De bepaling van anti-dsdna bij systemische lupus erythematosus herbekeken

Transcriptie

1 De bepaling van anti-dsdna bij systemische lupus erythematosus herbekeken Evy De Witte 16/05/2013

2 Overzicht Inleiding Methodologie UZGent Behandeling In-house studie Besluit 2

4 Kliniek SLE Chronische auto-immuunziekte Prevalentie 1/1000 (9x meer bij vrouwen) Mortaliteit: hoogst3 jaarnadx oorzaken ±30%: actieveziekte ± 20%: infecties(secundair aan immunosuppressiva) ± 50%: progressief orgaanfalen Multi-systemische ziekte Huid Interne organen Immunologische afwijkingen 4

5 20% 85% 25%, pleuritis (61%) 30-40% Hematologic disorders (60%) Anemia, thrombocytopenia, leukopenia Gewrichten en spieren (95%) Manson et al., Orph J rare diseases 2006

6 Tsokos, NEJM 2011

7 Van Bavel C et al., Mol Immunol. 2010

8 Pathogenese SLE Rolvan de B-celen de vormingvan antistoffen Neonatale lupus Initiatie door neo-epitopen of verborgen epitopen Klonaleexpansie van dsdnaspecifieke B-cellendie ontsnappen aan het tolerantie mechanisme Naïeve ssdna specifieke B-cellen muteren naar dsdna specifieke B-cellen Antistofrespons = aangrijpingspunt voor therapie 8

9 Anti-DNA antistoffen Niet-specifiek anti-dsdna Niet-pathogene antistoffen zwakke antigenische druk SLE specifieke anti-dsdna Pathogene antistoffen hoge en persisterende druk gezonde personen (<0.1%) andere AIZ tijdens infecties (1-12%) lage titer IgM>>IgG, IgA polyreactief( Ag, ssdna) lage aviditeit bvb. oiv. genetische, omgevings-, hormonale factoren hogere titer IgG>> IgM, IgA Specifiek dsdna hoge aviditeit Anti-TNFα geïnduceerde anti-dsdna Niet-pathogene antistoffen Medicamenteus geïnduceerde auto-immuniteit TNFα-blokkers (infliximab, etanercept ) IgM en/of IgA tot stop therapie lage aviditeit NIET geassocieerd met andere serologische of klinische kenmerken van SLE 9

10 Rol van anti-dsdna: diagnose SLE American College of Rheumatology (ACR) Classificatie van SLE Theorie: éénduidige patiëntengroepen voor onderzoek Praktijk: gebruik in de diagnose van SLE Historiek Cohen et al., 1971 Tan et al., 1982 Inclusie van serologische criteria, naast de klinische criteria Hochberg et al., 1997 Verdere uitdieping aanwezigheid van anti-fosfolipiden Ab s Onderscheid SLE en anti-fosfolipidsyndroom moeilijk obv. ACR criteria: dit serologisch criterium staat ter discussie. (Smith, Lupus 1999) 10

11 Rol van anti-dsdna: diagnose SLE 11 ACR criteria Klinische criteria Vlinderexantheem Discoïde lupus Fotosensitiviteit Orale ulcera Arthritis Pleuritis of pericarditis Renale afwijkingen Centrale stoornissen Hematologische afwijkingen Serologische criteria Antinucleaire antistoffen (ANA) Anti-DNA/-Sm/-fosfolipiden Ab s 4 positieve criteria SLE 11 Petri & Magder, Lupus 2004

12 Rol van anti-dsdna: diagnose SLE Serologische criteria SLE auto-antistoffenreeds aanwezig tot enkele jaren vóór het begin van de eerste symptomen ANA > 95% SLE patiënten Anti-DNA 50-80% Anti-Sm 5-30% Anti-RiboP 10-20% Anti-PCNA zeldzaam Hoge specificiteit voor SLE Anti-U1RNP 13-32% Anti-SSA 25-60% Anti-SSB 19-30% Anti-histonen 50-80% Anti-fosfolipiden 40-60% Anti-C1q 17-58% Anti-RA % Anti-PCNA zeldzaam Munoz et al., Aut. Rev Conrad et al., PSP

13 Rol van anti-dsdna: follow-up SLE Anti-DNA aanwezig vóór eerste klinisch symptoom Titer bij actieve ziekte en evolutie naar lupus nefritis Titer bij anti-cd20 therapie en andere B-celspecifieke therapeutica => Kwantitatieve waarde = voorspellende waarde in FU! 13

