Acute myeloïde leukemie

Transcriptie

1 September ste jaargang Nr: 7 Acute myeloïde leukemie Moleculaire diagnostiek Particuliere laboratoria Urinecontrole op drugs Diagnostiek auto-immuunziekten

2 Urine Fluorescence Flow Cytometry There s no way to stop evolution in urinalysis The basic microscope Intelligent microscopy, still subject to individual user interpretation. No standardisation! Urine fluorescence flow cytometry: the solution for urinalysis n two dedicated channels with fluorescence staining for enhanced detection of patho logical samples n better statistical reliability means more information to decide on infections and haematurias n highly convenient operation n standardised analysis throughout Sysmex Nederland B.V. Ecustraat 11, 4879 NP Etten-Leur, The Netherlands Phone +31 (0) Fax +31 (0) info@sysmex.nl Sysmex Belgium N.V. Park Rozendal, building A, Terhulpsesteenweg 6a, 1560 Hoeilaart, Belgium Phone +32 (0) Fax +32 (0) info@sysmex.be

3 In dit nummer Moleculaire diagnostiek bij acute myeloïde leukemie Peter Valk en Pauline Hogenbirk-Hupkes Acute myeloïde leukemie (AML) is een vorm van kanker in het beenmerg en bloed. De levensverwachting van AML-patiënten zonder behandeling is enkele weken tot maanden. AML komt voornamelijk voor bij volwassenen, maar wordt ook gediagnosticeerd bij kinderen. De gemiddelde leeftijd van patiënten is 60 jaar en de ziekte komt vaker voor bij mannen dan vrouwen. In Nederland krijgt 1 op de mensen AML. Sommige mensen met hematologische ziektebeelden zoals myelodysplastische syndromen (MDS) en myeloproliferatieve aandoeningen hebben een hoger risico op het ontwikkelen van AML. Ook bepaalde genetische aandoeningen, zoals het downsyndroom, geven een verhoogd risico voor het ontwikkelen van AML. Gezien de acute aard van de ziekte is het van belang snel een exacte diagnose te stellen en de juiste behandeling te starten. In de meeste gevallen is de oorzaak van deze bloedkanker onbekend. Wel is bekend dat er afwijkingen in het genetisch materiaal, het DNA, van de bloedcellen ontstaan. In de afgelopen jaren zijn een aantal van deze afwijkingen in AML geïdentificeerd. Deze genetische abnormaliteiten spelen een belangrijke rol bij de ontwikkeling van de leukemie, maar kunnen eveneens gebruikt worden om therapiekeuzes te maken. Een aantal van deze afwijkingen in het DNA heeft namelijk een prognostische waarde. De moleculaire diagnostiek is daarom in de afgelopen jaren een belangrijke leidraad geworden bij de keuze van behandeling voor patiënten met AML. Controle van urine op drugs Bij Diagnostiek voor U werd onlangs een klein feestje gevierd. Het medischdiagnostisch centrum in Eindhoven sleepte een grote opdracht binnen: de Europese aanbesteding urinecontroles en reagentia van de Dienst Justitiële Inrichtingen (DJI). De klus houdt in dat Diagnostiek voor U voor alle onder de DJI vallende instellingen in Nederland urinemonsters van cliënten gaat onderzoeken op het gebruik van drugs. Dat komt neer op 100 tot 200 onderzoeken per dag, bovenop de normale productie. Urine controleren op het gebruik van drugs, wat komt daar zoal bij kijken? Welke valkuilen kan de analist tegenkomen? En hoe gaat Diagnostiek voor U dit karwei aanpakken? Wieslab opent zijn deuren in Nederland Het Zweedse Wieslab is al jaren het grootste particuliere servicelab voor autoimmuundiagnostiek in Scandinavië. Nu in juni een vestiging van het Wieslab haar deuren opende in Nijmegen, biedt dit artsen en laboratoria in Nederland aanvullende mogelijkheden voor snelle en betrouwbare serologische testen in de diagnostiek van auto-immuunziekten. Technisch directeur Martin Salden van het Nijmeegse Wieslab wil met kwaliteit en competentie gedegen invulling geven aan het woord service in servicelab. Dus niet routinematig zo veel mogelijk testjes draaien, maar artsen daadwerkelijk ondersteuning bieden met wetenschappelijke informatievoorziening, bijvoorbeeld via scholing. Met het openingssymposium werd meteen de eerste stap gezet Verenigingsnieuws Nieuwe leden Van het bestuur CAO Vaste rubrieken NVML-cursussen NVML-nascholing NVML-congres Opleidingen Hogeschool van Arnhem en Nijmegen Avans+ Centrum voor Natuur & Techniek Centrum Bioscience en Diagnostiek Agenda Uitgave: Nederlandse Vereniging van biomedisch Laboratoriummedewerkers. NVML-leden ontvangen Analyse gratis. Copyright: Het overnemen van artikelen is alleen toegestaan na toestemming van de redactiecoördinator. De NVML aanvaardt geen enkele aansprakelijkheid voor de gepubliceerde advertenties; evenmin houdt het opnemen van advertenties en industriële informatie een aanbeveling van de NVML in. ISSN Analyse september

4 Moleculaire diagnostiek bij acute myeloïde leukemie Peter Valk, hoofd Moleculair Diagnostisch laboratorium, afdeling Hematologie, ErasmusMC, Rotterdam Pauline Hogenbirk-Hupkes, analiste specifieke taken Moleculair Diagnostisch laboratorium, afdeling Hematologie, ErasmusMC, Rotterdam Acute myeloïde leukemie (AML) is een vorm van kanker in het beenmerg en bloed. De levensverwachting van AML-patiënten zonder behandeling is enkele weken tot maanden. AML komt voornamelijk voor bij volwassenen, maar wordt ook gediagnosticeerd bij kinderen. De gemiddelde leeftijd van patiënten is 60 jaar en de ziekte komt vaker voor bij mannen dan vrouwen. In Nederland krijgt 1 op de mensen AML. Sommige mensen met hematologische ziektebeelden zoals myelodysplastische syndromen (MDS) en myeloproliferative aandoeningen hebben een hoger risico op het ontwikkelen van AML. Ook bepaalde genetische aandoeningen, zoals het downsyndroom, geven een verhoogd risico voor het ontwikkelen van AML. Gezien de acute aard van de ziekte is het van belang snel een exacte diagnose te stellen en de juiste behandeling te starten. In de meeste gevallen is de oorzaak van deze bloedkanker onbekend. Wel is bekend dat er afwijkingen in het genetisch materiaal, het DNA, van de bloedcellen ontstaan. In de afgelopen jaren zijn een aantal van deze afwijkingen in AML geïdentificeerd. Deze genetische abnormaliteiten spelen een belangrijke rol bij de ontwikkeling van de leukemie, maar kunnen eveneens gebruikt worden om therapiekeuzes te maken. Een aantal van deze afwijkingen in het DNA heeft namelijk een prognostische waarde. De moleculaire diagnostiek is daarom in de afgelopen jaren een belangrijke leidraad geworden bij de keuze van behandeling voor patiënten met AML. Wat is AML? AML wordt gekenmerkt door de ongecontroleerde groei en deling (proliferatie) van onrijpe myeloïde witte bloedcellen. Myeloïde staat voor met betrekking tot het beenmerg en myelon betekent merg. Normaliter worden in het beenmerg stamcellen aangemaakt die zich ontwikkelen tot verschillende typen bloedcellen met hun specifieke taken (figuur 1). Als gevolg van beschadigingen in het DNA van de stamcel blijft de ontwikkeling van de witte bloedcellen bij AML achter. De onrijpe cellen, de blasten, nemen snel in aantal toe. Deze opeenhoping van niet-functionele blasten verdringt in korte tijd de normale bloedaanmaak in het beenmerg. De onrijpe cellen kunnen in een later stadium ook in het bloed terechtkomen en uiteindelijk in de organen. Diagnose De diagnostiek van hematologische maligniteiten is een multidisciplinaire aangelegenheid. Bij een patiënt met een verdenking op AML wordt allereerst bloed- en beenmergonderzoek verricht. Bij een verhoogd leukocytenaantal, een sterk verlaagd aantal witte bloedcellen of een verlaging van het aantal rode bloedcellen of bloedplaatjes, zal het beenmerg allereerst morfologisch beoordeeld worden. In het geval van AML zal een homogeen patroon van meer dan 20% onrijpe blasten zichtbaar zijn (figuur 6A). Vervolgens wordt immunofenotypering, cytogenetica en moleculaire diagnostiek uitgevoerd om de juiste diagnose te stellen. Met immunofenotypering wordt bekeken of het inderdaad een AML is en niet een andere vorm van acute leukemie, zoals acute lymfatische leukemie (ALL) (figuur 1). Hierbij zijn differentiatiespecifieke markers, myeloïde en lymfoïde, essentieel. Met cytogenetisch en moleculairediagnostisch onderzoek wordt bepaald welke genetische abnormaliteiten aanwezig zijn in het DNA van de blasten van de patiënt met AML. Dit zijn verworven afwijkingen die alleen in de leukemiecellen aanwezig zijn. Traditioneel werd AML ingedeeld met behulp van de Frans-Amerikaans-Britse (FAB) classificatie op basis van morfologie en histochemie. De huidige classificatie van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) is niet alleen gebaseerd op de morfologische eigenschappen, maar tevens op immunofenotypering, cytogenetisch onderzoek en moleculaire diagnostiek. Cytogenetica In de afgelopen decennia zijn in de leukemiecellen aanwezige chromosomale afwijkingen, die kunnen worden aangetoond door middel van cytogenetisch onderzoek, gebruikt voor de risicoclassificatie van AML. Bijvoorbeeld: AML-patiënten met een specifieke fusie van chromosoom 8 en 21 (translocatie: t(8;21)) of een inversie van chromosoom 16 (inv(16)) worden ingedeeld in een groep met een relatief goede prognose. Echter, AML-patiënten met een verlies van chromosoom 7 met andere additionele chromosomale afwijkingen worden geclassificeerd als patiënten met een minder goede therapierespons. De therapie wordt dus op basis van dergelijke verworven afwijkingen aangepast. Bij een AML met een t(8;21) of inv(16) zal voor een relatief minder risicovolle behandeling gekozen worden, bijvoorbeeld chemotherapie. Echter, bij de behandeling van een AML met een verlies van chromosoom 7 met andere 196 Analyse september 2010

