Identificatie en screening van kandidaatgenen voor aorta aneurysma s

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar Identificatie en screening van kandidaatgenen voor aorta aneurysma s Alexander SCHAUWVLIEGHE Promotor: Prof. Dr. B. Loeys Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUNDE

2 Inhoudstafel Inhoudstafel Inhoudstafel I Voorwoord III Abstract 1 1. Inleiding : Wat zijn aorta aneurysma s? : Epidemiologie 3 1.3: Etiologie : Opbouw bloedvat : Opbouw gladde spiercel : Wat zijn de oorzaken van een aorta aneurysma? 4 1.4: Pathogenese 6 1.5: Classificatie 7 1.6: Kliniek 8 1.7: Diagnose 8 1.8: Evolutie 9 1.9: Behandeling : Behandeling van risicofactoren : Medische behandeling : Chirurgische behandeling : Methode : Aorta ascendens aneurysma s: : Booganeurysma s : Endovasculaire stenting : Wanneer opereren? : Asymptomatische patiënten : Symptomatische patiënten : Seriële beeldvorming : Embryologie Marterialen en Methoden : Literatuuronderzoek : Werkwijze : Gebruikte labotechnieken : Polymerase Chain Reaction (PCR) : Principe : Touch-Down PCR : Elementen mastermix : PCR-toestel 17 I

3 Inhoudstafel 2.3.2: Agarosegelelektroforese : Principe : Protocol : Sequencing : Principe : Analyse : Koppelingsonderzoek : Wat is koppelingsonderzoek? : Lod-score : Mastermix : Protocol : Analyse : Doelstelling Resultaten : Resultaten literatuuronderzoek : Genetische syndromen die voorbeschikken tot type A aorta dissecties : Marfan Syndroom : Loeys-Dietz syndroom (LDS) : Ehlers-Danlos syndroom : Cutis laxa : Arterieel tortuositas syndroom (ATS) : Turner syndroom : Noonan syndroom : Filamine A mutaties : Niet-syndromale familiale thoracale aorta aneurysma s en dissecties : Patente ductus arteriosus met thoracale aorta aneurysma s (MYH11 mutaties) : Mutaties in het gladde spiercel α-actine en thoracale aorta aneurysma s : TGF-β receptor mutaties leidend tot familiale niet-syndromale aorta aneurysma s : Bicuspide aortaklep in associatie met thoracale aorta aneurysma s : Andere loci geassocieerd aan familiale niet-syndromale aorta aneurysma s : Koppelingsonderzoek : Calponine : Werking gladde spiercel : Structuur calponine : Functie calponine : resultaten calponine : Optimalisatie primers 46 Exon 1,2,4,5,6,7 46 Exon : Resultaten analyse Discussie Referentielijst Bijlage 62 II

4 Voorwoord Voorwoord Graag zou ik mijn promotor Prof. dr. B. Loeys willen bedanken voor zijn permanente beschikbaarheid ondanks zijn drukke agenda. Machteld Baetens en Hendrik Van de Voorde die steeds bereid waren me met hun expertise verder te helpen wanneer er ergens vragen rezen. Karen Wettinck, Petra Van Acker, Charlotte Opsomer, Lynn Demuynck, Delfien Syx en Joris S Heeren en vele anderen, werkzaam in het MRB, die me hielpen als er zich technische moeilijkheden stelden. Ook zou ik papa, mama, mijn zus Ann-Sofie en mijn broer Pieter-Paul en zijn vrouw Leen willen bedanken voor hun steun. Sofie Gossé en Elisabeth De Mont voor de gezellige momenten en gesprekken tijdens de julimaand. Mijn vrienden en mijn vriendin, lotgenoten, wil ik bedanken omdat we elkaar zo goed begrepen in ons gemeenschappelijk gezaag. Bovendien zou ik ook prof. Paul Coucke willen danken, supervisor van het labo medische genetica. III

5 Abstract Abstract Inleiding: Aorta aneurysma s zijn verantwoordelijk voor één à twee percent van de mortaliteit in de Westerse wereld. Ze worden onderverdeeld in abdominale en thoracale aorta aneurysma s. Daar waar abdominale aneurysma s vaak het gevolg zijn van levensstijlgebonden factoren (hypertensie, atherosclerose), kennen thoracale aneurysma s vaak een genetische etiologie. Thoracale aorta aneurysma s worden verder onderverdeeld in syndromale en niet-syndromale thoracale aorta aneurysma s. Ongeveer één op vijf van de patiënten met een niet-syndromaal aorta aneurysma heeft een eerstegraadsverwant met een aorta aneurysma. Onderzoek naar gendysfuncties binnen deze niet-syndromale context bevindt zich, in tegenstelling tot het domein van de syndromale aorta aneurysma s, nog in zijn kinderschoenen. Doel: Verrichten van literatuuronderzoek om inzicht te verwerven in de verschillende genetische syndromen met hun specifieke genmutatie. Het bestuderen van zeldzame genetische ziektes waarbij een bepaalde predispositie bestaat voor de ontwikkeling van aorta aneurysma s laat toe om tot een beter begrip te komen van de pathogenese van aorta aneurysma s. Een familie met familiaal voorkomende aorta aneurysma s wordt gescreend naar koppeling met bekende loci waarvoor koppeling reeds werd aangetoond. Screenen van een cohorte van zesendertig patiënten voor een mutatie in het gen coderend voor calponine. Materialen en methoden: Aan de hand van de zoekrobot Pubmed werden relevante artikels gevonden om het nodige inzicht te verwerven in die syndromen, die gekenmerkt zijn door aorta aneurysma s. Met behulp van de aanwezige expertise op het medisch genetisch labo werden relevante moleculair genetische vaardigheden aangeleerd waardoor de nodige onderzoekshandelingen zelfstandig konden worden uitgevoerd. Resultaten: Uit de literatuurstudie is gebleken dat er een belangrijke rol is weggelegd voor TGF-β signaalcascade in de pathogenese van genetische syndromen die voorbeschikken tot thoracale aorta aneurysma s. Het onderkennen van pathogenetische mechanismen biedt de mogelijkheid voor een meer gerichte medische therapie. Veelbelovende resultaten worden bekomen voor de behandeling met losartan. Naast het blokkeren van angiotensine II receptoren zou losartan ook het TGF-β signaalpad blokkeren. Langetermijnresultaten moeten echter nog afgewacht worden. Bij patiënten met niet-syndromaal familiale aorta aneurysma s werd koppeling aangetoond voor loci op chromosoom vijf en elf. Een familie werd bestudeerd voor koppeling met deze loci en het resultaat hiervan was negatief. Daarnaast werden in de laatste jaren bij patiënten met familiale thoracale aorta aneurysma s mutaties beschreven in genen die coderen voor eiwitten van het contractiel apparaat van gladde spiercellen. Twee gendysfuncties zijn reeds gevonden in de niet-syndromale context. In families met de associatie van aorta aneurysma s en patente ductus arteriosus werden mutaties gevonden in het 1