15 Overzicht bepalingsmethoden ANA IIF op HEp2(000)-cellen Peene et al., ARD 2001: homogeen patroon is een aanwijzing voor de aanwezigheid van anti-dna Gevoelig maar niet specifiek genoeg SCREENING Confirmatie met meer specifieke assays: enzymimmunoassays (EIA) IIF op Chritidia luciliae (CLIFT) Radioimmunoassays (RIA) 15

16 SLE HD GN DC systemic lupus erythematosus healthy blooddonors glomerulonefritis which mimic lupus nefritis diseased controls (CTD, AID, ID, neoplasie) Referentie Farr CLIFT EIA s ANA N n DxSLE sens(%) spec (%) sens(%) spec (%) sens(%) spec (%) sens(%) spec (%) Hernando SLE, 103 non-sle? Derksen SLE, 192 DC ACR Wasmuth SLE, 103 non-sle ACR Haugbro SLE, 60 DC, 59 HD ACR Riboldi SLE, 81 HD, 86 DC? Ghirardello 2007??? Heidenreich SLE, 43 GN histologische Dx lupus nefritis Launay SLE, 101 HD, 53 DC ACR Antico SLE, 88 DC ACR Op De Beeck SLE, 149 HD, 429DC ACR Ghirardello SLE, 55 HD, 161 DC ACR

17 SLE HD GN DC systemic lupus erythematosus healthy blooddonors glomerulonefritis which mimic lupus nefritis diseased controls (AID, ID, neoplasie) Referentie Farr CLIFT EIA s ANA N n DxSLE sens(%) spec (%) sens(%) spec (%) sens(%) spec (%) sens(%) spec (%) Hernando SLE, 103 non-sle? Derksen SLE, 192 DC ACR Wasmuth SLE, 103 non-sle ACR Haugbro SLE, 60 DC, 59 HD ACR Riboldi SLE, 81 HD, 86 DC? Ghirardello 2007??? Heidenreich SLE, 43 GN histologische Dx lupus nefritis Launay SLE, 101 HD, 53 DC ACR Antico SLE, 88 DC ACR Op De Beeck SLE, 149 HD, 429DC ACR Ghirardello SLE, 55 HD, 161 DC ACR

18 Overzicht bepalingsmethoden Specifiekere assays gevoeligheidsspectrum Aviditeit Isotype Kwantitatieve meting Test Detectie van dsdna antistoffen met volgende eigenschappen: laag avide medium avide hoog avide isotype Niet-specifiek ANF? x x IgG (1) Specifiek CLIFT x x IgG (1) EIA x x x IgG Farr x IgG, IgA, IgM (1) Afhankelijk van de specificiteit van het conjugaatvoor IgG; ook detectie van IgAen IgMmogelijk. 18

19 Overzicht bepalingsmethoden CLIFT IIF Crithidia luciliae Substraat = circulair dsdna in de kinetoplast Zeer specifiek, maar minder gevoelig dan ANA Semi-kwantitatief(negatief tot 5+) Detectie van isotypes Polyspecifiek conjugaat(igg heavy en light chain) Specifiek conjugaat (IgG heavy chain) 19

20 Overzicht bepalingsmethoden Farr assay(trinity Biotech) Niet-competitieve RIA Precipitatie assay met ammoniumsulfaat Incubatie met 125 I-gelabelde dsdnatracer [tracer] ~ [anti-dsdna] Meetbereik: IU/mL Kwantitatieve meting maar radio-activiteit, kostprijs, batch-analyse Detectie van hoog avideiga, IgMen IgG Dissociatie van laag tot matig avide anti-dsdna complexen! 20

23 Overzicht bepalingsmethoden EIA DNA aan een vaste drager 1. ssdna 2. dsdna via een drager: aspecifieke bindingen 3. Biotine-DNA en drager-streptavidine Laag tot hoge aviditeit detecteerbaar specificiteit in performantie 1. in secundair antilichaam 2. soort DNA (eukaryoot, pro-eukaryoot, contaminatie met ssdna) in meetbereik en cut-off(co) 1. controlepopulaties (HD vs CTD vs DC) 2. Maar! Gebruik van IU en standaarden Kwantitatief Automatiseerbaar: alternatief voor CLIFT en RIA 23