5 Figuur 1 Schematische weergave van de bloedcelvorming. De differentiatie van lymfatische en myeloïde cellen en de voorlopercellen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van AML en ALL. additionele chromosomale afwijkingen zal voor een risicovolle stamceltransplantatie worden gekozen. Patiënten met een acute promyelocytenleukemie (APL) hebben een specifieke fusie van chromosoom 15 en 17 (translocatie: t(15;17)), wat resulteert in expressie van het fusie-eiwit PML- RARA. RARA is de vitamine A-receptor. Patiënten met een t(15;17) krijgen, naast chemotherapie, vitamine A (ATRA), aangezien de leukemische cellen hierdoor verder uitrijpen. Deze gedifferentieerde leukemiecellen verdwijnen vervolgens uit het beenmerg. Door deze therapie hebben patiënten met APL een zeer goede prognose. Het is dus zeer belangrijk om voor aanvang van de therapie te weten of de t(15;17) aanwezig is. Dit kan door cytogenetisch onderzoek. Er is echter een relatief grote groep van patiënten die geen cytogenetische afwijkingen hebben (40-50% van de AMLpatiënten). Recentelijk zijn er nieuwe genetische afwijkingen in de maligne cellen van patiënten met AML geïdentificeerd. Dit zijn kleine puntmutaties, deleties en inserties van genetisch materiaal, die niet door cytogenetisch onderzoek kunnen worden aangetoond. Deze kleine DNA-afwijkingen kunnen eveneens belangrijke prognostische waarde hebben en worden gebruikt voor het classificeren van AML-patiënten zonder cytogenetische afwijkingen. De kleine DNA-veranderingen worden, door gebruik te maken van verschillende moleculair-biologische technieken, op het niveau van DNA of RNA bepaald binnen de moleculaire diagnostiek. Het merendeel van de bepalingen op de afdeling Hematologie van het ErasmusMC wordt uitgevoerd op RNA. Moleculaire diagnostiek Voor de moleculair-diagnostische analyse van een nieuwe AMLpatiënt wordt beenmerg en/of bloed afgenomen. Uit de witte bloedcellen wordt vervolgens RNA en DNA geïsoleerd. Het RNA is het uitgangsmateriaal waarmee met een reverse transcriptase polymerasekettingreactie (RT-PCR), gevolgd door andere moleculair-biologische technieken, genetische afwijkingen kunnen worden aangetoond. Alle bepalingen binnen de moleculaire diagnostiek worden in duplo bepaald om contaminaties uit te sluiten. Er worden ten minste twee ampullen van 10x10 6 witte bloedcellen in 1 ml RNA- Bee van het beenmerg en/of bloed van de patiënt weggezet. RNA-bee is een compleet ready-to-use reagens, dat gebruikt wordt voor de isolatie van totaal RNA uit humane cellen. Uit de twee ampullen RNA-Bee wordt RNA geïsoleerd. Ook de kwaliteit van het RNA is essentieel. RNA van hoge kwaliteit wordt na agarosegel-elektroforese gekenmerkt door een 28S en 18S RNAband (figuur 2A). Het geïsoleerde RNA wordt gebruikt voor de synthese van complementair DNA (cdna), een DNA-kopie van het RNA. Hierbij wordt gebruikgemaakt van het enzym reverse transcriptase (RT) (figuur 2B). Het cdna is de input voor een PCR (figuur 2C en 2D). Met behulp van een PCR is het mogelijk om uit relatief kleine vervolg op volgende pagina > Analyse september

6 Figuur 2 Reverse transcriptase polymerasekettingreactie. A. Na gelelektroforese wordt RNA van hoge kwaliteit gekenmerkt door een 28S en 18S RNA-band. B. RNA wordt omgezet tot complementair DNA (cdna) met het enzym reverse transcriptase (RT). Het cdna wordt vervolgens gebruikt als uitgangsmateriaal voor de RT-PCR. C. Een polymerasekettingreactie (PCR) is een herhaling van een driestaps proces. Bij 94 ºC worden de verbindingen in het dubbelstrengs DNA (DS DNA) verbroken en wijken de strengen uiteen (denaturation). Vervolgens kunnen twee targets specifieke primers (P1 en P2) binden aan één van beide strengen DNA (40-68 ºC, annealing). Vanuit deze primers zorgt het enzym Taq polymerase voor een snelle aangroei van de ketens (72 ºC, extension). D. In theorie verdubbelt bij elke cyclus de hoeveelheid targetgen, zodat het aantal kopieën exponentieel toeneemt. Naarmate de reactie vordert, ontstaan er alleen nog fragmenten met een specifieke lengte (template DNA: uitgangsmateriaal met target-dna). hoeveelheden (c)dna een meetbaar product te vormen. Binnen de moleculaire diagnostiek worden kwalitatieve en kwantitatieve PCR s uitgevoerd (RT-PCR en RQ-PCR). RT-PCR Bij de RT-PCR wordt de cdna-synthesereactie op RNA, geïsoleerd uit perifeer bloed en/of beenmerg van de patiënt, gevolgd door een kwalitatieve PCR (figuur 2). Hierbij wordt de aan- en afwezigheid van een genetische afwijking bepaald, maar niet de hoeveelheid. Voor de vervolganalyse van de RT-PCR-producten worden verschillende technieken gebruikt. RT-PCR-producten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van bijvoorbeeld gel-elektroforese of denaturing High Performance Liquid Chromatography (dhplc). Daarnaast kan gebruik worden gemaakt van sequentieanalyse om inserties, deleties en mutaties in een RT-PCR-product te bepalen. Bij gel-elektroforese worden RT-PCR-producten gescheiden op grootte door gebruik te maken van verschil in migratiesnelheid in een elektrisch veld op een agarosegel. De producten worden zichtbaar onder UV-licht door de toevoeging van etidiumbromide (EtBr) aan de agarosegel (figuur 6C en 7B). Met dhplc kunnen RT-PCR-producten gescheiden worden op grootte of als heteroduplex voor mutatiedetectie. Het principe van deze fragmentscheiding is het scheidend vermogen van de kolom om dubbelstrengs (ds) DNA te binden en vrij te geven. De affiniteit van de PCR-producten voor de kolom wordt bepaald door de grootte van het fragment en de aanwezigheid van mutaties, waardoor heteroduplexen ontstaan. Met deze analyse kunnen inserties, deleties en mutaties in een RT-PCR-product zichtbaar worden gemaakt (figuur 6B). Om inserties, deleties en mutaties in RT-PCR-producten te bevestigen na een dhplc-analyse wordt het betreffende RT-PCR-product gesequenced. Met behulp van een capillair elektroforesesysteem, dat fluorescent gelabelde DNAfragmenten kan scheiden, detecteren en analyseren, wordt de exacte volgorde van de basen van een RT-PCR-product bepaald. RQ-PCR De real-time quantitative PCR (RQ-PCR) is een kwantitatieve PCR op (c)dna. Met behulp van een kwantitatieve PCR is het mogelijk om in (c)dna het exacte aantal kopieën van een specifieke target te bepalen (figuur 3). Dit in tegenstelling tot een kwalitatieve PCR (RT-PCR). De target kan een fusietranscript van een translocatie zijn, expressie van een leukemie-gen of een leukemiespecifieke mutatie. Naast RQ-PCR op specifieke AML-targetgenen van een patiënt wordt een RQ-PCR uitgevoerd op een zogenaamd huishoudgen. Op deze manier kan de kwaliteit van het cdna en de exacte input van het RNA bepaald worden. Ook wordt een bekende verdunningsreeks van RNA met het target-gen meegenomen in de specifieke RQ-PCR. Met behulp van deze ijklijn kan het aantal kopieën van het target-gen in een AML-patiënt berekend worden en de gevoeligheid van de bepaling worden bepaald. 198 Analyse september 2010

