Typering RhD/andere erytrocytenantigenen. Serologische bepaling vs moleculaire diagnostiek : Indicaties en strategie.

Transcriptie

1 Typering RhD/andere erytrocytenantigenen. Serologische bepaling vs moleculaire diagnostiek : Indicaties en strategie. Voorstelling van Casussen Vicky Van Sandt, moleculaire biologie Dr. A. Vanhonsebrouck, Immunohematologie

2 I. Rh D Inleiding Serologische bepaling- zwakke D/dubieuze D Moleculaire bepaling bij dubieuze D Huidige strategie -overzicht workflow -overzicht aanvragen Voorstel nieuwe strategie -richtlijnen -aanvraagpad moleculaire Rh D bij dubieuze serologie -kostprijs Inhoud

3 Inhoud II. Andere erytrocytenantigenen Serologische bepaling Moleculaire bepaling Huidige strategie Voorstel nieuwe strategie -richtlijnen -aanvraagpad serologie vs moleculair : testen -kostprijs III. Toekomst moleculaire bepalingen? VOORSTEL WERKGROEP NOMENCLATUUR KLINISCHE BIOLOGIE - RIZIV

4 Rh of Resus bloedgroepsysteem : 2 belangrijkste (na ABO) Belangrijkste antigeen is D: meest immunogeen -Rh pos (D pos) : 85 % (D aanwezig) -Rh neg (D neg) : 15 % (D afwezig : d antigeen) Rh D incompatibiliteit dwz Rh pos aan Rh neg -anti-d vorming (20-30 %) -antistof : risico op ernstige HTR - ernstige HDN -risicopopulatie : jonge vrouw < 50 j, personen met anti-d 4 bijk. Belangrijke antigenen : C,c,E,e (rhesusondergroepen) Rh systeem (D/CcEe) complex, heel polymorf serologisch : 50 antigenen Resus bloedgroep Inleiding moleculair : Rh D : ongeveer 200 allelen, Rh CE : 50 allelen Correcte bepaling RH D is van het grootste belang

5 Rh D INLEIDING SEROLOGIE

6 Enquête ivm serologische bepaling-moleculaire bepaling Resus D - Wie voert Rh D bepaling uit met 2 reagentia igv manuele methode? (backup automaat igv uitval LIS) - Wie voert Du test uit bij patiënten (niet neonati)? - Wie maakt gebruik van D reagentia die DVI variant wel opsporen? - Wie stuurt zwakke D door? voor mannen? vrouwen (vruchtbare leeftijd?) Moleculaire typering membraanantigenen - Wie stuurt door? Wat zijn indicaties?

7 Rh D serologische bepaling PRINCIPE : agglutinatie RBC met anti-d antisera Rh D pos : duidelijke pos reactie ( 3 + / nieuwe strategie> 3+) (2 x bepaald met zelfde of ander antisera) -techniek : tube of kolomagglutinatie -reagentia/fase : vroeger : polyclonaal (IgG) Du test (IAT) : patiënten NVT! (term Du:obsoleet) nu : monoclonaal (IgM),sterkere reacties (meeste zwakke D/partiële D : zwak +) monoclonaal IgM anti-d : mist DVI epit. - zwakke D serologisch : : Rh D pos/rh D Neg?

8 Zwakke D opsporen (Du test)- Donoren Directe Agglutinatie (IS = immediate spin) Pt s RBC Anti-D- IgG IS D- IAT / Zwakke D (Du) Incubeer 37C, Was, Voeg Anti-IgG reagens I.S. (-) Rapporteer D- + Rapporteer D+ D+

9 Zwakke serologische reactiviteit 3 mechanismen 1. Zwak D allel : verminderde D expressie 2. Partiële D (D mozaiëk): ontbrekende epitopen 3. Positie-effect : C in transpositie tov D

10 1. Verminderde expressie: zwak D allel RBC met normale D antigeendensiteit Zwakke D allel: normaal D Ag, Verminderde D antigeen densiteit (kwantitatief) Meestal geen risico op allo-immunisatie; status meestal Rh D pos Beleid : transfusie Rh D pos, geen Rhogamprofylaxie

11 2. Ontbrekende epitopen: partiële D D antigeen is samengesteld uit epitopen (mozaiëk) Partiële D : mist epitopen (kwalitatief) CAVE! Igv transfusie met D pos : productie van anti-d alloantistof tov ontbrekende epitoop Ontbrekend deel RBC RBC risico op allo-immunisatie! : patiënt Rh D neg Beleid : Transfusie Rh D neg, Rhogamprofylaxie

12 3. Positie Effect (Ceppelini effect) C in trans positie to D: (R,r ) : freq.0,05 % (R1,r ) : freq.0,8 % (R2,r ) : freq. 0,3 % D c e / d C e D C e / d C e D ce / d C e C in cis position to D: D C e / d c e Zwakke D serologisch GEEN zwakke D BELEID : RH D POS

13 Rh D serologische bepaling Richtlijn CBO, 2011 Evidentie PATIENTEN : één anti-rh D reagens (DVI mist) igv DVI : beschouwen als D neg owv risico op HDN niet opsporen zwakke D dmv IAT (cave DAT+) NEONATUS : wel opsporen zwakke D /variant DVI in het kader van Rhogamprofylaxie BCSH,2012 PATIENTEN : monoclonale anti-igm anti-d (mist DVI) Automaat : 1 x bepalen Manueel 2 x (1 of 2 reagentia = aff. om discrepanties <) -geen confirmatietest owv sterke monoclonale (cave DAT+) NEONATUS: geen DVI opsporen! owv zz risico op immunisatie owv meer risico op verkeerd reagens in routine

14 Serologisch zwakke RhD/ dubieuze Rh D Richtlijn BCSH Historically; it has been accepted that patients with -weak D cannot make anti-d : treated as D pos -partial D can make anti-d : treated as D neg Evidence from molecular testing suggests that this is not the case and some individuals with weak D have made anti-d. Nut van genotypering bij zwakke D! Daniels 2013, BJH, 161, review Molecular testing for weak D types 1-3 should be made as widely available as possible.

