Opsporen van Globodera spp. in grond

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria 2015/I-MET052/LAB/FLVVM Opsporen van Globodera spp. in grond Versie 02 In toepassing vanaf 27/04/2015 Verantwoordelijke administratie Verantwoordelijke dienst Bestemmelingen FLVVM Sectie biologische analyses: afdeling Globodera Medewerkers afdeling Globodera Naam functie / dienst Datum 1 Opmaak / revisie door: Elly Harnie Sectieverantwoordelijke Biologische analyses Nazicht door: Greet Verscheure Analist Ronny Martens QAM Goedkeuring door: Tony Vanhove Labmanager Elektronische goedkeuring 2015/I-MET052/LAB/FLVVM versie 02 1/12

2 Overzicht van de revisies Revisie Van toepassing vanaf Reden en omvang van de revisie 01 23/03/2015 Omzetten in de nieuwe Template; nieuwe identificatie, versienummering opnieuw starten met v.01 Toevoegen commentaar in het LIMS voor te kleine stalen (Bopmerking Belac audit). Weglaten opspoelen volledig staal /04/2015 Aanpassen temperatuurregistratie in lokaal GLO (automatische registratie in EVISENSE). Trefwoorden: Globodera grond 2015/I-MET052/FLVVM versie 01 2/12

3 INHOUDSTAFEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN GRONDMONSTER CYSTE LEVENSVATBAARHEID PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN TOESTELLEN WERKWIJZE OPSPOELEN VAN DE GRONDMONSTERS Voorbereiding van het opspoelen Opspoelen in de Soil Sample Extractor MICROSCOPISCHE BEPALING VAN HET AANTAL CYSTEN Voorbereiding van het microscopisch onderzoek Microscopisch onderzoek Soortbepaling en levensvatbaarheid KWALITEITSCONTROLE REFERENTIEMATERIAAL EERSTE- EN TWEEDELIJNSCONTROLE DERDELIJNSCONTROLE CONTROLE TEMPERATUUR VAN HET LOKAAL CONTROLE CONTAMINATIE VAN HET GEBRUIKTE MATERIAAL BEREKENING EN RAPPORTERING BEREKENING REGISTRATIE ANALYSEGEGEVENS Resultaten bijhouden op werklijsten Validatie en controle facturatie door de sectieverantwoordelijke Beproevingsverslag DOORLOOPTIJDEN VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN PROCEDURES / INSTRUCTIES FORMULIEREN LOGBOEKEN /I-MET052/LAB/FLVVM versie 01 3/12

4 1 Doel Dit voorschrift beschrijft de methode voor de kwantitatieve bepaling van Globodera spp. (Globodera rostochiensis en Globodera pallida) in grondmonsters. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor alle types grondmonsters die onderzocht moeten worden op aanwezigheid van aardappelcyste-aaltjes Globodera spp. 3 Wettelijke en normatieve documenten - PM 7/40(2): Globodera rostochiensis and Globodera pallida (EPPO norm) - PM 7/119(1): nematode extraction (EPPO norm) 4 Definities en afkortingen Term Origine definitie Definitie EPPO = OEPP PCE European and Mediterranean Plant Protection Organisation ; Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes Provinciale Controle Eenheid De definities werden niet opgenomen in bovenstaande tabel, wegens niet praktisch. 4.1 Grondmonster Bemonsterde grond verkregen hetzij door bemonstering van een bodemmonster dat wordt verzameld uit verschillende boormonsters per hectare, hetzij door bemonstering van planten of plantaardige producten (bvb. wortels, aardappelen). De standaardgrootte van een grondmonster is 1500 ml grond/ha, de minimumgrootte van een grondmonster is 500 ml/ha. Een grondmonster met een volume van meer dan 1500 ml wordt beschouwd als een grondmonster van 1500 ml. 4.2 Cyste Een cyste is een bolvormige structuur gevormd uit de gelooide cuticula (=huid) van de vrouwelijke nematode na haar dood. Een cyste kan tot 1000 larven bevatten. In Figuur 1 wordt de cyclus van een aardappelcyste-aaltje weergegeven. 4.3 Levensvatbaarheid Een cyste is levensvatbaar indien het levende eitjes of juvenielen (larven) bevat. 2015/I-MET052/LAB/FLVVM versie 01 4/12