7 AML-bepalingen binnen de moleculaire diagnostiek Binnen de moleculaire diagnostiek wordt onder andere de aanen afwezigheid bepaald van de fusietranscripten die ontstaan bij een t(8;21) en een inv(16) (tabel 1). Het pakket aan bepalingen dat wordt uitgevoerd voor een patiënt met AML is de afgelopen jaren uitgebreid met nieuwe, prognostisch relevante markers. De relevantie van deze markers is bevestigd in onafhankelijke klinische studies. Vervolgens zijn deze markers geïncorporeerd in lopende klinische AML-behandelingsprotocollen. Voorbeelden van nieuwe marker-genen, die zijn geassocieerd met een relatief goede prognose, zijn mutaties in het gen CEBPA en mutaties in het gen NPM1 in AML-patiënten met een wild-type FLT3-gen (figuur 4). Een ander voorbeeld is verhoogde expressie van het gen EVI1, wat karakteristiek is voor AML-patiënten met een slechte respons op therapie. Zoals eerder aangegeven voor de prognostisch relevante chromosomale afwijkingen, wordt de therapie van de AML-patiënten aangepast aan de hand van de aan- of afwezigheid van deze kleine moleculaire afwijkingen. HOVON De stichting Hemato-Oncologie voor Volwassenen Nederland (HOVON) houdt zich bezig met het verbeteren en bevorderen van behandelmethoden voor volwassen patiënten met hematologische kwaadaardige ziekten, zoals leukemie en lymfklierkanker. Binnen de HOVON worden AML-patiënten in studieverband behandeld. De AML-patiënten jonger dan 65 jaar worden binnen de HOVON102-studie ingedeeld in verschillende prognostische groepen, gebaseerd op klinische karakteristieken, response op initiële therapie, cytogenetica en moleculaire diagnostiek (tabel 1). Door de incorporatie van de moleculair-diagnostische markers in de lopende klinische HOVON-AML-studie, is de moleculaire analyse de belangrijkste leidraad geworden bij de keuze voor de wijze van behandeling van patiënten met AML. Behandeling en vooruitzichten Gezien de snelle ontwikkeling van AML is het voor de patiënt van belang kort na diagnose te starten met de behandeling. De keuze van behandeling is afhankelijk van een aantal factoren zoals hierboven beschreven, maar ook leeftijd en de algemene gezondheid van de patiënt zijn van invloed. Het heeft de voorkeur AML-patiënten in studieverband te behandelen, zoals binnen de HOVON. Momenteel wordt er veel onderzoek verricht naar nieuwe vormen van behandeling als toevoeging aan de standaardtherapieën. Met intensieve chemotherapie (inductietherapie) zal bij iedere AML-patiënt in eerste instantie worden geprobeerd om een complete remmissie (CR) te bereiken. Een CR wil zeggen dat er geen symptomen van actieve AML meer worden waargenomen. Er is sprake van CR als er minder dan 5% blasten in het beenmerg aanwezig zijn. Verder worden er normale bloedwaarden gemeten, dat wil zeggen meer dan 1,5x10 9 /l granulocyten en meer dan 100x10 9 /l bloedplaatjes. Vaak worden patiënten door de chemokuren nog zieker doordat deze behandeling de beenmergactiviteit onderdrukt, waardoor ook het risico op infecties toeneemt. Als een AML refractair is, wil dit zeggen dat er geen remissie wordt bereikt. De AML is dan ongevoelig voor de behandeling of een recidief reageert niet op verdere behandeling. Als een remissie is bereikt, wordt aanvullende chemotherapie gegeven. Deze consolidatiekuren moeten eventuele resterende leukemische cellen vernietigen en duren weken tot maanden. Bij CR kan ook, als vervolgbehandeling, een autologe of allogene stamceltransplantatie worden gegeven om de resterende leukemische cellen uit te schakelen. Dit hangt onder andere af van de aan- of afwezigheid van specifieke (cyto)genetische afwijkingen in de AML. Figuur 3 Kwantitatieve PCR (RQ-PCR). Het principe van een kwantitatieve PCR lijkt op een kwalitatieve PCR (figuur 2C). Naast de twee primers (rood/geel) wordt een targetspecifieke probe (groen) toegevoegd. De probe heeft een reporter (R) fluorochroom (5 -uiteinde) en een quencher (Q) (3 -uiteinde). De reporter wordt geactiveerd met een laser. Zolang de probe intact is, staat het reporter fluorochroom onder de uitdovende werking van de quencher. Tijdens de kwantitatieve PCR hechten de primers en de probe aan specifieke sequenties van het target-(c)dna (hybridization and extension). Gedurende de extensiefase wordt de probe afgebroken door de 5 3 exonuclease-activiteit van het Taq Polymerase (strand displacement en cleavage). Hierdoor staat de reporter niet meer onder invloed van de quencher met als gevolg een toename van het reporter fluorescentiesignaal. De hoeveelheid reporter fluorescentiesignaal is een maat voor de hoeveelheid van de target in het uitgangsmateriaal. vervolg op volgende pagina > Analyse september

8 met daarnaast abnormale granulocyten en megakaryocyten. Immunofenotypering toonde cellen aan met myeloïde markers, wat duidt op een myeloïde leukemie. Cytogenetisch onderzoek liet meerdere chromosomale afwijkingen zien, zonder prognostische waarde. Moleculaire diagnostiek toonde een verhoogde expressie van het EVI1-gen aan door middel van RQ-PCR (figuur 5). Op basis van dit laatste resultaat werd de patiënt, volgens de HOVON102-risicoclassificatie, ingedeeld in de categorie zeer slechte prognose (tabel 1). Er werd gestart met kuur I volgens HOVON102. Tien dagen later was er morfologisch een CR en werd gestart met kuur II. Momenteel loopt het onderzoek om een goede donor te vinden voor deze patiënt voor een stamceltransplantatie. Figuur 4 Overleving van AML-patiënten met NPM1-mutaties en/of FLT3 ITD. De afwezigheid van een mutatie wordt aangegeven met wild-type (wt). De AMLpatiënten met een NPM1-mutatie (NPM1 mut) en een FLT3 wild-type (FLT3 wt) hebben een relatief goede overleving (groene lijn). Tabel 1 Prognostisch relevante subgroepen in het HOVON102-AML klinisch protocol. In de HOVON102 worden vier prognostische subgroepen onderscheiden en in drie daarvan is de moleculaire diagnostiek essentieel. In deze tabel zijn andere klinische en cytogenetische kenmerken, die noodzakelijk zijn voor de complete classificatie van de AML-patiënten die worden geïncludeerd in de HOVON102- studie, niet opgenomen. Bij ongeveer 75% van de volwassen patiënten jonger dan 60 jaar wordt CR bereikt. Bij oudere patiënten is de kans op remissie 50%. Bij patiënten met een CR heeft 20 tot 40% na drie jaar geen AML-symptomen meer. Door stamceltransplantatie neemt het percentage significant toe. Als na enige tijd na CR de AML terugkomt, is er sprake van een recidief. Bij een recidief kan een AML-patiënt opnieuw met chemotherapie worden behandeld indien er eerder een goede reactie is geweest. Patiënten met een recidief en een geschikte donor komen in aanmerking voor een allogene stamceltransplantatie. Bij ongeveer de helft van de patiënten met CR keert de ziekte na één of twee jaar terug. Moleculaire diagnostiek bij AML-patiënten (casusbespreking) AML met zeer slechte prognose De volgende patiënt is vanuit een perifeer ziekenhuis doorverwezen naar de afdeling Hematologie op het ErasmusMC in verband met een verdenking op AML. In het beenmerg (BM) van de patiënt bevonden zich bij diagnose ruim 25% blasten AML met goede prognose In de periferie verscheen een patiënt op de spoedeisende hulp in verband met een afwijkend bloedbeeld. Patiënt was al een half jaar aan het kwakkelen, was moe, lusteloos en kwam tot niets. Morfologisch beenmergonderzoek liet ruim 62% blasten zien (figuur 6A) en de immunofenotypering was passend bij een AML. De patiënt werd doorverwezen naar de afdeling Hematologie op het ErasmusMC. Cytogenetisch onderzoek liet geen chromosomale afwijkingen zien. De moleculaire diagnostiek toonde een NPM1-mutatie aan, waarbij de FLT3 ITD niet aantoonbaar was (figuur 6B en 6C). Volgens de WHO en de HOVON102 werd deze patiënt geclassificeerd als AML met een relatief goede prognose (figuur 4, tabel 1). De patiënt is gestart met de therapie volgens HOVON102. Na kuur I was de patiënt morfologisch in CR en is vervolgens gestart met kuur II. Deze patiënt zal geen risicovolle stamceltransplantatie ondergaan, maar zal een derde chemokuur krijgen. AML met BCR-ABL-breukpunt Een chronische myeloïde leukemie (CML) in blastencrisis lijkt op een AML. Bij 95% van CML-patiënten wordt een specifieke fusie van chromosoom 9 en 22 gevonden (translocatie: t(9;22)) (figuur 7A), waardoor het BCR-ABL-fusie-eiwit ontstaat. Als adenosinetrifosfaat (ATP) bindt met dit BCR-ABL-fusie-eiwit wordt dit tyrosinekinase-eiwit geactiveerd, waardoor een toename van celdeling plaatsvindt. Een patiënt met CML wordt behandeld met imatinib. Imatinib is een specifieke remmer van het BCR-ABL-fusie-eiwit, die de abnormale signaaloverdracht binnen de leukemiecellen verlaagt. Dit komt doordat imatinib de plek van ATP inneemt, waardoor het BCR-ABL-fusie-eiwit wordt gedeactiveerd (figuur 8). Het gebruik van imatinib bij CML laat een overlevingspercentage van meer dan 90% zien. Een patiënt werd gediagnosticeerd met AML. De uit het beenmerg verkregen blasten (43%) bestonden voor 55% uit myeloïde voorlopercellen met enige kenmerken van uitrijping. Ook de immunofenotypering duidde op myeloïde cellen. Cytogenetisch onderzoek toonde, in één van de onderzochte metafases, een t(9;22) aan. Deze afwijking wordt in 1-2% van alle AML-gevallen gevonden. Het AML-pakket voor de moleculaire diagnostiek liet geen genetische afwijkingen zien, maar op basis van de cytogenetische bevindingen werd ook op het BCR-ABLfusietranscript getest dat aantoonbaar bleek (figuur 7B). AML met deze afwijking heeft in principe een slechte prognose. Er werd een behandeling ingesteld met intensieve chemotherapie met aanvullend imatinib. De patiënt werd vervolgens gevolgd door middel van een RQ-PCR voor het BCR-ABL-fusietranscript (figuur 7C). De patiënt liet in eerste instantie een response zien op de therapie. Echter, na verloop van tijd nam het aantal leukemiecellen sterk toe. De intensieve chemotherapie gecombineerd met imatinib was in dit geval niet effectief. Deze 200 Analyse september 2010

