Bepaling van het kankerrisico voor de patiënt verbonden aan een computed tomografie onderzoek via biomerkers voor lage dosis blootstelling.

Transcriptie

1 Bepaling van het kankerrisico voor de patiënt verbonden aan een computed tomografie onderzoek via biomerkers voor lage dosis blootstelling. Eva Van der Stock Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Hubert Thierens Vakgroep: Medische Basiswetenschappen Academiejaar

2

3 Bepaling van het kankerrisico voor de patiënt verbonden aan een computed tomografie onderzoek via biomerkers voor lage dosis blootstelling. Eva Van der Stock Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Hubert Thierens Vakgroep: Medische Basiswetenschappen Academiejaar

4 De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef. 20 mei 2011 Eva Van der Stock Prof. Dr. H. Thierens

5 Voorwoord Vooraleer over te gaan tot de werkelijke thesis wil ik eerst enkele mensen hartelijk bedanken voor hun medewerking en steun waardoor het onderzoek en het schrijven van deze thesis goed is kunnen verlopen. Om te beginnen dank ik mijn promoter, Prof. Dr. H. Thierens, voor zijn enthousiasme en zijn inzet voor het onderzoek en voor de kans die ik kreeg om deze studie uit te voeren. In het bijzonder wil ik mijn begeleidster MSc Laurence Beels ten zeerste bedanken om steeds de tijd te nemen om geduldig mijn vragen te beantwoorden en al het nodige uit te leggen. Ze zorgde ervoor dat mijn zelfvertrouwen en mijn vermogen om kritisch te denken groeide gedurende het jaar in het labo en dat ik me goed voelde in de laboratoriumomgeving. Zonder haar kon deze thesis nooit tot een goed einde gebracht worden. MSc Iris Rossaert wil ik zeker ook bedanken, vooral voor de vele moeite om de cellen te scoren op de Metafer en ook om mij te helpen bij de analyse en interpretatie van de data. Dr. Klaus Bacher was een grote hulp bij de statistiek, dus hem wil ik ook bedanken. Verder is eveneens Dr. Smeets bedankt voor de moeite die hij gedaan heeft om de gegevens van de oncologische patiënten op te zoeken en door te geven. Uiteraard zijn alle patiënten die meewerkten aan deze studie hartelijk bedankt, want zonder hen zou er geen in vivo onderzoek kunnen uitgevoerd worden, en ook de verple(e)g(st)ers van de dienst CT (0K12) van het UZ Gent voor hun medewerking bij de bloedafnamen en voor de sfeer tijdens het wachten op geschikte patiënten. Mijn klasgenoten Julie, Assunta, Lieselotte, Jolien en Femke wil ik bedanken voor de gemoedelijke sfeer in ons computerkamertje en voor de hulp en motivatie tijdens het schrijven van de thesis. Ook wil ik iedereen die in de labo s werkte bedanken voor de samenwerking bij onder andere het gebruik van het materiaal. Mijn ouders zijn een grote en belangrijke steun geweest voor mij gedurende de hele opleiding en ook tijdens de thesis. Dankzij hen heb ik deze opleiding kunnen volgen en heb ik de motivatie gehad om steeds hard te blijven werken. Uiteindelijk wil ik nog een zeer belangrijk persoon bedanken, namelijk mijn vriend Jef, die mij altijd heeft gesteund en gemotiveerd tijdens het studeren en tijdens het schrijven van deze thesis, en altijd vertrouwen in mij had. I

6 Bedankt! Inhoudstafel Voorwoord... I Inhoudstafel... II Lijst van figuren... V Lijst van tabellen... VI Afkortingen... VII Samenvatting... 1 Hoofdstuk 1: Inleiding Stralingsbelasting CT Werking en principe van CT Gebruik van intraveneus contrastmedium bij CT Risico s verbonden aan lage dosissen X-stralen Soorten effecten van ioniserende straling Stralingsgevoeligheid van kinderen Lineair No-Treshold (LNT) model Ontstaan van DNA schade Herstel van DNA schade Detectie van DNA schade Fosforylering van H2AX eiwitten Defosforylering van γ-h2ax γ-h2ax als biomerker voor blootstelling aan een lage dosis ioniserende straling Moleculaire biomerkers Principe polymerase chain reaction (PCR) Genen Doelstelling masterproef II

7 Hoofdstuk 2: Materiaal en methoden Inleiding Studiepopulatie Staalafname Foci T-lymfocyt isolatie Lymfocyten tellen γ-h2ax immuunkleuring Scoring van γ-h2ax foci Kwantitatieve real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR) Isolatie van mononucleaire cellen RNA extractie uit mononucleaire cellen RNA omzetten naar cdna Primers Reactiemix voor RT-PCR QRT-PCR programma In vitro bestraling kvp X-stralen Co γ-stralen Berekening bloeddosis Data analyse en statistische analyse γ-h2ax foci QRT-PCR Hoofdstuk 3: Resultaten Foci Experiment contrastmedium (in vitro) Optimalisatie Metafer (in vitro) Optimalisatie protocol bloedscheiding (in vitro) γ-h2ax foci geïnduceerd na een CT-scan bij kankerpatiënten... (in vivo) III

8 3.2 Genexpressie Primerefficiënties (in vitro) Test referentiegenen (in vitro) Test targetgenen (in vitro) Hoofdstuk 4: Bespreking Foci Invloed van jodiumhoudend contrastmedium Optimalisatie γ-h2ax foci, in vivo geïnduceerd door een CT-onderzoek bij oncologische patiënten Genexpressie Algemeen besluit Referentielijst Bijlagen... I IV

9 Lijst van figuren Pagina 1.1 Bijdrage van CT aan de blootstelling aan X-stralen gebruikt voor medisch diagnostische doeleinden Multislice CT-scan waarbij 4 sneden tegelijkertijd gescand worden, met behulp van 4 detectorrijen, tijdens één omwenteling van de X-stralenbuis Mogelijke uitkomsten voor de somatische cel na stralingsschade Geschatte risico op kankersterfte door één CT-onderzoek, uitgezet als functie van de leeftijd bij blootstelling aan de CT X-stralen Overzicht van de verschillende manieren om de risico s bij hoge dosissen te extrapoleren naar lage dosissen Directe en indirecte schade aan DNA door ioniserende straling DSB herstelmechanismen: homologe recombinatie (HR) en niet-homologe endjoining (NHEJ) H2AX- pathway geactiveerd door de DNA schade De PCR-cyclus bestaat uit 3 fasen: De denaturatie, de annealing en de elongatie Illustratie van QRT-PCR Schema van de studieopzet voor de scoring van γ-h2ax foci Schema van de studieopzet voor in vitro genexpressie Cellen tellen op een Bürker telkamer Principe van indirecte immuunkleuring Gemiddeld aantal geïnduceerde foci in elke dosisgroep Aantal geïnduceerde γ-h2ax foci bij de 3 tijdstippen van bloedscheiding na 100 mgy γ-straling, uitgemiddeld over 4 donoren (3 donoren bij het 5u-tijdstip) Aantal geïnduceerde γ-h2ax foci bij de 2 types bloedscheiding na 100 mgy γ-straling Gemiddeld aantal geïnduceerde foci per cel voor de 10 kankerpatiënten uitgezet in functie van de bloeddosis (mgy) Volgorde van de referentiegenen volgens hun stabiliteit (Genorm) Gemiddelde opregulatie van de genexpressie van GADD45A, CDKN1A en MDM2 na bestraling met 1 Gy γ-straling 40 V