15 Rh D serologische bepaling Reagentia anti-d DIVERS! Cave interpretatie!! -polyclonale reagentia : gericht tegen mengsel epitopen -monoclonale reagentia : gericht tegen 1 epitoop D variant : polyclonaal reagens: + vs monoclonaal reagens : - -reagentia die D VI - (patiënten) of DVI+ (donoren/neonati) -meeste reagentia : mengsel (Blend)(mengsel monoclon.anti-igm s of anti-igm+anti-igg) reageert met meeste zwakke D s partiële D s, zwakke R.

16 Rh D serologische bepaling DETERMINATIE van D status DONOREN : D neg : confirmatie IAT fase zwakke D, partiële D:labeling als Rh D pos PATIENTEN : -D neg :geen IAT fase vereist (cave DAT+) beschouw patiënt als Rh D neg - reagentia : monoclon anti-d IgM (mist DVI) NEONATUS : opsporen van zwakke D,DVI (Rhogamprofylaxie) (niet volgens BCSH) SEROLOGIE : geen onderscheid tussen D zwak en D partieel? beschouwen als Rh D pos of Rh D neg?

17 Serologische Rh D bepaling: reagentia bij PATIENTEN NEONATUS

18 Serologisch zwakke RhD/ dubieuze Rh D Discrepante laboresultaten verwarring bij artsen, geloofwaardigheid labo? Beschouwen als Rh D neg? -Rh D neg bloed:zz -meeste zwakke D s:geen allo-immunisatie -Rhogam : niet onnodig toedienen Beschouwen als Rh D pos? -partiële D : wel allo-immunisatie(hdn) -vanaf welke reactiesterkte? 1 +?? OPLOSSING : DvB : GENOTYPERING Rh D

19 Rh D genetische basis SEROLOGIE MOLECULAIR 2 genen : RhD gen en RhCE gen: sterke homologie, 10 exonen,

20 Rh D CE genetische basis Sterke homologie met CE gen 10 exonen 6 Extracellulaire epitopen 12 transmembranaire lussen Intracellulair deel

21 RH HAPLOTYPE : Gen RHD +RHCE Nomenclatuur Wiener haplotype Caucas. B Zwarte B. R1 DCe 42 % 17 % R2 DcE 14 % 11 % R Dce 4 % 44 % r /ce 37 % 26 % Voorbeeld Fenotype % Afgeleid genotype DCcee 34 % R1r ccdee 2 % R r of R R (zwarte B.) Associatie met zwakke D en variant D

22 GENETICA BLOEDGROEPVARIATIE (polymorfisme) mechanismen Homologie met nabijheid RHCE gen : diversiteit Rh D allelen -SNP : Single Nucleotide Polymorfisme (puntmutatie) 1 nucleotide (basepaar) verschil in Ag determinant (AZ) (Rh D zwak,andere bloedgroepantigenen) -genconversie /cross over uitwisseling exonen tussen 2 genen met vorming van hybride gen = PRINCIPE voor sommige vormen Rh D partieel - deleties vb. D el :heel zwakke vorm (enkel fixatie-elutie) Azië : tgv deletie exon 9 (10-30 % Azië, 0,027 % Europa)

23 Moleculaire techniek : SSP (Sequentie Specifieke Primers) SSP : primers specifiek voor SNP

24 RhD varianten ZWAKKE D s Verzwakte serologie door veranderingen intramembranair of intracellulair: Afhankelijk van de positie en aard van de AZ substitutie KAN dit een impact hebben op de extracellulaire presentatie van de D eptitopen. PARTIELE D s Verzwakte serologie door extracellulaire epitopen die ontbreken of veranderd zijn. celmembraan Rode bloedcel

25 Zwakke D : moleculaire basis SNP D el : Azië : deletie Rh D gen (exon 9)

26 Rh D moleculaire bepaling : Zwakke D ZWAKKE D Frequentie : 0,5-1 % Cauc. bevolking Geen correlatie SEROL.reactie (Ag densiteit) en type MOLEC. Correlatie met Rh ondergroepen - Type 1 R1r (D+C+E-c+e+) - Type 2 R2r (D+C-E+c+e+) - Type 3 zz % geen anti-d RH D POS - Type 4.0, 4.1?? - Type 4.2, 5, 11, 15, 19, 20 productie anti-d igv D+ RBC RH D NEG D el

27 DII tot DVII (+ subtypes) DAR, DBT,DNB,DHAR Frequentie : DVI:0,02-0,05 %, andere types :0,002 % -Cauc. Bevolk. DVI :casus fatale HDN -Bep. types geass. Afrik. bevolking Correlatie met Rh ondergroepen R R (ccd.ee) vb. DIIIa -SEROLOGIE : reageert pos met meeste anti-d (sterk tot zwak afh. type) -soms detectie enkel igv anti-d - Rh D moleculaire bepaling : partiële D RH D NEG - SNP : tgv mutaties extracellulair - hybriden : uitwisseling tussen RHDgen-CE gen