6 Abstract MYH-11 gen (myosine heavy chain 11). In families met geïsoleerde aorta aneurysma s werden mutaties geïdentificeerd in het gen coderende voor ACTA-2 (alpha-2 of smooth muscle actin gen). Calponine is een eiwit welke het actomyosine ATP ase blokkeert en een actieve rol zou spelen in het PKC signaalpad. Wat de exacte rol is in dit signaalpad is tot op heden onduidelijk. Bij zesendertig patiënten die negatief waren voor screening naar FBN1, ACTA2 en TGFBR1/2 mutaties, werden onderzocht of ze drager zijn van een mutatie in het gen coderende voor calponine. Bij drie patiënten werd één bekend polymorfisme gevonden. 2

7 Inleiding 1. Inleiding 1.1.: Wat zijn aorta aneurysma s? Aorta aneurysma s worden gedefinieerd als een verbreding van de aorta met twee standaard deviaties boven het gemiddelde in functie van het lichaamsoppervlak en de leeftijd (Loeys et al., 2008). Een andere definitie stelt dat een aorta aneurysma een permanente dilatatie is met een diameter die minstens vijftig procent groter is dan de verwachte normale diameter (Hiratzka et al., 2010). Bij een acute dissectie loopt, via een scheur in de tunica intima (zie 1.3.1: opbouw bloedvat), bloed uit het lumen in de wand van de aorta, wat leidt tot het ontstaan van een vals lumen. 1.2.: Epidemiologie Aorta aneurysma s en dissecties zijn één van de belangrijkste doodsoorzaken in de geïndustrialiseerde wereld (Milewicz et al., 2008), en zijn zelfs verantwoordelijk voor 1-2% van de totale mortaliteit/morbiditeit (Loeys et al., 2008). Het voorkomen van aorta aneurysma s wordt geschat op 5,9 gevallen per honderdduizend persoonsjaren. De gemiddelde leeftijd van de diagnose ligt tussen de negenenvijftig en negenenzestig jaar en het komt ook twee tot viermaal meer bij mannen voor (Coady et al., 1999). De prevalentie lijkt toe te nemen, enerzijds dankzij de verbeterde beeldvormingstechnieken en anderzijds dankzij de kennis over de ernst van de pathologie. Acute aorta dissecties komen voor bij vijf tot dertig mensen op een totaal van een miljoen per jaar. Bij een acute aorta dissectie zal minder dan de helft van de patiënten het ziekenhuis levend bereiken. Tijdens de eerste vierentwintig tot achtenveertig uur sterft per uur één à twee percent van de patiënten (Wung and Aouitzerat, 2004). 1.3: Etiologie 1.3.1: Opbouw bloedvat De aorta is opgebouwd uit drie lagen. De binnenste laag en buitenste laag zijn dun en worden respectievelijk de tunica intima en de tunica adventitia genoemd. De tunica intima is opgebouwd uit een laag van endotheelcellen die rusten op subendotheliaal weefsel, dat onder andere bestaat uit collageen, elastine vezels en fibroblasten. De lamina elastica interna (binnenste laag van de tunica intima) scheidt de intima van de media. Deze laag is gefenestreerd waardoor nutriënten kunnen diffunderen van het lumen naar de cellen in de wand (Wung and Aouitzerat, 2004). De dikke middenste laag, de tunica media, is betrokken in de pathogenese (zie verder) van aorta aneurysma s (Loeys et al., 2008). Deze laag is opgebouwd uit gladde spiercellen en elastine vezels. De gladde spiercellen zijn longitudinaal diffuus verdeeld rond de circulair georiënteerde elastine vezels. Door de concentrische elastische vezels en gladde spiercellen is de tunica media verantwoordelijk voor de elasticiteit en de spankracht van de aorta. De gladde spiercellen contraheren in respons op de pulsatiele bloeddruk om zo de polsdruk en debiet constant te houden (Milewicz et al., 2008). Rond de tunica 3

8 Inleiding media ligt de tunica adventitia. Deze bestaat voornamelijk uit collageen en bevat ook vasa vasorum en zenuwen (Hiratzka et al., 2010). Collageen en elastine zijn de belangrijkste structurele proteïnen van de aorta, een elastische arterie. Collageen is belangrijk voor behoud van de structuur terwijl elastine instaat voor de elastische veerkracht (Wung en Aouitzerat, 2004) : Opbouw gladde spiercel Figuur 1: Moleculaire opbouw cytoskelet/contractiel apparaat (Milewicz et al., 2008) Het structureel skelet van de gladde spiercel bestaat uit het contractiel apparaat enerzijds en het cytoskelet anderzijds. Het cytoskelet bestaat uit niet-musculair actine (β en γ) en intermediaire filamenten. De contractiele eenheid bestaat uit dunne en dikke filamenten. De dunne filamenten bestaan uit α-actine en de dikke filamenten uit β-myosine zware keten. Filamine A is verantwoordelijk voor het verbinden van het cytoskelet met het celoppervlak. Integrine receptoren zijn transmembranaire eiwitten en dienen als belangrijke receptoren voor de extracellulaire matrix (ECM). Deze integrine receptoren dienen als link tussen de ECM, het actine cytoskelet en de contractiele eenheden en wordt daarom ook wel het mechanotransductiecomplex geheten. Deze integrine receptoren zijn samengesteld uit α- en β-subeenheden. Een specifieke αβ-combinatie verleent de receptor een specifieke ligandspecificiteit. Het belangrijkste bestanddeel van de extracellulaire matrix zijn microfibrillen. Het belangrijkste eiwit bestanddeel van deze laatste is fibrilline-1. Er wordt gesuggereerd dat fibrilline-1 bevattende microfibrillen deel uitmaken van het mechanotransductiecomplex doordat fibrilline een herkenningsite heeft voor integrine (Milewicz et al., 2008) : Wat zijn de oorzaken van een aorta aneurysma? Genetische invloeden, fysiologische factoren en omgevingsfactoren zijn belangrijke oorzaken van aorta aneurysma s (Wung and Aouitzerat, 2004). Bij aorta aneurysma s en dissecties is er in de wand van de aorta fragmentatie en verlies van elastine vezels en opstapeling van proteoglycanen in de tunica 4