10 Lijst van tabellen Pagina 2.1 cdna-reactie Verloop van de cdna reactie Reactiemix voor één gen Verloop van de QRT-PCR γ-h2ax foci per dosis, vergroting en type telling Primersequenties en -efficiënties voor de 12 geteste genen De 9 referentiegenen VI

11 Afkortingen C: graden Celsius µ: attenuatiecoëfficiënten µl: microliter µm: micromolair 3D: driedimensionaal 53BP1: 53 binding protein 1 60 Co: cobalt-60 A: Adenine acc: acceleratie AL: antilichaam ATM: ataxia teleangiectasia mutated ATR: ATM and Rad3-related B2M Beta-2-Microglobulin BARD: BRCA1-geassocieerd RING domein eiwit BER: base-excision repair bp: baseparen? BRCA: borstkanker eiwit BSA: Bovine Serum Albumine C: Cytosine CDC: cell division control protein CDKN1A: cyclin-dependent kinase inhibitor 1 cdna: complement DNA cgy: centigray Chk: celcyclus checkpoint eiwit cm: centimeter Cq: cycling quantity CT: computer tomografie DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole DLP: dose length product DNA: deoxyribonucleic acid DNA-PK: DNA-dependent proteïne kinase dntp: deoxyribonucleotide triphosphate DSB: dubbelstrengbreuk EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid ESB: enkelstrengbreuk F: forward primer FCS: fetal calf serum g: gram G: Guanine VII

12 GADD45A: growth arrest and DNA damage A Gy: gray H 2 O 2 : waterstofperoxide HDR: high dose rate HMBS: hydroxymethylbilane synthase HR: homologe recombinatie IDT: Integrated DNA Technologies ImPACT: Imaging Performance Assessment of CT Scanners IRIF: ionizing radiation-induced focus I: jodium IV: intraveneus JNK: kg: kilogram KT: kamertemperatuur kv: kilovoltage L: lengte LNT: lineair-no-threshold LSS: Life Span Study M: expression stability measure mas: milliampère maal seconde MDC: mediator van DNA schade checkpoint eiwit MDM2: Mdm2 p53 binding protein homolog (mouse) Mg: milligram MgCl 2 : magnesiumchloride mgy: milligray min: minute ml: milliliter mm: millimeter MRN: MRE11-RAD50-NBS1 complex msv: millisievert NF: normalization factor ng: nanogram NHEJ: niet-homologe endjoining nr: nummer NRQ: normalized relative quantification PBMC: peripheral blood nuclear cells PBS: phosphate buffered saline PCNA: PCR: polymerase chain reaction PFA: paraformaldehyde QRT-PCR: kwantitatieve real-time PCR VIII

13 R: reverse primer RAM-TRITC: rabbit anti-mouse tetramethylrhodamine isomer R. RNA: RiboNucleicAcid RNF: ring finger protein ROS: reactive oxygen species Rpm: Rounds Per Minute RPMI: Roswell Park Memorial Institute medium RQ: relative quantification RT minus: Reverse Transcriptase minus SD: standaarddeviatie sec: seconden SNP s: single nucleotide polymorphisms SPSS: Statistical Package for the Social Sciences SPSS: Statistical Package for the Social Sciences SYBR: Synergy Brands T: Thymine T a : annealingtemperatuur TE: Tris en EDTA T m : smelttemperatuur U/ml: units/ml UCSC: University of California Santa Cruz UV: ultraviolet UZ Gent: Universitair Ziekenhuis Gent WIP: wild-type p53-induced phosphatase WWB: warmwaterbad xg: times gravity XLF = NHEJ1: nonhomologous end-joining factor 1 XRCC: X-ray cross complementing γ-h2ax: gefosforyleerd histon variant H2AX IX

14 Samenvatting Ioniserende straling kan dubbelstrengbreuken (DSB s) in het DNA veroorzaken, wat uiteindelijk kan leiden tot kankervorming. Hoe groot het kankerrisico is na blootstelling aan ioniserende straling, gebruikt in de medische diagnostiek, staat nog ter discussie. Aan de hand van een biomerker kan dit lage-dosis kankerrisico geëvalueerd wordt. Een van de eerste stappen in de respons na DNA schade, is de vorming van één lokale foci die bestaat uit gefosforyleerde H2AX eiwitten (γ-h2ax), ter hoogte van elke DSB. Door middel van een antilichaam gericht tegen deze γ-h2ax eiwitten, kunnen de DSB s in T-lymfocyten dus gevisualiseerd worden. In deze thesis werd gebruik gemaakt van deze biomerker, zowel na in vitro bestraling van gezond bloed, als na in vivo bestraling van volwassen, oncologische patiënten die een CT-scan ondergaan. Een andere biomerker die kan gebruikt worden om het lage dosis kankerrisico te evalueren, is kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR). In deze thesis werd via deze techniek in vitro onderzoek uitgevoerd naar referentiegenen die stabiel blijven en targetgenen die worden opgereguleerd, beide na bestraling van mononucleaire bloedcellen (PBMC s) met 1 Gy γ- straling. De resultaten van enkele in vitro experimenten toonden aan dat jodiumhoudend contrastmedium aanwezig tijdens de bestraling geen effect heeft op het aantal gevormde γ- H2AX foci. Er werd eveneens aangetoond dat de verwerking van het bloed voor het onderzoek naar γ-h2ax foci moet starten binnen de 5 uur na de bloedafname, en dat de scoring van γ-h2ax foci het best semi-automatisch wordt uitgevoerd met een 40x-vergroting. Het in vivo onderzoek toonde aan dat de respons van oncologische patiënten na een CT-scan vergelijkbaar is met die van niet-oncologische patiënten geobserveerd in andere studies. Genexpressie onderzoek resulteerde, in drie stabiele referentiegenen (UBC, ACTB en GAPDH) en drie opgereguleerde targetgenen (CDKN1A, GADD45A en MDM2) na 1 Gy γ- straling. Op basis van deze resultaten werd voor het foci luik besloten om de studiepopulatie van de multicentrische, pediatrische studie uit te breiden met oncologische patiënten. In het kader van de genexpressie werd besloten dat de experimenten op PBMC s reproduceerbare resultaten geven in vergelijking met vorig werk op whole blood. Trefwoorden: Computer Tomografie, γ-h2ax, genexpressie. 1