28 Rh D partieel : hybride vormen RhD gen CE gen Afrik.bevolk

29 RH D partieel Rh D partieel Moleculaire basis Ras Serologie Freq DII SNP Caucasisch DIIIa 3 SNP Zwarte Bevolking Sterke expressie DIVa 3 SNP Zwarte Bevolking Sterke expressie DIVb Hybrid gen RhD-CE-D Caucasisch,Japan 1/ DV Hybrid gen RhD-CE-D Cauc,Zwart,Japan 1/30000 DVI : type1/2/3/4 Hybrid gen RhD-CE-D Cauc, Japan Type I : weinig Ag 1/6800 DVII 1 SNP Caucasisch 1/900 DFR Hybrid gen RhD-CE-D Caucasisch 1/60000 DBT : type1/2 Hybrid gen RhD-CE-D Cauc/Japan/Zwart DHAR /Ro HAR Hybrid gen RhD-CE-D (1exonD) DAR (4.2 w) 3SNP Zwarte Bevolking Caucasisch Enzymefase>IAT <1/60000

30 Titer Type RhD Alternatieve benaming allo 1:64 D cat Va (Hus.) RHD-CE(5)-D allo 1:1 DAU-3 RHD(V279M,T379M) allo 1:1 DAU-4 RHD(E233K,T379M) 1:04 DDE RHD(D40E) allo 1:32 DFL RHD(Y165C) allo 1:1 DHMi RHD(T283I) allo 1:16 D III type IV RHD (L62F,A137V,N152T) allo 1:16 DIIIc RHD-CE(3)-Dc allo 1:8 D IIIc RHD-CE(3)-D allo 1:16 D IIIc RHD-CE(3)-D allo 1:256 D IV pending allo 1:8 DIV type 5 RHD-CE(7-9)-D allo 1:1 D IV type III RHD-CE(6-9)-D allo 1:2 D IV type III RHD-CE(6-9)-D allo 1:8 D IV type III RHD-CE(6-9)-D allo 1:4 D IV type IV RHD-CE(7:D350H-A354N)-D allo 1:256 D IV type IV RHD-CE(7:D350H-A354N)-D allo 1:1 D IV type IV RHD-CE(7:D350H-A354N)-D allo 1:128 D IV type IV RHD-CE(7:D350H-A354N)-D allo 1:8 DIV type IV RHD-CE(7:D350H-A354N)-D allo 1:16 DIVa-2 RHD(L62F, N152T, D350H) allo 1:2 D IVb RHD-CE(7-9)-D allo 1:4 DMI RHD(M170I) allo 1:128 DNB RHD(G355S) allo 1:32 DNB RHD(G355S) allo 1:16 DNB RHD(G355S) allo 1:32 DNB RHD(G355S) allo 1:4 DNB RHD(G355S) allo 1:8 DNB RHD(G355S) allo 1:8 DNB RHD(G355S) allo 1:1 DNB RHD(G355S) allo <1:1 DNB RHD(G355S) allo 1:128 DOL/Cde S RHD(M170T,F223V), CdeS Titer Type RhD Alternatieve benaming allo 1:64 DV type 7 RHD-CE(5:F223V-G263R)-D allo 1:64 DVI type 2 RHD-Ce(4-6)-D (exon scanning) allo 1:8 DVI type 2 RHD-Ce(4-6)-D (exon scanning) allo 1:4 DVI type 2 RHD-Ce(4-6)-D (exon scanning) 1:01 D VI type I RHD-cE(4-5)-D (exon scanning) allo 1:2 D VI type I RHD-cE(4-5)-D (exon scanning) allo 1:4 D VI type I RHD-cE(4-5)-D (exon scanning) allo 1:8 D VI type II RHD-Ce(4-6)-D (exon scanning) allo 1:8 D VI type II RHD-Ce(4-6)-D (exon scanning) allo 1:32000 D VI type II RHD-Ce(4-6)-D (exon scanning) allo 1:1 D VI type II RHD-Ce(4-6)-D (exon scanning) allo 1:128 D VI type III RHD-Ce(3-6)-D (exon scanning) allo 1:32 D VI type III RHD-Ce(3-6)-D (exon scanning) allo <1:1 D VII RHD(L110P) allo 1:2 D VII RHD(L110P) allo 1:2 D VII RHD(L110P) allo 1:1 D VII RHD(L110P) allo titer not reported R Har 0 RHCE-D(5)-CE allo 1:32 R Har 0 RHCE-D(5)-CE allo 1:16 R Har 0 RHCE-D(5)-CE allo 1:32 R Har 0 RHCE-D(5)-CE allo 1:4 R Har 0 RHCE-D(5)-CE allo 1:2 R Har 0 RHCE-D(5)-CE allo 1:16 R Har 0 RHCE-D(5)-CE allo 1:256 R Har 0 RHCE-D(5)-CE allo <1:1 R Har 0 RHCE-D(5)-CE allo 1:4 R Har 0 RHCE-D(5)-CE allo 1:256 weak D type 11 RHD(M295I) in CDe haplotype allo 1:1 weak D type 15 RHD(G282D) allo 1:128 weak D type RHD(T201R,F223V,I342T) allo 1:64 weak D type 4.2.3/RHDPsi RHD(T201R,F223V,I342T) RHDPsi