9 Figuur 5 Een AML-patiënt met verhoogde EVI1-expressie: een zeer slechte prognose. Resultaat van een RQ-PCR voor EVI1-expresssie op cdna van de AML-patiënt. X-as: aantal PCR-cycli; Y-as: EVI1-specifiek fluorescentiesignaal. A. Verdunningsreeks van de positieve controle voor de EVI1 RQ-PCR met de grens voor een verhoogde EVI1-expressie aangegeven met een stippellijn (1:10 verdunning (10-1 )). De hoeveelheid EVI1 wordt bepaald waar de exponentiële amplificatie van de PCR door de zogenaamde threshold (groene horizontale lijn) kruist (zie pijlen 10 0, 10-2 en 10-4 verdunning). B. EVI1 RQ-PCR op een beenmergmonster bij diagnose (in duplo) van de AML-patiënt met een verhoogde EVI1-expressie. Figuur 6 Een AML-patiënt met een NPM1-mutatie zonder een FLT3 ITD : een relatief goede prognose. A. Morfologie: naast de normale uitrijping, veel blasten (1), weinig granulocyten (2) en normale erythroblasten (3). B. NPM1 RT-PCR van een beenmerg-sample bij diagnose van een AML-patiënt gevolgd door dhplc WAVE-analyse. De AML-patiënt vertoont (in duplo, 1 en 2) vergelijkbare patronen als de positieve controlemonsters. De AMLpatiënt heeft een NPM1-mutatie. C. FLT3 ITD RT-PCR gel-elektroforeseanalyse van een beenmerg-sample bij diagnose (in duplo, 1 en 2) van een AML-patiënt zonder FLT3 ITD. MOLM13 is de positieve controle waarin naast een normaal allel een FLT3 ITD aantoonbaar is (HL60 negatieve controle, m-1 en m-2 (1:10 en 1:100 verdunningen van de FLT3 ITD positieve cellijn MOLM13 in HL60). Figuur 7 Een AML-patiënt met t(9;22). A. Schematische representatie van de t(9;22). Door de fusie van delen van chromosoom 9 en 22 ontstaat de t(9;22) en het BCR-ABL-fusiegen. B. BCR-ABL RT-PCR gevolgd door gel-elektroforeseanalyse van een beenmergmonster bij diagnose van een AML-patiënt met een BCR-ABL-genfusie. K562 is een cellijn met een t(9;22). In een verdunningsreeks van K562 is het BCR-ABL-fusietranscript nog aantoonbaar in een 1: verdunning (k-4). In het patiëntenmonster is het BCR-ABL-fusietranscript aantoonbaar (in duplo, 1 en 2). C. Grafiek van de BCR-ABL RQ-PCR-resultaten van beenmerg- en bloedmonsters (respectievelijk blauwe en rode lijn) van een patiënt met een BCR-ABL-genfusie bij diagnose en follow-up. vervolg op volgende pagina > Analyse september

10 Figuur 8 Werking van imatinib. A. ATP bindt aan BCR-ABL en substraten worden ongecontroleerd gefosforyleerd. B. Imatinib remt de activiteit van de BCR-ABL-kinase door te binden op de plaats waar normaal ATP bindt. Het substraat wordt niet meer gefosforyleerd. Er zullen geen signalen de cel in worden ingestuurd, waardoor de celdeling onder controle wordt gehouden. patiënt heeft vervolgens een stamceltransplantatie ondergaan en sindsdien zijn er geen BCR-ABL-positieve leukemiecellen meer aantoonbaar. Verbetering van de moleculaire diagnostiek Nieuwe genoombrede technologieën zijn recentelijk geïntroduceerd binnen het wetenschappelijk onderzoek aan hematologische maligniteiten. Deze nieuwe technologieën worden onder andere gebruikt om de diagnostiek en prognose van AML te verbeteren door bijvoorbeeld nieuwe subtypen in AML te identificeren. Binnen dit genoombrede translationeel onderzoek wordt gebruikgemaakt van gen- en micrornaexpressieanalyses, genotypering, methylatieprofilering en zeer recentelijk ook next generation sequencing (figuur 9). Genoombrede gen- en microrna-expressieanalyses Wij hebben eerder aangetoond dat AML op basis van genoombrede genexpressieanalyses met RNA-arrays, alsook microrna-expressieanalyses, kan worden ingedeeld in specifieke groepen (1,2). Deze groepen van AML-patiënten hebben specifieke genexpressieprofielen. Enkele van deze groepen worden gekarakteriseerd door bekende genetische afwijkingen, met prognostische waarde in AML, zoals een t(8;21), inv(16) of t(15;17), subtypen met een relatief goede prognose. Deze klassen van patiënten werden herkend door specifieke expressiepatronen, die dus tevens een prognostische waarde bevatten. Er werd ook een groep van patiënten geïdentificeerd zonder een bekende afwijking in alle patiënten, maar de patiënten in deze groep bleken slecht te reageren op therapie. De genoombrede genen microrna-expressieanalyses maken het mogelijk om nieuwe subtypen in AML te identificeren en geven tevens meer inzicht in bekende moleculair gedefinieerde AML-subtypen. De eerdergenoemde genexpressiepatronen kunnen worden gebruikt om groepen van patiënten met prognostisch relevante afwijkingen te voorspellen, waardoor bepaalde specialistische diagnostiek kan worden vervangen. Predictieanalyses op representatieve groepen van AML-patiënten laten zien dat het voorspellen van bepaalde afwijkingen, zoals de aanwezigheid van een t(8;21), inv(16) of t(15;17), op basis van genexpressieprofielen heel goed mogelijk is (3). Andere klinisch relevante markers kunnen niet worden voorspeld op basis van gen- en/of micrornaexpressiepatroon. Genoombrede expressieanalyses kunnen dus worden toegepast binnen de moleculaire diagnostiek, maar hiermee kan op dit moment niet het gehele spectrum aan relevante moleculair-diagnostische markers worden bepaald. Genoombrede genotypering Genoombrede genotypering met behulp van DNA-arrays wordt gebruikt voor het identificeren van kleine chromosomale regio s met verlies, winst of afwijkingen in de samenstelling van het genetisch materiaal. Deze chromosomale regio s kunnen een indicatie geven over de aanwezigheid van oncogenen en tumorsuppressorgenen. Een voorbeeld hiervan zijn de mutaties in het TET2-gen, die recentelijk zijn geïdentificeerd in AML en myeloproliferatieve ziekten, gebruikmakend van genoombrede genotypering (4). De genoombrede genotypering-analyses op AML hebben aangetoond dat in AML zonder cytogenetische afwijkingen relatief weinig kleine genetische afwijkingen worden gevonden (gemiddeld 4-6) per AML. AML blijkt dus een zeer stabiel genoom te hebben. Deze technologie maakt het echter zeer goed mogelijk om nieuwe afwijkingen in AML op te sporen. Genoombrede methyleringanalyses Met behulp van deze technologie wordt genoombreed gekeken of sequenties die belangrijk zijn voor genexpressieregulatie, zogenaamde promotoren, gemethyleerd zijn. Door methylatie van de promotor kan de expressie van deze genen verstoord worden. Ook hier zijn groepen van AML herkenbaar met specifieke genotypen met verschillende respons op therapie (5). Ook binnen bestaande subgroepen van AML zijn groepen herkenbaar met een uniek hypermethyleringsprofiel, namelijk AML met mutaties in het CEBPA-gen (6). In deze groep AML is de expressie van CEBPA geïnactiveerd als gevolg van promotermethylering. Toepassing van deze technologie kan eveneens leiden tot verfijning van de moleculaire diagnostiek. Next generation sequencing In de afgelopen twee jaar zijn de eerste publicaties verschenen over next generation sequencing. Met behulp van deze 202 Analyse september 2010

