Beste Student,

Transcriptie

1

2 Beste Student, De documenten op VETserieus.nl zijn alleen bedoeld als ondersteuning bij het studeren. De samenvattingen worden nagekeken door studenten tijdens het volgen van de lessen en waar nodig aangepast. Dit project heeft als doel foutloze samenvattingen te bieden die met hun tijd meegaan, ondanks dit streven is er altijd een kans dat er fouten in de documenten staan. Mocht je tijdens het lezen van de samenvatting fouten vinden kun je dat doorgeven via de contactpagina op de site of direct een mail sturen naar De student is verantwoordelijk voor zijn of haar leermethode en voor het uiteindelijke resultaat. Allemaal veel succes met de voorbereidingen!! Hartelijke groet, VETserieus.nl

3 Samenvatting CW HC 1 Het onderscheid tussen levende en niet levende dingen is dat levende dingen allemaal uit cellen bestaan samen met de belangrijke eigenschap de mogelijkheid zichzelf te reproduceren. In die zin kunnen we dus virussen eigenlijk ook als niet levend beschouwen omdat ze niet de mogelijkheid hebben zichzelf te reproduceren en daar een gastheer voor nodig hebben. Cellen lijken niet allemaal op elkaar, er zijn ten minste 10 miljoen verschillende cellen bekend, die elk van elkaar in grootte, vorm en functie verschillen. Voorbeeld: de melkzuurbacterie (lactobacillus) is een paar micrometer in lengte terwijl een kikkerei 1 millimeter groot is. Voorbeeld: een neuroncel is uitgestrekt en langwerpig over een grote afstand terwijl de paracemium juist de vorm van een onderzeeër met heel veel haartjes heeft. De bacterie Bdellovibrio is juist worstvormig en de flaggelum een schroefvorm. Cellen verschillen ook enorm in chemische behoeften en activiteiten. Sommigen hebben zuurstof nodig, voor anderen is dit juist dodelijk. Ook de behoefte aan grondstoffen nodig voor overleving verschillen, zo kunnen sommigen van slechts water, CO2 en zonlicht leven terwijl anderen complexe moleculen als voeding gebruiken. Cellen zijn ook levend, naast de mogelijkheid tot reproductie, door de mogelijkheid tot groei, energie van de ene vorm in de andere omzetten en kunnen reageren op de omgeving. Ondanks dat cellen een enorme verscheidenheid tonen hebben ze op hetzelfde moment een grote overeenkomst. Alle levende dingen, dus bestaande uit cellen, bevatten DNA. Deze DNA strengen bestaan bij alle cellen uit de 4 zelfde nucleotiden. Alle DNA wordt omgezet in RNA welke dan weer codeert voor eiwitten. Verder bestaan alle eiwitten uit een verzameling van 20 aminozuren. Omdat cellen delen is het dus mogelijk om twee cellen uit 1 te kweken. Uiteindelijk zijn alle cellen op de wereld afkomstig van 1 en dezelfde cel die door mutaties verder gedifferentieerd zijn. Of deze mutaties blijven bestaan en op hun beurt weer worden doorgegeven hangt natuurlijk af van de evolutie, vergoot het de overlevingskansen of verkleind het de overlevingskansen? (of neutraal natuurlijk). De gehele verzameling van DNA in een cel wordt het genoom genoemd. Deze codeert voor de aanmaak van eiwitten en bepaald daardoor de functie van de cel. Binnen meercellige organismen bevat elke cel precies hetzelfde genoom, maar toch hebben de cel andere functies, uiterlijk en vorm. Dit kan zo zijn omdat verschillende cellen verschillende genen tot uiting brengen. Ze zijn dus selectief welke genen ze voor instructie gebruiken. De cues die cellen dan weer gebruiken om te weten welke genen dit zijn komen uit de omgeving en van voorvaderen. De mogelijkheid tot verschillende genen tot expressie brengen geeft aanpassingsmogelijkheden die eencellige organismen niet hebben (specialisatie). In de 17 e eeuw is de eerste microscoop ontwikkeld. Deze bood mogelijkheid om cellen zichtbaar te maken en te kunnen bestuderen. Na de start van deze ontwikkeling zijn vele nieuwe technieken gemaakt om cellen en celonderdelen te bestuderen. In 1930 kwam bijvoorbeeld de elektronenmicroscoop naast de lichtmicroscoop. Vanaf het moment dat het mogelijk was om de cellen te bestuderen hebben ze ook namen gekregen. Het woord Cell komt van Hook, die hier de naam aan gegeven heeft (ook al bedoelde hij eigenlijk de celwanden van plantcellen die overbleven waarna de cellen waren overleden). Voor 1838 was het gebruik van de microscoop toch alleen voor zeer rijke mensen weggelegd. De celbiologie van heden te dage is eigenlijk pas ontstaan sinds Schleiden en Schwann twee artikelen schreven waarin cellen als de essentiele bouwstenen van het hele leven worden aangeduidt. Hun werk bracht de

4 realisatie te weeg dat alle cellen uiteindelijk voortkomen uit deling voorgaande cellen cel theorie. Acceptatie van dit gegeven leidt tot een heel andere benadering van cel biologie: bestudering van het heden kan niet losstaan van bestudering van het verleden. Dit is precies wat Darwins evolutietheorie (1859) doet. Een stukje weefsel bestaat uit een verzameling van duizenden cellen die of dicht op elkaar gepakt zijn of zich bevinden in een extra cellulaire matrix wat bestaat uit eiwitvezels in een polysaccharidegel. Stuk duim Stukje huid van duim Stukje cellen van de huid Een cel Een organel (mitochondrion) Een stukje binnen een organel Een ribosoom van een organel Een stukje ribosoom Een atoom van ribosoom 20 millimeter 2 millimeter 0,2millimeter 5-20 micrometer 2 micrometer 0,2 micrometer 20 nanometer 2 nanometer 0,2 nanometer Het is lastig om de interne structuren van een cel te zien, ten eerste omdat deze klein zijn en ten tweede omdat ze transparant van kleur zijn. Een manier om dit op te lossen is door een kleuring te gebruiken, een andere manier is gebruik te maken van de verschillen in brekingsindex. (De brekingsindex is een verhoudingsgetal tussen de snelheden van licht in verschillende media. De brekingsindex kan worden gebruikt om de hoek van breking te berekenen. Omdat de brekingsindex een verhoudingsgetal is heeft het geen eenheid. De brekingsindex in vacuüm is precies 1, in alle andere stoffen is de lichtsnelheid lager dan die in vacuüm en is de brekingsindex dus altijd groter dan 1.). resolutie (oplossend vermogen) wil zeggen die afstand tussen twee punten waarbij ze nog als onafhankelijke punten onderscheiden kunnen worden. De technieken die gebruikt worden om naar cellen te kijken zijn als volgt: 1. licht microscoop: deze kan cellen tot ongeveer 1000x vergoten, en heeft dus een resolutie van 0,2 micrometer (200 nm)(natuurlijke limiet door eigenschappen van lichtgolven). Er zijn 3 benodigheden om cellen te kunnen zien door een lichtmicroscoop. Allereerst moet een fel licht op een preparaat gericht zijn, ten tweede moet het preparaat doorlaatbaar voor licht zijn en ten derde moet er een geschikte set van lenzen zijn. De meeste weefsels zijn niet klein genoeg en niet transparant genoeg om direct onder een microscoop te zien, vandaar dat ze gesneden (ingebed in weefsel, soort gelatine pudding, is noodzakelijk om plakjes te kunnen snijden) en gefixeerd worden (binding van twee moleculen door beiden covalent binden aan een andere stof) en op een glazen op plastic plaatje worden geplaatst. Vaak worden ze ook nog gekleurd. H&E kleuring is hier een voorbeeld van. De positief geladen hematoxyline kleurt basofiele structuren paars/blauw, en bindt dus aan negatief geladen structuren zoals DNa, RNA en Glycoproteinen met veel siaalzuur. De eosine is negatief geladen en kleurt acidofiele structuren roze/rood en bindt aan positief geladen structuren zoals eiwitten in secretiegranula.