31 Zwarte B. Zwarte/Blanke B Anti-D productie bij partiële D Human Blood Groups (Second Edition Daniels 2007)

32 D VARIANT : INDELING ZWAKKE D PARTIELE D Serologisch Moleculair Transfusiebeleid/Rhogam PATIENT KWANTITATIEF (Ag densiteit <) intramembranair of intracellulair vaak SNP TYPE 1, 2, 3 (zz) Rh D positief KWALITATIEF (Ag densiteit < of =) -ontbrekende epitopen -nieuwe epitopen (hybride vorm) extracellulair SNP, ook hybride CE-D PARTIELE D cave donor Rh D positief Rh D positief Transfusiebeleid/Rhogam cave donor Beleid D variant (zwakke D/partiële D) (igv confirmatie moleculair) NIET TYPE 1,2, 3 (vb. type 11,15, ) Rh D negatief Rh D positief Rh D neg(owv evt. allo-anti-d prod)

33 Huidige strategie Rh D genotypering bij dubieuze Rh D 2006 opstart van moleculaire D genotypering zwakkere reactiesterkte < 3+ of interlabodiscrepanties -anti-d positief bij Rh D pos patiënten -zowel bij mannen als vrouwen < 50 of > 50 j -ook serologie : ABO/D : D met 2 antisera/ CcEe -geen RIZIV nomenclatuur, gratis -RIZIV : ABO/D, CcEe opsporen van een zwak RH1 fenotype B 125 (= 4,02 ) Diagnose 23 : igv RhD neg zwang. vrouwen en pasgeborenen van RhD neg moeders -DvB investeringen uitgevoerd, expertise opgebouwd : nieuw voorstel owv financieel zware kostprijs

34 Werkgroep moleculaire biologie Projectgroep immunohematologie en moleculaire biologie voor beleid Rh D en erytrocytenantigenen Leden : Molec. Biologie: Dr. M.P Emonds, Dr. Ap. K. Deiteren, Vicky Van Sandt Immunohematologie : Dr. K. De Vreese, Dr. A. Vanhonsebrouck Analyse resultaten en data Voorstel nieuwe strategie

35 Workflow moleculaire RhD STAP 1: Weak D type BAGene Geen resultaat Zwakke D positief STAP 2: Partial D type BAGene RhD pos (type 1, 2, 3) RhD neg (nt type 1, 2, 3) Partiële D positief RhD negatief onbepaald RhD positief RhD neg RhDpos

36 Zwakke D : STAP 1 dmv BAGene (Techniek SSP) DNA amplificatie pos (4en 5) SNP mutatie thv 4en 5 is aanwezig

37 % STAP 1: Weak D type BAGene ,2 16,5 47,0 31,0 DvB= 785 1,0 DvB= 785 2,0 3,0 0,2 0,1 type 15 type 5 type 4.2, DAR tye 4.0, 4.1 type 3 type 2 type 1 geen identificatie NI Stap 2 : 16,5 % (n= 131) RhD pos: 79% RhD neg: 4,5%

38 Partiële D Stap II : BAGene (techniek SSP) Dpos Dneg D HAR DNA amplificatie aanwezig:rhd epitoop aanwezig DNA amplificatie afwezig: RhD epitoop afwezig

39 % STAP 2: Partial D type BAGene (10 % D POS STAP 1) 60,0 DvB (n=131) : 16, 5 % in STAP (3 % D neg stap I) 17,0 D VARIANT 22 % ( 3,5 % D NEG bij STAP 1) ,0 1,0 1,0 3,0 2,0 2,0 1,0 3,0 1,0 1,0 1,0 6,0 onbepaald Partiële RHD-CE(2-9)-D Partiële RHD-CE(3-7)-D Partiële RHCE-D(5)-CE Partiële D DFR, D psi Partiële D DBT type 1 Partiële D DAU Partiële D cat VII Partiële D cat VI type 3 Partiële D cat VI type 2 Partiële D cat VI type 1 Partiële D cat II D pos D neg niet uitgevoerd

40 Eindresultaat na Stap 2 Rh D pos : 88,8 % RhD neg: 11,2 %

41 (deels): partiële D

42 Associatie met Rh ondergroepen Fenotype Ccee (R1r) n % n D pos n D neg n Dzw (T1,2,3) D part % Type (DAR),DVI, DBT,DFR, DVII, Beleid Rh D pos % Beleid Rh D Neg % 93 % 7 % ccee (R2r) ccee (R R ) ,4 % Type 2 4 Type 5,15 98 % 2 % 45 7,7 % Type 4.0,4.1,4.2(DAR) DHAR, DAU CCee 22 3,8 % zz type 1/3 11 % 89% % 0 % CcEe 8 1,4 % % 0 % ccee 7 1, % 13 % CcEE 1 0, % 0 %

43 Richtlijnen indicatie-populatie uitvoeren Rh D genotypering Richtlijn BCHS, Sanquin, Tijdschrift Bloedtransfusie 2012, vol 5.3 BJH,2013, 161 G. Daniels Review Indicatie en populatie discrepantie ts 2 anti-d reagentia zwakkere reacties D bepaling Risicogroepen : confirmatietest (tijdelijk D neg) -vrouwen < 50 jaar -patiënten die chronische transfusie vereisen Overige : mannen, vrouwen>50 j : geen confirmatietest Deze zwakke D serolog als D pos beschouwen discrepantie tss 2 anti-d reagentia ( 2+ vb.4+/2+) zwakkere reacties D bepaling <2 + (arbitrair) Rh D pos met anti-d : zowel allo als auto-as zwakke reacties anti-d : D+ tenzij Vrouwen < 50 j en chron. Transfusie (tijdelijk D neg) moleculaire biologie uitvoeren (indien mogelijk)