5 Figuur 1. Levenscyclus van het aardappelcyste-aaltje. 5 Principe De grondmonsters worden opgespoeld in een Soil Sampler Extractor waarbij cysten en organisch materiaal worden opgevangen in zeven. Deze zeven worden gedroogd aan de lucht, waarna het materiaal op de zeef kan onderzocht worden op aanwezigheid van cysten met behulp van een binoculair. 6 Prestatiekenmerken Voor de prestatiekenmerken van de methode wordt verwezen naar het validatiedossier. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen Personen die werken in het lokaal van de opspoeltoestellen, kunnen een veiligheidsbril dragen. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1. Opvangzeven: maaswijdte 250 µm, diameter 200 mm, hoogte rand 50 mm, type Retsch (leverancier Labo Service Belgium) 8.2. Spatel 8.3. Plastic maatbekers van 1 liter 8.4. Houten telplaat 8.5. Dissectienaald 8.6. Zeef: maaswijdte 800 µm, diameter 200 mm, hoogte rand 50 mm, type Retsch (leverancier Labo Service Belgium) 2015/I-MET052/LAB/FLVVM versie 01 5/12

6 8.7. Plastic recipiënt voor bewaren van cysten 8.8. Plastic petrischaaltje (diameter 10 cm) 9 Toestellen - Soil Sample Extractor, - stereomicroscopen en lichtbronnen. 10 Werkwijze De grondmonsters worden ontvangen in de afdeling dispatching. Er wordt onderscheid gemaakt tussen niet FAVV monsters (klantenstalen afkomstig van Waals Gewest, Vlaams Gewest of bijvoorbeeld CKCert) en FAVV monsters. De niet FAVV monsters krijgen in de dispatching een reeksnummer en vervolgens een monsternummer. De FAVV monsters krijgen in de afdeling Globodera een reeksnummer. De grondmonsters zijn steeds voorzien van werklijsten bij ontvangst in de afdeling Globodera: 2015/ I-MET052-F001/LAB/FLVVM Overzicht op te spoelen stalen Globodera spp. FAVV 2015/ I-MET052-F002/LAB/FLVVM Overzicht aflezing stalen Globodera spp. FAVV (beide voor FAVV stalen) 2015/ I-MET052-F003/LAB/FLVVM Overzicht op te spoelen stalen Globodera spp. Request 2015/ I-MET052-F004/LAB/FLVVM Overzicht aflezing stalen Globodera spp. Request (beide voor niet FAVV stalen) 10.1 Opspoelen van de grondmonsters Voorbereiding van het opspoelen - Breng het grondmonster over in één of drie plastiek maatbekers (8.3): een monster van 500 ml wordt overgebracht in één plastiek maatbeker (8.3), een monster van 1500 ml wordt verdeeld over drie plastiek maatbekers (8.3). - Algemene regel : Vul de maatbeker (8.3) met ongeveer 500 ml grondmonster en dit door vullen tot boven de maatstreep van 400 ml en maximaal tot aan de maatstreep van 600 ml. Probeer zo goed mogelijk de streep van 500 ml te benaderen. Uitzondering voor stalen met stenen en/of grof plantenmateriaal (takjes, wortels) : vul de maatbeker (8.3) tot aan de maatstreep van 400 ml. - Leg een etiket met het monsternummer bij elk deelmonster in de maatbeker (8.3). In geval er drie deelmonsters zijn, wordt A, B en C bijgeschreven op de etiketten. 2015/I-MET052/LAB/FLVVM versie 01 6/12