5 a. geavanceerde lichtmicroscopie: Levende cellen kunnen bekeken worden door gebruik te maken van verschillende technieken maar bijvoorbeeld niet door kleuring (dan gaan ze dood). Hier wordt bij de techniek gebruik gemaakt van de verschillende brekingsindexen en de manier waarop licht hierdoor er door heen gaat. Fase contrast maakt gebruik van afgekaatst en niet afgekaatst licht, differentiele interferentie maakt gebruik van twee lichtbundel welke dan met elkaar vergeleken worden. b. fluorescerende microscopie: fluorescerende kleuringen kunnen ook gebruikt worden om bepaalde structuren aan te tonen. Fluorescerende kleuringen absorberen het licht op 1 golflengte en stralen het weer op een langere golflengte uit. De golflengte die wordt afgegeven door een stof is altijd lager dan bij binnenkomst. De energie is dus lager. Sommige van deze kleuringen kunnen specifiek aan 1 soort molecuul binden, zoals een DNA kleuring of kleuring door binding met antilichamen. Het is gelijkend aan de normale lichtmicroscoop behalve dat het licht door een tweetal filters gehaald wordt. De eerste filter laat alleen die kleur door die de fluorescerende kleurstof aantoont, het tweede filter blokkeert dit licht en laat alleen het teruggekaatste licht van het preparaat door. Het kan gebruikt worden voor lokalisatie van structuren, fluorkleuren kunnen direct of indirect aan het molecuul gekoppeld, er kunnen meerdere kleuren tegelijk gebruikt en kan ook op levende cellen. In levende cellen maak je dan gebruik van een van nature fluorescerend eiwit GFP. Hierbij kan door modificatie GFP aan het eiwit van interesse gebonden en dan gaat dit eiwit fluoresceren. c. confocale microscopie: deze heeft een laser als bron van licht welke op een specifieke locatie wordt gezet. Het fluorescerende molecuul wordt alleen in beeld gebracht als deze zich precies op de locatie van de laser bevindt. De laser kan langs het preparaat scannen om zo een mooi 2d beeld van het preparaat te maken. Wanneer men op verschillende diepten kijkt is zelfs een 3d overzicht te maken. Dit is met

6 name handig als de structuren boven en onder elkaar bevinden, welke in een 2d optie dan een groene vlek opleveren terwijl dit een mooie vorm geeft met confocale microscopie. (zie plaatje p. 9) 2. elektronen microscopie: zwart/wit, grijstinten. a. transmissie elektronen microscopie: wanneer men gebruik maakt van een elektronen microscoop vindt dit altijd in vaccuum plaats. Het is niet mogelijk met deze vorm van microscopie naar levende cellen te kijken. Het maakt in plaats van een lichtstraal gebruikt van een elektronenstraal. Deze heeft een veel kortere golflengte en biedt daardoor de mogelijkheid voor een hogere resolutie (2 nanometer). Tevens maakt het in plaats van glazen lenzen gebruik van magnetische spoeltjes. het preparaat moet ontzettend dun zijn (veel dunner dan bij licht) en het contrast/kleuring wordt bereikt door toevoeging van elektron dichte zware metalen (elektrontegenhoudend). (2 nm). De elektronen gaan door het preparaat heen. b. scanning elektronen microscopie: hierbij wordt het preparaat met een laagje zwaar metaal omhuld. Het preparaat wordt gescand met een straal van elektronen waarbij met een detector de hoeveelheid teruggekaatste en vastgehouden elektronen scant. Uiteindelijk wordt door een computer een 3d beeld gevormd van de oppervlakte van de structuur. De elektronen gaan dus niet door het weefsel heen. (3-20 nm) prokaryotische cellen: deze cellen bevatten geen nucleus. Een voorbeeld hiervan zijn bacteriën maar ook andere cellen behoren tot deze klasse zoals archaea. Bacteriën hebben gewoonlijk een sferische, staaf of spiraal vorm, en zijn slechts enkele micrometers lang (1). Ze hebben gewoonlijk een celwand welke het plasmamembraan omsluit, maar de celwand is geen lipide bilaag. Het membraan natuurlijk wel. Hierbinnen vinden we het cytoplasma en het circulaire DNA. Ze kunnen ontzettend snel reproduceren, 20 minuten. Omdat ze met grote aantallen zijn, snel groeien en reproduceren op een seksachtige manier (delen van genetisch materiaal) hebben ze een snelle evolutie. De meeste prokaryoten leven als single cell organismen. Ondanks hun uiterlijk zijn ze in chemisch opzicht de meest diverse en inventieve klasse van cellen. Ze kunnen in tal van habitats leven, met en zonder zuurstof, zeer warm of koud, allerlei bronnen als brandstof, fotosynthese etc. Naast bacteriën is er nog een andere klasse binnen de prokaryoten: arachnaea. Deze twee klassen verschillen onderling net zoveel van elkaar als ze elk van de eukaryoten verschillen. De meeste prokaryoten die wij in het dagelijks leven tegen komen zijn de bacteriën, de arachnaea kom je tegen in ander soortige leefomgevingen, waar andere cellen niet kunnen leven (vulkaan, oceaanbodem en koeienmaag). Eukaryotische cellen: deze cellen hebben een nucleus, en zijn over het algemeen groter dan de prokaryoten (5 micrometer). Sommige leven onafhankelijk zoals gist en schimmel cellen maar het meerendeel komen we tegen in meercellige organismen. Het bezit van een nucleus voor cellen gaat automatisch gepaard met het bezit van andere organellen. 1. nucleus: de nucleus is het meest prominent in een cel en wordt omringd door twee membranen, welke de nucleaire envelop vormen, deze is continu met het ER. Hierbinnen vinden we langwerpige moleculen van DNA welke in de lichtmicroscoop als chromosomen zichtbaar zijn tijdens de voorbereiding op celdeling. (kijk goed in HC2 naar de vorming van dubbele membraan en ER). De aanwezigheid van een kern is handig om een rol te spelen bij de differentiatie van de cellen. Hierdoor kan namelijk specifiek bepaald RNA het cytosol in en de rest niet. We rekenen de cel als organel ondanks dat deze door de kern poriën niet geheel omsloten is door een membraan, wat andere organellen wel zijn. a. Nucleolus: dit is het deel van de nucleus dat ribosomaal RNA maakt en ribosomen assembleerd. 2. mitochondria: dit is een zeer belangrijk onderdeel en gezien als het energiecentrum van de cel. Ook deze bevat 2 membranen, waarbij het binnenmembraan in christae wordt opgevouwen. Ze

7 bevatten hun eigen DNA en reproduceren door deling. Het wordt gedacht dat ze afkomstig zijn van bacteriën, welke in symbiotische relatie leefde met een eukaryotische cel. Nu echter bevat het mitochondrion nog maar een klein deel van zijn eigen DNA en heeft dus absoluut de cel nodig voor overleving. Omdat het mitochondrion zuurstof gebruikt en CO2 uitstoot wordt het ook wel het ademhalingscentrum op cellulair niveau genoemd. Zonder mitochondria zou zuurstof giftig worden. (fig. 1-19, p. 18). 3. chloroplasten: locatie van fotosynthese in plantcellen. Verder niet op in diergeneeskunde. 4. endoplasmatisch reticulum: een doolhof van tussen verbonden ruimte met een gevouwen membraan. Hier worden de meeste celcompartementen gemaakt. a. Ruw ER: zit eruit als langwerpige verzameling pannenkoeken (cisterne). Zorgt voor synthese van membraan en secretie eiwitten. Bevat ribosomen aan de membraanzijde. b. Glad ER: ziet eruit als een verzameling buisjes. synthese van vetzuren en polypeptiden, CA2+ opslag en detoxificatie. Bevat geen ribosomen aan de membraanzijde. 5. golgi apparaat: is het tussenstation tussen stoffen in het ER gemaakt en andere celorganellen. Het sorteert en modificeert de producten van het ER. Het ziet eruit als een verzameling zakken op elkaar gestapeld. Het bestaat uit 3 regio s, waaronder een ingang (cis), een middenstuk (mediaal) en een uitgang (trans). Elke regio heeft een aparte set van modificerende eiwitten. Het is gelokaliseerd vlak bij de celnucleus en bij de centrosome. 6. lysosomen: dit zijn smalle onregelmatig gevormde organellen waar binnen digestie van de cel voorkomt. Ze laten voedingsstoffen vrij door afbraak van macromoleculen en breken ongewilde moleculen af voor hergebruik of uitscheiding. Ze zijn omgeven door een enkel membraan, een lumen met een ph van 5. Dit is handig voor versnelde afbraak. De degradatiereacties worden uitegevoerd door acid hydrolases. 7. peroxisomen: zijn smalle, membraan omringde vesicles waarbinnen een reactie kan plaatsvinden om waterstofperoxide afgebroken kan worden. Tevens belangrijk voor de degradatie van vetzuren en andere toxische stoffen met behulp van dezelfde waterstofperoxide. Hebben een enkel membraan en sommige enzymen zien eruit als kleine kristallen. 8. vesicles: zijn kleine membraanomringde blaasjes welke gebruikt kunnen worden voor exocytose (naar buiten) en endocytose (naar binnen). Transport tussen de organellen gebeurt ook met vesicles en deze communicerende organellen maken samen deel uit van het vacuolaire systeem. De mitochondrien en de perixosomen maken door niet te communiceren hier geen deel van uit. 9. cytosol: wanneer alles uit de cel verwijderd wordt inclusief de organellen zouden we achterblijven met het cytosol. Deze bevat een hoop kleine en grote moleculen, zo dicht op elkaar geplakt dat het eerder lijkt op een gel dan een vloeibare oplossing. Het is een plaats voor veel chemische reacties in de cel waaronder de eerste afbraak van voedsel moleculen. In het cytosol vindt eveneens een van de sleutel synthetische processen plaats, het maken van eiwitten door ribosomen (kleine partikelen in het cytosol). 10. cytoskelet: in eukaryotische cellen wordt het cytosol doorkruist door het cytoskelet gemaakt van eiwitfilamenten. a. actin filamenten: De kleinste filamenten aanwezig in alle eukaryotische cellen maar het meeste in spiercellen waar ze voor samentrekkende krachten zorgen. b. Microtubules: dit zijn de grootste filamenten en helpen om de chromosomen bij celdeling uit elkaar te trekken en eerlijk onder dochtercellen te verdelen. c. Intermediaire filamenten: zijn middelmatig van grootte en helpen de cel mechanisch te versterken. De filamenten samen met de eraan gebonden eiwitten zorgen voor een systeem dat mechanische sterkte, vorm en de krachten en begeleiding in beweging voorziet.