44 Indicatie Populatie Testen EDTA staal Prijs Nieuwe strategie DvB uitvoeren Rh D genotypering DvB Nieuwe strategie 1. zwakkere reacties D bepaling < 4+ of interlabo discrepanties (geef resultaten mee aub) -vrouwen 50 jaar -patiënten met chronische transfusie (Hb pathiën) mannen, vrouwen>50 j igv (1) : Rh D pos beschouwen (cfr. Richtlijn toediening Rh D pos aan Rh D neg) 2. anti-d bij Rh D positieve patiënten De serologische reactiesterkte is geen reflectie van type partiële D, zwakke D; veelal arbitrair bepaald, ifv reagentia < 4+ : owv zwakkere reactiesterkte, weinig 3 + reactie 1. ABO/D serologisch herhalen : 2 anti-d reagentia 2. Resus ondergroepen (CcEe) : correlatie zwakke D/partiële D 3. Moleculaire Rh D typering : cfr. flowdiagram 4. Conclusieresultaat Rh D pos of neg - transfusieadvies Rh D moleculair: 148,87 : best arts/patiënt inlichten (ABO/D en CcEe : conform RIZIV onderaanneming)

45 Vanaf welke reactiesterkte? -geen correlatie tussen serologie ( reagentia) en moleculaire bepaling -procedure INTS : nationaal referentiecentrum Frankrijk indien < 4+ Noizat-Pirenne et al,transfusion,2007, 47:

46 Vanaf welke reactiesterkte? < 4+ Transfusion, vol 51, Dec 2011, Bach-Nga Pham Expressie zwakke D type 1,2 : VARIATIE! (0-4+) onderscheid met variant serologisch niet mogelijk Aanbeveling : moleculaire analyse igv verminderde expressie ongeacht reactiesterkte Rh D zwak Type 1 Rh D zwak Type 2 WVTV 30 april en 30 mei 2013

47 ALGORITME Dubieuze RhD zwakke D Doelgroep: - vrouwen < 50 jaar - chronische transfusies Indicatie: Afwijkende serologie: - Rh D < 4+ - discrepante Rh D typering - aanwezigheid van anti-d Serologie: - herhaling Rh D manueel dmv 2 verschillende monocl. anti-d (mist D VI) - bepaling Rh ondergroepen: C, c, E, e Moleculair: STAP 1: Opsporen zwakke D Zwakke D positief Geen resultaat Zwakke D Type 1, 2, 3 Zwakke D Niet type 1, 2, 3 STAP 2: Opsporen partiële/hybride D Correlatie serologie OK Correlatie Serologie NOK Rh D neg Rh D pos Rh D Partieel/ hybride Rh D pos Rh D neg Rh D neg Rh D neg Rh D pos Rh D neg Transfusie advies Rapportering: meest frequente situatie

48 KKN ( 1978, ) Zwanger Serologische bevindingen: Reactie met anti-d reagens: 2+ Rhesus ondergroepen: C-E-c+e+ Onregelmatige antistoffen: 1/3 cellen positief Anti-D met titer 1:1 Casus RhD Moleculaire RHD bepaling

49 Casus RhD KKN ( 1978, ) STAP 1 Zwakke D test: Zwakke D: type 4.0, 4.1

50 KKN ( 1978, ) Zwakke D: type 4.0, 4.1 Type 4.0 > Nucleotide changes relative to standard RHD :» 602 C>G, 667 T>G, 819 G>A (weak D type 4.0)» 602 C>G, 667 T>G (weak D type 4.0.1) > Amino acid changes relative to standard RhD :» Thr to Arg at codon 201, Phe to Val at codon 223 (T201R, F223V) > Additional comments: Possible allo-anti-d repeatedly observed? Type 4.1 > Nucleotide changes relative to standard RHD :» 48 G>C, 602 C>G, 667 T>G, 819 G>A > Amino acid changes relative to standard RhD : Casus RhD» Trp to Cys at codon 16, Thr to Arg at codon 201, Phe to Val at codon 223 (W16C, T201R, F223V) > Additional comments: No allo-anti-d documented to date Verklaring allo anti-d? Door zwakke D 4.0/4.1 mutatie op zich of door bijkomende onderliggende mutaties? VERHAAL KLOPT NIET: Verder partieel typeren.

51 Casus RhD KKN ( 1978, ) Partiële D: - Ontbrekende amplificatie wel 3 - Zeer zwakke amplificatie wel 2: niet optimale primer binding door mutatie of amplificatie variatie?

52 Casus RhD Reactie 3 ontbreekt: DIIIa Haplotype: cde Nucleotide changes relative to standard RHD : 455 A>C, 602 C>G, 667 T>G (all templated) Amino acid changes relative to standard RhD : N152T, T201R, F223V Distribution and frequency: Possibly frequent in some populations with African ancestry. DIIIc Haplotype: Cde Nucleotide changes relative to standard RHD : 361 T>A, 380 T>C, 383 A>G, 455 A>C (contiguous stretch of RHCE-like nucleotides) Amino acid changes relative to standard RhD : L121M, V127A, D128G, N152T Additional comments: Anti-D immunizations repeatedly observed DIII type 4 Haplotype: CDe Nucleotide changes relative to standard RHD : 186 G>T,410 C>T, 455 A>C (templated) Amino acid changes relative to standard RhD : L62F,A137V,N152T Distribution and frequency: Single observation known Additional comments: Anti-D immunization observed

53 Casus RhD Reactie 2 = zwak DIIIb like variant? Haplotype? Nucleotide changes relative to standard RHD : > 150 T>C, 178 A>C, 201 G>A, 203 G>A, 307 T>C (contiguous stretch of RHCE-like nucleotides) Amino acid changes relative to standard RhD : > I60L, S68N, S103 3 variaties op 1 allel? vermoedelijk wel (rationale: zo niet zouden de ontbrekende epitopen in allel 2 gecompenseerd worden door deze aanwezig in allel 1: en dus zou allel 2 (partiële D) niet zichtbaar zijn).