15 Inleiding Hoofdstuk 1: Inleiding 1.1 Stralingsbelasting De populatie wordt continu blootgesteld aan een lage dosis ioniserende straling. Enerzijds is deze straling afkomstig van natuurlijke bronnen zoals de ruimte, de zon en radioactieve stoffen uit onze omgeving [1,2]. Anderzijds wordt de populatie ook blootgesteld aan stralingsbronnen die door de mens gemaakt zijn, zoals X-stralen die gebruikt worden in de medische diagnostiek. De gemiddelde stralingsbelasting per jaar bedraagt in België ongeveer 4,25 msv per persoon. Hiervan is 2 msv toe te schrijven aan de natuurlijke stralingsbronnen, waardoor de medische diagnostiek dus jaarlijks bijdraagt tot 2,25 msv per persoon (in 2008) [3]. Van deze medische toepassingen dragen het aantal computertomografie (CT) onderzoeken slechts bij tot 10% ( in 2008) van het totaal aantal diagnostische onderzoeken. Deze CT-onderzoeken zijn echter wel verantwoordelijk voor ongeveer 57% van de blootstelling aan X-stralen ten gevolge van de medische diagnostiek (zie figuur 1.1) [3,4]. CT Rx Nucleaire Interventionele 5% 10% 28% 57% Figuur 1.1: Bijdrage van CT aan de blootstelling aan X-stralen gebruikt voor medisch diagnostische doeleinden (België 2008) (bron: [3]). De laatste decennia is het aantal CT-scans dat jaarlijks genomen wordt, sterk gestegen. Dit komt enerzijds door de verbeterde beeldkwaliteit en anderzijds door de verminderde scantijd, waardoor het dus een zeer betrouwbare en snelle diagnose toelaat. Hoewel deze twee eigenschappen van CT een groot voordeel betekenen in vergelijking met de conventionele 2

16 Inleiding radiografie, zorgt CT ook voor één groot nadeel. De stralingsdosis die gepaard gaat met een CT-scan, is namelijk veel hoger in vergelijking met de stralingsdosis van conventionele planaire radiografie [5]. Een CT-scan van de thorax of abdomen gaat bijvoorbeeld gepaard met een gemiddelde effectieve dosis van respectievelijk 4,14 msv of 11,30 msv, terwijl dit bij een conventioneel radiografisch onderzoek respectievelijk slechts 0,03 msv en 0,99 msv bedraagt [6]. 1.2 CT Werking en principe van CT CT is een radiodiagnostische techniek waarbij finaal met behulp van een computer naar transversale doorsneden van de patiënt kan gekeken worden, en de snededikte van deze doorsneden kan variëren van 1 tot 10 mm. Het verschil in attenuatie van X-stralen door verschillende weefsels vormt de basis van de medische beeldvorming met X-stralen. Bij CT kunnen anatomische structuren met attenuatiecoëfficiënten (µ) die minder dan 1% verschillen, gedetecteerd worden, terwijl bij conventionele radiografie slechts 2% attenuatieverschil onderscheiden kan worden. Aangezien bij CT naar een transversale doorsnede kan gekeken worden, kan er diepte-informatie verkregen worden, wat niet mogelijk is bij conventionele radiografie. De conventionele, planaire radiografie zorgt namelijk voor superpositie van de verschillende organen [7]. Aangezien een CT-scan een gedetailleerd beeld van weefsels en organen weergeeft, kunnen verschillende aandoeningen zoals tumoren in een vroeger stadium ontdekt worden [8, 9]. De hedendaagse CT-scanners zijn multislice spiraal CT-scanners en bestaan uit een patiënttafel en een gantry. De gantry bevat een statische detectorring en een X-stralenbuis op een slipring en beschrijft een relatieve schroefbeweging rond de patiënt doordat de patiënt op de tafel met constante snelheid door de gantry wordt bewogen. Deze methode laat nauwkeurige 3D-reconstructie toe van de organen en weefsels binnen het gescande volume door de verschillende sneden virtueel aan elkaar te laten aansluiten. De term multislice duidt op de verschillende aangrenzende detectorrijen waardoor meerdere sneden tegelijkertijd kunnen gescand worden tijdens één rotatie van de gantry (zie figuur 1.2). 3

17 Inleiding Figuur 1.2: Multislice CT-scan waarbij 4 sneden tegelijkertijd gescand worden, met behulp van 4 detectorrijen, tijdens één omwenteling van de X-stralenbuis [10]. Dit zorgt ervoor dat eenzelfde patiëntvolume veel sneller gescand kan worden, waardoor bewegingsartefacten vermeden kunnen worden. Hoe meer sneden tegelijkertijd kunnen gescand worden, hoe korter de scantijden. Momenteel zijn er reeds systemen voorhanden die tot 320 sneden tegelijkertijd kunnen scannen [7,10]. De dosisparameter die gebruikt wordt in de dosimetrie van CT-onderzoeken is het dosislengte product (DLP). Deze waarde kan rechtsreeks afgelezen worden van de CT-console na elk onderzoek en karakteriseert zowel de intensiteit van de straling als de lengte van het bestraalde lichaam [7] Gebruik van intraveneus contrastmedium bij CT Bij een CT-onderzoek wordt er vaak contrastmedium op intraveneuze (IV) wijze ingespoten om de aflijning van de bloedvaten beter te kunnen visualiseren. Contrastmedium bevat namelijk stoffen met een hoog atoomnummer, wat zorgt voor een sterke attenuatie van de X- stralen en hierdoor is het contrast tussen de bloedvaten, gevuld met dit medium, en de omliggende weefsels groter. De aanwezigheid van contrastmedium tijdens een CT-scan verbetert daardoor de diagnostische sensitiviteit van de scan [11]. De meest gebruikte contrastmedia zijn jodiumhoudende stoffen zoals iomeprol of iopromide. In combinatie met ioniserende straling kan jodium aan de hand van secundaire elektronen, geproduceerd via het foto-elektrisch effect, de energieabsorptie verhogen in het biologisch weefsel naburig aan het contrastmedium. Dit kan vervolgens leiden tot meer DNA schade [12,13]. 4