26 Overzicht bepalingsmethoden Andere Line immunoassays Micro-arrays Laser bead immunoassays => Performanties nog niet bewezen in grotere studies! 26

27 Standaardisatie Feltkamp, 1988 SLE patiënt Wo, in 1980 Evaluatie: Farr assay(amersham) en CLIFT in 8 laboratoria WHO expert committee: 100 IU/500µl (vial) of 200 IU/ml Wo/80 beheerd door CLB (bloedtransfusiecentrum Nederland) Nu:voorraad is op!! Geen vervolgacties 27

28 Standaardisatie Of variatie?! Referentie Cut-off (IU/ml) Performantie N n Dx SLE Test Firma Spec (95%) sens(%) spec (%) sens(%) spec (%) Antico SLE, 28 CTD, 60 ID ACR criteria CLIFT 1/ CLIA FEIA ELISA ELISA (extracted) Farr Launay SLE, 101 HD 99 SLE,53 AID ACR criteria CLIFT 1/10-17 Diastat Elia Liaison Farr 7 7,

29 Standaardisatie Variatie in cut-off?! Meeste kits gebruiken echter Wo/80 Verschil in techniek, antigeen, secundair antilichaam en gebruikte controlepopulatie Grote variatie in performantie EIA Illustreert eveneens: ondanks gebruik IU/mL, grote variatie COwaarden 29

30 Standaardisatie Literatuur: Berth et Debeuf Materiaal 4128 consecutieve stalen < huisartsen ANA (HEp2 cellen): IIF 1/80 ENEliA dsdna vanaf 10 IU/ml N= 43 stalen Geen inclusie obv. klinische criteria! Methoden CLIFT EliA dsdna (Phadia) Nucleosome dot kit (Alphadia) Anti-dsDNA NcX ELISA (Euroimmun) Anti-dsDNA Microplate EIA (Bio-Rad) Quanta Lite dsdna SC ELISA (Inova) Resultaten Alle EIA op dezelfde manier gestandaardiseerd Toch variatie in resultaten! 30

31 Besluit methodologie Farr gevoeliger dan CLIFT EIA scoren steeds beter maar kunnen specificiteit van CLIFT en Farr voorlopig niet evenaren EIA variëren onderling sterk in performantie Farr= theoretisch meest performante kwantitatieve test nadeel: RIA, kostprijs, batch analyse 31

33 Oorspronkelijke situatie Negatief => STOP positief CLIFT 33

34 Oorspronkelijke situatie NADEEL: CLIFT is niet kwantitatief! Follow-up SLE Belimumab terugbetaling vanaf anti-dsdna > 30 IU/ml! nood aan kwantificatie! 34

36 Overzicht Lokale cutane behandeling Minder bijwerkingen dan NSAIDs, systemischecorticosteroïden of immuunsuppressiva NSAID s Musculoskeletale klachten zoals arthralgie en arthritis Koorts Hoofdpijn Milde serositis Hydroxychloroquine Huidaantasting, musculoskeletale klachten Systemische behandeling met corticosteroïden Bij orgaanaantasting Lagere doses voor cutane of musculoskeletale behandeling Andere immunosuppressiva (Methotrexaat, cyclofosfamide, azathioprine, mycofenolaat of rituximab) Bij inadequate respons op corticosteroïden Monoklonale antilichamen 36

37 Belimumab(Benlysta) Werkingsmechanisme Recombinant humaan monoklonaal antilichaam Inhibitie van BLyS aan B-cel receptoren BLyS= B-lymfocytenstimulerend eiwit ~ ziekte-activiteit SLE 37

38 Werkingsmechanisme 1) Overleving van B-cellen waaronder autoreactieve B-cellen 2) Differentiatie van B-cellen tot plasmacellen

39 Belimumab trials n 70 Fase 1 Furie et al. Fase 2 Wallace et al. Fase 3 Navarra et al. Doel Veiligheid, biologische activiteit, FK Dx SLE Methode ACR criteria Geen therapie Stabiel Ooit auto-as+ Farr (5 IU/ml) % anti-dsdna + 60% Resultaten Goede tolerantie Aantal B-cellen

