfde kweekcondities worden gekweekt, hebben ze gelijkaardige morfologie, proliferatiecapaciteit, teratoma vorming en zelfs medewerking aan chimere muizen met germline transmissie. Jammer genoeg is de efficiëntie nog steeds zeer laag (er zijn ongeveer 30 experimenten nodig voor 1 geslaagde generatie van mgs cellen) Deze stijgt door het verlies van de p53 functie, een welbekende tumor supressor. Alhoewel mgs-cellen een andere imprinting vertonen dan de GScellen en hun chimere muizen normaal lijken is er nog meer onderzoek nodig naar de carcinogeniteit van de gedifferentieerde mgs-cel afkomstige cellen (17). Niet enkel uit het kweken van neonatale testes cellen maar ook van adulte muistestis cellen kunnen germline competente pluripotente stamcellen worden gegenereerd. Deze worden dan multipotent adult germline stem Marieken Vanden Broucke Pagina 13

14 (mags)- cellen genoemd. Maar hun mannelijke imprinting kan beperkingen opleggen aan hun differentiatiepotentieel (17). Reprogrammering van spermatogoniale stamcellen is enkel mogelijk bij mannen en niet bij vrouwen. Als alternatief kan men via parthenogenese toch vrouwelijke stamcellen verkrijgen. Parthenogenese is de voortplanting via onbevruchte eicellen. Deze eicellen kunnen door chemische of andere prikkels tot ontwikkeling worden gebracht. Doordat de embryonale ontwikkeling van zoogdieren ook vaderlijke gen expressie nodig heeft, sterven deze embryo's normaliter vroeg na implantatie. Want de bekomen embryo s hebben enkel een vrouwelijke imprinting. Er werden reeds parthenogenetische ES-cellen verkregen van zowel muizen als non-humane en humane primaten. Deze hebben echter een minder heterogeen MHC presentatie en zouden dus afgestoten worden daar ze gemakkelijk herkend worden door ons immuunsysteem, in het bijzonder de natural killer cells. Een oplossing voor dit probleem werd aangegeven door Daley en zijn collega's die een methode ontwikkelde om de beide vrouwelijke MHC-loci te behouden bij de parthenogenese (17) Geïnduceerde pluripotente stamcellen Uit het voorgaande kan men hypothetiseren dat er in ES-cellen en eicellen factoren moeten aanwezig zijn die de pluripotentie induceren en in stand houden. In 2006 werd een baanbrekend onderzoek gepubliceerd. Takahashi, Yamanaka en hun collega's slaagden er in om met behulp van retrovirusen, transcriptiefactoren in te brengen bij volwassen somatische cellen en op deze mannier ze te reprogrammeren tot pluripotente stamcellen, Induced Pluripotent Stem Cells genaamd of ipsc. Er werden 24 verschillende factoren getest op hun potentieel om pluripotentie te induceren. Na analyse bleek dat met de retroviraal gemedieerde introductie van slechts vier transcriptiefactoren (Oct3/4, Sox2, c-myc en Klf4) een fibroblast kan worden omgevormd naar een pluripotente status (15). De eerste generatie ips-cellen die op deze wijze werden gegenereerd waren vergelijkbaar in morfologie, proliferatie en teratomavorming met ES-cellen maar bleken echter niet in staat te zijn om na injectie in een blastocyst aanleiding te geven tot volwassen chimere muizen of mee te doen aan de germline transmissie. Wel werden er chimere embryo's gevormd. Dit kan verklaard worden door het significante verschil in gen expressie en DNA methylisatiepatroon tussen de ES-cellen en de ips-cellen. Dit verschil bleek verklaarbaar door het gebruik van Fbx-15 als selectiecriteria. Fbx-15 is een target van Oct3/4 en Sox2 maar is niet noodzakelijk voor pluripotentie. Er werd gezocht naar andere betere selectiecriteria. Nanog werd in 2007 beschreven als een beter selectiemarker. Nanog speelt een cruciale rol in de reprogrammatie. De Nanog geselecteerde ipsc-cellen zijn vrijwel niet te differentiëren van de EScellen in hun genexpressie patroon, DNA-methylatie en histoon modificatie. Hierbij komt ook dat vrouwelijke Nanog-geselecteerde ips-cellen een reactivatie van het somatisch geïnactiveerde X- chromosoom ondergaan en bij differentiatie een random X-inactivatie ondergaan. Oct-3/4 kan ook gebruikt worden als waardevol alternatief (17). Deze tweede generatie ips-cellen is vrijwel onherkenbaar van de EScellen waarbij sommige ips-cellijnen een equivalent ontwikkelingspotentiaal vertonen als dat van ES-cellen zoals men kon aantonen bij wijze van tetraploïde complementatie (19).. Met dezelfde transcriptiefactoren kan men cellen van verschillende diersoorten zoals de mens, apen en ratten reprogrammeren en ook verschillende cellen afkomstig van verschillende weefsels zoals, keratinocyten, neurale cellen, maag en 14