18 Inleiding 1.3 Risico s verbonden aan lage dosissen X-stralen Soorten effecten van ioniserende straling Ioniserende straling kan enerzijds leiden tot deterministische of vroege effecten en anderzijds tot stochastische of late effecten. Deterministische effecten treden op na blootstelling aan een hoge dosis ioniserende straling en de ernst van deterministische effecten is gerelateerd aan de stralingsdosis. De oorzaak van deze effecten is het in apoptose gaan van grote groepen cellen, waardoor de functie van het betrokken orgaan aangetast wordt. De schade kan al optreden binnen enkele uren tot maanden na de stralingsblootstelling en daarom worden ze ook vroege effecten genoemd. Voorbeelden van deterministische effecten zijn een verbrande huid, pulmonair syndroom en hypothyroïdisme [2]. Stochastische effecten daarentegen zijn onafhankelijk van de stralingsdosis en kunnen dus optreden na blootstelling aan lage dosissen ioniserende straling. In tegenstelling tot deterministische effecten komen stochastische effecten pas jaren na de stralingsblootstelling tot uiting [14,2]. De term stochastisch betekent willekeurig, wat inhoudt dat er niet met zekerheid een effect optreedt, maar de kans dat het effect optreedt stijgt met toenemende stralingsdosis [5]. Stochastische effecten worden opgedeeld in genetische afwijkingen en kanker. Genetische afwijkingen ontstaan wanneer mutaties plaatsvinden in geslachtscellen en daardoor treedt het biologische effect op in het nageslacht. De inductie van kanker is echter het meest zorgwekkende stochastisch effect in het kader van blootstelling aan lage dosissen ioniserende straling [2]. Aangezien de stralingsbelasting voor de populatie stijgt door het jaarlijks toenemend aantal CT-onderzoeken, ontstaat er sinds kort ongerustheid over eventuele kankerinductie ten gevolge van de X-stralen van deze CT-onderzoeken [15]. Brenner et al. toonden voor X- en γ- stralen aan dat een acute dosis vanaf 50 msv een verhoogd kankerrisico veroorzaakt en dat er zelfs een mogelijkheid is dat dit kankerrisico reeds na 5 msv verhoogd is. Hoewel de risico s klein zijn, kunnen ze niet verwaarloosd worden, want wanneer een klein risico voorkomt bij een groot aantal individuen (zoals bijvoorbeeld de steeds groter wordende populatie die een CT-onderzoek ondergaat), kan dit leiden tot een significant gezondheidsprobleem [16]. 5

19 Inleiding Ioniserende straling leidt tot DNA schade (zie ook 1.3.4) en hierbij zijn vooral DNA dubbelstrengbreuken (DSB s) belangrijk, omdat beide strengen van het DNA beschadigd zijn en het correct herstel van de breuk dus moeilijker is [17]. Als de DNA schade te groot is, kan de cel geëlimineerd worden (celdood of apoptose). ptose). Deze schade kan echter ook hersteld worden door de DNA herstelmechanismen van onze cellen. Hierbij bestaat de kans dat de schade foutief hersteld wordt, en dan kan dit leiden tot mutaties, chromosoomaberraties of genoominstabiliteit. Deze radiobiologische effecten kunnen in somatische cellen op lange termijn kanker veroorzaken (zie figuur 1.3) [18]. Ioniserende straling DNA schade Celdood correct DNA herstel Mutatie of chromosoomaberratie of genoominstabiliteit Kanker Figuur 1.3: Mogelijke uitkomsten voor de somatische cel na stralingsschade (gebaseerd op [18]). Indien de mutaties voorkomen in genen die bijvoorbeeld essentieel zijn voor herstel van DNA schade, genen die verantwoordelijk zijn voor de inductie van apoptose of genen die instaan voor activatie van celcyclus checkpoints (ataxia teleangiectasia mutated (ATM) en p53), is er een grote kans op kankerinductie [18]. Meestal zijn er meerdere mutaties nodig om tot een tumor te leiden en elk proces dat de mutatiefrequentie verhoogt zal resulteren in een groter risico op neoplastische transformatie [14]. De latentietijd tussen de blootstelling aan straling en het ontstaan van kanker bedraagt vaak tientallen jaren in het geval van solide tumoren en 5 à 15 jaar in het geval van leukemieën [17] Stralingsgevoeligheid van kinderen Kinderen zijn minstens 3 keer zo gevoelig voor eenzelfde dosis ioniserende straling als volwassenen. Deze hogere stralingsgevoeligheid is enerzijds te wijten aan het groter aantal 6

20 Inleiding delende cellen, waardoor kinderen meer radiosensitieve weefsels hebben, en anderzijds aan de langere levensverwachting na de stralingsblootstelling, waardoor deze kinderen vaak nog in leven zijn als de tumor zich ontwikkelt [5]. In het kader van risicoberekeningen moet er dus rekening gehouden worden met de leeftijd van de patiënten. De kankermortaliteit stijgt namelijk sterk met dalende leeftijd van het kind (zie figuur 1.4) [19]. In 2001 werd door Brenner et al. onderzocht dat na één CT-onderzoek het risico voor een kind om een fatale kanker te ontwikkelen 1 op 1000 was [19]. De laatste jaren is men zich er meer van bewust dat de dosis die kinderen oplopen tijdens een CT-onderzoek zo laag mogelijk gehouden moet worden en daardoor worden er tegenwoordig vele nieuwe technieken onderzocht en aangepaste protocols voor kinderen gehanteerd om de dosis zoveel mogelijk te beperken. Figuur 1.4: Geschatte risico op kankersterfte door één CT-onderzoek, uitgezet als functie van de leeftijd bij blootstelling aan de CT X-stralen. De streeplijn en de stippellijn stellen het risico voor na respectievelijk een abdominale scan en na een hoofdscan [19] Lineair No-Treshold (LNT) model Epidemiologische data zijn statistisch niet sterk genoeg om het kankerrisico ten gevolge van een lage dosis ioniserende straling te bepalen, omdat het kankerrisico na blootstelling aan een lage dosis niet veel verschilt van het natuurlijk voorkomend kankerrisico. Daarom wordt het lage dosis kankerrisico momenteel geschat via het Lineair No-Treshold (LNT) model. Dit model beschouwt een lineaire extrapolatie naar lage en zeer lage dosissen uit risico's van hoge dosissen die bepaald werden door de Life Span Study (LSS) van de overlevenden van de atoombommen op Hiroshima en Nagasaki en ook door andere studies met hoge dosissen straling (zie figuur 1.5, curve a) [20]. Het LNT model impliceert dat er geen drempelwaarde is 7

21 Inleiding waaronder met zekerheid kan gezegd worden dat er geen kanker of genetische effecten veroorzaakt zullen worden door de ioniserende straling. Daarenboven impliceert het LNT model dat een verdubbeling van de stralingsdosis leidt tot een verdubbeling van de kans op het ontstaan van kanker of genetische effecten [5]. Het LNT model is gebaseerd op de hit hypothese waarbij gedacht wordt dat ioniserende straling enkel biologische schade toebrengt aan de cellen die geraakt worden door de elektronenbaan, en de biologische mechanismen die optreden na lage en hoge dosissen ioniserende straling worden verondersteld gelijk te zijn. Hoewel de LNT hypothese tot op heden gebruikt wordt met betrekking tot stralingsprotectie doeleinden, wordt de validiteit van deze hypothese sterk in vraag gesteld door radiobiologische observaties die aantonen dat biologische schade niet enkel optreedt in de bestraalde cel, maar ook in naburige niet-bestraalde cellen. Deze non-targeted effecten kunnen leiden tot een verhoogd of verlaagd kankerrisico, zoals hieronder besproken zal worden [16,21]. De verschillende mogelijkheden, naast het LNT model, om hoge dosis risico s te extrapoleren naar lage dosis risico s worden getoond in figuur 1.6 [16]. Een eerste model is het drempelwaardemodel, waarbij geïmpliceerd wordt dat onder een bepaalde drempelwaarde geen verhoogd risico op kanker voorkomt (zie figuur 1.5, curve d) [22]. Stralingsgerelateerd kankerrisico Dosis Figuur 1.5: Overzicht van de verschillende manieren om de risico s bij hoge dosissen te extrapoleren naar lage dosissen: het LNT model (a), hypersensitiviteit door bystander effect (b), adaptief effect (c), drempelwaarde model (d) en hormesis model (e) [16]. Een tweede mogelijkheid, die aangetoond wordt door sommige studies, is dat een lage dosis ioniserende straling beschermend zou kunnen werken (adaptief effect). Cellen zouden door de lage dosis ioniserende straling geprikkeld worden en hierdoor de transcriptie van stress- en 8