40 Belimumab trials Fase 1 Furie et al. n Fase 2 Wallace et al. Fase 3 Navarra et al. Doel Veiligheid, biologische activiteit, FK Idem fase 1, efficaciteit mét standaardtherapie bij actieve SLE Dx SLE ACR criteria Geen therapie Stabiel Ooit auto-as+ ACR criteria Standaardtherapie SELENA-SLEDAI 4 Ooit auto-as+ Methode Farr (5 IU/ml) ELISA Biorad (30 IU/ml) % anti-dsdna + 60% 50% Resultaten Goede tolerantie Aantal B-cellen Serologisch actieve SLE patn hebben significant effect mét standaardtherapie

41 Belimumab trials Fase 1 Furie et al. Fase 2 Wallace et al. n Doel Dx SLE Veiligheid, biologische activiteit, FK ACR criteria Geen therapie Stabiel Ooit auto-as+ Idem fase 1, efficaciteit mét standaardtherapie bij actieve SLE ACR criteria Standaardtherapie SELENA-SLEDAI 4 Ooit auto-as+ Fase 3 Navarra et al. Idem fase 2, efficaciteit mét standaardtherapie bij serologisch actieve SLE ACR criteria Standaardtherapie SELENA-SLEDAI 6 ANA ( 1:80) of anti-dsdna ( 30 IU/ml) Methode Farr (5 IU/ml) ELISA Biorad (30 IU/ml) ELISA Biorad (30 IU/ml) % anti-dsdna + 60% 50% 70% Resultaten Goede tolerantie Aantal B-cellen Serologisch actieve SLE patn hebben significant effect mét standaardtherapie ANA+/anti-dsDNA+ SLE patn hebben significant effect mét standaardtherapie

42 Belimumab Vergoedingsvoorwaarden 1) Onvoldoende antwoord op volgende behandeling: Anti-malaria middel, EN Corticosteroïden aan een dosis van 7.5mg/dag (prednisone equivalent) gedurende 3 maanden, EN Een ander immunosuppressief middel, EN 2) Een SELENA-SLEDAI score 10, EN 3) Een BILAG score van minstens 1A of 2B, EN 4) De aanwezigheid van natieveanti-dnaantilichamen (>30 IU/ml), EN 5) Deficit van complementfactoren C3 en/of C4 ten opzichte van de referentiewaarden van het laboratorium. => Gebaseerd op fase 2 en 3 studie: serologisch actieve SLE, detectie met ELISA met CO van 30 IU/ml, fase 1 van Belimumabtrial met Farr assay(5 IU/ml) 42

43 Belimumab DNA algoritme niet aanpassen naar dit criterium Voorkeur geven aan assays met een goede performantie RIZIV Op basis van Belimumab trial Criterium: anti-dsdna 30 IU/ml WETENSCHAP Hoe definieer je anti-dsdna positiviteit? Assay variabiliteit Gebrekkige standaardisatie 43

45 Objectieven 1. In-huis vergelijking van verschillende anti-dsdna assays CLIFT met 2 verschillende conjugaten Farr assay(trinity Biotech ~ Amerlex) Sensitiviteit/specificiteit voor SLE? 2. Cascade-testing Wat is het effect op de performantiekarakteristiekenbij gebruik van cascade-testing? Welke is de beste strategie? CTD screen in plaats van symphony screen, waar inpassen in het algoritme? 45

46 Methode en materialen 1. Patiëntenpopulatie N=248 Consecutieve stalen van afdeling reumatologie (inclusief pediatrie en consultaties) en nefrologie Retrospectieve klinische cohorte (niet uitsluitend Dx stalen) SLE 44 Andere CTD 154 Drug-induced lupus (~ anti-tnfα) 7 Geen zekerheidsdiagnose(sle niet uitgesloten) 43 Data-analyse op n= Assays CLIFT met polyspecifiek en specifiek conjugaat Farr assay(trinity Biotech) CTD screen 46

47 Methode en materialen CTD screen (EIA) 47

48 Resultaten 1. Performantiekarakteristieken anti-dsdna voor SLE Test principe Test details Sens. Spec. LR+ IIF CLIFT poly conj. 66 % 97 % 25 CLIFT IgG conj. 57 % 99 % 44 RIA Farr (CO 7 IU/mL) 64 % 98 % 32 Farr (CO 10 IU/mL) 55 % 99 % 42 Interpretatie LR+ LR- Geen verschil tussen pre- en post-test probabiliteit (test heeft geen klinisch nut) 1 1 Klein verschil (zelden klinisch significant) Klein verschil dat relevant kan zijn in een specifieke situatie (test is niet bruikbaar) Bescheiden maar substantieel klinisch verschil (test is bruikbaar) Vaak een klinisch significant verschil >10 <0.1 48