9 Inleiding media (Milewicz et al., 2008). Aneurysma s zijn dan ook het gevolg van cystische degeneratie van de tunica media, welke zich histologisch uit als gladdespiercelverlies en elastinevezeldegeneratie (Isselbacher et al., 2005). In associatie met deze degeneratie worden soms inflammatoire cellen teruggevonden, maar de rol hiervan is onduidelijk (Loeys et al., 2008). Bij aorta aneurysma s worden mutaties gevonden in genen die betrokken zijn bij de structuur van het contractiel apparaat van de gladde spiercel. Dit suggereert dat gladdespiercelcontractie een belangrijke rol speelt in het onderhouden van de normale structuur van de aorta en ook een afremmende functie vervult in de ontwikkeling van aorta aneurysma s (Milewicz et al., 2008). Genetische aanleg is een belangrijk etiologische factor. Genetisch bepaalde aorta aneurysma s kunnen passen binnen een syndromale context (bespreking van syndromen: zie later). Bij niet-syndromale aorta aneurysma s spelen familiale factoren een belangrijke rol. Negentien percent van de geïsoleerde gevallen met aorta aneurysma s hebben een eerstegraadsverwant met een thoracaal aorta aneurysma (Milewicz et al., 2008; Isselbacher et al., 2005). Hypertensie geeft een verhoogd risico op aorta dissectie. Als een hypertensieve episode (meestal emotioneel of inspanningsgewijs) een hoge druk genereert en de limiet overschrijdt welke de aorta kan verdragen geeft dit een aorta dissectie (Elefteriades, 2008). Andere mogelijke voorbeschikkende factoren voor thoracale aorta aneurysma s zijn syfilis, infectieuze aortitis, reuscelarteritis, aorta trauma en dissectie. Atherosclerose is geen frequente oorzaak van thoracale aorta aneurysma s (Guo et al., 2006). Deze is net als hypertensie wel vaak geassocieerd met abdominale aneurysma s (Isselbacher et al., 2005). Deze laatste vallen buiten het opzet van deze thesis. 5

10 Inleiding 1.4: Pathogenese Figuur 2: Schematische weergave pathogenese (Milewicz et al., 2008) Gen Mutaties Toegenomen druk op de bloedvatwand Onderbreking van de gladdespiercelfunctie door verstoring van een component in het mechanotransductiecomplex (ACTA2, MYH11, FLNA, FBN1) Hypertensie of isometrische activiteit Gladde spiercel dysfunctie/overbevraging Activatie van compensatiemechanismen van de gladde spiercel. Dit leidt tot expressie van mitotische en trofische factoren zoals IGF-1, TGF-β1 Activatie van compensatiemechanismen van de gladde spiercel. Dit leidt tot toegenomen hoeveelheid metalloproteïnasen en proteoglycanen Afbraak van elastinevezels Opstapeling van proteoglycanen Bij thoracale aneurysma s is de gladdespiercelfunctie verstoord. Enerzijds kan dit het gevolg zijn van mutaties in genen betrokken in het mechanotransductiecomplex van de gladde spiercel (ACTA2, MYH11 en FBN1: zie verder). Anderzijds kan de gladdespiercelfunctie overmatig belast worden door een toegenomen druk op de bloedvatwand. Dit laatste kan het gevolg zijn van chronisch aanwezige 6

11 Inleiding hypertensie maar ook van isometrische activiteiten die gepaard gaan an met een verhoogde bloeddruk (zoals gewichtheffen). De gladde spiercel reageert hierop, niet alleen door middel van expressie van mitotische en trofische factoren, maar ook door een verhoging van matrixmetalloproteïnasen en proteoglycanen. Dit alles leidt tot degradatie van elastinevezels en toename van proteoglycanen in de extracellulaire matrix (Milewicz et al., 2008). De extracellulaire matrix (ECM) dient ook als opslagplaats van groeifactoren en groeifactorbindende proteïnen en kan dienen als ligand van celadhesiereceptoren. Stoornissen in de opbouw van de elementen, die de extracellulaire matrix opbouwen, leidt tot een verstoorde matrixconfiguratie en functie. De structuur en functie van de wand van de aorta hangt in sterke mate af van de integriteit van de ECM. Een bepaald gegeven (roken, hypertensie) en genetische predispositie (Marfan, Ehler-Danlos, bicuspide aortaklep, ) kan fungeren als oorspronkelijke stimulus om de structuur van de ECM te verstoren. Hierop wordt gereageerd door inductie en activatie van proteolytische enzymen. Dit leidt tot verdere destructie van de ECM. Hierop ontstaat een dilatatie en neemt de druk op de wand nog extra toe. Matrixmetalloproteïnasen (MMPs) zijn in dit proces betrokken, gezien hun capaciteit om alle componenten van de ECM af te breken (Barbour et al., 2007). De activiteit van MMP wordt door verschillende mechanismen gereguleerd. Deze regulatie gebeurt op het niveau van de transcriptie en de vrijstelling van MMPs maar ook door posttranslationele modificaties en endogene weefsel- inhibitoren (TIMPs). In een normale fysiologische situatie is er een goede balans tussen de activiteit van de MMPs en TIMPs zodat de opbouw van de matrix in evenwicht is met de afbouw. In het geval van een aneurysma is dit evenwicht verstoord door een overproductie van de MMPs en een verlaagde activiteit van de TIMPs. Dit resulteert in een verhoogde proteolyse en degeneratie van de ECM (Jones et al., 2009). 1.5: Classificatie Type A Type B Figuur 3: Type A en type B dissectie (Milewicz et al., 2008). 7

12 Inleiding Thoracale aneurysma s kunnen ingedeeld worden op basis van het deel van de aorta dat wordt getroffen en het aneurysma kan verschillende segmenten betreffen. Zo kunnen de aortawortel, aorta ascendens, aortaboog of aorta descendens worden getroffen door een aneurysma. 60% van de aneurysma s worden gelokaliseerd ter hoogte van de aortawortel en/of aorta ascendens, 40% in de aorta descendens en 10% in de aortaboog (Isselbacher et al., 2005). Aorta rupturen worden onderverdeeld in twee types. Type A zijn rupturen die optreden in het stijgende deel van de aorta (distaal van de aortaklep). Type B scheuren zijn scheuren die typisch optreden in het dalende deel juist distaal van de oorsprong van de linker arteria subclavia. Beide types nemen 95 % van thoracale aneurysma s voor hun rekening (Loeys et al., 2008). 1.6: Kliniek Aorta aneurysma s blijven in vijfennegentig procent asymptomatisch. Bij vijf procent geeft het aanleiding tot symptomen. Een patiënt met een aneurysma in de aorta ascendens kan klagen over retrosternale pijn, terwijl aneurysma s in de aorta descendens aanleiding kunnen geven tot interscapulaire pijn (Elefteriades, 2008). Patiënten zijn dus meestal asymptomatisch op het moment van de diagnose. Deze aneurysma s komen dan tot uiting door middel van beeldvorming (röntgenologisch, CT of echocardiografie), aangevraagd in het kader van een andere indicatie. Bij een aortawortelaneurysma wordt, bij een routinematig uitgevoerde auscultatie, soms regurgitatie vastgesteld. Vormt het aneurysma een uitgesproken massa, dan kan het door de massawerking nabijgelegen structuren obstrueren. Hoest, wheezing, dyspnoe of recidiverende pneumonie kan aldus ten gevolge van compressie van de trachea of de hoofdbronchus optreden. Compressie van de oesofagus kan leiden tot dysfagie en druk op de nervus laryngeus recurrens kan leiden tot heesheid (Isselbacher et al., 2005). 1.7: Diagnose De meest geschikte beeldvormingstechnieken om aorta aneurysma s in het licht te stellen zijn transoesofagale echocardiografie, CT en MR angiografie. De aorta met zijn zijtakken kan worden gevisualiseerd aan de hand van echocardiografie. Door het gebruik van verschillende beeldvormingsincidenties kan men de aorta ascendens, de aortaboog en aortawortel visualiseren. Transoesofagale echocardiografie is beter dan transthoracale echocardiografie. Vergeleken met andere beeldvormingsmodaliteiten is echocardiografie geen geschikte beeldvormingstechniek voor de visualisatie van de aorta descendens (Hiratzka et al., 2010). Andere methodes om aorta aneurysma s in beeld te brengen zijn CT of MR angiografie. De lokalisatie van het aneurysma kan soms indicatief zijn voor welke beeldvorming gekozen dient te worden. Aortawortel wordt het best met MR gevisualiseerd terwijl axiale beeldvorming voor een tortueuze aorta minder geschikt is. Een tortuositas aortae wordt het best gevisualiseerd met hetzij een 3D-CT hetzij een MR angiografie (Isselbacher et al., 2005). Een röntgenologische opname (Rx) van de thorax kan meestal 8