22 Inleiding herstelgenen induceren, waardoor de capaciteit van de cellen om DNA te herstellen zou verhogen en doorgegeven worden aan nabijgelegen cellen. Dit zou bij een volgende, hoge dosis blootstelling resulteren in minder biologische schade. Door dit adaptief effect zou het kankerrisico bij lage dosissen dus lager zijn in vergelijking met het kankerrisico bepaald via het LNT model (hyposensitiviteit) (zie figuur 1.5, curve c) [23,24]. De hormesis theorie gaat hier nog iets verder in en zegt dat een voldoende lage dosis ioniserende straling zelfs leidt tot een lager kankerrisico in vergelijking met het natuurlijk voorkomend kankerrisico (zie figuur 1.5, curve e) [25]. Daardoor zou een lage dosis ioniserende straling een positief effect hebben op de gezondheid [26]. Een derde mogelijkheid, die aangetoond wordt door andere studies, is een hoger kankerrisico na een lage dosis ioniserende straling in vergelijking met het kankerrisico bepaald volgens het LNT model (hypersensitiviteit). In niet-bestraalde cellen zou er indirect schade optreden ten gevolge van de ioniserende straling doordat bestraalde cellen factoren die schade veroorzaken, doorgeven naar hun buurcellen (bystander effect), ofwel via oplosbare substanties in het medium ofwel via gap junctie gemedieerde intercellulaire communicatiesystemen. Hierdoor is het aantal beschadigde cellen groter dan geschat via de hit hypothese (zie figuur 1.5, curve b) [20,21,27,28,]. Dit bystander effect zou verwaarloosbaar zijn bij hogere dosissen, omdat alle cellen reeds direct beschadigd zijn door de elektronenbaan en hierdoor zal het bystander effect niet meer significant bijdragen tot de totale stralingsschade [16,21,29]. Tot op heden bestaat er controverse over het kankerrisico na een lage dosis blootsteling aan ioniserende straling en hierdoor wordt het LNT model nog steeds gebruikt om de bevolking te beschermen tegen de nadelige effecten van ioniserende straling [20] Ontstaan van DNA schade Aangezien epidemiologische studies niet gebruikt kunnen worden om kankerrisico s bij lage dosissen te bestuderen, dient er een andere aanpak gehanteerd te worden. De biologische effecten die veroorzaakt worden door een lage dosis ioniserende straling, zoals DNA schade, kunnen geëvalueerd worden om meer inzicht te krijgen in de gezondheidsconsequenties van een lage dosis straling. Ioniserende straling is hoogenergetische elektromagnetische straling en is in staat om ionisaties te veroorzaken in de atomen/moleculen van de materie die doorkruist wordt. Wanneer deze materie het menselijk lichaam is, zoals bij een CT- 9

23 Inleiding onderzoek, kan ioniserende straling het DNA of andere moleculen in het weefsel ioniseren. Bij X- en γ-stralen zorgt het secundair elektron dat vrijkomt bij de ionisaties, voor de biologische schade door enerzijds op directe wijze schade aan te brengen ter hoogte van de DNA molecule, of anderzijds op indirecte wijze DNA schade te veroorzaken aan de hand van de radiolyse van water. Bij deze indirecte wijze worden watermoleculen in de onmiddellijke nabijheid van het DNA geïoniseerd en ontstaan er reactieve hydroxylradicalen. Deze radicalen kunnen dan op hun beurt het DNA ioniseren (zie figuur 1.6) [14,28,30]. Figuur 1.6: Directe en indirecte schade aan DNA door ioniserende straling (aangepast uit [28]). Dergelijke ionisaties in het DNA kunnen verschillende types schade veroorzaken, waaronder enkelstrengbreuken (ESB s), dubbelstrengbreuken (DSB s) en modificaties van de basen. Een ESB is een breuk in slechts één streng van de DNA dubbele helix [14]. Een DSB ontstaat wanneer er twee ESB s in de twee complementaire strengen op zeer korte afstand van elkaar (± 3 nucleotiden) ontstaan. Deze dicht bij elkaar gelegen ESB s kunnen ofwel veroorzaakt worden door twee aparte secundaire elektronen of hydroxylradicalen, ofwel door één zeer laag energetisch secundair elektron dat op het einde van de elektronenbaan voorkomt [17]. DNA kan ook beschadigd worden door endogene factoren, zoals zuurstofradicalen, UVstralen, antikanker medicatie en andere mutagenen stoffen [17]. 10

24 Inleiding Herstel van DNA schade Een ESB en modificaties van basen kunnen snel hersteld worden door single-strand break repair (SSBR) en base excision repair (BER) en omdat er via deze herstelmechanismen gebruik gemaakt wordt van de niet-beschadigde complementaire streng, worden er bijna nooit fouten geïnduceerd [31]. Het accuraat herstel van DSB s is daarentegen veel complexer, omdat de complementaire streng niet meer aanwezig is. Er zijn twee mogelijke mechanismen om een DSB te herstellen: homologe recombinatie (HR) en niet-homologe endjoining (NHEJ) (zie figuur 1.7). Figuur 1.7: DSB herstelmechanismen: homologe recombinatie (HR) en niet-homologe endjoining (NHEJ) [32]. HR is gebaseerd op de genetische informatie van een onbeschadigd zusterchromatide waardoor het herstel van de DSB accuraat ( error-free ) is. De voornaamste genen die betrokken zijn bij dit herstelmechanisme zijn RAD51, RAD52, RAD54, X-ray repair crosscomplementing (XRCC) 2 en 3 en BRCA2. HR komt bij de mens vooral voor in de S- en G2- fase van de celcyclus, terwijl NHEJ eerder voorkomt in de G0- en G1-fase [18]. 11