8 Het cytoskelet is continu in beweging, waarbij filamenten worden samengbonden en weer losgemaakt binnen een bestek van minuten. Langs deze wegen en kabels van filamenten bewegen ook de organellen en vesicelen. De hele interne cel is dus in beweging en binnen een paar seconden heeft een organel elke hoek van de cel gezien. Zoals we hebben gezien bestaat de eukaryotische cel uit een groot aantal compartimenten die de bacteriecel niet heeft. Toch stammen ze beiden natuurlijk van een cel af. Hoe de eukaryotische cel ontstaan is is vooralsnog onduidelijk, maar een theorie stelt dat de eukaryotische cel een predator was van bacteriecellen. Dit zou dan een cel moeten zijn geweest met een doorlaatbaarmembraan (eten) een cytoskelet (beweging) en een grote afmeting om zijn voedsel in te passen. Het idee dat er cellen zijn die andere cellen kunnen opeten is voor een deel ontstaan uit de kennis van proteozoanen welke zichzelf met andere cellen voeden. Voorbeeld: didinium is een cel die 10x zo groot is als de gemiddelde cel en zich voedt aan voornamelijk andere proteozoanen. Antilichamen kunnen ook gebruikt worden om stoffen aan te tonen. Een organisme is in staat om voor elke denkbare stof een antilichaam te vormen. Ze worden geproduceerd door B-cellen, een speciale witte bloedcel. Een antigeen wordt door een antilichaam herkend. Wanneer een b cell aan een antigen bindt wordt een groot aantal van de antilichamen tegen die stof geproduceerd. Wanneer je bijvoorbeeld een dier injecteert met een lichaamsvreemde stof gaat deze antilichamen tegen die stof produceren. Deze antilichamen kunnen vervolgens uit het bloed gescheiden worden. 1. antilichamen om moleculen te zuiveren: een mix van moleculen wordt samengevoegd met een bepaald soort antilichaam. Deze antilichamen binden aan speciale moleculen waardoor die moleculen andere eigenschappen krijgt. Kolomchromatografie kan gebruikt worden om de antilichamen met moleculen van de rest te zuiveren. Een wash verwijdert vervolgens weer de antilichamen. 2. monoklonale antilichamen: grote hoeveelheden van hetzelfde antilichaam kunnen gemaakt worden door een b cel die deze produceert te binden aan een tumorcel. Het resultaat is een cel die ontelbaar keer deelt en tegelijk het antilichaam produceert. 3. antilichamen als moleculaire labeling: antilichamen worden aan een fluerescerende kleurstof gebonden en deze binden dan vervolgens aan delen in het weefsel. Deze kunnen microscopisch gedetecteerd worden of met behulp van de biochemische eigenschappen door middel van elektroforese. het bepaald meer de locatie van een stof dan de exacte structuur. H2 Een cel wordt omringd door een plasma membraan. De eigenschappen van het membraan corresponderen met de eigenschappen van de cel, dus het moet een barriere vormen tegelijk met de mogelijkheden tot reproductie, groeien, in en uitscheiden van stoffen. Hierdoor is het membraan ook zo gemaakt dat het niet kan scheuren. Wanneer een cel van vorm of grootte veranderd doet het membraan dit ook. De verdere eigenschappen van het membraan zijn: - reguleert transport nutrienten - reguleert transport afvalstoffen - creert correct chemisch milieu - vormt een plek voor chemische reacties die niet in waterige omgeving kunnen - detecteert signalen uit extracellulaire - gaat interacties aan met andere cellen of ECM - vormen een raamwerk voor eiwitcomplexen - gaan vermengen van componenten tegen - zijn betrokken en controleren selectieve uitwisseling van compartimenten.

9 Bacteriën hebben slechts 1 membraan, eukaryotische cellen echter hebben ook nog binnenmembramen, die de organellen omsluiten, welke dezelfde eigenschappen als het plasma membraan bevatten. Wel verschillen ze in andere opzichten per organel omdat deze verschillende karakters hebben. Ongeacht hun locatie bestaan alle membranen uit eiwitten en lipiden. De lipiden vormen een lipide bilaag en geeft het membraan de basis structuur en permeabiliteit. De eiwitten zorgen voor de rest van de functies en zorgt voor de verschillen tussen verschillende membranen. Membranen zijn licht microscopisch niet te zien, tenzij deze schuin worden aangesneden en het membraan oppervlak glycoproteinen bevat die gekleurd kunnen worden. De meeste celmembranen worden verterkt door een netwerk van eiwitten die aan het membraan gebonden worden door aan de transmembrane eiwitten te binden. De vorm en mechanische eigenschappen worden door dit netwerk bepaald en heet de cel cortex wat zich aan de cytosollische kant van het membraan bevindt. De cel cortex van rode bloedcellen is het beste begrepen en vrij simpel. Het voornaamste component van deze cortex is spectrine, een eiwit in de vorm van een staaf van 100 nanometer lengte. Intracellulaire bindingseiwitten houden het spectrine op de plaats. Wanneer dit eiwit niet goed werkt krijg je ook abnormaliteiten in structuur van de cellen (anemie) en celdood. Andere cellen gebruiken naast mechanische versterking de celcortex ook om van vorm te veranderen en te bewegen. Naast de lipiden worden ook de eiwitten beschermt door covalent gebonden suikers. De meeste van deze suikers zijn korte oligosacchariden (2 suikers) en gebonden aan een eiwit heten het glycoproteinen (of glycolipiden). Anderen hebben lange suikerketens (polysacchariden) en heten proteoglycanen. Alle suikeronderdelen van de glycoproteinen/lipiden en proteoglycanen bevinden zich aan 1 kant van het membraan aan de niet-cytosollische kant, de suikerlaag. De suikerlaag beschermt de cel van mechanische en chemische schade. Door de absorbatie van water door de suikers krijgt het een beetje een slijmerig oppervlakte. Het helpt hierdoor dat cellen aan elkaar plakken of bijvoorbeeld aan de wanden van bloedvaten. Tevens helpt deze suikerlaag bij de celcelherkenning en adhesie. Net zoals de meeste eiwitten met elkaar binden op bepaalde plaatsen hebben sommige eiwitten (lectinen) de mogelijkheid bepaalde oligosacchariden te herkennen en te binden. Aangezien suikers enorm divers zijn in de manier van binding (niet de standaard peptidebinding zoals bij eiwitten) en de verschillende bestanddelen is er een enorme variatie is glycoproteinen en glycolipiden. Het kan dus gebruikt worden als een herkenbare en individuele bekleding van de cel dat door andere cellen herkend kan worden. Naast deze functie heeft de laag nog een andere functie in ontstekingsreacties. In het begin van een bacteriele infectie dragen de witte bloedcellen bepaalde suikers op hun cel (neutrofielen). Deze worden herkend door lectinen wat er voor zorgt dat ze aan deze eiwitten binden en op die manier de bloedbaan verlaten en de plaats van onsteking opzoeken (fig 11-33, p. 382). Ondanks dat membranen vaak voorgesteld worden als een vloeibare 2d laag waarin de eiwitten en lipiden vrijelijk kunnen bewegen is dit te simpel. Sommige eiwitten zijn namelijk op bepaalde plaatsen nodig en de cel heeft manieren ontwikkeld om deze op de plaats te houden. De gebieden waarin bepaalde eiwitten met een fucntie worden vastgehouden heten de membraan domeinen die zich dus op het mebraan oppervlakte van de cel of organel bevinden. Hoe deze vastzitten kan op een aantal manieren: 1. gebonden aan een vaste structuur buiten de cel (bv. extracellulaire matrix). 2. gebonden aan relatief onbeweeglijke structuren in de cel (cel cortex) 3. gelokaliseerd doordat cellen zelf barrières maken om de beweging van de eiwitten te voorkomen