13 Inleiding een aorta aneurysma visualiseren, maar een normale Rx sluit de aanwezigheid ervan niet uit. Uiteindelijke selectie van de meest geschikte beeldvorming hangt af van de beschikbaarheid van de apparatuur en de toestand van de patiënt (Hiratzka et al., 2010). 1.8: Evolutie Veel kennis omtrent de natuurlijke evolutie van aorta aneurysma s is niet voorhanden. Dit komt doordat de huidige behandelingsvormen van vroegtijdige interventie niet toelaten een verregaande evolutie te volgen. Elefeteriades et al. poneert dat een aneurysma per jaar gemiddeld met 0,12 cm in diameter toeneemt. De initiële diameter van het aneurysma is een belangrijke predictieve factor voor de snelheid van de groei van aneurysma s (Isselbacher et al., 2005). Twee procent van de aneurysma s met een diameter van minder dan vijf centimeter, drie procent van de aneurysma s met een doormeter tussen de 5 en 5.9 cm en zeven procent van de aneurysma s met een diameter 6cm evolueren per jaar naar een aorta dissectie (Davies et al., 2002). Figuur 4: Weergave van de impact van de diameter van het aorta aneurysma op het risico voor het ontwikkelen van een ruptuur. Y-as geeft de mogelijkheid tot complicatie weer. De x-as geeft de diameter van het aorta aneurysma weer. (Coady et al., 1997) 1.9: Behandeling Ruptuur of dissectie van een aneurysma is geassocieerd met een hoge morbiditeit en mortaliteit ondanks de verbeterde chirurgische technieken. Daartegenover staat dat profylactisch herstel van een aorta ascendens aneurysma voor ruptuur en dissectie geassocieerd is met zeer lage morbiditeit en mortaliteit (Milewicz et al., 2008). Wanneer een aorta aneurysma wordt gediagnosticeerd, dan moet worden nagekeken of dit aneurysma een manifestatie is van een syndroom. Voor deze screening is doorverwijzing naar een geneticus aan te raden (Loeys et al., 2008) : Behandeling van risicofactoren Risicofactoren voor de ontwikkeling van thoracale aorta aneurysma s (TAA) zijn hypertensie, roken en chronisch obstructieve longziekten. Hypertensie moet medisch behandeld worden bij patiënten met thoracale aorta aneurysma s (zie 1.9.2) maar levensstijlaanpassingen, gewichtsreductie en matige alcoholinname zijn standaard antihypertensiemaatregelen die ook voor patiënten met TAA kunnen worden geïmplementeerd. Bovendien wordt de rokende patiënt aangeraden het tabakgebruik te staken. 9

14 Inleiding Er zijn geen gerandomiseerde of prospectieve studies voorhanden die het effect van roken op TAA bestuderen, maar de aorta aneurysma s van patiënten die roken, hebben een verdubbelde expansiesnelheid. Ook wordt aangeraden om bij patiënten met TAA het lipidenprofiel te optmaliseren, maar er zijn geen studies die aantonen dat statines de expansie van een aorta aneurysma vertragen (Hiratzka et al., 2010) : Medische behandeling Hypertensie is vaak geassocieerd aan aneurysma s zowel bij patiënten met genetische predispositie als bij geïsoleerde gevallen met aorta aneurysma s. Daarom is medicamenteuze behandeling van hypertensie bij patiënten met aneurysma s aangewezen (Wung and Aouitzerat, 2004). Het doel moet zijn om de bloeddruk onder 140/90 mm Hg te krijgen voor patiënten zonder diabetes of onder de 130/80 mm Hg voor diabetici (Hiratzka et al., 2010). Medische behandeling beperkt zich nu tot het voorschrijven van β-blokkers. Behandelde patiënten vertonen minder cardiovasculaire complicaties zoals aorta regurgitatie, aorta dissectie en vertonen toegenomen overleving. β-blokkers zijn effectief omdat ze enerzijds negatief chronotroop werken en anderzijds negatief inotroop werken, wat resulteert in een verminderd debiet en bloeddruk in de aorta ascendens. Op basis van de beschreven pathogenese, moeten medicamenten, die de bloeddruk verlagen, ook de compensatoire activiteiten van de gladde spiercel lam leggen en dus ook de klinische manifestaties van de ziekte (Milewicz et al., 2008). Als β-blokkers gecontraindiceerd zijn, kan men opteren voor Ca-blokkers en ACE-remmers, alhoewel geen Randomized Controlled Trials (RCT s) bestaan (Loeys et al., 2008) : Chirurgische behandeling : Methode : Aorta ascendens aneurysma s: Hierbij wordt een cardiopulmonaire bypass aangelegd. Vervolgens wordt het aneurysma in zijn geheel verwijderd en vervangen door een Dacron tube greffe. Is de aortawortel betrokken, dan wordt een prothese gebruikt voorzien van een klepsysteem. Na implantatie worden dan de arteriae coronariae geïmplanteerd. De mortaliteit van chirurgie ligt tussen de 3% en de 5% (Isselbacher et al., 2005). Is de functie van de aortaklep nog gespaard, dan kan gekozen worden voor een chirurgische interventie waarbij de klep ongemoeid wordt gelaten, zodat de patiënt niet wordt gedwongen tot een levenslange inname van anticoagulantia (Loeys et al., 2008) : Booganeurysma s: Hierbij worden eerst de brachiocefale zijtakken afgeklemd. Daarna wordt het betrokken segment verwijderd en vervangen door een prothese waarop de verschillende brachiocefale zijtakken worden geïmplanteerd. Dit alles gebeurt onder hypotherme cardioplegie. De hypotherme episode wordt in 10