25 Inleiding NHEJ is gebaseerd op de directe aaneenhechting van de twee uiteinden van de beschadigde DNA molecule zonder gebruik te maken van een intact zusterchromatide. Hierdoor veroorzaakt NHEJ soms kleine deleties van DNA ( error-prone ), maar NHEJ heeft wel als voordeel dat de breuk sneller hersteld wordt en er dus minder fouten kunnen gemaakt worden. Dit is dan ook de reden waarom NHEJ het dominante DSB herstelmechanisme is in eukaryoten [18]. De voornaamste genen betrokken in NHEJ zijn XRCC 4, Ku70/Ku80, DNA- PKcs, Ligase 4, XLF en Artemis [18,32]. Celcyclus checkpoints zorgen mee voor het accuraat herstel van DNA schade door de celcyclus op bepaalde plaatsen/tijdstippen te vertragen, zodat de cel meer tijd krijgt om de DNA schade te herstellen. Hiermee tracht de cel te vermijden dat beschadigd DNA gerepliceerd wordt, wat zou kunnen leiden tot mutaties en chromosoomaberraties. Twee tumorsuppressorgenen zijn hierin van levensbelang: ATM en p53 [18, 33]. 1.4 Detectie van DNA schade Cytogenetische technieken evalueren chromosoomschade en vormen de basis van de biologische dosimetrie. De meest gebruikte cytogenetische technieken zijn de klassieke dicentrische test waarbij chromosoomaberraties gedetecteerd worden en de micronucleus test waarbij micronuclei, die ontstaan uit chromosoomfragmenten, geanalyseerd worden. Deze cytogenetische testen zijn tijdrovend omdat een celcultuur moet opgezet worden en bovendien zijn ze slechts in staat om dosissen vanaf ongeveer 100 mgy te detecteren, wat veel hoger is dan de dosissen die zullen gebruikt worden in deze thesis. Daarom zal een nieuwere, zeer gevoelige (tot 1 mgy) DNA schade test gebruikt worden, namelijk de scoring van γ-h2ax foci. Deze test laat toe om de inductie van DNA DSB s te evalueren aangezien 1 γ-h2ax focus 1 DSB voorstelt [34, 35, 36] Fosforylering van H2AX eiwitten Als een DSB ontstaat in het DNA ten gevolge van ioniserende straling, wordt deze schade herkend door het sensor complex MRE11-RAD50-NBS1 (MRN). Dit complex trekt ATM aan naar de plaats van de DNA schade en vervolgens wordt ATM geactiveerd door 12

26 Inleiding autofosforylatie. Dit geactiveerde ATM kinase fosforyleert op zijn beurt eiwitten die verantwoordelijk zijn voor DNA herstel, zoals histoneiwit H2AX, borstkanker eiwit BRCA1, p53 bindend eiwit 53BP1 en mediator van DNA schade checkpoint eiwit (MDC1). Daarnaast fosforyleert ATM ook eiwitten verantwoordelijk voor de celcyclus checkpoints, namelijk Chk1 en Chk2. De fosforylatie van H2AX gebeurt binnen enkele minuten na het ontstaan van de DSB, op serine 139 [34,37]. Deze gefosforyleerde en daardoor geactiveerde vorm van het histoneiwit wordt γ-h2ax genoemd. γ-h2ax rekruteert MDC1, dat interageert met het MRN complex en dit zal leiden tot het aantrekken van nog meer ATM-eiwitten tot de DSB s (zie figuur 1.8). Hierdoor worden de ATM-afhankelijke DNA-schadesignalen geamplificeerd zodat de herstelpathways kunnen getriggerd worden (zowel HR als NHEJ) [17]. Nucleosoom met H2AX Figuur 1.8: H2AX- pathway geactiveerd door de DNA schade (aangepast uit [38]). P stelt een fosfaatgroep voor. Naast de amplificatie van de DNA-schade signalen, hebben γ-h2ax eiwitten ook als functie om de uiteinden van de DNA molecule bij elkaar te houden en om het chromatine te hervormen zodat DNA processing gemakkelijker kan gebeuren [37] Defosforylering van γ-h2ax Wanneer de DSB hersteld is, wordt γ-h2ax gedefosforyleerd aan de hand van fosfatasen. Een fosfatase verwijdert de fosfaatgroep van de H2AX-histonen en ook van andere eiwitten die geactiveerd werden in de DNA damage respons (DDR) zodat dit proces gedeactiveerd wordt en de cel terugkeert naar zijn oorspronkelijke staat [39]. Er werden reeds verschillende 13

27 Inleiding fosfatasen ontdekt die in staat zijn om γ-h2ax te defosforyleren, zoals protein phosphatase (PP) 1, PP2A, PP4 en wild-type p53-induced phosphatase 1 (WIP1) [39,40] γ-h2ax als biomerker voor blootstelling aan een lage dosis ioniserende straling Één γ-h2ax focus stelt één DSB voor en bestaat uit honderden tot duizenden van deze gefosforyleerde histoneiwitten en alle factoren die gerekruteerd werden door γ-h2ax, met als doel om de DSB te hertstellen [34]. Het maximum aantal van deze foci wordt na 15 tot 30 minuten na de bestraling bereikt. Daarna neemt het aantal foci stilaan af, wat min of meer overeenkomt met het herstel van de DSB s [36]. Aangezien één γ-h2ax focus overeenkomt met één DSB, is de analyse van het aantal γ- H2AX foci een maat voor het aantal DSB s in een cel [41]. De analyse van deze γ-h2ax eiwitten gebeurt via een immuunkleuring met een fluorescent secundair antilichaam gericht tegen het primaire γ-h2ax antilichaam. Daarna kunnen de foci geteld worden met behulp van een fluorescentiemicroscoop, wat eventueel zelfs automatisch kan gebeuren [42]. 1.5 Moleculaire biomerkers Principe polymerase chain reaction (PCR) Ioniserende straling en de bijkomende DNA schade kan leiden tot wijzigingen in de genexpressie van bepaalde genen. De analyse van genexpressie kan gebeuren aan de hand van kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR) of microarray. Deze laatste techniek heeft als voordeel dat een globale monitoring van de complexe celrespons na ioniserende straling kan uitgevoerd worden [43]. Een polymerase kettingreactie of polymerase chain reaction (PCR) is de aangewezen methode als de niveaus van mrna transcripten van enkele op voorhand geselecteerde genen moeten gemeten en gekwantificeerd worden [43]. Tijdens een PCR-reactie wordt een fragment van het DNA geamplificeerd tijdens verschillende PCR-cycli die elk onderverdeeld worden in 3 stappen (zie figuur 1.9). In een eerste stap stijgt de temperatuur tot 95 C om het 14