7 - Indien het monster kleiachtig is, wordt het monster voorgeweekt gedurende ongeveer een half uur. Hiervoor wordt leidingwater in de plastiek beker (8.3) toegevoegd zodat het grondmonster onder het wateroppervlak komt. Daarna wordt alles voorzichtig omgeroerd met een spatel (8.5). Let hierbij op dat er geen grondmonster verloren gaat door grond die blijft kleven aan de spatel. - De monsters zijn nu klaar om opgespoeld te worden. Opmerking: Indien te weinig staal aanwezig is wordt dit op het etiket aangegeven Opspoelen in de Soil Sample Extractor Voor informatie over gebruik van de Soil Sample Extractor wordt verwezen naar het logboek van het toestel: LAB 24 I-LOG Neem het etiket met het monsternummer uit de maatbeker (8.3). - Noteer de datum van opspoelen op het etiket. - Breng de inhoud van de plastiek beker (8.3) zorgvuldig over in de zeef bovenaan het opspoeltoestel (9.1). Plaats een propere opvangzeef (maaswijdte 250 µm) (8.1) in de PVC grondplaat aan het uiteinde van het toestel - Start het opspoelen volgens de procedures beschreven in het logboek. Gebruik de opspoelcyclus die geschikt is voor de aard van het grondmonster. De richtwaarden zijn: Zanderige gronden: R-time: 80 sec R-pauze: 5 sec WET Kleigronden: R-time: max 240 sec (variabel) of meerdere cycli na elkaar tot het staal opgespoeld is R-pauze: 5 sec WET De R-time of rinsing time (=spoeltijd) mag gewijzigd worden, de R-pauze of rinsing pauze (= de pauze tussen twee pulsen) moet op 5 seconden ingesteld blijven. - Neem na het opspoelen de opvangzeef met het opgevangen organisch materiaal en de eventuele cysten van het toestel en laat de zeef met het materiaal drogen aan de lucht. Het drogen gebeurt bij kamertemperatuur en dit tot het materiaal voldoende droog is om het te kunnen analyseren onder de microscoop. Om wegwaaien van materiaal te vermijden, worden de zeven geplaatst in de droogstoven (die niet functioneren) in lokaal Leg het etiket met het monsternummer bij het materiaal in de zeef. Opmerking: Indien de temperatuur van het lokaal boven de 30 C oploopt, moeten opgespoelde grondstalen gedroogd worden in een andere ruimte dan in 5.03, nl. in een van de andere gekoelde ruimtes van het laboratorium. Zie ook Indien de stalen erg vochtig zijn (uitlopen van water) mogen ze maximum 1 week worden bewaard. 2015/I-MET052/LAB/FLVVM versie 01 7/12

8 10.2 Microscopische bepaling van het aantal cysten Voorbereiding van het microscopisch onderzoek - Zeef het gedroogde monster door een zeef van 800 micron (8.6) en vang op in een zeef van 250 micron (8.1). - Verwijder het restant op de zeef van 800 micron (8.6) en de doorval door de zeef van 250 micron (8.1). Zie ook Figuur µm te onderzoeken fractie 250 µm Te verwijderen: takken en groter organisch materiaal Te verwijderen: zand en fijn materiaal Figuur 2. Selectie van de te onderzoeken fractie via zeven - Breng het restant op de zeef van 250 micron (8.1) met behulp van een plat weegschaaltje (8.5) in de gleuven van een houten telplaat (8.4, Figuur 3). Zorg ervoor dat er niet te veel materiaal in de gleuven ligt. Indien nodig wordt de telplaat meer dan eens gevuld en bekeken. Figuur 3. Houten telplaat Microscopisch onderzoek - Bekijk het materiaal op de houten telplaat richel per richel onder de microscoop voorzien van een objectief 2x of 4x / oculair 10x of 20x. Gebruik de dissectienaald (8.5) als hulpmiddel. - Tel het aantal aangetroffen cysten. Een cyste heeft een ronde vorm met gladde bruine cuticula (=huid) (zie foto Figuur 4). Bij twijfel wordt een tweede analist geraadpleegd voor bevestiging. 2015/I-MET052/LAB/FLVVM versie 01 8/12