10 (bijvoorbeeld dicht op elkaar geplakte cellen). Een mooi voorbeeld hiervan zijn de epitheelcellen in de darmwand. Deze hebben aan de apicale zijde (de kant van het lumen) andere eiwitten nodig dan aan de laterale/ basale zijde. Aan de apicale zijde voor voedingsopname en aan de laterale voor transprot uit de cel naar het bloed. De cellen zitten zo dicht op elkaar geplakt dat er een tight junction wordt gevormd. Speciale eiwitten houden deze junctions goed dicht waardoor de doorgang dicht wordt gehouden (zie fig 11-39, p. 386). The dynamische natuur van membranen is zo centraal voor hun functie dat het nu een werkmodel naam heeft: vloeibaar mozaïek model. Hoe je deze vloeibaarheid meet is op verschillende manieren. De eerste is visueel waarbij je bepaalde moleculen labelt en kijkt hoe snel deze zich van plaats veranderen. Een manier hiervoor is bijvoorbeeld gelabelde antilichamen. Hiermee kun je echter niet de exacte specificiteit van beweging onderzoeken (sommigen bewegen niet zoals hierboven beschreven). FRAP aanval (Fluorescerende recovery after photobleaching) is een manier waarmeeje wel gedetailleerd kunt kijken. Hierbij label je alle eiwitten in een membraan met fluorescerende kleurstof. Daarna bleek je selectief 1 klein stukje membraan. Dan kun je kijken naar hoe snel dit gebleekte stukje door migratie van fluorescerende eiwitten weer gekleurd wordt. Met deze techniek bekijk je een gebied en daarmee honderden eiwitten tegelijk, je kunt niet zien wat een enkel molecuul doet. Als bijvoorbeeld een molecuul niet binnen het gebleekte deel migreert kun je niet weten of dit komt omdat deze binnen een bepaald gebied moet blijven of dat deze echt aan het membraan op een plek vast zit. Om om dit probleem heen te komen hebben onderzoekers methoden voor labeling en volgen van individuele moleculen ontwikkeld. Single partikel tracking (SPT) microscopie is een methode om dit te doen, waarbij met goud gekleurde antilichamen op bepaalde moleculen binden. Onder een videomicroscoop kan deze beweging vervolgens gevolgd worden. Om zonder de restricties van het eigen membraan de beweging van eiwitten te volgen is het mogelijk deze van het membraan te scheiden en in kunstmatige vesikelen te plaatsen. Het zal duidelijk zijn dat de eiwitten in deze omgeving door de verminderde drukte sneller en vrijelijker bewegen, tevens worden veel eiwitten op andere manieren gebonden (cytoskelet, ECM) die in deze vesikelen niet aanwezig zijn. De voornaamste bron van energie voor een cel is ATP welke gegenereerd wordt tijdens de glycolyse in het cytosol en de elektronentransport op het binnenmebraan van het mitochondrion. Elektronen transport wordt ook in de bacterieen gedaan en het is dus ook niet verwonderlijk dat eukaryotische cellen ook deze mogelijkheid bezitten (eerst symbiotische relatie van zo n aerobe bacterie welke later het mitochondrium vormt. In eukaryotische cellen is dus ook het mitochondrium de locatie van elektronen transport. Zonder mitochondria zouden cellen ook afhankelijk zijn van de minder efficiente glycolyse voor ATP productie. Defecten in de mitochondrien hebben dus zeer ernstige gevolgen. Denk hierbij bijvoorbeeld aan de ziekte myoclonische epilepsie en ragged red fiber disease, waarbij een van de transfer RNA genen gemuteerd is. Dit leidt tot een verminderde synthese van mitochondriale eiwitten benodigd voor elektrontransport en ATP synthese. Het gevolg is spierzwakte en hartproblemen. Spier en zenuwweefsel hebben de meeste problemen door de grote behoefte aan ATP. Bacteriën hebben geen mitochondria en het plasma membraan voert dan dezelfde functie uit als het binnenmembraan van een mitochondrium.

11 Mitochondria zijn over het algemeen gelijkend op bacteriën in vorm en grootte. Ze bevatten hun eigen DNA, RNA en een compleet transcriptie en translatiesysteem inclusief ribosomen (eiwitsynthese). Ze zijn ontzettend mobiel en continu van vorm en positie aan het veranderen. In 1 levercel zitten maar liefst mitochondrien en kunnen hierdoor een lange rij vormen langs de microtubulen van het cytoskelet. In andere cellen zijn ze gebonden op een plaats waar veel directe ATP nodig is. Elke mitochondrium wordt gebonden door twee hoog gespecialiseerde membranen, welke een belangrijke rol spelen in de activiteiten van het organel. Het cytsol is het kale gedeelte van de cel, het cytoplasma is dus cytosol + organellen. Cytosol bevat wel het cytoskelet, de polyribosomen en de metabole enzymen. Het buitenmembraan bevat ontzettend veel van het eiwit porine, welke waterige kanalen vormt in de lipide bilaag. Hierdoor is dit membraan permeabel voor moleculen van 5000 dalton of minder. De intermembraan ruimte is hierdoor qua samenstelling gelijk aan het cytosol met betrekking tot kleine moleculen. Het binnenmembraan daarentegen is ondoorlaatbaar voor ionen en de meeste kleine moleculen, tenzij er transporteiwitten voor zijn. De matrix van het mitochondrium bevat daarom alleen moleculen die specifiek erdoor heen zijn gekomen. De meeste eiwitten die zich in het binnenmembraan bevinden zijn componenten voor de elektronen transport en ATP synthese. Het heeft een groot oppervlak door de invouwingen die christae genoemd worden. Hierdoor is er een groot oppervlak voor ATP productie (ongeveer 1/3 van alle membranen binnen een levercel). De christae varieren eveneens in grootte afhankelijk van de energie behoefte voor een cel (3x zoveel voor hart als lever). HC 3 en 4 Om eiwitten goed te onderzoeken zijn er methoden om ze van de rest van de cel te zuiveren. De eerste stap hierin is natuurlijk de cel kapot te maken en de onderdelen eruit te krijgen. Dit kan met mechanische technieken, homogenisatie, waarvan er 4 bekende zijn. Kapot maken door: hoge frequentiegeluiden; een detergent om gaten in het plasmamembraan te maken; cellen door een te kleine ruimte forceren en een nauw gesloten rotator in een buis met cellen er tussen. Het resulterende homogenaat bevat de moleculen van het cytosol en de organellen, waarbij als het goed is het grootste deel intact is. Dit homogenaat moet vervolgens verder gezuiverd worden om de eiwitten te kunnen onderzoeken. Het meest gebruikt hiervoor is centrifuge waarbij het homogenaat op hoge snelheid wordt rondgedraaid. De grotere en meer dichte moleculen zullen in de bodem van het homogenaat terecht kunnen en de rest daarboven. Differentiële centrifuge is een methode waarbij herhaaldelijk op steeds hogere snelheid gecentrifugeerd wordt waarbij het homogenaat in onderdelen wordt gesplitst. Ook hier vindt scheiding plaats op basis van grootte en dichtheid. Velocity (snelheid) centrifuge is eiegenlijk een soort combinatie met kolomchromatografie. Hierbij wordt het homogenaat op een zoutoplossing gelegd en vervolgens gecentrifugeerd. De verschillende onderdelen van het homogenaat komen door dichtheid en grootte na centrifugatie op andere locaties in het buisje terecht. Deze kun je door af tappen van elkaar scheiden. Equilibrium sedimentatie (density gradient centrifuge) hierbij wordt het homogenaat in een stof geplaats die over de linie van het buisje verschilt in dichtheid. Na centrifuge zullen de verschillende onderdelen van het homogenaat op die locatie zitten waarbij de dichtheid matcht met de eigen dichtheid. Ook hierbij kan weer aan de basis van het buisje afgetapt worden om te scheiden.