15 leverweefsel reprogrammeren,wat er op wijst dat de fundamentele eigenschappen van het transcriptienetwerk die instaat voor pluripotentie gedurende de evolutie bewaard is gebleven (1) Mechanisme van de belangrijkste 4 transcriptiefactoren Pluripotente stamcellen zijn onsterfelijk en hebben een open en actieve chromatine structuur. C-myc proteïnen zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor het openen van de chromatine structuur die zich voordoet in somatische cellen. C-myc lijkt echter ook op p53-afhankelijke mannier apoptose te veroorzaken. KLF4 onderdrukt de p53 en de c-myc afhankelijke apoptose en activeerde p21 die dan op zijn beurt instaat voor de onderdrukking van de proliferatie. Deze opmerking maakt duidelijk dat de ballans tussen c-myc en KLF4 een kritieke rol speelt bij het transformatieproces naar ips-cellen. c-myc en KLF4 alleen resulteert echter enkel in de generatie van tumorcellen en geen pluripotent stamcellen. Het is waarschijnlijk dat Oct- 3/4 de bestemming van de cel dirigeert weg van de tumor cellen en naar het ES-like cellen. Oct-3/4 alleen is echter niet voldoende. Sox2 blijkt ook noodzakelijk te zijn om synergetisch verschillende target genen te activeren of te inhiberen. KLF4 fungeert hier mogelijks als een 3de cofactor (17). 1.4 Rol van de epiginetica bij reprogrammering De evolutie van zygote tot volwassen organisme wordt gekarakteriseerd door fasen van reprogrammering en differentiatie. De veranderingen in genexpressie die dit proces vergezellen worden veroorzaakt door transcriptiefactoren en epigenetische modificaties (epigenetische programmering). In andere woorden, de ontwikkelende somatische cellen verkrijgen een groeiend aantal epigenetische markers. In contrast hiermee staat de epigenetische reprogrammering die plaats vindt in het vroege embryo en de kiemcellen. Reprogrammering houdt in dat de epigenetische markers worden gereset wat meestal een groter ontwikkelingspotentieel als gevolg geeft(18). Epigenetische modificaties zijn genetische processen die erfelijke veranderingen veroorzaken zonder een verandering in de DNA sequentie. De mechanismen die dit bewerkstelligen zijn onder andere: DNA methylering, histoon modificaties, DNA replication timing, nucleosome positionering en heterochromatizatie. DNA methylisatie gebeurt meestal symmetrisch ter hoogte van een cytosine base in CpG nucleotiden en is meestal geassocieerd aan gen repressie en de vorming van heterochromatine. Histone modificaties bevatten een reeks van modificaties, inclusief acetylisatie, methylisatie, fosforilatie, ADP ribosylatie en ubiquitylatie. De histone modificaties kunnen zowel een repressief effect veroorzaken als een activerend effect veroorzaken (18) In vivo reprogrammering De primordiale kiemcellen kunnen bij de muis worden waargenomen vanaf dag 6,25 van de embryonale ontwikkeling. Ze bevinden zich in de extra-embryonale regio posterieur van de primitieve streep. De primordiale kiemcellen ondergaan uitgebreide reprogrammering tijdens en na hun migratie naar de ontwikkelende gonaden. Dit resulteert in de deletie van de ouderlijke imprinting (epigenetische modificatie waarbij het moederlijk en vaderlijke allel van een gen respectievelijk geactiveerd en onderdrukt worden, of omgekeerd) en andere epigenetische merkers in hun genoom(18). Marieken Vanden Broucke Pagina 15