49 Resultaten 2. Likelihoodratio s voor test combinaties Oorspronkelijk algoritme LR for SLE CLIFT poly (+) and CLIFT IgG(+) 43,70 CLIFT poly (+) and CLIFT IgG(-) 7,00 CLIFT poly (-) and CLIFT IgG(-) 0,35 CLIFT poly (-) and CLIFT IgG(+) nvt sensitiviteit: 57% specificiteit: 99% Nieuw algoritme: CLIFT poly Farr LR for SLE CLIFT poly (+) Farr (CO 7-10) (+) CLIFT poly (+) Farr (CO 7-10) (-) 2,63-4,38 CLIFT poly (-) Farr (CO 7-10) (-) 0,31-0,35 CLIFT poly (-) Farr (CO 7-10) (+) 2,33-0,00 sensitiviteit: 59% -55% (CO 7-10IU/ml) specificiteit: 100% 49

50 Resultaten 3. Reagenskost bij cascade testing Oorspronkelijk algoritme: CLIFT IgGin cascade na CLIFT poly= 3,3/staal Nieuw algoritme: Farrin cascade na CLIFT poly= 4,5/staal NB.: Farrop állestalen = 9/staal 50

51 Resultaten 4. CTD als screeningstest? Negatief STOP positief Anti-dsDNA met CTD screen positief CLIFT poly Farr 51

52 Resultaten Test sensitiviteit specificiteit CLIFT poly conj. 66 % 97 % Farr (c/o 10 IU/mL) 55 % 99 % CTD 77 % 57% CTD algoritme CTD (+) CLIFT poly (+) Farr (c/o 7) (+) CTD (+) CLIFT poly (+) Farr (c/o 10) (+) LR for SLE Sensitiviteit CTD algoritme Farr (7 IU/ml): 48% Farr (10 IU/ml): 46% Sensitiviteit nieuw algoritme Farr (7 IU/ml): 59% Farr (10 IU/ml): 55% 52

53 Resultaten CTD CLIFT poly Farr Diagnose = SLE CTD-screen Totaal CLIFT poly Totaal

54 Resultaten CTD-maarCLIFT poly + Farr? staal 71: Farr 5.48 IU/mL CTD: 0.1 staal 163: Farr 8.31 IU/mL CTD: 0.2 staal 91: Farr10.65IU/mL CTD: 0.4 staal 116: Farr IU/mL CTD: 0.2 staal 192: Farr 43.7 IU/mL CTD: 0.6 staal 32: Farr IU/mL CTD:

55 Nieuwe situatie UZGent Aanvraag dsdna As CLIFT Poly - Praktisch Aanvraagformulier: dsdna As CLIFT poly 2x/week Farr 1x/maand (optimale batch analyse + stabiliteit reagentia) CLIFT IgGspec bij Dx urgenties STOP + Farr Resultaat (IU/ml) Interpretatie 0-7 negatief 7-10 twijfelachtig > 10 positief 55

57 Bepaling van anti-dsdnabelangrijk in de Dxen FU SLE Grote uitdaging omwille van het verschil in relevante en minder relevante anti-dnaantistoffen (aviditeit, IgG, IgM, IgA) assay variabiliteit ondanks internationale standaardisatie EIA in routine laboratoria: kwantitatief én automatiseerbaar! Grote variatie in performantiekarakteristieken! Farr assay Meest performant, kwantitatief, maar arbeidsintensief Beperkt tot laboratoria met RIA erkenning Terugbetalingscriteria Belimumab Kwantitatieve bepaling van anti-dsdna vereist Haalbaarheid van RIZIV criterium afhankelijk van de gebruikte assay Geen directe extrapolatie van criterium dsdnaas (CO 30 IU/ml) voor serologisch actieve SLE naar dagdagelijkse praktijk mogelijk Artsen zijn hier niet gelukkig mee - criterium staat ter discussie! 57

58 BEDANKT! Apr. Biol. Carolien Bonroy ASO Charlotte Verfaillie Prof. F. Dekeyser MLT s labo niet-infectieuze serologie Annette Virgie Vicky

59 Vragen? 59