11 Figuur 9 Toepassing van nieuwe genoombrede technologieën voor verbetering van de diagnostiek en de opheldering van de biologie van AML. technologie kan de DNA-sequentie van het gehele genoom van bijvoorbeeld een AML bepaald worden. De eerste twee AMLgenomen die op deze wijze geanalyseerd zijn, toonden aan dat er veel mutaties in een AML aanwezig zijn (7,8). Echter, de meeste DNAmutaties worden niet teruggevonden in andere gevallen van AML. Het is daarom niet duidelijk of deze mutaties belangrijk zijn voor de ontwikkeling van AML. Een uitzondering hierop zijn de mutaties in het IDH1-gen, die aanwezig zijn in ongeveer 15% van alle AML. Deze mutatie heeft echter een beperkte prognostische waarde. De grote uitdaging voor de komende jaren is de geïntegreerde analyse van alle genoombrede datasets. Deze analyses zullen niet alleen de diagnostiek voor AML-patiënten verbeteren, maar kunnen eveneens meer inzicht geven in de ontwikkeling van AML en in de toekomst worden gebruikt voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën. De auteurs De afdeling Hematologie van het Erasmus MC richt zich op het stellen van de diagnose en de behandeling van patiënten met hematologische ziekten. Daarnaast verzorgt de afdeling onderwijs en doet wetenschappelijk onderzoek. De afdeling Hematologie heeft poliklinieken, dagbehandelingsfaciliteiten en klinische afdelingen. Daarnaast beschikt de afdeling over laboratoria voor hematocytologie, trombose en hemostase, bloedtransfusie, moleculaire diagnostiek, stamcelbewerking en over een hemaferese- en klinische researchunit. Het wetenschappelijk onderzoek is globaal georganiseerd binnen drie hoofdthema s: 1. bloedcelvorming en stamceltransplantatie; 2. maligne transformatie van hematopoëtische stamcellen; en 3. hemostase en trombose. Aan het laboratoriumonderzoek is een reeks van klinische studies verbonden. Deze klinische studies betreffen de evaluatie en invoering van nieuwe moleculair-diagnostische bepalingen, de toepassing van allogene stamceltransplantatie, de ontwikkeling van immuno(gen)therapie, evenals een breed scala aan klinische fase I- tot III-studies van nieuwe behandelingsmethoden voor diverse hematologische ziekten. Peter Valk is het hoofd van het Moleculair Diagnostisch laboratorium op de afdeling Hematologie van het ErasmusMC. Daarnaast is hij werkgroepleider en verricht wetenschappelijk onderzoek aan AML. Pauline Hogenbirk-Hupkes is analiste specifieke taken binnen het Moleculair Diagnostisch laboratorium op de afdeling Hematologie van het ErasmusMC. Naast de dagelijkse moleculaire diagnostiek voor leukemiepatiënten levert het Moleculair Diagnostisch laboratorium een bijdrage aan de ontwikkelingen van nieuwe technieken, onderzoek en studies ten aanzien van de moleculaire diagnostiek. Literatuur 1 Valk PJ, Verhaak RG, Beijen MA, et al. Prognostically useful gene-expression profiles in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 2004;350: Jongen-Lavrencic M, Sun SM, Dijkstra MK, et al. MicroRNA expression profiling in relation to the genetic heterogeneity of acute myeloid leukemia. Blood. 2008;111: Verhaak RG, Wouters BJ, Erpelinck CA, et al. Prediction of molecular subtypes in acute myeloid leukemia based on gene expression profiling. Haematologica. 2009;94: Delhommeau F, Dupont S, Della Valle V, et al. Mutation in TET2 in myeloid cancers. N Engl J Med. 2009;360: Figueroa ME, Lugthart S, Li Y, et al. DNA methylation signatures identify biologically distinct subtypes in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 2010;17: Wouters BJ, Jorda MA, Keeshan K, et al. Distinct gene expression profiles of acute myeloid/t-lymphoid leukemia with silenced CEBPA and mutations in NOTCH1. Blood. 2007;110: Mardis ER, Ding L, Dooling DJ, et al. Recurring mutations found by s equencing an acute myeloid leukemia genome. N Engl J Med. 2009;361(11): Ley TJ, Mardis ER, Ding L, et al. DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome. Nature. 2008;456: Internet Analyse september

12 Dinner tonight? Did you pass PeliCase? Sanquin Reagents introduces new PeliCase, the first Quality Survey to test your various lab skills in Blood Group Serology. And to compare yourself with colleagues worldwide. A great way to improve, test and match your personal lab skills four times a year. Will you be the first professional in your lab to be PeliCase Certified? For more information call or reagents@sanquin.nl This is how PeliCase works: 1) Buy an annual subscription via reagents@sanquin.nl 2) Four times per annum you receive a PeliCase panel, containing test samples and patient case details. 3) Submit your lab results to the designated site before the closing date. Explanation report immediately available. 4) After the closing date you can re-enter the site and see the anonymous test results of all participants - including your own performance in comparison with all participants. 204 Analyse september 2010 Blood and Beyond share (y)our science

13 Berichten Controle van urine op drugs Diagnostiek voor U wint Europese aanbesteding Bij Diagnostiek voor U werd onlangs een klein feestje gevierd. Het medisch-diagnostisch centrum in Eindhoven sleepte een grote opdracht binnen: de Europese aanbesteding urinecontroles en reagentia van de Dienst Justitiële Inrichtingen (DJI). De klus houdt in dat Diagnostiek voor U voor alle onder de DJI vallende instellingen in Nederland urinemonsters van cliënten gaat onderzoeken op het gebruik van drugs. Dat komt neer op 100 tot 200 onderzoeken per dag, bovenop de normale productie. Urine controleren op het gebruik van drugs, wat komt daar zoal bij kijken? Welke valkuilen kan de analist tegenkomen? En hoe gaat Diagnostiek voor U dit karwei aanpakken? Ook in inrichtingen die onder de DJI vallen, worden drugs gebruikt. Dat dit ongewenst is, mag duidelijk zijn. Al was het alleen maar omdat druggebruik kan leiden tot onvoorspelbaar en ongewenst gedrag van de cliënt. Het is daarom belangrijk om te ontdekken of iemand drugs heeft gebruikt, zodat er adequaat tegen kan worden opgetreden. Controle van de urine op drugs vindt dan ook frequent plaats bij alle inkomende cliënten en bij cliënten bij wie druggebruik wordt vermoed. Tot voor kort werden urinecontroles decentraal uitgevoerd; iedere PI (penitentiaire inrichting) kon de tests zelf doen of uitbesteden aan een (lokaal) laboratorium. In 2009 besloot de DJI, waaronder alle penitentiaire inrichtingen, justitiële jeugdinrichtingen, forensische psychiatrische centra en het Pieter Baan Centrum ressorteren, de urinecontroles te centraliseren en schreef daartoe een Europese aanbesteding uit. Diagnostiek voor U was een van de partijen die zich inschreven. We hebben de aanbesteding glansrijk gewonnen, mag ik wel zeggen, constateert afdelingsmanager laboratorium Gerard Moerenhout van Diagnostiek voor U tevreden. Er werd gekeken naar prijs en kwaliteit. Op beide terreinen waren we ruimschoots beter dan de andere inschrijvers. Daar zijn we trots op. Procedure De inrichtingen kunnen urinemonsters laten screenen op de volgende verdovende middelen: cannabis (hasj, weed), amfetamines, barbituraten, benzodiazepines (slaap- en kalmeringsmiddelen), cocaïne, methadon, opiaten (onder andere heroïne), xtc, lsd, pcp (fencyclidine) en alcohol. De urinemonsters (twee buizen, bij voorkeur de eerste ochtendurine) worden afgenomen op de locaties. Om fraude te voorkomen, gebeurt dit onder toezicht. Zodra de twee buizen bij het laboratorium zijn aangekomen, per reguliere post of per koerier, wordt de order aangemeld in het LIS. Eén buis wordt opgeslagen in de diepvries en twee weken bewaard voor eventueel herhalings- of bevestigingsonderzoek. Dat kan nodig zijn als de cliënt of de aanvrager bezwaar maakt tegen de uitslag van de eerste analyse. De tweede buis gaat direct door naar het lab, wordt door het verdeelstation in de juiste wachtrij gezet en gaat meteen daarna de analyser in. Deze leest de barcode en voert automatisch de gevraagde test of tests uit. De analyser stuurt de testresultaten rechtstreeks naar het LIS, waarna ze geïnterpreteerd en eventueel becommentarieerd worden. Al een kwartier later kunnen de inrichtingen de uitslag inzien via de internettoepassing Cyberlab. Het is belangrijk dat de uitslag snel beschikbaar is, stelt Gerard Moerenhout. De inrichtingen voeren een lik-op-stukbeleid. Ze willen cliënten die drugs hebben gebruikt snel confronteren met de testuitslag om indien nodig sancties te kunnen opleggen. Drie soorten tests De inrichtingen kunnen drie soorten tests aanvragen: een screening, een herhalingsonderzoek en een bevestigingsonderzoek. De screening is een immunoassay die snel en relatief goedkoop kan worden uitgevoerd. Deze routineprocedure is erop gericht om snel vast te stellen of een bepaalde stof of groep stoffen in de urine aanwezig is. De screening kan gevoelig zijn voor storende stoffen, waardoor mogelijk fout-positiviteit optreedt. Een berucht voorbeeld is maanzaad, dat een kleine hoeveelheid opiaten bevat. Als een gedetineerde grote hoeveelheden maanzaad heeft gegeten, kan dit een positieve opiatenuitslag tot gevolg hebben. Ook paracetamolcodeïne of een hoestdrankje met codeïne kan een ongewenste kruisreactie geven. Twijfelt de cliënt aan de uitslag, dan kan hij/zij een herhalingsonderzoek aanvragen met hetzelfde urinemonster uit de tweede buis. Mits tijdig aangevraagd, is de uitslag daarvan nog dezelfde dag beschikbaar. Is er daarna nog steeds twijfel, dan rest de mogelijkheid van een GC-MS-analyse (gaschromatografiemassaspectrometrie). Om te bepalen of een uitslag positief of negatief is, heeft elke drugtest zijn eigen afkapwaarde of cut-offpunt. De afkapwaarde van cannabis bijvoorbeeld is 50 ng/ml tetrahydrocannabinol, die van cocaïne 300 ng/ml benzoylecgonine. Alle uitslagen boven de afkapwaarde zijn positief, alles eronder negatief. Uiteraard is het cruciaal dat de meetresultaten honderd procent betrouwbaar zijn. Daarom wordt de analyser enkele malen per dag gecontroleerd. Bovendien wordt de machine voor elk nieuw lotnummer of indien de QC (kwaliteitscontrole) dit noodzakelijk maakt, opnieuw gekalibreerd. Bij de beoordeling van de controle worden de Westgard rules gehanteerd. De uiteindelijke goedkeuring gebeurt onder verantwoordelijkheid van de klinisch chemicus en een apotheker. Cannabis Verreweg de meest gebruikte drug is cannabis. Daarom gaan we hier iets dieper in op de testmethode op cannabisgebruik en de beoordeling van de uitslag. De cannabisbepaling is een immuno-assay waarbij sprake is van competitie tussen cannabis in het monster en met G6PDH (glucose- 6-phosphate dehydrogenase) gelabelde cannabis in het reagens. Er vindt een competitie plaats om te binden aan antilichamen met een vast aantal bindingsplaatsen. Door de binding aan de antilichamen neemt de enzymactiviteit van het G6PDH af. G6PDH is in staat vervolg op volgende pagina > Analyse september