28 Inleiding dubbelstrengige DNA te smelten (denaturatie), daarna daalt de temperatuur tot de annealing temperatuur van de forward en reverse primers, zodat deze kunnen binden met het enkelstrengige cdna. De primers flankeren het DNA-fragment dat moet worden geamplificeerd. In een derde fase stijgt de temperatuur weer zodat het DNA polymerase, dat bestendig is tegen hoge temperaturen, het fragment vanaf de primers terug dubbelstrengig kan maken. Na één cyclus is het oorspronkelijke aantal kopieën van die bepaalde sequentie verdubbeld, zodat na meerdere cycli het aantal kopieën exponentieel stijgt [44]. Figuur 1.9: De PCR-cyclus bestaat uit 3 fasen: De denatur atie, de annealing en de elongatie (rode korte stukjes zijn primers, groen is DNA polymerase) [44]. Bij traditionele PCR gebeurt de detectie van het fluorescent signaal en de kwantificatie van het PCR-product op het einde van de PCR-reactie, na de laatste cyclus. Bij QRT-PCR daarentegen, wordt het fluorescent signaal na elke cyclus gedetecteerd en op een zeer sensitieve wijze gekwantificeerd waardoor er een amplificatiecurve verkregen wordt waarbij de fluorescentie ten opzichte van het nummer van de cyclus wordt uitgezet [45]. De cyclus waarbij deze curve de drempelwaarde of threshold overschrijdt, wordt de cycling quantity (Cq) genoemd (zie figuur 1.10) [46]. Als drempelwaarde wordt het moment gekozen wanneer de fluorescentie exponentieel begint te stijgen (voldoende boven de achtergrondwaarde) en alle curven evenwijdig lopen [44]. De kwantificatie van het PCR-product kan absoluut of relatief gebeuren. Bij de eerste methode, de absolute methode, wordt gebruik gemaakt van een standaardcurve en de absolute hoeveelheid van een bepaald staal kan hierop afgelezen worden als de Cq gekend is. In deze thesis wordt echter gebruik gemaakt van de relatieve methode waarbij voor elke donor of patiënt de Cq in het staal na de bestraling wordt vergeleken met de 15

29 Inleiding Cq in het staal vóór de bestraling [44,46]. Fluorescentie RQ = 2 Cq RQ 1/3 = 2 4 = 16 RQ 2/3 = 2 2 = 4 RQ 3/3 = 2 0 = Cq1 Cq2 Cq3 PCR cyclus Figuur 1.10: Illustratie van QRT-PCR. Cq staat voor cycling quantity en de RQ in het kader naast de curve is de relative quantity waarbij de Cq s van twee curves vergeleken worden [47]. Om te compenseren voor verschillen in de kwaliteit en de kwantiteit van de producten in de RT-reactie en de PCR-reactie, wordt het expressieniveau van het targetgen dat verandert na bestraling, eerst genormaliseerd met behulp van interne controles, namelijk referentiegenen die stabiel moeten blijven gedurende de volledige set-up van het experiment [45] Genen Een cel die blootgesteld wordt aan ioniserende straling zal DNA schade- en herstelmechanismen activeren door expressie van bepaalde genen te moduleren [48]. De expressie van specifieke genen hangt af van de stralingsdosis, het dosistempo, de stralingskwaliteit en de tijd tussen de stralingsblootstelling en de analyse. Een lineaire dosisrespons relatie van sommige genen werd reeds geobserveerd binnen een dosisgebied van 1 3 Gy, tussen 0,5-4 Gy en bij een dosis zo laag als 2cGy [49]. Mogelijke genen die kunnen voldoen als biomerker voor blootstelling aan ioniserende straling worden opgereguleerd na DNA schade en zijn targets van p53, zoals cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKN1A = P21 of CIP1 of WAF1), growth arrest and DNA-damageinducible protein (GADD45A) en Mdm2 p53 binding protein homolog (mouse) (MDM2). 16

30 Inleiding CDKN1A is een factor noodzakelijk in het stoppen van de celcyclus in de G1-fase als antwoord op verschillende types stress [50]. Het interageert met proliferating cell nuclear antigen (PCNA) en regelt zo het DNA herstel. Bij een overmaat aan DSB s zal echter apoptose noodzakelijk zijn en daarvoor zal CDKN1A moeten gedegradeerd worden [51]. GADD45A wordt tot expressie gebracht bij omgevingsstress, zoals blootstelling aan ioniserende straling. Het eiwit interageert met PCNA, CDKN1A, cell division control protein 2 (CDC2) en de p38 en c-jun NH2-terminal kinase (JNK) stress respons kinasen. Het zorgt voor behoud van genoomstabiliteit en DNA herstel [52]. MDM2 reguleert de p53-gemedieerde respons na stress zodat deze reactie kan overleefd worden. Dit gen is een oncogen, want overexpressie leidt tot te veel inhibitie van p53 en bijgevolg tot het ontstaan van een tumor [53]. 1.6 Doelstelling masterproef Deze masterproef heeft als doel een beter inzicht te scheppen in de biologische effecten van blootstelling aan lage dosissen X-stralen om in de toekomst hiermee rekening te houden in de schatting van het kankerrisico van kinderen en in de stralingsbescherming. Via de scoring van γ-h2ax foci, die een goede biomerker blijken te zijn voor DNA DSB s, zal gekeken worden naar de in vivo dosis-repons curve. Recent werd in de vakgroep een bifasisch dosis-respons verloop geobserveerd in lymfocyten van kinderen die een hartkatheterisatie ondergingen. In de grotere studie waarin deze thesis kadert, zal nagegaan worden of deze lage dosis hypersensitiviteit kan teruggevonden worden bij kinderen die een CT-scan ondergaan. Verder zal ook onderzocht worden of de stressgenen CDKN1A, GADD45A en MDM2 in peripheral blood monuclear cells (PBMC s) goede biomerkers zijn voor stralingseffecten veroorzaakt door een lage dosis X-stralen van een CT-scan, met behulp van QRT-PCR. Aan de hand van deze techniek kan een accurate relatie tussen de dosis en het expressieniveau van verschillende genen gevalideerd worden. Concreet zal deze thesis bestaan uit verschillende experimenten om het protocol dat tijdens de kinderstudie zal gebruikt worden, te optimaliseren. 17

31 Materiaal en methoden Hoofdstuk 2: Materiaal en methoden 2.1 Inleiding Voor het onderzoek naar de γ-h2ax foci worden er voor elk staal, zowel in vivo als in vitro verschillende stappen doorlopen (figuur 2.1). De protocollen voor dit foci luik moeten worden geoptimaliseerd zodat later in de overkoepelende studie op een gestandaardiseerde wijze gewerkt kan worden. Bloedafname T-lymfocyt isolatie Immuunkleuring Scoring van foci Figuur 2.1: Schema van de studieopzet voor de scoring van γ-h2ax foci. Voor het in vitro QRT-PCR onderzoek moeten er eveneens voor elk bloedstaal verschillende stappen uitgevoerd worden (figuur 2.2). Bloedafname Isolatie PBMC's RNA extractie RNA omzetten naar cdna QRT-PCR Figuur 2.2: Schema van de studieopzet voor in vitro genexpressie. De methoden voor dit onderdeel van de thesis moeten eveneens eerst geoptimaliseerd worden. Er moeten onder andere primers gezocht worden voor de genen van interesse en voor de kandidaat referentiegenen en van elk primerpaar moet de efficiëntie bepaald worden. 2.2 Studiepopulatie Voor de in vitro experimenten en optimalisatie van de methoden wordt er bloed van volwassen controle personen gebruikt. 18