12 Voor een cel om goed te kunnen functioneren moeten de verschillende processen die soms complementair aan elkaar zijn gescheiden worden. Een manier die veel gebruikt wordt hiervoor zijn de enzymen die nodig zijn voor deze reacties in grotere enzym complexen te plaatsen. Een tweede strategie is de verschillende processen in verschillende membraan omsloten compartimenten te laten plaatsvinden, membraan omsloten organellen. De belangrijkste organellen zijn in het kort hierboven al behandeld. Van sommige organellen hebben we er slechts 1 per cel (nucleus, ER en Golgi) en van anderen honderden (lysosomen, peroxisomen, endosomen) en van mitochondrien zelfs 1700 per cel!. Gemiddeld tellen de organellen de helft van het hele volume van de eukaryotische cel. De compartimenten van een cel zijn zeer waarschijnlijk in stadia geëvolueerd. Bacteriën hebben geen organellen en kunnen toch zichzelf van voldoende energie voorzien door hun grote oppervlakte/volume ratio. Eukaryotische cellen hebben een veel kleiner ratio en moesten dus naar een andere oplossing zoeken. Membraan omsloten organellen bieden deze functie door de vergroting in membraanoppervlak en zijn op ten minste twee manieren geëvolueerd. 1. het nucleaire membraan, Golgi, ER, lysosomen en endosomen zijn ontstaan door invaginatie van het plasmamembraan. Het wordt daarom ook wel het endomembraan systeem/vacuolair systeem genoemd. Deze organellen communiceren ook met elkaar. Doordat deze organellen dus oorspronkelijk van buiten de cel naar binnen treden worden ze ook in veel opzichten als extracellulair beschouwd. 2. mitochondria komen van een andere oorsprong. Van hen wordt gedacht van een bacterie af te stammen die in een symbiotische relatie met de eukaryotische cel leeft. Het mitochondrion blijft dus ook door de andere oorsprong buiten het vacuolaire systeem (communicatie). Wat er met peroxisomen is gebeurd weten we niet. Voordat een eukaryotische cel kan delen zullen ook de organellen gedupliceerd moeten worden. Voor de meeste organellen geldt dat ze ontstaan uit voorgaande organellen die groeien en vervolgens delen. De nucleaire envelop, het ER en het Golgi echter splitsen op in kleine vesikelen, welke weer samenkomen als de dochtercellen zijn gevormd. Om vervolgens te kunnen groeien zijn eiwitten (voor zowel het membraan als in het lumen) nodig. Voor sommige organellen worden deze direct via het cytosol geleverd, hier gaat het om de mitochondria, peroxisomen en nucleus. Voor anderen, inclusief het Golgi, lysosomen en endosomen, worden deze indirect via het ER aangeleverd. Voor ribosomen is een ander pad, wat losstaat van het verhaal hieronder, voor de synthese van eiwitten en ribosomale subnits. Daarom behandel ik deze eerst even kort. Eiwit synthese voor ribosomen: stukje RNA codeert voor een ribosomaal eiwit in het cytosol eiwitten gaan naar de nucleolus waar ze aan elkaar gezet worden ribosomale subunits terug naar het cytosol. Uitgezonderd enkele mitochondriale eiwitten worden vrijwel alle gesynthetiseerde eiwitten gestart met de synthese op de ribosomen in het cytosol. Tijdens de start van de synthese wordt een aminozuurvolgorde, sorting signal, aangemaakt op het eiwit welke het eiwit dirigeert naar de het organel waar deze nodig is. Eiwitten die dit signaal niet bevatten zullen ook in het cytosol blijven rondzwerven. Er bestaan verschillende signalen voor de verschillende organellen. Sorting signalen bestaan gewoonlijk uit een reeks van aminozuren en wordt vaak verwijderd nadat het sorteerproces is afgelopen. Ze zijn noodzakelijk en voldoende om het sorteerproces te laten verlopen. Anders dan de specifieke aminozuurvolgorde is er meer verschil in hydrofobiteit en geladen aminozuren die de uiteindelijke locatie bepalen van een sorting signal en dus de functie uitoefent. Eenmaal bij het organel aangekomen moet het eiwit ook naar binnen worden gehaald. Hoe dit gebeurd is voor elk organel anders, maar kost voor allemaal energie.

13 1. nucleus: de eiwitten worden door de nucleaire poriën naar binnen gehaald. Door de porien kan verkeer twee kanten op gaan, nieuw gemaakte eiwitten kunnen erin en RNA en ribosomalen subunits kunnen eruit. mrna moleculen die niet volledig zijn worden ook niet getransporteerd, wat suggereert dat dit een kwaliteitscontrole punt is voor de mrna synthese en verwerking. Deze porien functioneren als selectieve poorten die actief macromoleculen naar binnen transporteren mits ze het juist sorting signaal bevatten, maar vrije diffusie geven voor kleinere oplosbare moleculen, waaronder aminozuren. Het signaal dat eiwitten naar de nucleus dirigeert heet het nucleaire lokalisatie signaal, welke over het algemeen 1 of 2 stukjes van positieve aminozuren bevat zoals lysines en arganines. De nieuw gesynthetiseerde eiwitten die naar de nucleus moeten gaan worden over het algemeen in het cytosol al geholpen om de weg te vinden. Dit zijn eiwitten in het cytosol die nucleaire transport receptoren worden genoemd, welke aan het lokalisatie signaal bindt en het eiwit begeleidt naar een porie dmv interactie met porievezels. Het eiwit wordt vervolgens actief getransporteerd met behulp van GTP hydrolyse. In het centrum van de porie zit namelijk een soort van luikje welke hierdoor opengaat. De transport receptor wordt weer naar het cytosol gebracht en het eiwit gebruikt. Het eiwit wordt in zijn volledig gevouwen vorm getransporteerd, 2. ER, mitochondria en peroxisomen: de eiwitten worden in deze organellen naar binnen gehaald door middel van eiwit translocatoren die in het membraan zitten. Het eiwit kan hier (anders dan bij de porien) niet gevouwen doorheen en zal normaliter als een slang (dus ongevouwen) door het poortje moeten kruipen. Wat betreft de perixosomen is er weinig bekend van het exacte transportmechanisme. a. Mitochondria: de eiwitten die dit organel binnenkomen hebben meestal een signaal sequentie op de N-terminus. De eiwitten worden in 1 keer over zowel het buiten als binnenmembraan getransporteerd, op gespecialiseerde plaatsen waar de twee membranen met elkaar in contact zijn. Elk eiwit moet ontvouwen worden als het getransporteerd wordt en het signaal molecuul wordt na transport eraf geknipt. Chaperone moleculen binnen het organel helpen het eiwit over het membraan te trekken en vervolgens het eiwit weer om in de juiste conformatie op te vouwen. Transport binnen het organel gebeurd ook weer met sorting signals die bijna altijd pas tevoorschijn komen als het eerste signaal is afgeknipt. Als het bijvoorbeeld membraan eiwitten moeten worden zien we hetzelfde systeem als straks bij ER te zien zal zijn. Naast eiwitten hebben mitochondrien ook lipiden voor hun membraan nodig. Deze worden gedacht getransporteerd te worden direct van een membraan naar het andere door zogeheten lipide-dragende moleculen die in water oplosbaar zijn. b. Endoplasmatisch reticulum: de eiwitten die bij het ER aankomen bevatten een zogenaamde ER signaal sequentie welke bestaat uit een segment van 8 of meer hydrofobe aminozuren. het ER ontvangt naast eiwitten die bedoeld zijn voor het eigen organel ook eiwitten die naar andere organellen toe moeten (Golgi, lyso, endo en cel oppervlak). Als deze eiwitten eenmaal in het ER binnen zijn zullen zij niet meer vrijelijk in het cytosol terecht komen, maar in vesikelen van organel naar organel getransporteerd worden. Anders dan de eiwitten die de andere organellen binnenkomen worden de eiwitten voor het ER aan het membraan vast gesynthetiseerd, door ribosomen aan het ruwe ER (uiteraard aan de cytosolzijde). Dit zijn membraan-gebonden ribosomen, anders dan de vrij ribosomen die gebruikt worden voor alle andere eiwitten gecodeerd door het nucleaire DNA. Als een vrije ribosoom begint aan de synthese van een eiwit met ER signaal wordt dit deze ribosoom naar het membraan gedirigeerd. De eiwitten die het ER binnenkomen zijn door de synthese aan het membraan nog lineair en nog niet in 3Dconformatie. Hierdoor kost het, anders dan bijvoorbeeld voor de eiwitten in het mitochondrion, minder energie voor transport. Twee typen eiwitten worden vanaf het cytosol naar het ER getransporteerd: - water oplosbare eiwitten die vrijgelaten worden in het ER lumen nadat deze volledig over het membraan is getransporteerd. Deze eiwitten zijn of bedoeld voor secretie of het lumen van een van de