15 Inleiding duur gereduceerd wanneer men gebruik maakt van een prothese met verschillende zijtakken waarop de brachiocefale zijtakken één voor één worden geïmplanteerd. De belangrijkste complicaties bij een dergelijke interventie zijn neurologische consequenties als gevolg van langdurige cerebrale ischemie of embolisatie door atherosclerotische plaques : Endovasculaire stenting Een recente evolutie is het endovasculair herstel van aneurysmata. Dit gaat gepaard met minder mortaliteit en morbiditeit, maar langetermijnresultaten moeten nog afgewacht worden (Mustafa et al., 2010). Het aanbrengen van een stent, stopt in sommige gevallen de vergroting van het aneurysma niet. Verdere ziekte-evolutie kan leiden tot het falen van de stent. Het is dan ook belangrijk de patiënt nauwkeurig op te volgen (Jones et al., 2009) : Wanneer opereren? Voor een schematische weergave wordt verwezen naar bijlage : Asymptomatische patiënten Asymptomatische patiënten met thoracala aorta aneurysma s (TAA s) worden best geopereerd als de diameter van het aneurysma gelijk is aan of groter dan 5,5 cm. Voor patiënten met een syndromaal aorta aneurysma worden strengere afkapwaarden gebruikt om te beslissen tot chirurgische interventie (tussen vier en vijf centimeter afhankelijk van het syndroom). TAA s, die jaarlijks een toename in diameter hebben van een halve centimeter of meer, komen ook in aanmerking voor een chirurgische profylactische interventie (onafhankelijk van de doormeter van het aneurysma). Als patiënten een klepherstel ondergaan, worden dilataties van de aortawortel of de aorta ascendens die in diameter groter zijn dan 4,5 centimeter, concomitant meegecorrigeerd (Hiratzka et al., 2010) : Symptomatische patiënten Bij patiënten met symptomen, suggestief voor een uitbreiding van een thoracaal aorta anuerysma, wordt geopteerd voor een snelle chirurgische interventie, tenzij de patiënt door andere aandoeningen een verkorte levensverwachting of een verminderde levenskwaliteit heeft : Seriële beeldvorming Seriële beeldvorming van patiënten met een gediagnosticeerd aneurysma vormt een belangrijk onderdeel in de langdurige opvolging van dergelijke patiënten. Op basis van de initiële beeldvorming, uitgevoerd bij de diagnosestelling, is het onmogelijk een inschatting te maken van de snelheid waarmee het aneurysma toeneemt. Na zes maanden moet de beeldvorming opnieuw plaatsvinden. Is het aneurysma dan niet toegenomen in grootte, dan is een jaarlijkse beeldvorming voldoende. Is er echter een toename in doormeter, dan dient dit om de drie tot zes maanden worden opgevolgd met een CT of MR (Isselbacher et al., 2005). Seriële beeldvorming is niet enkel belangrijk om de evolutie te 11

16 Inleiding bepalen want ook andere aneurysma s kunnen zich ontwikkelen. Een patiënt met een aneurysma heeft namelijk een verhoogde kans er nog één te ontwikkelen (Wung and Aouitzerat, 2004). Daarom moet na een operatie een patiënt blijvend opgevolgd worden met beeldvorming voor de tijdige detectie van aneurysma s in het chirurgisch hersteld aorta gedeelte en van aneurysma s meer distaal in het lichaam (Loeys et al., 2008). 1.10: Embryologie Neurale lijstcellen zijn pluripotente cellen die aanleiding kunnen geven tot verschillende celtypes, weefsels en organen. Deze cellen zijn nodig voor de differentiatieprocessen, optredend in de verschillende ontwikkelingsstadia van verschillende orgaansystemen zoals het perifeer zenuwstelsel, het aangezichtsskelet, melanocyten en cardiaal outflow tract septum. Inductie van de neurale lijstcellen gebeurt aan de dorsale zijde van het zich ontwikkelend ruggenmerg (aanvankelijk vormt zich de neurale buis). Door de interactie tussen het oppervlakkig gelegen ectoderm en de neurale plaat ondergaan ze epitheliaal-mesenchymale transformatie en gaan dan migreren en verder differentiëren. Een subpopulatie van de neurale lijstcellen vormen de cardiale neurale lijstcellen (CNC: cardiac neural crest cells (En)). Deze zijn afkomstig van de neurale lijst gelegen tussen de otische placode en de vierde somiet. Deze CNC ondergaan een epitheliale-mesenchymale transformatie en migreren dan via de derde, vierde en zesde faryngeale bogen naar het hart (Snider et al., 2007). Cardiac neural lijst cellen spelen een rol in het ontwikkelen van het proximaal deel van het septum en het voorzien van myocard in het septum (Snider et al., 2007). Naast het vormen van het aorticopulmonaal septum, speelt het ook een rol in het ontwikkelen van de tunica media van de aortaboog en de grote zijtakken (Epstein and Stoller, 2005). Figuur 5: weergave van een normale remodellering (Epstein and Stoller, 2005) Een normale cardiovasculaire ontwikkeling begint met één enkel bloedvat, dat zich verdeelt ter hoogte van de aortazak in bilateraal symmetrische bloedvaten: de derde, vierde of zesde aortaboogarteriën. Deze arteriën zijn tijdelijk en gaan aanleiding geven tot de volwassen aorta, welke linksdraaiend is. Dit is het resultaat van een asymmetrisch geprogrammeerde regressie of blijvende aanwezigheid van de specifieke boogarteriën. De arteriën van de derde farynxboog geven aanleiding tot de arteria carotis 12