54 Casus RhD KKN ( 1978, ) Zygositeit: heterozygoot Dd De 3 variaties liggen op hetzelfde allel: New variant! TA: D NEG

55 Besluit : Casus RhD = combinatie van serologische en van moleculaire data Het verhaal moet kloppen: Zeer zwakke serologie (tot 1+) is zelfs bij afwezigheid van zwakke D of partiële D mutaties uit veiligheid: Transfusieadvies D NEG Rh systeem = zeer polymorf!! Onbekende mutaties, risico op immunisatie Toekomst = sequencing

56 II. Bepaling andere erytrocytenantigenen

57 Methode Directe methode Indirecte methode Antisera monoclonale anti-igm Anti-IgG antisera Techniek Tubetechniek Kolomagglutinatie Fase Bloedgroepantigenen C,c,E,e/Jka,Jkb/MNS/ K Lea,Leb/P1/Cw/A1 IAT fase : Liss-Coombskaart Fya,Fyb/ s/ k Kpa,Kpb/Lua,Lub,Wra,Cha Controles Pos en Neg controle/ antigeen Pos en Neg controle/antigeen! DAT Interferentie Opmerking : in groene kleur klinisch belangrijke antigenen Recente transfusie (donorrbc) Serologische bepaling andere erytrocytenantigenen Recente transfusie (donor RBC) Vals positief igv -DAT + (IAT fase) vb. AIHA : auto-antistoffen

58 Serologische bepaling RBC antigenen Directe methode Indirecte methode : antiglobulinereagens Interferentie ivg DAT +

59 Moleculaire bepaling RBC antigenen DNA gebaseerde testen: EDTA volbloed owv bloedgroepen genetisch bepaald Voordelen vs serologie -geen vers bloed nodig -geen invloed transfusie -geen interferentie DAT+ -igv auto-antistoffen -igv multipele antistoffen geen DNA wel DNA

60 Moleculaire bloedgroepvariatie : SNP BG polymorfisme Nucleotidesubsitutie AZ substitutie Rh E/e C 676 G Pro 226 Ala Rh C/c 6 SNP s 4 AZ subsituties K/k T698C Met 193 Thr Fya/Fyb G125A Gly42 Asp Jka/Jkb G838A Asp 280 Asn S/s T143C Met29Thr M/N C59T,G71A,T72g Ser20Leu/Gly24Glu Lua/Lub A252G His77Arg.... Techniek bepaling : opsporen dmv PCR met allellspecifieke primers voor elk bloedgroepsysteem -SSP : Sequence Specifieke primers (agarose EF techniek) -SSO : Sequence Specifieke Oligo nucleotide probes dmv beads (Luminex)

61 Technieken: SSP PCR reactie VOLBLOED DNA Detectie : Electroforese K M S Fya Jka E C neg pos neg pos pos pos neg neg SSP dmv allelspecifieke primers pos pos pos pos pos pos pos neg k N s Fyb Jkb e c NC

62 SSO: LUMINEX Iedere bead heeft een eigen kleur identiteit Iedere bead heeft een specifieke probe (SNP) 1) PCR amplificatie target met label 2) Hybridisatie met de beads EN 3) Analyse LUMINEX Bead identificatie Bead reactiviteit

63 SSP versus SSO SSP (home made) SSO (commercieel) Kell K, k, K, k, Jsa, Jsb, Kpa, Kpb, Kpc MNS M, N, S, s M, N, S, s, S-s-Uvar Kidd Jka, Jkb Jka, Jkb, Jk (Finnish null) Duffy Fya, Fyb Fya, Fyb, Fyx (a-b weak), FyGATAsil Rhesus E, e, C, c E, e, C, c Technieken URGENTIE : SSP (STAT panel van membraanantigenen) erna SSO : panel + bijkomende mutaties Rapportering van serologie SSP en SSO en fenotype conclusieresultaat ROUTINE : SSO (panel van membraanantigenen) Rapportering van serologie en SSO en fenotype conclusieresultaat

64 Voorbeeld van protocol (SSO) Fy GATA = discordantie tussen serologie /moleculaire bepaling

65 Duffy bloedgroep Afrikaanse bevolking Fy a-,fyb- Vb. Moleculair : Fya -, Fyb+ : discordantie met serologie : Fya-,Fyb- FY*1/*2 125 G > A (Asp 42Gly) Promotor Ex 1 Ex 2 GATA-1 mutatie : erytroid specifiek FY*O : 67 T > C 265 C>T FY*X SSP techniek : 1 SNP thv exon 2 opsporen : 125 G > A voor Fya/Fyb:Fya-,Fyb+ SSO techniek : ook FY*X : zwakke expressie ook FY*O : mutatie thv promotorregio :FyGATA -geen transcriptie thv RBC van Fyb, wel expressie Fyb weefsels -maken geen anti-fyb, wel anti-fya -TRANSFUSIEADVIES(TA): enkel Fya-, wordt beschouwd als Fyb+

66 RIZIV Nomenclatuur RBC antigenen Bepalen van andere RBC antigenen (dan ABO/Rh) B150 = 4,82 /antigeen RIZIV nomenclatuur:enkel voor serologische bepaling!!! Geen onderscheid tussen directe-indirecte methode (wel voor 28/09/2009 B100 -B 150) Cumulregel van toepassing : max 16 Diagnoseregel 33: indien het serum van de patiënt -onregelmatige anti-erythrocyten antilichamen bevat -als het met het oog op het enten van een orgaan, beenmerg of hematopoïetische stamcellen -in geval van chronische anemie die veelvuldige transfusies vergt, gespeid over verscheidene maanden