14 andere organellen. Het ER signaal wordt naar het membraan gedirigeerd met behulp van ten minste twee componenten. 1. signal recognition partikel (SRP): aanwezig in het cytosol en bindt aan het signaal wanneer het aan het ribosoom wordt aangemaakt. Binding zorgt voor een tijdelijke stop in de eiwitsynthese. 2. SRP receptor: bevindt zich op het membraan en herkend de SRP gebonden aan het eiwit waardoor de ribosoom en het eiwit aan het membraan verankerd worden, pas na binding van de SRP aan de receptor gaat de synthese weer verder. De SRP wordt in het cytosol vrijgelaten en de eiwitsynthese gaat verder. 3. translocatie kanaal: het gebonden ribosoom zit op het kanaal naast de SRP receptor, waardoor het eiwit tijdens de synthese het lumen in stroomt. Naast het dirigeren van de eiwitten naar het ER dient het signaal segment ook nog een andere functie, namelijk het openen van het kanaal. Het signaal segment blijft gebonden aan het kanaal terwijl de rest van het eiwit erlangs naar binnen stroomt. Op een gegeven moment knipt signaal peptidase het signaal af aan de luminale zijde van het membraan. Het signaal wordt afgebroken tot aminozuren. Zodra de C- terminus (synthese begint aan de N-terminus, en het signaal in dit verhaal ook aan de N-terminus) binnen is wordt het eiwit losgelaten van het kanaal. - prospectieve (moeten dus nog worden) transmembraan eiwitten die slechts gedeeltelijk over het membraan worden getransporteerd en dus niet in het lumen komen. Deze eiwitten blijven of in het ER membraan of worden getransporteerd naar andere membranen waaronder ook het plasmamembraan. De synthese van deze eiwitten is iet wat gecompliceerder dan de normale synthese van lumen eiwitten. In het simpelste geval is er sprake van 1 transmebraan stuk. In dit geval wordt ook de N-terminus gesynthetiseerd richting het lumen. Bij de synthese van een hydrofoob deel echter zal het transfer process stoppen, stop-transfer segment. Dit omdat het hydrofobe deel in het membraan wil blijven en niet in de waterige omgeving van het lumen wil/kan komen. Het stop transfer segement drijft af in het membraan waar het een alpha-helix vormt en het eiwit in het membraan verankerd. Het signaal segment wordt afgeknipt. De N-terminus is aan de luminale kant en de c-terminus aan de cytosolkant. In sommige eiwitten is het echter niet de N-terminus maar een middenstuk van het eiwit dat als transfer signaal dient, start transfer segment. het stop transfer segment vinden we een stuk verderop. Deze beiden segmenten worden niet afgeknipt omdat deze transmembrane delen vormen die belangrijk zijn voor de functie. Deze eiwitten vormen vaak dus binnen 1 eiwit meerdere transmembrane delen. Het aantal stop en start delen kunnen hoger worden als er meer transmembraan delen in de vorm van alpha helixen nodig zijn. Bekijk hierbij goed de plaatjes op p. 509, van Alberts!!!. Er zijn 4 typen membraaneiwitten: Type I: signaal sequentie bevindt zich aan de N-terminaal, het eiwit gaat eenmaal door het membraan heen. N terminus zit dus aan de lumen kant en de C terminus aan de cytosol kant. Het signaal wordt afgeknipt. Type II: start transfer stuk zit in het midden van het eiwit. Hierdoor klapt het eiwit om en komt de C terminus aan de lumen kant en de N terminus aan de cytosol kant. Het start tarnsfer deel wordt het transmembraan deel van het eiwit en dus niet afgeknipt. Type IV (III onbekend): dit is het type waarbij meerdere transmembraandelen mogelijk zijn. De start transfer zit verder in het midden, gevolgd door een stop transfer. Dit zorgt voor twee delen door het membraan, de start en stop in het membraan vast. Er kunnen meerdere transmembraan stukken ontstaan door meerdere start en stop coderingen.

15 Na synthese worden sommigen eiwitten aan een soort anker gezet die zich al in het membraan bevindt, een GPI anker (glucosylphosphatidylinositol). Dit is een lipide met twee vetzuren en een polaire kopgroep. De overdracht van een eiwit op dit anker vindt plaats met behulp van GPI transferidase. In het ER ondergaan de eiwitten 5 belangrijke posttranslationele modificaties en kwaliteitscontroles: 1. Formatie van disulfidebruggen tussen de cysteïne zijgroepen welke SH-groepen bevatten. Dit dient ervoor om de comformatie stabieler te maken. 2. Toevoegen en modificeren van suikers aan de asparagine groepen. Dit heet dan N (van Asn) glycosylering. De toevoeging van een suiker gebeurt al terwijl het eiwit nog gesynthetiseerd wordt, aan het membraan. Er wordt dan een reeds bestaande lipide gelinkte oligosaccharide aan het eiwit gekoppeld, welke zich eerder aan een dolichol bifosfaat bevondt. Deze suikers bestaan uit verschillende groepen waaronder Mannose, Glucose en N-acetylglucosaminen. In het RER lumen aangekomen wordt deze N-linked oligosaccharide verder bewerkt. Eventueel kunnen de suikers ook weer verwijderd worden. 3. Vouwing: de glycosylketens die aangebonden zijn worden vervolgens door de chaperone eiwitten gebruikt om de correcte vouwing te bereiken, deze zijn dus hier belangrijk voor. a. Kwaliteitscontrole 4. Specifieke proteolytische klieving 5. Assemblage in multimere eiwitcomplexen 3. vanaf het ER naar het Golgi en daarna eventueel naar een ander compartiment van het endomembrane systeem worden door vesikelen (membraanblaasjes) getransporteerd. Deze blaasjes worden gevuld met een te transporteren stof (cargo) aan de lumen kant van het organel (ER als eerste). De blaasjes gaan via het cytosol naar een ander organel waar ze fuseren met dat membraan. Tijdens dit proces worden ook de membraaneiwitten en lipiden die het blaasje hebben gevormd getransporteerd naar een ander organel, samen dus met opgeloste eiwitten. het transport met deze blaasjes kunnen zowel naar buiten vanaf het golgi naar het plasma membraan via secretieblaasjes of naar de lysosomen. ook vanaf het extracellualaire naar binnen van het plasma membraan is mogelijk: endosomen lysosomen gaan en kunnen dus een route van communicatie bieden tussen de onderdelen van de cel en er buiten. Er is dus een onderscheidt tussen twee grote paden: 1. secretiepad naar buiten: deze start met de biosynthese van eiwitten aan het ER membraan welke naar binnen in het membraan gaan. Vervolgens gaan deze naar het Golgi apparaat en daarna via secretiegranula naar buiten. 2. binnenwaarts endocytisch pad: dit pad zorgt voor vertering en afbraak van extracellulaire stoffen, en beweegt stoffen vanuit het plasma membraan via endosomen naar de grote afvalbak van de cellen, de lysosomen. Om goed te kunnen functioneren moet elk transportblaasje (vesicle) alleen die eiwitten meenemen die geschikt zijn voor de bestemming en moeten ze alleen met het juiste membraan fuseren. Elk organel moet zijn eigen specifieke eigenschappen kunnen behouden. Alle herkenningsmechanismen van de juiste membranen en eiwitten gebeuren via eiwitten die aan het vesikel membraan vastzitten. Allereerst is het dus belangrijk dat het juiste stukje membraan met de juiste membraaneiwitten in een vesikel terecht komen. Een stukje membraan wordt hierdoor bedekt door coat eiwitten. Deze zorgen er allereerst voor de het stukje membraan zich vormt tot een coated vesikel. Deze coat dient als herkenningspunt voor andere membranen waarmee het vesikel moet fuseren. Tevens dient de coat nog een andere functie, namelijk het zorgen voor het vastpakken van eiwitten voor transport welke selectief

16 uitgevoerd kan worden. Tot slot zorgt het nog dat het membraan gaat uitstulpen om een blaasje te vormen. Cellen produceren meerdere soorten Coat s: 1. clathrine coat: deze vesikelen komen van het Golgi apparaat en hebben als bestemming het secretiepad. tevens kunnen zij dienen vanaf het plasmamembraan naar binnen in het endocytische pad. De vorming van deze vesikelen gaat in een bepaalde volgorde. Allereerst bindt clathrine aan een stukje membraan, de coated pit. Het membraan wordt in een blaasje achtige vorm gemaakt. Een klein GTP bindend molecuul dynamine vormt een band rond het blaasje waardoor deze afkneld wordt en vrij van het membraan komt. Andere vesikelen gebruiken vergelijkbare systemen (figuur 15-19). zoals net al gezegd speelt de coat ook een rol in het selecteren van het cargo (te transporteren eiwitten). Clathrine speelt zelf hier niet direct een rol in, hierbij komt een tweede soort coat eiwit in beeld: adaptinen, welke zich tussen de clathrine coat en het membraan bevinden. Ze verankeren dus als het ware ook de clathrine aan het membraan. In de selectie van eiwitten spelen ze de rol dat ze de cargoreceptoren die de cargomoleculen binden vastpakken. Op deze manier wordt dus zowel de receptor als het eiwit in de vesikel meegenomen. De adaptinen die de cargo pakken in het plasmamembraan zijn wezenlijk verschillend van die in het Golgi apparaat, omdat deze verschillende soorten receptoren moeten kunnen binden. 2. COP-coat: wordt gebruikt door vesikelen die van het ER naar het Golgi gaan (COP II) en die van een onderdeel van het Golgi naar een ander onderdeel van het Golgi gaan (COP I). Wanneer een vesikel eenmaal los is van het membraan moet deze getransporteerd worden naar de juiste locatie. Over het algemeen gebeurt dit met behulp van motoreiwitten, die over het cytoskelet bewegen. Eenmaal bij de juiste locatie aangekomen moet deze het organel herkennen en er aanmeren. Op het membraan van een vesikel bevinden zich targets die specificeren wat er zich binnen in bevindt en waar het vandaan komt, welke herkend worden door het juiste membraan. Het mechanisme wat zich hier mee bezig houdt wordt ondersteunt door zogenaamde SNARE s. elke vesikel heeft een V-SNARE die specifiek bindt op een bepaald T-SNARE van het doelmembraan (T=target; V= vesicle). Wanneer het vesikel eenmaal aangemeerd is vindt fusie meestal niet direct plaats, maar wacht een moleculair signaal af. Om te kunnen fuseren moeten de twee membranen niet zozeer dicht bij elkaar zijn, maar echt met een maximale afstand van 1,5 nanometer van elkaar zijn. Om dit te laten gebeueren moet allereerst het water aan de hydrofillische zijde van het membraan verwijderd worden. Dit is echter energetisch infavoriet en daarom ook waarschijnlijk dat deze reacties gekatalyseerd worden. De SNAREeiwitten spelen ook een rol, de T en V draaien bij contact om elkaar heen waardoor de membranen als het ware naar elkaar toe geschroefd worden. Secretiepad: Elk molecuul dat via exocytose (fusie van plasmamembraan met als doel stoffen naar buiten te werken) moet een vaste route volgen om dit te bereiken en wordt meestal chemisch gemodificeerd op de weg naar buiten. Naast de modificatie worden alle stoffen ook gecontroleerd op kwaliteit alvorens in de extracellulaire omgeving los te laten, is dit niet het geval zal het molecuul binnen blijven en in de cel worden afgebroken. Meeste moleculen beginnen de modificatie in het ER door covalente bindingen. Hier worden zwavelbruggen gevormd door oxidatie van cysteine zijketens, om de stabiliteit van het eiwit te vergroten. Deze zwavelbruggen worden door de reducerende omgeving niet in het cytosol gevormd. Verder worden in het ER ook veel eiwitten omgevormd tot glycoproteinen door aanhechting van oligosacchariden, suikergroepen, glycosylatie. Ook dit proces verloopt wel in het ER en niet (zeer weinig) in het cytosol door aanwezigheid van de zogeheten glycosylerende enzymen. De suikergroepen