17 Inleiding communis, de vierde farynxboog arteriën geven aanleiding tot het vormen van het distale deel van de aortaboog, de arteria brachiocefalica (welke gemeenschappelijke basis is van de arteria carotis communis dextra en de arteria subclavia dextra). De zesde farynxboogarteriën geven aanleiding tot het ontstaan van de ductus arteriosus (of de ductus van Botal) en de proximale delen van de arteriae pulmonales. De definitieve structuur is het resultaat van de interactie tussen het mesenchym, de endotheelcellen van de faryngeale arteriën, de neurale lijstcellen, welke de oorsprong zijn van de gladde spiercellen en het endoderm. Abnormale remodellering leidt tot allerlei congenitale cardiovasculaire afwijkingen. (Snider et al., 2007). De aard van de congenitale afwijkingen ten gevolge van CNC dysfunctie suggereert een continuüm van afwijkingen relatief aan de ernst van CNC dysfunctie (Stoller and Epstein, 2005). Remodelleren gaat uit van differentiatie, proliferatie, migreren over grote afstanden en een goed gereguleerde apoptose. Apoptose speelt ook een belangrijke rol in de vroege ontwikkeling van het cardiovasculair systeem. De zoektocht naar een mogelijke consequentie van het dysfuntioneren van dit proces biedt heel wat mogelijkheden met betrekking tot toekomstige onderzoekingen (Fisher et al., 2002). Het belang van cardiale neurale lijstcellen voor de cardiovasculaire ontwikkeling is zeer groot. Getuigen hiervan zijn de ernstige congenitale afwijkingen welke het gevolg zijn van het verwijderen of genetische manipulatie van cardiale neurale lijstcellen. Er zijn al een aantal signaalwegen blootgelegd die een rol spelen in de vorming en migratie van de CNC. Het gemeenschappelijk mechanisme en de relatie tussen de onderliggende signaalwegen moet echter nog opgehelderd worden (Snider et al., 2007). NOTCH, TGF-β en Semaphorin spelen hierbij een rol. De meeste gendysfuncties die blootgelegd zijn, zijn gebaseerd op diermodellen. Ook op basis van diermodellen is gebleken dat de cardiovasculaire ontwikkeling ook het resultaat is van interacties tussen lokale weefsels zoals endotheel, faryngeaal endoderm, ectoderm en cardiaal mesenchym en myocard. Verder onderzoek moet uitmaken welke interacties en signaalpaden een belangrijke rol spelen bij de mens (Epstein and Stoller, 2005). Aorta aneurysma s kunnen binnen bepaalde families geassocieerd zijn met een bicuspide aortaklep, cerebrale aneurysmata of een coarctatio aortae. De aortakleppen en de tunica media van de aorta ascendens en de zijtakken zijn afkomstig van cardale neurale lijstcellen. Een dysfunctie op het niveau van deze cellen kan de oorzaak zijn van cardiovasculaire ziekte binnen deze families (Pannu et al., 2006). 13

18 Materialen en methoden 2. Marterialen en Methoden 2.1: Literatuuronderzoek Met behulp van de zoekrobot Pubmed werden artikels gezocht om inzicht te verwerven in thoracale aneurysma s en hun genetische basis. Hierbij werd gebruik gemaakt van de kernwoorden thoracic aortic aneurysms. Op basis van de gevonden artikels werden ook nieuwe artikels gevonden die werden geciteerd. De artikels die gebruikt werden, werden opgenomen in de referentielijst. 2.2: Werkwijze Eerst werden een aantal artikels gezocht om inzicht te verwerven in de pathologie. Het eerste thesisjaar werd besteed aan het labowerk, waar het verwerven van een aantal vaardigheden werd gevolgd door het uitvoeren van praktisch werk. Eerst werd een koppelingsonderzoek uitgevoerd en dan werd een kandidaatgen gescreend op mutaties in een populatie van 36 patiënten geselecteerd uit een lijst van patiënten verzameld door prof. dr. B. Loeys. 2.3: Gebruikte labotechnieken 2.3.1: Polymerase Chain Reaction (PCR) : Principe Met behulp van de polymerase chain reaction (PCR) kan een specifiek DNA-fragment, uitgaand van een geringe hoeveelheid DNA, in veelvoud worden vermenigvuldigd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een cyclus die vele malen wordt herhaald. Een dergelijke cyclus bestaat uit drie stappen: denaturatie, hybridisatie en elongatie. Het DNA-fragment, dat dient verveelvoudigd te worden (het template DNA), wordt bepaald door het gebruik van een primer. Een primer is een oligonucleotide dat ontworpen wordt om specifiek te binden op een specifieke plaats in het genoom. Voor een PCR- reactie zijn er twee primers nodig: een forward en een reverse primer. Een forward primer bindt op 5-3 streng (de sense-dna streng) terwijl de reverse primer op de 3-5 streng (anti-sense streng) bindt. De forward en reverse primer moeten elk aan één kant van de template binden om deze dan specifiek te vermenigvuldigen. Een meer precieze bespreking van primers volgt in De PCR cyclus bestaat dus uit drie stappen. Een woordje uitleg: I. Denaturatie: De twee strengen van het dubbelstrengig DNA worden bijeengehouden door waterstofbruggen. Het doel van het denatureren van het dubbelstrengig DNA is het verbreken van die waterstofbruggen teneinde het dubbelstrengig DNA om te zetten naar het enkelstrengig DNA. Door de oplossing met het dubbelstrengig DNA op te warmen tot gewoonlijk 92 tot 97 C 14

19 Materialen en methoden II. III. worden de waterstofbruggen tussen de basen gebroken en wordt enkelstrengig DNA (ssdna) bekomen, welke dan dient als template voor de aanmaak van nieuwe strengen. Hybridisatie: De temperatuur wordt verlaagd tot een temperatuur tussen de 40 C en 60 C. Zo worden de primers, aanwezig in de mastermix, toegelaten om het DNA op een specifieke plaats te binden. Hoe lager de temperatuur, hoe meer de primer de kans heeft om het ssdna te binden. Hierdoor is er een hogere kans dat de primer zich op een verkeerde plaats op het DNA bindt. Omgekeerd betekent dat bij hogere temperatuur de primer minder kans heeft om het ssdna te binden en dit enkel kan op de plaatsen waar het meest waterstofbruggen kan gevormd worden. Dus bij hogere temperatuur worden er minder bindingen gevormd maar zijn ze wel specifieker. Bij lagere temperatuur worden er meer bindingen gevormd maar is de kans hoger dat er meer aspecifieke binding wordt gevormd waardoor er meer ongewenste DNA-amplicons kunnen worden gevormd. De temperatuur waarop dit alles gebeurt wordt bepaald door de karakteristieken van de primer, met name lengte en samenstelling (GC/AT verhouding). Elongatie: Deze stap gebeurt op 72 C. Op deze temperatuur heeft het thermostabiele (warmtebestendige) Taq DNA-polymerase de meest optimale werking. Dit enzyme zorgt ervoor dat primers gebonden op het template DNA worden verlengd aan het 3 uiteinde met verbruik van de juiste vrije mononucleotiden die ook aanwezig zijn in de mastermix. Bij deze laatste stap wordt een nieuwe streng gevormd. Deze cyclus wordt een aantal maal doorlopen, waarbij het nieuw gevormd DNA telkens als template dienst doet. Het DNA wordt zo exponentieel verveelvoudigd, waarbij na elke cyclus het product werd verdubbeld. Wordt de cyclus twintig maal doorlopen, dan zijn er van elke DNA-streng 2 20 kopieën. De hoeveelheid DNA dat niet de sequentie bevat, is verwaarloosbaar in vergelijking met de hoeveelheid dat wel die sequentie bevat : Touch-Down PCR Bij een touch-down PCR worden bij elke cyclus, net zoals bij een standaard PCR denaturatie, hybridisatie en elongatie doorlopen maar met dit verschil dat bij de eerste cyclus de temperatuur van de hybridisatie hoog wordt gehouden en dat bij het doorlopen van een aantal cycli deze temperatuur wordt verlaagd. Door van bij het begin de temperatuur hoog te houden, wordt er een grotere specificiteit bekomen. De verlaagde temperatuur na een aantal cycli zorgt dan weer voor een grotere opbrengst : Elementen mastermix In de oplossing, welke voorwerp is van een PCR, zitten een aantal elementen die elk hun nut hebben: 15