14 om NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) om te zetten in NADH. De G6PDH-enzymactiviteit wordt spectrofotometrisch bepaald bij 340/412 nm. Als er veel cannabis in het monster aanwezig is, zal er minder gelabelde cannabis aan de antilichamen kunnen binden en zal er meer NAD omgezet worden in NADH. De verandering in enzymactiviteit is dus een maat voor de concentratie cannabis in het monster. Deze waarde wordt aangegeven in cannabinoïde ng/ml. Is de waarde hoger dan 50 ng/ml, dan is het oordeel zeker positief. Afbraak van cannabis Als de cannabistest een positief resultaat geeft, betekent dat niet automatisch dat de gedetineerde kortgeleden cannabis heeft gebruikt. Na het gebruik van cannabis heeft het lichaam tijd nodig om de afbraakresten af te voeren. De halfwaardetijd van cannabis (d.w.z. de tijd die het lichaam nodig heeft om de helft van de werkzame stof af te breken) varieert van 14 tot 38 uur. Dit is afhankelijk van onder andere gewicht, activiteiten en vochtinname. Bovendien worden bij chronische cannabisgebruikers de afbraakproducten ook opgeslagen in het vetweefsel, waar ze tot 80 dagen ( all-day use en overgewicht) na het laatste gebruik aanwezig kunnen blijven. Op het moment dat de betreffende persoon meer energie verbruikt, bijvoorbeeld tijdens sporten of bij koorts, komen die reststoffen vrij, onder meer in de urine. Een testuitslag zou dan kunnen suggereren dat die persoon onlangs cannabis heeft gebruikt, terwijl dat niet het geval is. Om een urine-uitslag goed te kunnen interpreteren, is het dus belangrijk om het gedrag en het gebruikspatroon van de betrokkene te kennen. Creatinine Bij de analyse door Diagnostiek voor U wordt ook altijd het creatininegehalte van de urine bepaald. Creatinine, een stof die ontstaat bij spierafbraak, wordt uitgescheiden in de urine en is maatgevend voor de concentratie van de urine. Donkere urine duidt op een hoge creatininewaarde, lichte urine op een lage creatininewaarde. Bij het beoordelen van uitslagen op het gebruik en/of hergebruik van cannabis is de cannabinoïde-creatinineratio een belangrijke parameter. Deze ratio wordt bepaald door de absolute waarde van de cannabinoïde te delen door de absolute waarde van de creatinine. Als de cannabinoïde-creatinineratio s van opeenvolgende urinemonsters worden uitgezet in een curve, kan worden vastgesteld of sprake is van hergebruik. Je hebt de cannabinoïdecreatinineratio nodig om de testuitslagen correct te interpreteren, zegt Gerard Moerenhout. Een cannabinoïdewaarde boven de afkap betekent niet altijd dat de cliënt onlangs cannabis heeft gebruikt. En andersom geldt hetzelfde. Daarom wordt aan de hand van de cannabinoïde-creatinineratio altijd een onderbouwd advies of interpretatie bij de uitslag meegegeven, met name indien de controle binnen vijf dagen na de vorige plaatsvindt. Pogingen tot fraude Sommige cliënten proberen hun urinemonster te manipuleren om de testuitslag te beïnvloeden. Ze voegen bijvoorbeeld aan het monster een vreemde stof toe zoals water, chloortabletten, azijn of zeep (in vitro-manipulatie). Ook komt het voor dat men extreem veel water drinkt om de urine te verdunnen (in vivo-manipulatie). Door elk monster te testen op ph-waarde en op creatininewaarde Gerard Moerenhout, afdelingsmanager laboratorium Diagnostiek voor U. 206 Analyse september 2010

15 kunnen deze pogingen tot fraude worden ondervangen. Als de ph-waarde lager is dan 4 of hoger dan 8, heeft de cliënt mogelijk bewust geprobeerd het urinemonster te vervuilen met zuur of een basische stof. Dit kan de uitslag beïnvloeden en is mogelijk ook een aanwijzing dat de cliënt iets te verbergen heeft. Ook als de creatininewaarde extreem laag is, wordt de cliënt aangesproken. Normaal heeft ochtendurine een creatininewaarde van >5 nmol/l. Bij een waarde van <2 nmol/l beginnen twijfels te rijzen. Bij een waarde lager dan 0,4 nmol/l is zeker geen sprake van urine, maar eerder van water of thee. Diagnostiek voor U Diagnostiek voor U verricht jaarlijks zo n tot diagnostische onderzoeken voor huisartsen en instellingen. Het beschikt over een modern laboratorium voor bloeden urineonderzoek. Diagnostiek voor U heeft een ruime ervaring met drugsanalyses. Voorheen voerde het laboratorium al drugstests uit voor TBS-inrichting De Grote Beek in Eindhoven en voor een vijftal penitentiaire inrichtingen. Met ingang van 2010 dus voor alle instellingen die onder de Dienst Justitiële Inrichtingen vallen. Het zal gaan om 100 tot 200 tests per dag. Dat is een groei van de productie van zo n 10%, aldus Gerard Moerenhout: Om te kunnen voldoen aan de extra vraag zetten we meer mensen in en vinden aanpassingen in de bezetting plaats. De tests worden uitgevoerd op een Abbott C8000 analyser. Mocht er extra capaciteit nodig zijn, dan beschikt Diagnostiek voor U ook over twee Ci8200-machines, die normaliter worden ingezet voor bloedonderzoek. In noodgevallen kan uitgeweken worden naar het laboratorium van het St. Jans Gasthuis in Weert, onderdeel van Diagnostiek voor U, waar een C8000 en een Ci8200 klaarstaan als back-up. De intentie is om eind dit jaar voor de locatie in Eindhoven nieuwe analysers met een grotere capaciteit aan te schaffen. Naast bloed- en urineonderzoek verricht Diagnostiek voor U tal van andere metingen en onderzoeken, waaronder röntgenonderzoek, echo s, hartfilmpjes, longfunctietesten en botdichtheidsmetingen. Diagnostiek voor U beschikt over zowel een CCKL- als een ISOaccreditatie en is lid van de Samenwerkende Artsenlaboratoria Nederland. Nu op De complete jaargangen van Analyse 2008 en 2009! In pdf-formaat, zodat u ieder nummer nog eens van voor tot achter kunt doornemen. Ook vindt u hier per jaargang vanaf 2003 een index gerubriceerd op titels en auteurs. Ga dus naar: NVML Wilhelminapark 52, 3581 NM Utrecht. Telefoon: Telefonisch bereikbaar: maandag tot en met donderdag van 9:00 tot 14:00. Fax: nvml@nvml.nl. Website: Bereikbaarheid bureaumedewerkers Ria Blom (organisatie nascholing): maandag, dinsdag en donderdag. Marja Pospiech (beroepsinhoudelijke belangenbehartiging en algemene zaken): maandag tot en met donderdag. Alice Gosselt-Imming (organisatie nascholing): maandag, dinsdag en donderdag. Jenny Schoemaker (voorlichting en sociale belangenbehartiging): dinsdag t/m donderdag. Lidmaatschap Voor informatie en ledenadministratie kunt u contact opnemen met het bureau van de NVML. Contributie Lees het aanmeldingsformulier op de website: www. nvml.nl. Opzegging Schriftelijk vóór 1 november van het lopende jaar per post, fax of . U ontvangt hiervan een bevestiging binnen 10 werkdagen. Omdat niet al het communicatieverkeer probleemloos verloopt, adviseren wij u bij het uitblijven van de bevestiging telefonisch contact op te nemen met het bureau van de NVML. Bestuur Voorzitter mw. M.J. Egbers, afdeling Medische Microbiologie, Isala Klinieken Zwolle Penningmeester mw. M.A.M. Verdaasdonk, afdeling Pathologie, UMC Utrecht Secretaris dhr. R. de Nooijer, Middelbaar Laboratorium Onderwijs, locatie Hogeschool Leiden Lid mw. N. IJzerman, hoofd KAM-dienst, Medial, Hoofddorp Adviseurs mw. dr. S.M. van Ham, Amsterdam. Celluliar immunoloog dr. J.A. Kaan, Utrecht. medisch microbioloog dr. E.C.M. Ooms, Den Haag. patholoog prof. dr. C.G.J. Sweep, Nijmegen klinisch chemicus NVML-Commissies en werkgroepen Commissie Internationale Contacten Contactpersoon: Marja Pospiech, bureau NVML. Commissie Kwaliteit Contactpersoon: Marianne Schoorl. Commissie Nascholing Contactpersoon: Alice Gosselt-Imming en Ria Blom, bureau NVML. Commissie Onderwijs Contactpersoon: Marja Pospiech, bureau NVML. Redactiecommissie Contactpersoon: Bart Krekels, bartkrekels@hetnet.nl Werkgroep Registratie Contactpersoon: Marja Pospiech, bureau NVML Commissie Sociale Belangen Contactpersonen: Marja Pospiech en Jenny Schoemaker, bureau NVML. Werkgroep Hoofdanalisten Medische Microbiologie (WHAMM) Contactpersoon: Marja Pospiech, bureau NVML