17 dienen een aantal verschillende functies: vasthouden binnen het ER totdat het fatsoenlijk gevouwen is, of dienen als transportsignaal om de stof in het juiste vesikel te krijgen. Als ze deel uit maken van het celoppervlak dragen ze bij aan de suikerlaag en kunnen dus helpen in de herkenningen tussen cellen. De oligosacchariden worden niet gevormd door aanhechting van suikertjes 1 voor 1. in plaats daarvan is er al een complete suikergroep van 14 suikers aanwezig die vastgehecht zit aan een speciale lipide, dolichol, in het ER membraan. Deze suikergroep laat vervolgens los en bindt zich in 1 keer aan de NH2 groep van asparagine zodra deze in het lumen verschijnt. Deze stap wordt door 1 enkel enzym gekatalyseerd, oligosacchariden eiwit transferase. Aangezien dit enzym zich aan de lumen kant van het membraan bevindt kan het ook verklaren waarom er geen gesuikerde eiwitten in de cytosol kant van het membraan zitten. Oligosacchariden die op deze manier aan de NH2 keten van asparagine zitten worden N-linked genoemd en zijn bij verre de meest voorkomende binding bij glycoeiwitten. De uiteindelijke glycoproteinen zijn ontzettend divers en de N-bindingen ook. Dit komt door verdere modificatie in zowel het ER als het Golgi. Sommige eiwitten dienen in het ER te blijven en hebben dan hier een ER retention signaal voor welke bestaat uit een sequentie van 4 aminozuren op de C-terminus. De meeste eiwitten echter moeten verder naar andere celonderdelen. Deze gaan via vesikelen eerst naar het Golgi apparaat. Voordat deze eiwitten eruit mogen worden ze sterk geselecteerd en alleen de juist gevouwen eiwitten of de juiste gevormde polymeren en dimeren mogen door. De foute eiwitten worden in het ER aan chaperonen gebonden tot ze wel de juiste configuratie hebben en anders worden ze afgebroken. Soms kan deze kwaliteitscontrole ontzettend fataal zijn voor een mechanisme. Voorbeeld: cystic fibrosis is een ziekte waarbij een mutatie plaatsvindt die ervoor zorgt dat een plasmamebraan net niet goed gevouwen is. Ondanks dat deze mutant best zou kunnen functioneren als chloride kanaal krijgt het de kans niet omdat het in het ER wordt vastgehouden. Dus het ER zorgt door de kwaliteitscontrole ervoor dat een niet desastreuze mutatie toch ontzettend erg wordt. In het golgi apparaat aangekomen komen de eiwitten eerst in het cis netwerk welke vlak bij het ER gelegen is. De eiwitten vervolgen hun weg vervolgens tussen de cisterne via de mediale naar de transzijde met behulp van vesikelen. Uiteindelijk komen de eiwitten buiten het Golgi vrij om naar het celoppervlak te gaan of een ander compartiment. Zowel het Cis als het Trans deel van het Golgi zijn belangrijk bij het sorteren van eiwitten. In het cis wordt bijvoorbeeld al onderscheidt gemaakt tussen eiwitten met een ER retention signal die dus terug moeten naar het ER en andere eiwitten die het Golgi kunnen vervolgen. In het transdeel wordt onderscheidt gemaakt tussen de eiwitten die naar de lysosomen moeten en de eiwitten die naar het cel oppervlakte moeten. Veel van de suikergroepen die in het ER aan de eiwitten gebonden waren ondervinden verdere modificatie in het Golgi apparaat. 1. modificatie N-glycosylering (Asn) 2. O-glycosylering (aan OH groep van ser, thr, of hydroxyser) (de N glycosylering vindt dus alleen plaats in het ER terwijl de O-glycosylering in het Golgi gedaan wordt). 3. proteolytische knip eiwitten 4. sulfatering eiwitten (aanbinden van een fosfaatgroep) Er is een duidelijke correlatie tussen de processen die doorlopen worden (1 t/m 4) en de locatie binnen het Golgi, de stappen altijd van cis naar trans. De suikers worden dus eerst afgehaald in Cis netwerk, Cis cisterne en mefdiale cisterne en aangeplakt in mediale cisterne en trans cisterne.

18 De antigenen die bloedgroepen bepalen hebben bijvoorbeeld verschillende suikergroepen welke in het golgi zo gemodificeerd zijn. Eiwitten die van het Golgi naar het plasma membraan moeten gaan bevinden zich in het constitutieve exocytose pad. Dit pad werkt continu en zorgt ervoor dat nieuwe lipiden en eiwitten naar het plasmamembraan worden gebracht zodat deze kan groeien. Dit pad brengt ook eiwitten naar het cel oppervlak waar ze uitgescheden kunnen worden, secretie, om in het ECM te gaan, adhesie aan celoppervlak, voeding of dienen als signaal. Het terecht komen in dit pad behoeft geen signaal segment en is dus niet selectief, het wordt daarom ook wel het default pad genoemd. Naast dit pad is er nog een ander pad die ook als doel heeft eiwitten naar buiten te brengen (secretie). Dit pad wordt echter wel gereguleerd een daarom ook wel het gereguleerde exocytose pad genoemd. Dit pad opereert alleen in speciale secretiecellen met als doel natuurlijk om bijvoorbeeld hormonen, enzymen of mucus uit te scheiden. Deze stoffen worden opgeslagen in zogenaamde secretie vesikelen welke dan een tijdje in het cytosol rond blijven drijven. Zodra er een extracellulair signaal wordt gegeven gaan ze met het plasma membraan fuseren. Voorbeeld: afgifte van Insuline door de alvleesklier. De eiwitten die dit doel hebben worden in het trans golgi al gesorteerd en voorzien van speciale oppervlakte eigenschappen. Deze eigenschappen zorgen ervoor dat de eiwitten onder ionische omstandigheden (lage ph en hoge CA2+) zoals die in het trans golgi heersen kunnen samenkomen. deze pakketjes van eiwitten worden dan herkend door een onbekend mechanisme en verpakt in de secretie vesikelen. De eiwitten die dus niet samenklonteren worden niet herkend en gaan automatisch het constitutieve pad in. De samenklontering van de eiwitten heeft naast selectie nog een andere functie, het mogelijk maken van de eiwitten om in veel grotere aantallen in een vesikel te passen omdat ze lekker dicht op elkaar geplakt zitten. Hierdoor kunnen met 1 vesikel grote hoeveelheden stoffen worden vrijgegeven. Wanneer een transport of secretie vesikel fuseert met het membraan wordt het vesikel membraan onderdeel van het plasma membraan. De reden dat het plasma membraan niet steeds groter wordt is omdat de hoeveelheid endo en exocytose redelijk in balans zijn. In polaire cellen (zenuwcellen, epitheelcellen), dus met twee verschillende kanten, worden sommige eiwitten aan de apicale kant (lumen kant van orgaan) uitgescheden terwijl andere eiwitten aan de basolaterale kant (bloedbaan) worden uitgescheden. Apicaal in polaire cellen: altijd door gereguleerde secretie, bijvoorbeeld verteringsenzymen van de alvleesklier. Basolateraal in polaire cellen: constitutief en gereguleerd. Constitutief bijvoorbeeld: albumine en transferine door lever. Gereguleerd: insuline door eilandjes van langerhans; neurotransmitters door zenuwcellen. In niet polaire cellen in de uitscheiding altijd constitutief. Endocytotische paden Vloeistoffen, voedingstoffen, partikelen en zelfs andere cellen kunnen de cel binnenkomen door een proces endocytose. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een endocytotisch vesikel. Na binnenkomst wordt het materiaal uiteindelijk afgegeven aan de lysosomen, waar het verteerd wordt. De gevormde metabolieten worden in het cytosol vrijgelaten. Twee soorten vesikelen worden gevormd op basis van grootte:

19 1. pinocytose: heeft kleinere vesikelen (150nm) en is gebruikt bij het drinken (vloeistoffen) en moleculen. Pinocytose wordt voornamelijk uitgevoerd door clathrine coated vesikelen welke dan vervolgens snel hun coat verliezen en fuseren met endosomen. Heirbij wordt dus ook een deel extracellulaire vloeistof overgedragen welke zich in het vesikel bevond. Daarom kan deze vorm van transport dus gebruikt worden om vloeistof op te nemen. Pinocytose discrimineert niet en pakt dus simpelweg elk molecuul wat ie kan pakken. In de meeste cellen kan er echter ook een ander mechanisme gebruikt worden om specifieke macromoleculen de cel in de krijgen. Deze macromoleculen binden aan de receptoren aan het cel oppervlak en kunnen dan als receptor macromolecuul complexen de cel in komen. Dit proces heet receptor-mediated endocytose en is een efficiente manier om toch veel van een stof in de cel te krijgen met name als de concentratie in de extracellulaire vloeistof laag is. Voorbeeld: opname van cholesterol wanneer deze nodig is. Cholesterol is zeer onoplosbaar en wordt door het bloed getransporteerd door aan een eiwit te binden. Hierdoor worden partikelen gevormd: Low Density Lipoproteinen, LDL. De LDL kan vervolgens aan de receptoren op het celopppervlak binden en op die via clathrine gecoated endosomen de cel in komen. Omdat ze hierdoor in de endosomen terecht komen waarbinnen de omgeving veel zuurder is dan erbuiten laat het LDL los van de receptor en verder aan de lysosomen overgedragen worden. Door hydrolyse komt uiteindelijk de cholesterol vrij. Sommige mensen hebben een defect gen waardoor er geen gebruik gemaakt kan worden van een LDL receptor. Cholesterol hoopt zich in dit geval op in het bloed, kan niet door de cel gebruikt worden en mensen krijgen last van hartfalen en arterosclerose. Receptor mediated endocytose kan ook gebruikt worden om andere stoffen op te nemen, zoals vitamine B12 en ijzer, welke beiden nodig zijn voor de synthese van hemaglobine. Helaas kan dit proces ook gebruikt worden door slechteriken zoals het HIV virus en griepvirus welke dit systeem gebruiken om de cel binnen te komen. Wanneer je door een elektronenmicroscoop kijkt en een elektrondichte vloeistof als marker gebruikt zie je dat het endosomale compartiment een complexe set van verbonden membraan buisjes en grotere vesikelen. Twee soorten endosomen kunnen op deze visuele wijze worden onderscheiden: 1. vroege endosomen: deze bevinden zich vlak onder het plasma membraan 2. late endosomen: na 5-15 minuten bevinden de stoffen zich hierin vlakbij de nucleus. Deze late endosomen hebben ook al een laag ph net zoals de lysosomen. De vroege endosomen worden langzaamaan de oude endosomen wanneer de blaasje binnen het vroege endosoom samen fuseren of fuseren met een bestaand laat endosoom. Het interieur van de endosomen is zurr, ph = 5-6, en dit wordt bereikt door een ATP afhankelijke pomp die H+ binnen in de cel pompt vanuit het cytosol. De compartementen binnen een endosoom fungeren als de basis voor een sorteerstation voor inwaartse endocytische pad. Dit is dezelfde functie als het trans Golgi netwerk voor het uitwaartse pad heeft. De zure omgeving van het endosoom speelt een cruciale rol in het sorteerproces, omdat hierdoor veel receptoren hun gebonden cargo loslaten. Wate r vervolgens met de receptoren gebeurd nadat ze hebben losgelaten verschilt per receptor. De meeste worden via endosomen naar het plasmamembraan gebracht (zoals LDL), maar sommigen worden doorgegeven aan de lysosomen waar ze worden afgebroken. Tot slot bestaat er nog een mogelijkheid voor de receptoren om via endosomen naar een ander deel van het plasmamembraan te gaan, waardoor de cargo moleculen van één deel van het membraan naar het andere verhuizen, transcytose. het is dus zo dat de cargomoleculen die aan een receptor gebonden zitten het lot van de receptor mede ondergaan, de moleculen die wel loslaten zijn gedoemd in het lysosoom terecht te komen voor afbraak. Een voorbeeld hiervan in het immunoglobuline dat via endosomen van de apicale naar de basolaterale kant wordt gebracht. Een receptor kan op dezelfde wijze aan de andere zijde van de cel terecht komen. Hoe de moleculen precies van een endosoom in een lysosoom komen is onduidelijk, één optie is het veranderen van een endosoom in een lysoom, of via transportblaasjes.

20 Lysosomen zijn de afvalvaten van de cellen waar veel moleculen worden afgebroken (eiwitten, vetten en polysacchariden). Mannose-6-fosfaat residuen stuurt de eiwitten naar de lysosomen, welke in het CIS Golgi door fosforylering van koolstofatoom 6 erop gezet worden (bekijk hiervoor college sheet). De mannose-6-fosfaat receptor die zich in het blaasje en later in een laat endosoom bevindt wordt via een blaasje naar het TRANS golgi teruggebracht, terwijl het eiwit via fusering in het lysosoom terecht komt. Lysosomen zijn zakjes van hydrolytische enzymen die op gecontroleerde wijze vertering uitvoeren. Er zijn ongeveer 40 verschillende enzymen in een lysosoom maar hebben allemaal een optiaal ph die zeer zuur is (5). Het membraan van het lysosoom zorgt er normaliter voor dat de afbraak enzymen niet in het cytosol terecht komen waar ze ongewilde moleculen of lichaamseigen moleculen kunnen afbreken, maar mocht dit wel gebeuren zorgt het ph optimum ervoor dat ze alsnog niet kunnen werken. Net als alle andere organellen heeft een lysosoom een unieke intracellulaire huishouding en een uniek membraan. Hieronder vallen ook transport eiwitten die de afgebroken macromoleculen naar het cytosol kunnen verplaatsen, en een ATP gedreven protonenpomp. De meeste van de membraan eiwitten zijn erg besuikerd, geglycosyleerd. Dit omdat de suikers ervoor zorgen dat de membraan eiwitten niet door het lysosoom zelf opgegeten worden. De enzymen die werkzaam zijn in het lysosoom worden gemaakt in het ER en via het Golgi naar een lysosoom getransporteerd. In het ER en cis Golgi worden ze gemerkt met een suiker (mannose-6-p) waardoor het trans Golgi zijn bestemming kan herkennen. Afhankelijk van de inhoud kunnen de transportblaasjes op verschillende manieren in het lysosoom terecht komen. Vanuit het extracellulaire gaan kleinere macromoleculen en vloeistof via endosomen (met clathrine bedekt voor specifieke membraaneiwitten en niet met clathrine bedekt voor aspecifieke eiwitten), via phagosomen voor extracellulaire partikelen, en voor afbraak van lichaamseigen stoffen (bijvoorbeeld mitochondria) via autophagosomen, welke fuseren met een lysosoom. Het is onbekend wat de marker is voor destructie van een eigen organel. 1. fagocytose: wordt meer gebruikt voor het eten en haalt grotere partikelen binnen via grotere vesikelen (250nm) die fagosomen worden genoemd. Alle eukaryotische cellen zijn in staat tot pinocytose terwijl facocytose door slecht speciale fagocytische cellen uitgevoerd kan worden. Eveneens zijn er receptoren betrokken bij fagocytose. Ondanks dit is fagocytose belangrijk voor het lichaam anders dan pure voeding. a. Macrofagen worden in het lichaam gebruikt om ons te beschermen tegen binnenvallende micro organismen zoals bacteriën. Deze moeten eerst aan de macrofaag zijn receptor binden aan het oppervlak om facocytose als gevolg te krijgen. Sommige van deze receptoren herkennen antilichamen die op de oppervlakte van het micro organisme gebonden zijn. Wanneer fagocyten deze cellen tegen komen vormen ze een soort deken van plasmamembraan, pseudopods, welke zich dan om het organisme heen vormen en een fagosoom vormen. Deze fagosomen fuseren dan weer met een lysosoom waar het organisme verteerd wordt. Net als bij autofagocytose vindt hier dus ook geen endosoom betrekking en gaan de stoffen direct het lysosoom in. Sommige bacteriën hebben truucjes ontwikkeld om onder dit beschermingsmechanimse uit te komen. Voorbeeld: de bacteriën voor tuberculose (myobacterium tuberculosis) kunnen de fusie tussen een fagosoom en een lysosoom inhiberen. In plaats van vernietigd te worden kan het organisme zich nu binnen de macrofaag vermenigvuldigen. Fagocytische cellen spelen ook een rol bij het opruimen van dode en beschadigde cellen. Voorbeeld eten 10 ^ 11 rode bloedcellen per dag.