67 Huidige strategie genotypering RBC antigenen Indicatie : preventie van allo-immunisatie 2006 opstart AIHA : genotypering (owv DAT+, vaak recente transfusie) (alternatief : allo-absorptie : lukt niet bij sterke auto-as) - Hemoglobinopathieën (SCD, thalassemie) : genotypering (owv vaak recente transfusie) - allo-as : igv aan. corresponderend antigeen (DD auto vs allo-as) DvB : minder owv preventie allo-immunisatie Tarificatie : tarificatie serologische nomenclatuur (indien ook serologie uitgevoerd : is deze gratis) Ervaring, expertise opgebouwd; financieel niet langer houdbaar

68 Richtlijnen ivm selectie fenocompatibel bloed Richtlijn Indicatie Bloedselectie/typering CBO,2011, Hemoglobinopathie : allo-immunisatie (10-50 %) (SCD, thalassemie) AIHA : alloimmunisatie (30 %) MDS Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, MNS (U) (Fya>Jkb>S> s volgorde) Rhesus,Kell, Kidd, Duffy,Ss volgorde Serologisch : igv geen recente transfusie (Rhesus, Kell, Kidd, S) Moleculair (Duffy, s) Rhesus, K Allo-AS Rhesus, K (daling 71% allo-as) evt. Fya > Jkb > S volg (daling 91 %) BCSH,2012 Sikkelcelanemie (SCD) Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, Ss (U) Thalassemie, MDS, PNH, chron anemie, allo-as Rhesus, Kell USA richtlijnen SCD centers SCD Igv allo-antistoffen ABO/D Limited match : K, C, E (c,e) Extended match : FY,MNS, JK

69 SCD : groot % allo-immunisatie (20-50%) owv Raciale verschillen ts RBC antigenen Ag Zwarte B Cauc. B Ag neg Cauc. B C E C,E,K neg : 19 % K c e Fya en Fya, Jkb,S neg : 0,7 % Fyb Jka Jkb S s 94 89

70 Nieuwe strategie DvB ivm typering erytrocytenantigenen Indicaties Serologie Moleculair 1. Aanwezigheid onregelmatige antistoffen : allo versus auto Aan/afwezigheid corresponderend antigeen (AC+/-) 2. Hemoglobinopathiëën Bij diagnose voor transfusie Guidelines 6M 3. AIHA (Autoimmuunhemolytische anemie,transfusiedependent) NVT Bevestiging aan/afwezigh. C corresponderend antigeen Preventie allo-immunisatie Igv recente transfusie Niet interpreteerbaar resultaat met serologie (vb. DAT+, DP) Owv auto-antistoffen 4. Aplastische anemie Igv recente transfusie Toediening van feno-compatibel bloed ter preventie van allo-immunisatie naast ABO/D ook rhesus Kell, Kidd Duffy, MNS compatibel CcEe, Kk, Jka,Jkb, Fya,Fyb, MNSs = 14 antigenen (SSP) Moleculair : steeds volledige batterij RBC antigenen ingezet!

71 Agendeer topic op transfusiecomité ZH zodat behandelende arts op hoogte is van strategie (indicatie, kostprijs) Nieuwe strategie DvB Igv AIHA met auto-antistoffen en chronische transfusienood is het state of the art om moleculaire bepaling RBC antigenen uit te voeren voor aflevering feno-compatibel bloed om een veilige transfusie en snelle aflevering te verzekeren. Igv zwakke Rh D bij jonge vrouw : nut van Rh D confirmatie - Rhogamprofylaxie - opvolging OAS zwangerschap meer freq. bij Rh D neg, ongerustheid - Rh D neg voorraad - immunisatie Resus Ag vb. CCDzwEe

72 TYPERING VAN MEMBRAANANTIGENEN Indicaties: - Aanwezigheid van onregelmatige antistoffen serologie: - aan/afwezigheid corresponderend antigeen (Autocontrole+/-) onderscheid tussen auto- versus allo-antistoffen moleculair: - bevestiging aan/afwezigheid corresponderend antigeen - Hemoglobinopathiëen (transfusiedependent) serologie: - in geval van geen recente transfusie moleculair: - in geval van recente transfusie - niet interpreteerbaar resultaat (vb. dubbele populatie, RAGT +) - Auto-immuunhemolytische anemie (transfusiedependent) moleculair: - in geval van auto-antistoffen - Aplastische anemie moleculair: - in geval van recente transfusie Serologie C c E e / Jka Jkb / Fya Fyb / M N S s / K k Directe methode (antisera IgM) Indirecte methode (antisera IgG) - resultaat interpreteerbaar - geen recente transfusie - resultaat niet interpreteerbaar owv: - + RAGT bv. Auto-antistoffen (AIHA) - recente transfusie Moleculair Techniek SSP en SSO Rapportering: serologisch C c E e / Jka Jkb / Fya Fyb / M N S s / K k / Kpa Kpb Kpc / Jsa Jsb Conclusieresultaat: - correlatie serologie moleculair (SSP SSO) - commentaar is voorzien i.g.v. discordantie WVTV 30 (bv. mei 2013 Fy systeem GATA box mutatie)