32 Materiaal en methoden Het in vivo onderzoek naar γ-h2ax foci betreft volwassen, oncologische patiënten van het UZ Gent die een contrast CT-scan van de thorax en/of het abdomen ondergaan en die zich al minstens 4 weken in de follow-up periode van radio- en/of chemotherapie bevinden (zie patiëntgegevens in bijlage A.5). Het onderzoeksproject is goedgekeurd door het Ethisch Comité van het UZ Gent en de vrijwilligers worden gevraagd een informed consent te ondertekenen. 2.3 Staalafname Het bloed van volwassen controle personen wordt afgenomen door de bloedprikdienst van het UZ Gent. Bij de volwassen, oncologische patiënten wordt vlak voor de CT-scan 8 ml veneus bloed afgenomen en vlak erna 2 ml en 8 ml veneus bloed. Voor elk van de bloedafnames worden heparinebuisjes gebruikt. In de eerdere studies op volwassenen werd het eerste buisje na CT niet gebruikt voor onderzoek wegens de mogelijke dilutie van het staal met contrastmedium. In deze studie zal de eerste 2 ml bloed apart worden geanalyseerd om een eventueel verschil te onderzoeken met de 8 ml bloed die meteen erna wordt afgenomen. Wegens het geringe bloedvolume van pediatrische patiënten, zal hierbij in de verdere studie slechts 2 ml bloed afgenomen worden na de CT-scan, dus onze studie op volwassenen simuleert deze situatie. Een bloedstaal genomen binnen enkele minuten na de blootstelling aan ioniserende straling weerspiegelt de gemiddelde dosis die het perifere bloed heeft gekregen en bevat een mix van bestraalde en niet-bestraalde lymfocyten [37]. Het bloed gebruikt voor in vivo en in vitro onderzoek, wordt op dezelfde manier behandeld na de bloedafname (in vivo) of na de bestraling (in vitro). De buisjes met bloed worden gedurende 30 minuten in een warmwaterbad (WWB) (Fisher Scientific) bij 37 C geplaatst om de DNA schade respons op gang te laten komen. Na 30 minuten is het aantal γ-h2ax foci namelijk maximaal. Daarna worden ze voor 15 minuten in ijswater afgekoeld om het reeds op gang gebrachte DNA herstel te stoppen. Door het aantal foci voor de bestraling af te trekken van het aantal foci gevormd na de bestraling, kan het aantal stralingsgeïnduceerde DSB s voor elke patiënt of voor elke in vitro conditie bepaald worden. 19

33 Materiaal en methoden 2.4 Foci T-lymfocyt isolatie Als de bloedstalen verzameld zijn, worden ze getransporteerd naar het labo. Daar wordt aan 2 ml bloed 100 µl RosetteSep Human T cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies) toegevoegd en dit wordt 20 minuten op kamertemperatuur (KT) bewaard. Daarna wordt er 2 ml phosphate buffered saline (PBS) (Gibco) + 2% fetal calf serum (FCS) (Invitrogen) toegevoegd en deze suspensie wordt nadien traag en onder een hoek van 45 toegevoegd aan 3 ml RosetteSep DM-L (Stemcell Technologies), zodat er twee lagen gevormd worden. De proefbuisjes worden hierna voor 20 minuten gecentrifugeerd (Eppendorf) op 1200xg (acc is 2 en brake is 0) zodat de verschillende onderdelen van het bloed en de DM-L gescheiden worden volgens hun densiteit. De dunne laag T-lymfocyten wordt met een Pasteurpipet overgebracht naar een 15 ml falcon (Becton Dickinson) waarin 5 ml PBS + 2% FCS aanwezig is. Er wordt gecentrifugeerd gedurende 10 minuten op 300xg (acc is 7 en brake is 7). Het supernatans wordt zorgvuldig verwijderd en de wasstap wordt nogmaals herhaald. De celpellet wordt opgelost in 4 ml compleet RPMI-medium 1 (Invitrogen) Lymfocyten tellen Voor de immuunkleuring (zie 2.4.3) zijn ongeveer tot cellen per 500 µl RPMI medium nodig. Hiervoor worden de cellen geteld met behulp van een Bürker telkamer (Marienfeld). Er wordt een ½ verdunning gemaakt met 20 µl celoplossing en 20 µl trypaanblauw (Sigma-Aldrich). Van deze verdunning wordt een kleine hoeveelheid op de telkamer gebracht. Onder de lichtmicroscoop (Axiolab, Zeiss) worden 16 kleine vakjes (figuur 2.3) geteld. Het aantal lymfocyten, opgelost in compleet RPMI-medium, wordt berekend met de volgende formule: aantal lymfocyten = gemiddeld aantal lymfocyten geteld in 16 vakjes x 2 x 4 x (2 voor de verdunning, 4 voor het totaal aantal ml waarin de cellen opgelost zijn, voor de omzetting van diepte (0,1 mm² = 0,1 µl) naar volume in ml (= 10³ µl)). Als er minder dan cellen in 0,5 ml zitten, moet de oplossing gecentrifugeerd worden gedurende 6 minuten op 126xg. Hierdoor wordt een celpellet 1. Compleet RPMI: 84% RPMI-1640 medium, 15% FCS, 1% L-glutamine, 50 U/ml penicilline en 50 µg/ml streptomycine. 20

34 Materiaal en methoden verkregen en kan het teveel aan medium worden verwijderd om de concentratie aan cellen te verhogen. Figuur 2.3: Cellen tellen op een Bürker telkamer. De zwarte cellen worden wel meegeteld. De witte cellen liggen ofwel buiten de randen van het grote vak, ofwel op de randen die niet worden meegeteld (hier de onderste en de rechter rand) γ-h2ax immuunkleuring Figuur 2.4: Principe van indirecte immuunkleuring. Het primair antilichaam (AL) (paars) bindt op het eiwit (oranje) en het secundair AL (groen) bindt op het primaire AL. Aan het secundair AL is een fluorescente merker (geel) gekoppeld om detectie mogelijk te maken. Na de bloedscheiding wordt een indirecte immuunkleuring uitgevoerd om de γ-h2ax foci te visualiseren. Van elk bloedstaal of van elke in vitro conditie worden drie poly-l-lysine slides (VWR International) gemaakt door 500 µl van de oplossing, verkregen na de bloedscheiding, te centrifugeren met een cytospin (Sigma) voor 10 minuten op 181xg om de cellen op de slides te projecteren. De positie van de cellen wordt gemarkeerd (Dako stift) en de slides worden kort aan de lucht gedroogd om vervolgens gedurende 20 minuten gefixeerd te worden in 3% paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich). Het teveel aan fixatief wordt met een tissue verwijderd en de slides worden overnacht bewaard in 0,5% PFA. De volgende dag worden de slides uit de 0,5% PFA gehaald, afgedroogd en voor 5 minuten in 21