16 In een eerste fase van de reprogrammering die start rond dag 8,5 kan men verschillende modificaties waarnemen. Een significant verlies van Lys9 histone H3 (H3K9me2) dimethylering en verlies van DNA methylering zijn de eerst waar te nemen veranderingen. Beiden zijn relatief stabiele repressieve modificaties. Maar ze zijn niet de enige, andere voorbeelden zijn verrijking met H3K4me2, H3K4me3, H3K9 acetylering (H3K9ac) en de verrijking van symmetrische methyleringen ter hoogte van het arg3 van histone H4 en H2A. De betekenis van deze gebeurtenissen is nog niet voldoende ontrafeld maar ze zijn geassocieerd met de expressie van transcriptiefactoren die eigen zijn aan een pluripotente status, zoals SOX2, OCT4, NANOG en STELLA. Dit duidt op het belang van de chromatine status bij het verkrijgen van pluripotentie (18). Een tweede fase van reprogrammering start vanaf dag 11,5 na de ingang van de PGC's in de ontwikkelende gonaden, tijdens deze perioden worden de imprintingen gewist en ook vele andere DNA sequenties worden gedemethyleerd. Maar demethylisatie is niet de enige gebeurtenis tijdens deze fase. Er worden ook andere veranderingen waargenomen, bijvoorbeeld een verlies aan linker histone 1, een downregulatie van de H3K9me3, H3K27me3 en een verdwijnen of verschijnen van factoren die geassocieerd zijn aan facultatief of constitutief heterochromatine. Facultatief heterochromatine is de fractie van chromatine die gecondenseerd en geïnactiveerd is in een bepaalde cellijn, maar gedecondenseerd en actief kan zijn in andere cellijnen. Constitutief heterchromatine is de fractie van het heterochromatine die compact blijft doorheen de levenscyclus, het is hoofdzakelijk samengesteld uit repetitieve sequenties en is geconcentreerd in karakteristieke regio's zoals centromeren (18). Deze 2 fasen lijden dus tot het progressief strippen van de meeste epigenetische markers aanwezig in de primordiale kiemcellen. De analyse van twee loci suggereren dat de DNA demethylisatie de chromatine remodelling voorafgaat(18). Nadat het genoom van de meeste epigenetische markers is gestript zal er een fase van DNA remethylisatie ontstaan. Bij mannelijke embryo's start dit proces op dag 15 a 16 van de embryologische ontwikkeling. Bij vrouwelijke embryo's zal dit slechts postnataal plaatsvinden(18). De meest prominente epigenetische modificaties hier is het invoegen van imprinting. We kunnen dus besluiten dat in de kiemcellijn er grofweg 2 fasen te onderscheiden zijn. De eerste is een fase van demethylisatie en stripping van de meeste epigenetische modificaties. De tweede fase is de remethyleringatie die bij de man in de pro-spermatogonia plaats vind en bij de vrouw na de geboorte in de groeiende oocyten (18) Na de fertilisatie De bevruchting brengt een nieuwe golf van epigenetische reprogrammeren met zich mee. Deze is gekarakteriseerd door de snelle activatie van DNA demethylisatie nog voor het begin van de DNA replicatie gevolgd door een passief DNA methylisatie die duurt tot aan het morula stadium. In contrast met de reprogrammatie die gebeurt in de PGC's worden de ouder-specifieke methylisaties ter hoogte van de Imprinting Control Regions behouden. De novo methylisatie wordt geïnitieerd voor het blastocyst stadium en gaat gepaard met de vroegste differentiatie, namelijk de opsplitsing in embryonaal en extra-embryonale cellijn, voorgesteld als respectievelijk de ICM en het trofectoderm. 16

17 Het globale methylisatiepatroon verschilt tussen beiden waarbij trofectodermcellen minder gemethyliseerd zijn vergeleken met de cellen van de ICM. Ook op het niveau van de histonen is er een verschil waarneembaar (18) Pluripotentie en epigenetica Er zijn drie fasen in de embryologische ontwikkeling van knaagdieren waaruit succesvol stamcellen kunnen worden geïsoleerd. Deze includeren de vroege PGC's tussen dag 8,5 en 12, 5 van de embryologische ontwikkeling die oorsprong geven aan embryonic germ cells in vitro, cellen van het morula tot blastulastadium waaruit embryonale stamcellen kunnen worden gepreleveerd en de epiblast stamcellen die hun oorsprong vinden in de 5,5 a 6,5 dagen oude embryo. Het is belangrijk om te vermelden dat menselijke embryonale stamcellen meer gelijkenissen hebben met murine episc-cellen dan met de muizen ES-cellen (18). De drie verschillende stamcellen brengen allen pluripotentie markers tot expressie