9 Figuur 4. Aaltje ongeveer 30 x vergroot Soortbepaling en levensvatbaarheid Bij positieve stalen wordt de levensvatbaarheid en/of de soortbepaling uitgevoerd door het ILVO (zie LAB 24 P 007 F 003 Overzicht versturen stammen, Globodera of monsters en melden van resultaten); dan wordt het plastiek recipiënt (8.7) met de gevonden cysten opgestuurd naar het Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO): ILVO t.a.v. Nicole Viaene (nicole.viaene@ilvo.vlaanderen.be) Afdeling Plant - Gewasbescherming Diagnosecentrum voor Planten Burgemeester Van Gansberghelaan 96 bus Merelbeke-Lemberge België Tel: 09/ Fax: 09/ (Tel direct: 09/ ) Het onderzoek van de levensvatbaarheid door ILVO duurt gemiddeld 4 weken; dat voor de soortbepaling duurt gemiddeld 1 week. Minimum 30 mooie cysten zijn nodig voor het onderzoek. Indien er minder dan 30 cysten aanwezig zijn: alle cysten doorsturen naar het ILVO. Na ontvangst van de resultaten worden deze ingegeven in het LIMS. 11 Kwaliteitscontrole 11.1 Referentiemateriaal Gecertificeerd referentiemateriaal (Globodera, Heterodera, Punctodera) is ter beschikking en wordt bewaard in het lokaal Eerste- en tweedelijnscontrole Voor eerste- en tweedelijnscontroles wordt verwezen naar de desbetreffende instructies. 2015/I-MET052/LAB/FLVVM versie 01 9/12

10 11.3 Derdelijnscontrole Jaarlijks wordt deelgenomen aan minstens één ringtest voor bepaling van aardappelcysteaaltjes in grond. Jaarlijks wordt op het einde van het jaar een planning voor de derdelijnscontroles opgemaakt cfr. microbiologische analyses. Gegevens ringtesten: 1. Nederlandse ringtest met natuurlijk gecontamineerde grondmonsters: Contactpersoon: Olaf Hartsema: Adres: Praktijkonderzoek Plant & Omgeving, Postbus 16, 6700 AA WAGENINGEN 2. Franse ringtest met kunstmatig gecontamineerde grondmonsters Contactpersoon: Laurent Ladeveze: Laboratoire de la santé des végétaux, 7 rue Jean Dixméras, Angers cedex 01, France 11.4 Controle temperatuur van het lokaal De maximumtemperatuur van het lokaal wordt dagelijks gecontroleerd als er grondmonsters worden geanalyseerd. Op dagen dat geen analyse gebeurt (bvb. periode juni september als er geen stalen zijn), wordt de temperatuurcontrole niet uitgevoerd. Deze temperatuurcontrole wordt opgevolgd in Evisense. geregistreerd op formulier 2015/ I-MET052-F005/LAB/FLVVM Controle maximumtemperatuur lokaal. Temperaturen hoger dan 25 C zijn niet gewenst, omdat de klant mogelijk levensvatbaarheid van de cysten wenst te laten controleren. Bij een te hoge temperatuur zal de airco automatisch ingeschakeld worden. - Wanneer de temperatuur van het lokaal zou oplopen tot boven de 25 C mogen de grondstalen niet meer bewaard worden in het lokaal. Indien het aanzetten van de airco er niet voor zorgt dat de T voldoende laag is, worden de stalen verhuisd naar de kelder. - In uitzonderlijke gevallen dat de temperatuur van het lokaal zou oplopen tot boven de 30 C moeten de grondmonster gedroogd worden op een koelere plaats tot de temperatuur weer genormaliseerd is Controle contaminatie van het gebruikte materiaal Om ons er van te vergewissen dat er geen cysten achterblijven op het materiaal dat gebruikt wordt om de cysten over te brengen van de zeven van 250 µm waarin de opgespoelde stalen werden opgevangen, naar het telplaatje (dus op de zeven van 800 µm en 250 µm en op het telplaatje en aan de borstel), wordt elke ochtend voor de eerste analyse volgende test uitgevoerd: de analist wrijft met de borstel over de lege zeven van 800 µm en 250 µm, borstelt dan hetgeen op de zeef van 250 µm ligt op het telplaatje (dit zal niets of nagenoeg niets zijn, want er is geen staal), en bekijkt het telplaatje onder de microscoop. 2015/I-MET052/LAB/FLVVM versie 01 10/12