20 Materialen en methoden Dubbelstrengig DNA of template DNA: is het DNA waarvan een fragment dient verveelvoudigd te worden. Taq polymerase: Deze DNA-polymerase is thermostabiel en is afkomstig van de bacterie thermus aquaticus. Het verlengt de DNA-streng met gebruik van de monomeren (zie hieronder). dntp s (deoxyribonucleotidetrifosfaten) zijn monomeren welke de bouwstenen zijn van het DNA. Deze monomeren worden door het Taq polymerase gebruikt om nieuwe strengen te vormen. Deze worden gebruikt wanneer de juiste base op de template ligt. Er zijn vier soorten die elk uit drie componenten bestaan. Alle vier beschikken ze over een desoxyribose en een trifosfaatgroep. Wat hen onderscheidt is de derde component: een base. De vier basen zijn adenosine, guanosine, cytosine en thymidine. De vier monomeren, elk bestaande uit de drie componenten (een base, desoxyribose en trifosfaatgroep), zijn deoxycytidine trifosfaat (dctp), deoxyguanosine trifosfaat (dgtp), deoxyandenosine trifosfaat (datp), deoxyguanosine trifosfaat (dgtp). Buffer: houdt het mengsel op de juiste ph zodat de reactie optimaal verloopt MgCl 2 : werkt als co-factor voor het warmtebestendige Taq-polymerase en stabiliseert het dubbelstrengig DNA, wat zijn implicaties heeft op de smelttemperatuur en specificiteit. Primers: een oligonucleotide die een bepaalde sequentie bevat die overeenkomt met een segment van het genoom, dat het deel dat moet worden gepcr d flankeert. Zo is kennis over de sequentie naast het deel waarin men geïnteresseerd is, zeker noodzakelijk. Hiervoor zijn er verschillende databanken op het web beschikbaar waaronder Ensembl en NCBI. Primers moeten aan bepaalde eisen voldoen: Smelttemperatuur: Deze wordt in belangrijke mate bepaald door het GCgehalte van de primer. Tussen adenine enerzijds en thymine anderzijds zijn er twee waterstofbruggen betrokken. Tussen guanine en cytosine daarentegen zijn het er drie. Om ervoor te zorgen dat de smelttemperatuur optimaal zou blijven, moet het GC-gehalte van de primer tussen 40 en 60 % liggen. Secundaire structuren: Tussen de primers mogen geen secundaire structuren worden gevormd, wat optreedt als er een complementair deel zou zijn dat groter zou zijn als drie basen. Specificiteit: alle primers moeten op een specifiek deel van het genoom binden. Dit kan nagekeken door de primer te blasten. Dit betekent het hele genoom na te gaan naar homologie tussen de primersequentie enerzijds en het hele genoom anderzijds. Blast (Basic Local Alignment Search Tool), beschikbaar via de NCBI website, is een zoekmachine die naar de sequenties zoekt met de 16

21 Materialen en methoden grootste homologie en als resultaat een lijst weergeeft met homologe regio s. Deze worden gerangschikt naar afnemende homologie : PCR-toestel Het gebruikte PCR-toestel is de thermal cycler, versie 2.08 van het merk Applied Biosystems : Agarosegelelektroforese : Principe Agarosegelelektroforese laat toe om DNA-fragmenten te scheiden op basis van grootte. Deze scheiding gebeurt door de DNA-fragmenten te laten bewegen volgens een elektrisch veld in een gel, gelegen in een basisch bufferbad. De DNA-fragmenten migreren in de richting van de positieve pool omdat fosfaatgroepen, component van de DNA-molecule, in basisch milieu negatief geladen zijn. De scheiding van de fragmenten wordt bepaald door de migratiesnelheid. In de gel migreren kleinere DNA-fragmenten sneller dan grotere fragmenten. Het verschil in snelheid wordt bepaald door de hoeveelheid agarose (%) die in de gel verwerkt is. Deze agarose vormt namelijk een ingewikkeld netwerk van fibrillen waarin kleinere DNA-fragmenten vlotter migreren ten opzichte van de grotere fragmenten. Als men fragmenten moet scheiden die niet veel in lengte verschillen, moet men een hogere concentratie agarose hanteren. In de gel wordt ook ethidiumbromide verwerkt. Deze stof intercaleert in de DNA-helix en zorgt ervoor dat het DNA onder een UV-lamp fluorescent wordt. De grootte van een PCR-product kan nagegaan worden door te vergelijken met een referentie DNA-ladder. Dit is een mengsel van DNA-fragmenten met gekende grootte. Agarosegelektroferese wordt gehanteerd als middel om het PCR-product te beoordelen naar zijn kwaliteit. Zijn er bijvoorbeeld meerdere bandjes, dan is het PCR-product aspecifiek. DNA-fragmenten van dezelfde lengte worden niet van elkaar gescheiden en wanneer we een mooi bandje bekomen, dan is het PCR-product geschikt voor sequencing. Worden er geen bandjes gevonden of zeer zwakke bandjes dan wijst dit op onvoldoende amplificatie : Protocol i. Bereiding agarosegel: ii. Door 5 g agarose in 250 ml TBE buffer te mengen wordt 2% agarosegel bekomen. De agarose wordt opgelost door de oplossing aan de kook te brengen en te mengen. Vervolgens worden 3 tot 5 druppels ethidiumbromide toegevoegd. Vervolgens wordt het mengsel in een mal gegoten voorzien van kammetjes. Dit geheel moet dan rusten zodat het afkoelt en opstijft. Na afkoeling wordt een homogene gel bekomen met een rij slotjes die dan later met DNA-product kunnen worden geladen. PCR-productbewerking en gel laden 17