bijvoorbeeld; OCT4, NANOG, SOX2, SALL4. Deze transcriptiefactoren zijn de hoofdfactoren die meewerken in het pluripotentie netwerk. Dit netwerk activeert genen die noodzakelijk zijn voor ES-cel overleving en proliferatie en onderdrukt target genen die enkel actief zijn tijdens differentiatie. Intrigerend genoeg reguleren deze transcriptiefactoren hun eigen expressie en vormen ze een self-reinforcing circuit of pluripotentie (18). Naast deze transcriptiefactoren word pluripotentie, zelfvernieuwing en differentiatie in de ES-cellen ook bepaald door de chromatine organisatie en de epigenetische modificaties. Genen die onderdrukt worden bij pluripotentie maar actief zijn bij differentiatie zijn meestal gemarkeerd door een bivalent H3K4me3 en H3K27me3 domein. De status van deze merkers kan efficiënt het verschil duidelijk maken tot een geëxpresseerd (H3K4me3), een voorbestemming tot expressie (H3K4me3 en H3K27me3) en een onderdrukt (H3K27me3) gen. Maar ongeveer 1/3 van de genen in ES-cellen zijn niet gemarkeerd door H3K4me3 nog door H3K27me3, deze genen worden echter meestal onderdrukt door een DNA methylisatie (18). Pluripotentie word bepaald door een intrigerend netwerk bestaande uit een wisselwerking tussen enerzijds transcriptiefactoren en anderzijds epigenetische modificaties. Verschillende epigenetische modificaties die genen onderdrukken of activeren zijn gebonden door OCT4, NANOG, SOX2 en/of SALL4. De ballans van de epigenetische modificaties met tegengestelde functies kan pluripotentie onderhouden door het versterken van de Oct4 en NANOG expressie. Maar een kleine verstoring van dit evenwicht kan lijden tot differentiatie. Dus pluripotentie is een kwetsbaar evenwicht(18). Een intrinsieke eigenschap van ES-cellen is hun fluctuatie tussen verschillende epigenetische statussen met een heterogene expressie van verschillende regulerende genen. Deze metastabiliteit wordt gezien als de cruciale stap die moet overwonnen worden bij de derivatie van ES-cellen, aangezien er in vivo een snelle val' gebeurt naar meer stabielere gedifferentieerde cellen. Voorbeelden van deze heterogene geexpreseerde factoren zijn NANOG, REX1, PECAM1 (platelet/endothelial cel adhesion molecule 1), SSEA1 (stagespecific embryonic antigen) en STELLA (18). Marieken Vanden Broucke Pagina 17

18 1.4.4 Epigenetica en differentiatie. Differentiatie is een fundamenteel eenrichtingsproces, alhoewel individuele cellen plasticiteit vertonen. Bij de bepaling van het cellot zijn zowel de transcriptiefactoren als de epigenetische factoren van belang De transcriptie factoren. De regulatie van Oct 4 lijkt een zeer belangrijke stap in de determinatie van het cellot. Oct4 bepaald of de differentiatie richting trofoblast, epiblast of primitief endoderm zal gaan. In de afwezigheid van Oct4 zullen de cellen zich differentiëren richting de trofoblastcellijn, overexpressie veroorzaakt differentiatie in primitief endoderm (17, 18). SALL4, een Oct4 regulerende factor, is net zo belangrijk als Oct4 bij de ontwikkeling van epiblast en primitief endoderm en net zoals bij Oct4 zal downregulatie van deze transcriptiefactoren lijden tot het ontstaan van trofoblast weefsel (18). NANOG is ook noodzakelijk voor de ontwikkeling van de ICM; downregulatie ervan zorgt voor differentiatie in de richting van het primitief endoderm (17, 18). De vorige transcriptiefactoren zijn geassocieerd met de differentiatie van de ICM. Bij de differentiatie van de trofoblastweefsel zijn andere transcriptiefactoren actief. EOMES (eomesodermin) is in samenwerking met CDX2 noodzakelijk voor het ontstaan van een normale en functionele trofoblast differentiatie en proliferatie in vivo. Maar ablatie van een van deze genen verhindert niet de initiële vorming van trofectoderm. Dit ondersteunt de hypothese dat er factoren stroomopwaarts zijn die kunnen functioneren als een initiële determinant van het trofoblast cellot. Elf5 ablatie heeft als gevolg dat er zich geen extra-embryonaal weefsel zal ontwikkelen en er zich geen trofoblaststamcellen zullen ontwikkelen in vitro. Elf5 zou de cruciale link vormen in het zelf amplificerend