11 De controle wordt geregistreerd in LAB 24 P 005 I 005 F 002 Eerstelijnscontrole en controle werkmateriaal Globodera. 12 Berekening en rapportering 12.1 Berekening Het eindresultaat is de som van het aantal cysten aangetroffen in de drie deelmonsters, indien een staal van 1500 ml werd geanalyseerd, of het aantal cysten aangetroffen in het enige deelmonster indien een staal van 500 ml werd geanalyseerd. Indien geen cysten werden aangetoond in het monster, is het eindresultaat 0 cysten/500ml voor een staal van 500 ml en 0 cysten/1500ml voor een staal van 1500 ml. Indien meer dan 100 cysten werden aangetoond in het monster, wordt gerapporteerd > 100 cysten/500ml of >100 cysten/1500ml. Indien meer dan 0 en minder dan 101 cysten werden aangetoond, is het eindresultaat dit aantal cysten/volume grond. Indien te weinig staal aanwezig is (aangeduid op het etiket door de opspoeler), wordt dit aangegeven als commentaar in het LIMS Registratie analysegegevens Resultaten bijhouden op werklijsten Het aantal aangetroffen cysten wordt genoteerd op de werklijsten. Indien geen cysten aanwezig waren in het staal, wordt het resultaat aangeduid met. Indien Globodera worden aangetroffen in het grondstaal, wordt dit resultaat gemeld aan de sectieverantwoordelijke voor melding van het resultaat volgens de procedure LAB 00 P 504 (Meedelen van analyseresultaten van interne labs aan het FAVV) Validatie en controle facturatie door de sectieverantwoordelijke De sectieverantwoordelijke controleert de resultaten en valideert ze (Validatie 2) in LIMS Beproevingsverslag Zie instructie dispatching LAB 24 P 023 I 002 Richtlijnen inschrijven klantenstalen Doorlooptijden Met de verschillende instanties zijn afspraken gemaakt rond doorlooptijden, te rekenen vanaf datum ontvangst in het laboratorium tot datum van het verslag. Tabel 2. Afspraken rond doorlooptijden van de Globodera analyse Tijdens seizoen (oktober - mei) Buiten seizoen (juni - september) 2015/I-MET052/LAB/FLVVM versie 01 11/12

12 Dringend FAVV Niet dringend Dringend FAVV Niet dringend 5 werkdagen 3 weken 5 weken 5 werkdagen 10 werkdagen 3 weken 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten 13.1 Procedures / instructies LAB 00 P 504 Meedelen van analyseresultaten van interne labs aan het FAVV LAB 24 P 023 I 002 Richtlijnen inschrijven klantenstalen LAB 24 P 005 I 005 Eerstelijnscontrole biologische analyses LAB 24 P 005 I 006 Tweedelijnscontrole biologische analyses: besmette monsters 13.2 Formulieren 2015/ I-MET052-F001/LAB/FLVVM Overzicht op te spoelen stalen Globodera spp. - FAVV 2015/ I-MET052-F002/LAB/FLVVM Overzicht aflezing stalen Globodera spp. - FAVV 2015/ I-MET052-F003/LAB/FLVVM Overzicht op te spoelen stalen Globodera spp. - Request 2015/ I-MET052-F004/LAB/FLVVM Overzicht aflezing stalen Globodera spp. Request 2015/ I-MET052-F005/LAB/FLVVM Controle maximumtemperatuur lokaal LAB 24 P 005 I 005 F 002 Eerstelijnscontrole en controle werkmateriaal Globodera. LAB 24 P 007 F 003 Overzicht versturen stammen, Globodera of monsters en melden van resultaten 13.3 Logboeken LAB 24 I-LOG 085 Zeef- en extractiemachine voor bodemstalen 2015/I-MET052/LAB/FLVVM versie 01 12/12