22 Materialen en methoden iii. iv. Van het PCR-product wordt 3µl genomen. Dit wordt met 10 µl orange vermengd. Van de ladder wordt een 1,5µl genomen en dit wordt tevens vermengd met 10 µl orange. Dit mengsel kan in zijn geheel worden gepipetteerd (geladen) in de slots. Doordat het soortelijk gewicht van het mengsel groter is dan de buffer, blijft het product op de bodem zitten. Elektoforese Over de gel met geladen slots wordt dan een spanningsveld aangelegd van 140 volt. Het negatief geladen DNA begint dan te migreren. Het elektrisch veld moet tussen een half uur tot drie kwartier in stand worden gehouden. Dit geldt voor fragmenten die kleiner zijn dan duizend baseparen. Voor grotere baseparen moet anderhalf uur voorzien worden omdat grotere fragmenten minder snel migreren. Deze tijdspanne moet voldoende zijn om DNAfragmenten te laten migreren en hun lengte in te schatten aan de hand van een ladder. Uitlezen: Na het afzetten van het elektrisch veld, wordt de gel met UV-stralen belicht waardoor het DNA-fragment kan worden gevisualiseerd : Sequencing : Principe Na controle van het welslagen van het PCR-product door agarosegelelektroforese uit te voeren, kan het PCR-product worden gesequeneerd. Sequeneren betekent het bepalen van de nucleotidevolgorde van het PCR-product. Dit gebeurt volgens de Sanger-methode die praktisch in een aantal stappen kan worden ingedeeld: het DNA opzuiveren, het uitvoeren van de eigenlijke sequencingreactie, het opzuiveren van het sequencingproduct en het aflezen van het resultaat door het uitvoeren van capillaire gelelektoforese. Dit alles kan hetzij gerobotiseerd hetzij handmatig (of manuele sequencing) met elk zijn voor- en nadelen. I. DNA opzuiveren II. Deze stap bestaat uit het toevoegen van exosap aan het PCR-product. ExoSap is een samenstelling van twee enzymen respectievelijk exonuclease en alkalisch fosfatase. Dit enzym zorgt ervoor dat het PCR-product wordt gezuiverd van primers en van overblijvende deoxyribonucleotidetrifosfaten of dntp s. Het alkalisch fosfatase gaat hierbij dntp s vernietigen door het verwijderen van een fosfaatgroep. Exonuclease gaat alle primers verwijderen door het enkelstrengig DNA (ssdna) in dntp s om te zetten. Bovendien gaan ze ook aspecifieke DNA-strengen, gevormd in de PCR-reactie, vernietigen. Eigenlijke sequeneringsreactie Na het opzuiveren van het DNA wordt het opgezuiverd DNA aan een reactiemengsel toegevoegd, welke primers (forward en reverse), dntp s, een buffer, DNA-polymerase en een 18

23 Materialen en methoden III. IV. kleine hoeveelheid dideoxynucleoside triphosphaat (ddntp s) bevat. De sequeneringsreactie steunt op de sequeneringsmethode volgens Sanger. Hierbij worden de ddntp s op een willekeurige wijze ingebouwd. De ddntp s verschillen van de dntp s doordat de 3 - hydroxylgroep bij de dideoxynucleotide ontbreekt. Een 2-3 ddntp bevat een waterstof op de 2 en 3 plaats van de ribosering. Zo ontstaan er DNA fragmenten van wisselende lengte want na inbouw van een ddntp kan verdere verlenging van de DNA-streng door het DNApolymerase niet meer gebeuren omdat een fosfodiësterbinding dan onmogelijk wordt. ddntp s worden daarom wel eens chain terminators genoemd. Door de inbouw van ddntp s wordt wel eens bij elke nucleotide de elongatie van de DNA-streng door de Taq-polymerase gestopt. De vier soorten ddntp s zijn ddgtp, ddttp, ddatp en ddctp. Elk van hen zijn voorzien van een fluorescente label (ook wel fluorochrome merker genaamd). Opzuiveren van het sequencingproduct Aan het sequentieproduct wordt ethanol toegevoegd. Tevens worden magnetische beads toegevoegd die zich hechten aan het DNA. Na aanbrengen van een magnetisch veld rond de wand van het epje waarin het sequentieproduct zit, wordt het DNA met de magnetische beads naar de wand van het epje aangetrokken. De resten van de sequentiereactie blijven in de oplossing en kunnen na spoeling met ethanol worden verwijderd. Daarna kan een elutiebuffer worden toegevoegd waardoor het DNA vrijkomt van de magnetische beads. De magnetische beads blijven vastgehecht aan de magneet. De vloeistof met DNA kan dan worden geïsoleerd en in een nieuw epje geplaatst. Capillaire gelelektoforese Het opgezuiverd sequencingproduct wordt in capillairen gebracht die gevuld zijn met polymeren. Er wordt dan een elektrisch veld aangelegd waardoor de DNA-fragmenten naar grootte worden ingedeeld door middel van elektroforese. Fragmenten van gelijke lengte komen dan op dezelfde plaats te liggen. Door middel van een laser wordt dan het aanwezige ddntp tot fluorescentie gebracht. De uitgezonden fluorescentie wordt dan opgevangen door een CCD-camera. De resultaten worden weergegeven via een elektoferogram. Dit is een grafiek waar de x-as de afgelegde lengte weergeeft (of de lengte van het DNA-fragment) en de y-as de intensiteit van de uitgezonden fluorescentie weergeeft, waarbij elke van de vier soorten ddntp s een eigen kleur heeft. Dit aflezen gebeurt automatisch via een ABI 3130 XL Genetic Analyser of ABI 3730 XL DNA analyser (Applied Biosystems) : Analyse De analyse gebeurt door het programma SeqScape. Het resultaat wordt dan als volgt weergegeven (zie figuur). 19

24 Materialen en methoden Figuur 6: Sequencingresultaat. Voorbeeld van een elektroferogram : Koppelingsonderzoek : Wat is koppelingsonderzoek? Koppeling of linkage wil zeggen dat bepaalde loci of allelen samen worden overgeërfd omdat tijdens de meiose geen recombinatie optreedt. Gekoppelde loci komen significant samen meer voor dan op basis van de individuele allelfrequenties voorspeld kan worden. Koppelingsonderzoek is lange tijd een veel uitgevoerd onderzoek geweest om uit te zoeken of een patiënt al dan niet aan een dominant erfelijke aandoening lijdt. Koppelingsonderzoek werd vroeger veelvuldig gebruikt om ziekte-loci binnen een familie met een pathologische belasting te identificeren. In een familie wordt dan gekeken hoe de overerving van de ziekte-loci gebeurt en wordt er onderzocht of er een verband kan worden gelegd met de manier waarop de ziekte tot expressie komt. Tussen gekoppelde merkers vindt, zoals reeds gezegd, geen recombinatie plaats. Deze merkers definiëren een DNA-fragment dat ongewijzigd wordt overgeërfd. Als een merker steeds aanwezig is bij bepaalde familieleden met een pathologie en afwezig is bij familieleden zonder de pathologie, kan worden gesteld dat de kans groot is dat de causale genetische afwijking zich in dat gebied bevindt : Lod-score Figuur 7: Illustratie bij de onderstaande tekst 20