16 Eerste Hulp Bij Overstappen? Elke dag hoort anders te zijn, maar wat als je werk op woensdag niet meer te onderscheiden is van dat op vrijdag? Dan ben je helemaal toe aan TMI, dé detacheerder in de Zorg. Want daar is elke dag anders. Je bepaalt zelf hoeveel je wilt werken en dat steeds op projectbasis in interessante nieuwe omgevingen, maar wel mét een vast contract. Zo sta je elke dag weer voor nieuwe uitdagingen en dat is wel zo interessant. En TMI is altijd op zoek naar de meest gemotiveerde mensen in de zorg, dus meld je nu aan op voor Eerste Hulp bij Overstappen. Je kunt ons ook mailen op of bellen op Eerste Hulp Bij Overstappen? Ga dan snel naar Wel eens bloedlichaampjes met het blote oog geteld? TMI_Ad_81x132_koffer.indd :32:24 Als internationale ontwikkelingsorganisatie zijn wij op zoek naar medisch analisten die hun kennis en kunde willen inzetten in Afrika of Azië. Primair werk je aan de opbouw en ontwikkeling van laboratoria in ziekenhuizen. Je houdt je bezig met het geven van training en bijscholing, het ontwikkelen van protocollen en het interpreteren en communiceren van labresultaten. Maar dan wel zonder de moderne middelen die je hier hebt. Ben je creatief, een doorzetter en heb Medisch analist je een afgeronde hlo-opleiding met minimaal twee jaren werkervaring? En heb je interesse in wat wij te bieden hebben? Kom dan naar de informatiemiddag op zaterdag 16 oktober. Schrijf je in op Er is werk aan de wereld. 208 Analyse september 2010

17 Van het bestuur Bruisend Het klinkt ontzettend cliché, maar wat gaat de tijd snel. Ik heb zoals veel Nederlanders mijn vakantie in ons kikkerlandje gevierd. Heerlijk op een bungalowpark zitten en uitstapjes maken met het gezin. Hopelijk heeft u net als ik genoten van het zomerweer en de batterij weer opgeladen. Het is belangrijk om nieuwe energie op te doen. Rust en ontspanning zorgen ervoor dat je het aankomend werkjaar weer enthousiast en bruisend tegemoet kunt gaan. Ook als bestuurder van de NVML krijg je te maken met spanningen en uitdagingen. Niet alleen de bestuurvergaderingen zijn levendig, maar ook de brainstormsessies van werkgroepen. We hebben in de afgelopen tijd bijeenkomsten gehad van de werkgroep EPBS. Daarnaast zijn we druk aan het brainstormen over wat we gaan doen met ons 65-jarig jubileum. We gaan dat combineren met de vakbeurs De datum en plaats zijn al bekend, namelijk donderdag 31 maart 2011 in zalencentrum CineMec te Ede. Kijk op de website voor de komende nascholingen en congressen. Of om een eerder nummer van Analyse nog eens in te zien, want de jaargangen 2003 tot en met 2009 zijn ook online te raadplegen. Zoals u waarschijnlijk al weet, zijn wij verbonden aan onze Europese vereniging de EPBS (zie De EPBS is een overkoepelende non-profitorganisatie van bijna alle Europese verenigingen van laboratoriummedewerkers. Zij organiseert regelmatig zelf meetings en is op veel biomedische congressen vertegenwoordigd. De EPBS houdt zich onder andere bezig met Europese samenwerking tussen de biomedische beroepsverenigingen, onderwijs, professionalisering van het beroep analist etc. Het bestuur van de NVML is verheugd dat mw. Geurts-Moespot (lid Commissie Internationale contacten) genomineerd is voor een functie binnen het bestuur van de EPBS. Als NVML hebben wij een tender ingediend om in 2011 de EPBS-meeting in Nederland te mogen organiseren. We blijven aan de weg timmeren. Kortom, de NVML is een bruisende vereniging! Roel de Nooijer, bestuurslid CAO Werknemers die onder de cao Ziekenhuizen vallen, ontvangen per 1 juli % extra salaris. Dit is conform de afspraken die in de cao Ziekenhuizen zijn gemaakt. Commissie Sociale Belangen NVML Uitgave Nederlandse vereniging van biomedisch laboratoriummedewerkers NVML leden ontvangen Analyse gratis. Voor vragen over contributie, adreswijzigingen of andere administratieve zaken rond Analyse kunt u contact opnemen met het bureau van de NVML. Redactiecoördinatie en eindredactie Bart Krekels Tekst & Redactie redactie@nvml.nl of bartkrekels@hetnet.nl Redactie mw. M. de Bie, Pathologie, St. Elisabeth Ziekenhuis, Tilburg mw. R. Blom, afdeling Nascholing NVML dhr. J.J.M. Heijnen, afd. Pathologie, Reinier de Graafgroep, Delft mw. I. Linde, Infectieziekten, GGD, Amsterdam dhr. R. Lindenbergh, Klinisch Chemisch en Hematologisch Laboratorium, Amphia Ziekenhuis Breda mw. A. Luidens, afdeling Cytologie/Klinische Pathologie, St. Elisabeth Ziekenhuis, Tilburg mw. P.J.J. Melsen, afd. Medische Microbiologie, AMC, Amsterdam mw. F.C. de Ruijter-Heijstek, Ede mw. dr. W.W.J. van de Sande, Medische Microbiologie en Infectieziekten, Erasmus MC, Rotterdam Coverfoto Vormgeving en opmaak Celina Koekenbier Druk Verweij Communicasa Groep Advertentie-exploitatie mw. F. de Ruijter-Heijstek telefoon: fax: f.deruijter@chello.nl Oplage 3250 exemplaren Advertenties & kopij Geldend advertentietarief: Tarievenlijst 2010 Sluitingsdatum advertenties Voor nr. 8: dinsdag 14 september. Inleverdata kopij De redactie ziet korte berichten (bijvoorbeeld over opleidingen) voor Analyse 8 graag uiterlijk op 13 september tegemoet. Analyse 8 verschijnt op donderdag 30 september en Analyse 9 op donderdag 4 november. Nieuwe leden Grenzebach Smit, W. Leids Universitair Medisch Centrum Leiden Kerkhof-Post, M. Ikazia Ziekenhuis Rotterdam Miltenburg-van de Neut, E. Academisch Medisch Centrum Amsterdam Mollema-Kooi, M.L. UMC Groningen Groningen Roden, M. van Stichting Medische Diagnostiek, MEDIAL Hoofddorp Straten, M. van Streeklaboratorium voor de Volksgezondheid Haarlem Strelistki, R. CMH/U Diagnostics Utrecht Schultheiss, M.E. Onze Lieve Vrouwe Gasthuis Amsterdam Wingerden, J.H.J. van CMH/U Diagnostics Utrecht Wolders, L.R. Haarlem

18 NVML Nederlandse Vereniging van biomedisch Laboratoriummedewerkers Ja! Ik word lid contributie 2010 (per jaar)* gediplomeerde leden 79,50 student-leden gratis leden met reductie** 41,00 * bij aanmelding worden gedeelten van het jaar pro rato berekend ** gepensioneerden, 2e lid (echt)paar Graag meesturen: Gediplomeerden bij voorkeur een kopie van het diploma (je hebt dan stemrecht in de Algemene Ledenvergadering en kunt zitting nemen in commissies en bestuur). Studenten een inschrijfbewijs van hun opleiding voor (bio)medisch laboratoriummedewerker. Naam: Voorletters: Geb.datum: M V Adres: Postcode: Tel.nr. thuis: woonplaats: thuis: Bank-/gironr.: Werkzaam in te Tel.nr. werk: werk: Ik wil in aanmerking komen voor reductie op de contributie i.v.m. Ik ben: In het bezit van het diploma: In opleiding voor: MBO medische richting HBO medische richting WO, medische richting anders, nl.: Datum diplomering: Ik val onder de: CAO-Ziekenhuizen CAO-Academische ziekenhuizen CAO-GGZ CAO-Verpleging en Verzorging Afstudeerrichting: klinische chemie medische microbiologie cyto/histopathologie alg. medisch medische biologie biochemie immunologie anders, nl.: Plaats/datum: anders, nl.: Het aanmeldingsformulier plus bijlagen kunt u sturen aan: Ledensecretariaat NVML, Antwoordnummer 625, 3500 ZJ Utrecht (postzegel is niet nodig) Doorlopende machtiging algemeen Ondergetekende machtigt de Nederlandse Vereniging van biomedisch Laboratoriummedewerkers (NVML) om van zijn/haar rekening een bedrag af te schrijven inzake de contributie voor het lidmaatschap van de NVML. Naam: Adres: Postcode en plaats: Bank-/gironr.: Handtekening: Datum: 210 Analyse september 2010 Indien niet akkoord met de afschrijving kan binnen 30 kalenderdagen een verzoek tot terugboeking bij bank of giro worden ingediend. Intrekking van de machtiging dient tijdig schriftelijk, per fax of mail, te worden gericht aan de NVML.