circuit met CDX2 en EOMES (18). Conclusie; de ICM word gedetermineerd door een netwerk waarin Oct4, NANOG, SALL4 en Sox2 betrokken zijn, De differentiatie naar de trofoblast-cellijn word geactiveerd door een circuit waarin CDX2, EOMES en ELF5 geactiveerd worden De epigenetische factoren die het cellot bepalen. Naast de cruciale transcriptiefactoren zijn er ook de epigenetische factoren die het cellot bepalen. Een voorbeeld is de aanwezigheid van co-activator-associated arginine methyltransferase 1 of CARM1, die de H3R2, H3R17, H3R26 methyleert. Blastocysten met een hoog endogeen CARM1 level zullen zich bij voorkeur differentiëren richting de embryonale cellijn. De epigenetische context bepaalt of een cel al dan niet permissief of niet-permissief is om zich te differentiëren richting een bepaalde cellijn maar ze kan er ook voor zorgen dat een cel meer geneigd is om een bepaalde differentiatieweg te volgen. Het is moeilijk om te bepalen of de sleutelrol transcriptiefactoren met lijndeterminerende capaciteit een epigenetisch milieu creëren die aan cellen restricties oplegt in verband met hun differentiatiepotentieel, of dat de eerst aanwezige epigenetishe restricties de activiteit van de belangrijkste transcriptiefactoren determineert en op 18

19 deze wijze het ontwikkelingspotentieel bepaald. Naast de transcriptiefactoren en de epigenetische factoren zijn ook cel-cel interacties en cellulaire polarisatie processen van belang bij de bepaling van het cellot(18) Factoren die het cellot vastleggen Na dat de cellen een voorkeur verworven hebben voor een bepaalde differentiatie route verwerven ze een verlies van de capaciteit om tussen verschillende cellijnen te switchen. Deze restrictie van het cel-lot wordt geregeld door de epigenetische regulatie van Elf5; deze is gemethyleerd en onderdrukt in de embryologische cellijn maar gehypomethyleerd en komt tot expressie in de trofectodermale cellijn. Door een positie-feedback loop met de trofectodermale genen CDX2 en EOMES versterkt Elf5 de beperking van het ontwikkelingspotentieel in de richting van de trofectodermale cellijn. Een ander voorbeeld is de expressie en hypomethylisatie van Stella in de ICM van de blastocyst en de gemethyliseerde en onderdrukte status van Stella in epiblast cellen na implantatie. Dit hangt samen met het meer beperkt ontwikkelingspotentieel van epiblast-stamcellen vergeleken met ES cellen. Zo zijn de ES-cellen veel potenter in de vorming van chimere muizen dan de episc-cellen die nooit of enkel in uitzonderlijke gevallen oorsprong geven aan chimera (18). Samengevat kunnen we stellen dat er eerst een permissieve chromatine status voor cellijn determinatie wordt verkregen, dit doormiddel van histoon modificaties en het hechte samenspel van transcriptorische regulatoren, inclusief OCT4, NANOG, SOX2, SALL4, CDX2 en EOMES. Eens de specifieke cellijn is vastgelegd is DNA methylisatie van enkele cruciale loci (vb Elf5 en Stella) voldoende om hun differentiatiepotentieel te beperken 1.5 Moleculaire handtekening van pluripotentie Het word steeds meer duidelijk dat de pluripotente stamcel types, kunnen worden opgedeeld in 2 fundamenteel verschillende categorieën. De eerste categorie is deze van de embryonale stamcel-like cellen, ofwel de naïeve pluripotente stamcellen genoemd. Deze categorie bevat de muis ES cellen geïsoleerd uit de ICM voor de implantatie in de uterus, zowel als de embryonale Germ stam cellen en de male germ stam cellen afkomstig uit de primordiale kiemcellen of de spermatogoniale stamcellen van muizen(12). De tweede categorie is deze van de epiblast-stamcel like cellen, typisch de post-implantatie epiblast stam cellen van muizen, ook wel de primed pluripotente stamcellen genoemd.(12). Deze twee categorieën worden gestabiliseerd in vitro door verschillende groeimedia, hebben andere specifieke moleculaire handtekeningen en groeipotentiëlen in vitro. Ook hangen deze twee statussen af van verschillende signaal cascades die vaak elkaar antagoniseren(12) De eerste categorie correspondeert met een meer immatuur stadia van pluripotentie terwijl de tweede categorie meer neiging vertoont om te differentiëren. Daarom hernoemden Nichols en Smith deze twee categorien naar de naïeve en de primed pluripotente status. Dit verschil word weerspiegeld door verschillende vaststellingen. Zo zijn de X chromosomen bij de ES Cel-like cellen beiden nog actief, bij de epis cel-like cellen is er al één van de twee chromosomen geïnactiveerd (12). Marieken Vanden Broucke Pagina 19