73 III. De balans kostprijs versus RIZIV Jaar Zwakke D Partiële D RBC antigenen Kostprijs 136,01 Budget , 00 > ,00 Voorstel DvB 148,87 187,13 Opstart 2006 tot heden (2013) : -toename van het aantal testen -zware investeringen DvB -geen tarificatie Rh D moleculair : tarificatie zwakke D met lage B waarde -geen tarificatie RBC antigenen moleculair : tarificatie serologie RBC antigenen VANAF 15 mei 2013 : tarificatie genotyperingen : Rh D (148,87 ) en RBC Ag (187,13 ) Opm. vgl Sanquin : molec test/ag = 42,27 x 14 = 591,78

74 III. Voorstel werkgroep nomenclatuur KLIN.BIOLOGIE RIZIV Test B waarde Aantal België Artikel 33 bis (B=0,042 1/3/2013) RBC antigenen moleculair ,00 Zwakke D moleculair ,00 Variant D moleculair ,00 -Indienen via werkgroep nomenclatuur KB gestart in RIZIV vergadering : 29 januari Implementatie tijdstip?

75 III. Voorstel nieuwe RIZIV nomenclatuur : artikel 33 bis Test RBC antigenen moleculair Zwakke D moleculair Variant D moleculair Diagnoseregel Enkel igv chronische transfusienood bij patiënten met auto-antistoffen, congenitale hemolytische aandoeningen, met aplastische anemie of met alloantistoffen na transfusie. Bij serologisch zwakke D -bij vrouwen < 50 j en pediatrische patiënten igv transfusienood, zwangere vrouwen, aandoeningen die chronische transfusies vergen -anti-d bij Rh D positieve patiënten Bij serologisch zwakke D waarbij geen zwakke D kon aangetoond met moleculaire methode.

76 CASUS RBC B., Afrikaanse origine (Guinea) - Zwanger 38w (4 de kind), slecht opgevolgde zwangerschap, status kind onbekend, geen echo s - Medische voorgeschiedenis onbekend - Zwangerschapsdiabetes, sectio gepland Testen IH: Bloedgroep O positief ccee Panels in Coombs volledig positief 3+ tot 4+, negatieve autotest in Coombs. Negatieve directe antiglobulinetest (geen auto-ab) publieke antistof? Serologische typering: S- s- ; Fya- Fyb- Vraag: welk bloed selecteren? WVTV 30 april en 30 mei 2013

77 CASUS RBC B., Afrikaanse origine (Guinea) S-s- Fya-Fyb- S-s- U-/UVAR Fya- FyGATA BASIS SSP = In deze casus ontoereikend WVTV 30 april en 30 mei 2013

78 CASUS RBC B., Afrikaanse origine (Guinea) Fya- FyGATA WVTV 30 april en 30 mei 2013

79 CASUS RBC FY varianten FyA/B 125 G > A (Asp 42Gly) RBC Promotor Ex 1 Ex 2 GATA-1 mutatie = erytroid specifiek FY*O : 67 T > C 265 C>T FY*X SSP techniek : 1 SNP thv exon 2 opsporen : 125 G > A voor Fya/Fyb Fya -, Fyb+ : discordantie met serologie : Fya-,Fyb- SSO techniek : ook FY*X : zwakke expressie, geen immunisatie risico. ook FY*O : mutatie thv promotorregio : GATA-box -geen transcriptie thv RBC van Fyb, wel expressie Fy b weefsels -maken geen anti-fyb, wel anti-fya Transfusie beleid: Fya neg (anti-fya kan HDN veroorzaken) XM nog steeds positief!! WVTV 30 april en 30 mei 2013

80 CASUS RBC Ss - SNP Met29Thr - U= HFA geassocieerd met S/s - S-/s- kan geassocieerd zijn met: - U- - Uvar Beide fenotypes bijna exclusief voorkomend bij Afrikanen. WVTV 30 april en 30 mei 2013 SSP techniek : enkel detectie SNP Ss SSO techniek : detectie UVAR mutaties 230T 5T

81 CASUS RBC B., Afrikaanse origine (Guinea) S-s-U- Fya- FyGATA WVTV 30 april en 30 mei 2013

82 CASUS RBC B., Afrikaanse origine (Guinea) S-s-U- Fya- FyGATA WVTV 30 april en 30 mei 2013

83 CASUS RBC Anti-U Serologische basis anti-u niet duidelijk. Klinische relevantie: -Risico op haemolytische transfusie reactie -Risico HDN Transfusie advies: S-/s- U- Voor deze patiënte noodzaak: WVTV Fya-, 30 april S-/s- en 30 mei U RBC units. = zeer zeldzaam, ingevrozen units

84 Sectio was gepland. Geen S-s- U- Fya- bloed beschikbaar!! Arts werd geïnformeerd: - indien mogelijk bloednoodzaak te vermijden Casus RBC - Baby mogelijk HDN, grondige controle bij geboorte = noodzakelijk. Nauwe samenwerking met transfusie centrum van groot belang voor optimale zorg voor moeder en kind. WVTV 30 april en 30 mei 2013

85 Zeldzame RBC genotypering? Bij ons wel! In centraal/zuidelij Afrika (Guinea)? Fy0 & U- biedt bescherming tegen invasie van de plasmodium merozoieten Natural selection/ survival of the fittest. WVTV 30 april en 30 mei 2013

86 Goodbye serologie? DNA = genotype Agglutinatie = fenotype Kracht ligt in combinatie!

87 INFO Website : Immunohematologie Tests Andere tests Directe antiglobulinetest Koude agglutininen Titer anti-a, anti- B Resus genotypering bij dubieuze serologie Typering RBC membraanantigenen