19 Berichten Wieslab opent zijn deuren in Nederland Het Zweedse Wieslab is al jaren het grootste particuliere servicelab voor auto-immuundiagnostiek in Scandinavië. Nu in juni een vestiging van het Wieslab haar deuren opende in Nijmegen, biedt dit artsen en laboratoria in Nederland aanvullende mogelijkheden voor snelle en betrouwbare serologische testen in de diagnostiek van auto-immuunziekten. Technisch directeur Martin Salden wil met kwaliteit en competentie gedegen invulling geven aan het woord service in servicelab. Dus niet routinematig zo veel mogelijk testjes draaien, maar artsen daadwerkelijk ondersteuning bieden met wetenschappelijke informatievoorziening, bijvoorbeeld via scholing. Met het openingssymposium werd meteen de eerste stap gezet. Nederland is een servicelab voor diagnostiek van auto-immuunziekten rijker. Op 22 juni vierde het Wieslab sinds 2004 een divisie van Euro-Diagnostica met een feestelijk symposium de officiële opening van zijn vestiging in Nijmegen. De algemeen directeur van Euro-Diagnostica, Jan Erik Collin, hanteerde de schaar om het lint door te knippen dat op symbolische wijze gespannen was voor een foto van het gloednieuwe lab op de Nijmeegse campus. De ruim vijftig genodigden die getuige waren van deze handeling, kregen vervolgens een interessante mix aan gastsprekers voorgeschoteld. Grote namen op het gebied van onder meer reumatologie, complement(systeem) en medische immunologie gaven een beschouwing over de ontwikkelingen binnen hun vakgebied in het licht van auto-immuniteit (zie kader 1). Particulier laboratorium Laboratoriumdiagnostiek voor auto-immuunziekten vindt doorgaans plaats binnen algemene klinisch-chemische laboratoria en gespecialiseerde immunologische laboratoria. Hoewel de laatste veelal verbonden zijn aan universitaire centra bestaan er ook particuliere laboratoria die deze diensten bieden. Een bekend voorbeeld hiervan is het in Malmö gevestigde Wieslab, dat in 1991 werd opgericht door prof. Jörgen Wieslander. Het Zweedse servicelab vervult een leidersrol op het gebied van auto-immuundiagnostiek en ontvangt monsters uit geheel Noord-Europa. Dat de onderneming succesvol is, blijkt verder uit het feit dat het Wieslab inmiddels is uitgegroeid tot het grootste particuliere laboratorium in Scandinavië. Jan Erik Collin, algemeen directeur Euro-Diagnostica, en Martin Salden, directeur Wieslab Nederland, hebben zojuist Wieslab Nederland officieel geopend. Analyse september

20 Historisch perspectief Het grote succes op Scandinavische bodem deed de directie van Euro-Diagnostica besluiten het Wieslab-concept ook in Nederland te introduceren. Vanuit historisch perspectief is Nederland een zeer logische locatie, aldus Martin Salden, technisch directeur van het Nijmeegse Wieslab. De R&D van Euro-Diagnostica bevindt zich namelijk al sinds 1992 in Arnhem. Ik was daar als technisch directeur verantwoordelijk voor de ontwikkeling van auto-immuuntesten die gebaseerd waren op synthetische peptiden. Om deze testen te valideren, waren grote hoeveelheden patiëntensera nodig. Daar was via ziekenhuizen zo moeilijk aan te komen dat ik mijn Zweedse baas adviseerde een particulier laboratorium op te kopen dat hierin kon voorzien. De keuze voor het Wieslab lag gezien de opgebouwde reputatie het meest voor de hand. Reumatest In april vestigde het Wieslab zich in het gloednieuwe Mercatorgebouw op de Nijmeegse universiteitscampus. Daarmee keerde Salden terug naar de plek waar zijn wetenschappelijke carrière begon. Dit is de omgeving waar hij in 1976 promoveerde in de biochemie en als waarnemend hoofd van het hematologisch lab een aantal jaren werkzaam was. De Nijmeegse campus was ook de plaats waar een samenwerking ontstond die leidde tot de ontwikkeling van de belangrijkste diagnostische test voor de meest voorkomende auto-immuunziekte, reumatoïde artritis (RA). Tijdens zijn promotieperiode leerde hij bij de vakgroep biochemie de huidige emeritus prof. Van Venrooij kennen. Jaren later kruisen de paden van hun onderzoek zich als hij een lezing van Van Venrooij bezoekt. Salden vertelt de spreker na afloop van diens presentatie dat hij waarschijnlijk het soort autoantilichamen in zijn vriezer heeft liggen die Van Venrooij met vruchteloze pogingen probeert op te wekken in proefdieren. Het was een toevalligheid die resulteerde in een langdurige samenwerking, waaronder de door STW gefinancierde zoektocht naar de antigenen die betrokken zijn bij RA. De ontdekking dat autoantistoffen van een patiënt met RA gericht zijn tegen het aminozuur citrulline bracht het onderzoek in een stroomversnelling. Het leidde uiteindelijk, in 2000, tot de lancering van de eerste test voor reuma (CCP-test). Bovendien had de verworven kennis tot gevolg dat het servicelab zijn analysepakket voor reuma-antistoffen kon uitbreiden. Op basis van cyclisch gecitrullineerde peptiden (CCP) kon namelijk een uiterst gevoelige en specifieke ELISA ontwikkeld worden. Deze CCP2-ELISA behoort tot het assortiment van ruim 110 analyses die bij het Wieslab aangevraagd kunnen worden. Omdat een groot aantal testen door de eigen R&D is ontwikkeld, is diepgaande kennis opgebouwd van de bijbehorende ziektebeelden. Het is niet ons doel om routinematig zo veel mogelijk testjes te draaien, maar om artsen te ondersteunen en goede voorlichting te geven, legt Salden uit. Het Wieslab wil zich nadrukkelijk ook wetenschappelijk profileren, met name wanneer zich belangrijke ontwikkelingen voordoen op het gebied van auto-immuunziekten. Ik ben van plan in de toekomst een vervolg te geven aan het juni-symposium om zodoende een stuk scholing te verzorgen op dit gebied. iphone-applicatie In dat kader van wetenschappelijke informatievoorziening past ook de uitgebrachte iphone-applicatie* van The Guide to Autoimmune Testing, het door Wieslab uitgebrachte handboek met een overzicht van auto-immuuntesten, waarvan de eerste versie in 1996 verscheen. De elektronische versie kan op twee manieren worden gebruikt. Zo kan bij het vermoeden van een auto-immuunziekte eenvoudigweg de naam van de ziekte worden ingevoerd, waarna een lijst verschijnt met aanbevolen analyses. Bij het selecteren van de analysenaam wordt dan gedetailleerde informatie over de specifieke test zichtbaar. Maar het omgekeerde is ook mogelijk. Bij een positief analyseresultaat kan de gerelateerde ziekte worden gezocht, doordat na selectie van de analysenaam een lijst met ziekten gepresenteerd wordt. Cruciaal Naast een uitgebreid aanbod aan standaard klinisch-immunologische testen onderscheidt het Wieslab zich onder meer met diagnostiek voor het paraneoplastisch syndroom en bepalingen voor het eiwit titine en een twintigtal neurologische antistoffen. Daarnaast kunnen citobepalingen voor systemische vasculitis zelfs 24 uur per dag, 7 dagen in de week aangevraagd worden. Jan Erik Collin schetste op de symposiumdag het grote belang van deze service. Ik herinner me een spoedbepaling om 2 uur tijdens een oudejaarsnacht. Een koerier leverde na een rit van honderden kilometers in Malmö een bloedbuis af voor een citobepaling die verband hield met een ernstige niervasculitis. Op zo n moment is een snel resultaat cruciaal voor de keuze van een juiste behandelmethode. Het kan voorkomen dat een patiënt overlijdt of de rest van zijn leven vastzit aan nierdialyse. Na afloop van het symposium was er voor iedere bezoeker een papieren versie van de handige Guide to Autoimmune Testing, plus een aanvraagformulier voor de aangeboden analyses en een bijbehorende envelop voor verzending van biologische materialen. Het Wieslab Nijmegen is er overduidelijk helemaal klaar voor: 24 uur per dag, zeven dagen in de week! * voor informatie over de iphone-applicatie en voor downloaden ervan, zie Analyse september 2010