20 Op vlak van ontwikkelingspotentieel zijn beide statussen in staat om embryoid body's te vormen en teratomen maar is nog geen chimera-vorming beschreven bij de primed cellen. Wel zijn deze laatste veel gemakkelijker te induceren voor het vormen van primordiale kiem cellen. Verschillende signalisatie pathways werken op verschillende mannieren in op de stamcellen. Zo zullen LIF/Stat3, BMP4, WNT, IGF de naïeve cellen stimuleren om hun pluripotente ongediferentieerde status te behouden. Bij de primed cellen gebeurt dit zelfde via de WNT en IGF regulatoren maar ook door TGF-beta, activin, FGF2 en ERK1/2. BMP4 zal hier echter stimuleren tot differentiatie, vooral dan de differentiatie naar primordiale germ cellen. Anderzijds wordt de naïve status dan weer gestimuleerd voor differentiatie door TGF-beta, activin, FGF2 en ERK1/2, wat dus net het omgekeerde is van die bij de primed status (12). Via de moleculaire handtekening kan men de twee verschillende categorieën ook onderscheiden. Beide tonen ze vergelijkbare activiteit van Oct4, Sox 2 genen en bezitten ze SSEA1 en alkalisch fosfatase. En geen één van hen bevat TRA1-60, TRA1-81, SSEA3/4. Verschillen zijn merkbaar op vlak van de expressie van Nanog, Klf2, Klf4, Rex1, Stella die in hoge concentraties terug te vinden zijn in de naïeve cellen maar slechts beperkt of niet worden gevonden bij de geprimede celgroep. Lijn specifieke markers zoals FGF5, Blimp1, Cer1 zijn dan weer enkel te vinden in de primed state. Dit weerspiegelt hun verder gevorderde differentiatie. Hetzelfde fenomeen ziet men voor de MHC type 1 complex presentatie die vrijwel afwezig is bij de ESC-like groep maar wel voorkomt bij de episc-like cellen. Oscillerende genpatronen van Nanog en Rex1 worden waargenomen bij de naïeve cellen. Bij de primed state is dit Blimp1 (een lijnspecifieke marker). Deze gegevens zijn allemaal afkomstig van de muis. Het feit dat naïeve cellen slechts bij bepaalde diersoorten of bepaalde kweeklijnen van een bepaalde diersoort kunnen geïsoleerd worden zorgde ervoor dat er meer onderzoek gebeurde naar de relatie tussen de twee pluripotente statusen en het al of niet mogelijk zijn om de ene status om te zetten tot de andere status van pluripotentie. Latere in vitro en in vivo experimenten toonden aan dat dit mogelijk is. Naïeve cellen kunnen door het promoten van het signaal van TGF-beta, activin en FGF2 aangezet worden om zich te differentiëren tot primed cellen. Meer nog primed EpiSC cellen kunnen epigenetisch terug worden omgezet naar naïve cellen door een variëteit aan genetische manipulatietechnieken en cultuur condities. Hier moet men echter een verschil maken tussen verschillende cellijnen zo zullen deze afkomstig uit permissive cellijnen enkel serum en Lif/Stat3 signaal nodig hebben maar zullen er meer factoren nodig zijn bij de non-permissive cellijnen (12). De menselijke embryonale stamcellen worden net als de muis embryonale stamcellen uit de ICM-geïsoleerd van pre-implantatie embryo's maar ze hebben meer gemeen met de muis primed state EpiS-cellen dan met de naïeve muis ES-Cel status. Zo zijn ze morfologisch gelijkend: met een platte morfologie (muis ESC cellen hebben een gebold uiterlijk), zijn ze afhankelijk van de FGF2/Activin signaal, en hebben ze de neiging voor een X-chromosoom inactivatie. Door het grote belang van de kweek condities bij de muis pluripotente stamcellen, kwam men tot de veronderstelling dat de isolatie en kweekmethode bij de menselijke ESC, misschien de oorzaak zou kunnen zijn van het meer primed dan naïef zijn van deze cellen. Zo werd aangetoond dat wanneer men de ESC isoleert en kweekt worden onder normale atmosferische 20